Nghiên cứu tác dụng ức chế của cao chiết cây Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.) lên sinh trưởng của Vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa Kutzing trong các thủy vực nước ngọt

MỞ ĐẦU Ô nhiễm môi trường không khí, nước và đất đã trở thành vấn đề hàng đầu, gióng hồi chuông cảnh báo về sự suy giảm chất lượng cuộc sống và sức khỏe con người không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều nơi trên thế giới. Ô nhiễm nguồn nước mặt là đặc biệt nghiêm trọng khi nhiều nơi trên thế giới người dân không có nước sạch để sử dụng cho ăn uống và sinh hoạt kéo theo tỉ lệ tử vong và bệnh tật gia tăng vì sử dụng nguồn nước không đạt yêu cầu. Nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến ô nhiễm nguồn nước mặt như xả trực tiếp các nguồn nước thải công nghiệp, nước thải sinh hoạt mà không qua xử lý hoặc lạm dụng quá mức phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật trong sản xuất nông nghiệp để nâng cao sản lượng lương thực đáp ứng sự gia tăng dân số thế giới trong những thập kỉ gần đây. Hậu quả dẫn đến gia tăng nguồn dinh dưỡng (chủ yếu là nitơ và photpho) trong các thủy vực gây nên hiện tượng phú dưỡng mà kéo theo là “tảo nở hoa” hoặc “nở hoa của nước”. Sự nở hoa của nước bản chất là sự phát triển ồ ạt của Vi khuẩn lam (VKL) và vi tảo, có khả năng sản sinh độc tố kéo theo sự nhiễm độc và cái chết của thủy hải sản, động vật nuôi, động vật hoang dã và con người [1]. Sự nở hoa của nước thường gây ra những tác động xấu lên môi trường như làm đục nước, tăng giá trị pH, giảm hàm lượng oxy hòa tan, tăng độc tố đặc biệt là độc tố microcystin. Kết quả điều tra ở các thủy vực nước ngọt cho thấy trong các loài VKL độc gây hiện tượng nở hoa nước thì Microcystis aeruginosa chiếm đến 90% và sản sinh ba loại độc tố nguy hiểm là độc tố gan (hepatotoxins), độc tố thần kinh (neurotoxins) và độc tố gây dị ứng da. Điều nghiêm trọng là tần suất xuất hiện các loài VKL độc ngày càng tăng làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người và động vật nuôi, động vật hoang dã do sử dụng nguồn nước có VKL độc. Do đó ngăn ngừa và giảm thiểu sự phát triển bùng nổ của VKL độc là vấn đề quan trọng cần phải được quan tâm. Các phương pháp xử lý ô nhiễm môi trường nước gây ra bởi VKL độc đã được nghiên cứu và áp dụng từ những phương pháp cơ học đơn giản như hớt váng, che sáng hay pha loãng nước hồ đến các phương pháp lý - hóa như dùng sóng siêu âm, sử dụng ánh sáng cực tím, hoặc sử dụng các hợp chất hóa học diệt tảo, các hợp chất có tính oxi hóa cao, các kim loại và nano kim loại. Những phương pháp này bên cạnh những ưu điểm dễ thấy như hiệu quả tác động nhanh, rõ rệt trong thời gian ngắn nhưng còn tồn tại những hạn chế như tốn kém kinh phí triển khai hoặc gây ra sự ô nhiễm môi trường thứ cấp, tác động không chọn lọc lên các loài sinh vật do đó gây suy giảm đa dạng sinh học đặc biệt sử dụng hóa chất sau một thời gian quan sát thấy hiện tượng nhờn thuốc và vì thế chúng bị hạn chế triển khai ở quy mô thực tế. Do đó phương pháp sinh học dùng các cao chiết có nguồn gốc thực vật để ức chế sinh trưởng VKL đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu vì tính hiệu quả và thân thiện với môi trường. Cây Mần tưới Eupatorium fortunei Turcz., thuộc họ Cúc (Asteraceae) là loài cây cỏ lâu năm, được sử dụng trong dân gian như một loại thuốc chữa bệnh và được chứng minh hoạt tính kháng khuẩn trong nhiều nghiên cứu khác nhau. Năm 2013, Nguyễn Tiến Đạt và cộng sự đã tiến hành khảo sát và so sánh hoạt tính diệt VKL độc M. aeruginosa của nhiều loại cao chiết từ các loài thực vật khác nhau tại Việt Nam cho thấy cao chiết cây Mần tưới có hiệu quả nhất để kiểm soát bùng nổ VKL độc [2]. Kết luận này được khẳng định bởi các công bố của Phạm Thanh Nga trong những năm tiếp theo [3]. Tuy nhiên đây mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu khảo sát hoạt tính diệt VKL độc của cao chiết cây Mần tưới. Từ những lý do trên đề tài luận án tiến sỹ: “Nghiên cứu tác dụng ức chế của cao chiết cây Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.) lên sinh trưởng của Vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa Kutzing trong các thủy vực nước ngọt” đã được lựa chọn để thực hiện. Luận án đã đặt ra mục tiêu như sau: Tạo được cao chiết thực vật ức chế hiệu quả sinh trưởng của Vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa. Luận án có tính chất kế thừa kết quả của những nghiên cứu trước và sẽ giải quyết nhiều vấn đề còn tồn tại. Luận án đã đặt ra những nội dung như sau: 1. Xây dựng quy trình tạo cao chiết tổng, cao chiết phân đoạn, các chất sạch phân lập từ cây Mần tưới. 2. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng ức chế của cao chiết tổng Mần tưới lên sinh trưởng của M. aeruginosa và đánh giá an toàn sinh thái.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

**********************

PHẠM THANH NGA NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ CỦA CAO CHIẾT

CÂY MẦN TƯỚI (EUPATORIUM FORTUNEI TURCZ.) LÊN

SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN

LAM ĐỘC MICROCYSTIS AERUGINOSA KUTZING

TRONG CÁC THỦY VỰC NƯỚC NGỌT

Chuyên ngành: Kỹ thuật môi trường

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Vi khuẩn lam độc và hiện tượng phú dưỡng trong các thủy vực nước ngọt 4

1.1.1 Vi khuẩn lam độc 4

1.1.2 Hiện tượng phú dưỡng và triển bùng nổ sinh khối VKL độc 6

1.1.3 Các biện pháp kiểm soát phát triển bùng nổ sinh khối VKL độc 10

1.1.4 Phương pháp triển khai áp dụng ngoài thực tế tại các ao, hồ Việt Nam 17

1.2 Sử dụng cao chiết thực vật và hoạt chất thiên nhiên để kiểm soát bùng nổ Vi khuẩn lam độc 20

1.2.1 Hoạt tính sinh học của cao chiết và các hợp chất thiên nhiên 20

1.2.2 Nghiên cứu điển hình sử dụng cao chiết, dịch chiết thực vật kiểm soát bùng phát VKL độc 22

1.2.3 Một số nhóm hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên kiểm soát bùng nổ VKL 30

1.2.4 Cơ chế tác động của các cao chiết và các hợp chất thiên nhiên lên sinh trưởng của VKL độc M aeruginosa 32

1.3 Cây Mần tưới Eupatorium fortunei 34

1.3.1 Sơ lược về cây Mần tưới Eupatorium fortunei 34

1.3.2 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học 34

1.3.3 Hoạt tính sinh học của cây Mần tưới 42

1.3.4 Ứng dụng cao chiết cây Mần tưới để kiểm soát bùng phát sinh khối VKL độc M aeruginosa 45

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47

2.1 Đối tượng nghiên cứu 47

2.1.1 Cây Mần tưới Eupatorium fortunei 47

2.1.2 Vi khuẩn lam độc nước ngọt Microcystis aeruginosa Kützing 47

2.1.3 Loài tảo lục Chlorella vulgaris 48

2.1.4 Bèo tấm Lemna minor 49

2.1.5 Giáp xác Daphnia magna 49

2.1.6 Quần thể thực vật phù du hồ Hoàn Kiếm và hồ Láng 50

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 50

2.2.1 Thiết bị và dụng cụ 50

2.2.2 Hóa chất 50

2.3 Phương pháp nghiên cứu 51

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu thực vật, tạo cao chiết và phân lập các hợp chất sạch 51

2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất sạch 51

2.3.3 Phương pháp đánh giá sinh trưởng của VKL, tảo lục Chlorella vulgaris và thực vật phù du 51

2.3.4 Phương pháp quan sát hình thái tế bào VKL và Chlorella vulgaris [63] 53

2.3.5 Phương pháp đánh giá độc tố của cao chiết lên Daphnia magna [135] 53

2.3.6 Phương pháp đánh giá độc tố của cao chiết lên Lemna minor [22] 54

2.3.7 Phương pháp phân tích chất lượng môi trường nước [17] 54

2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 55

2.4 Mô tả thực nghiệm 55

2.4.1 Thực nghiệm xử lý mẫu thực vật, tạo cao chiết và phân lập chất sạch 55

Quy trình phân lập các chất sạch từ cao chiết phân đoạn etyl axetate Mần tưới 59

2.4.2 Thực nghiệm nghiên cứu độc tính diệt VKL độc và tảo lục của các cao chiết 62

2.4.3 Thực nghiệm đánh giá tính an toàn của cao chiết 64

2.4.4 Thực nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao chiết đối với mẫu nước hồ tự nhiên 66

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 67

3.1 Công thức cấu tạo các chất sạch được phân lập từ cây Mần tưới Eupatorium fortunei 68 3.1.1 Hợp chất 7,8,9-trihydroxythymol (EfD4.7) 69

3.1.2 Hợp chất 8,10-didehydro-7,9-dihydroxythymol(EfD4.8) 75

3.1.3 Hợp chất 8,9,10- Trihydroxythymol (EfD5.1) 79

3.1.4 Hợp chất o-Coumaric acid (EfD1.8) 80

3.1.5 Hợp chất 4-(2-hydroxyethyl)benzaldehyde (EfD10.1) 81

3.1.6 Hợp chất kaempferol (EfD10.3) 82

3.1.7 Hợp chất 8,10-dihydroxy-9-acetoxythymol (EfD14.1) 83

3.2 Kết quả đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng và diệt VKL độc, vi tảo của các cao chiết và chất sạch được phân lập 86

3.2.1 Đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng VKL độc Microcystis aeruginosa TC3 của các cao chiết tổng Mần tưới 86

3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết tổng etanol Mần tưới lên sinh trưởng

của Microcystis aeruginosa TC3 và Chlorella vulgaris 89

3.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn lên sinh trưởng của Microcystis aeruginosa TC3 và Chlorella vulgaris 95

3.2.4 Đánh giá tiềm năng kiểm soát bùng nổ sinh khối Microcystis aeruginosa TC3 của cao chiết Mần tưới 101

3.2.5 Đánh giá hoạt tính diệt Microcystis aeruginosa TC3 của các chất sạch 105

3.2.6 Ảnh hưởng của cao chiết lên cấu trúc tế bào M aeruginosa TC3 và C vulgaris 109

3.3 Kết quả đánh giá tính an toàn của cao chiết thực vật Mần tưới (ảnh hưởng lên một số sinh vật khác) 115

3.3.1 Ảnh hưởng của cao chiết đến giáp xác Daphnia magna 115

3.3.2 Ảnh hưởng của cao chiết đến bèo tấm Lemna minor 121

3.4 Bước đầu thử nghiệm ảnh hưởng của cao chiết lên sinh trưởng VKL độc trong mẫu nước hồ tự nhiên 127

3.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng ức chế của cao chiết lên mẫu nước hồ Hoàn Kiếm quy mô phòng thí nghiệm 127

3.4.2 Kết quả thử nghiệm trên mẫu nước hồ Láng quy mô 5L tại phòng thí nghiệm 130

3.4.3 Kêt quả thử nghiệm trên mẫu nước hồ Láng quy mô ngoài trời 134

3.4.4 Ảnh hưởng của cao chiết đến các thông số môi trường 137

KẾT LUẬN 141

KIẾN NGHỊ 142

TÀI LIỆU THAM KHẢO 142 PHỤ LỤC

1 Quyết định về việc công nhận trúng tuyển nghiên cứu sinh năm 2015

2 Quyết định về việc công nhận tên đề tài và người hướng dẫn

3 Danh mục các bài báo công bố của NCS

4 Danh mục các phổ của các chất sạch được phân lập từ cây Mần tưới

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

13C NMR Cộng hưởng từ hạt nhân 13C Carbon Nuclear Magnetic

Resonance (13 C-NMR)

1H NMR Cộng hưởng từ hạt nhân 1H Proton Nuclear Magnetic

Resonance (1H-NMR)

EC50 Nồng độ ảnh hưởng 50% Half maximal effective

concentration EtOAc Dung môi etyl axetat Ethyl acetate solvent

EtOH Dung môi etanol Ethanol solvent

Coleration HR-ESI-

MS

Phổ khối lượng phun mù điện

tử phân giải cao

High-resolution electrospray ionisation mass spectrometry

correlation spectroscopy

IE Hiệu quả ức chế sinh trưởng Inhibition efficiency

LC50 Nồng độ gây chết 50% Lethal Concentration, 50%

SEM Kính hiển vi điện tử quét Scanning Electron Microscope TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua Transmission Electron

Microscopy

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Hiệu suất tạo cao chiết tổng trong các dung môi khác nhau 68 Bảng 3.2 Hiệu suất tạo cao chiết phân đoạn từ cao chiết tổng ethanol Mần tưới 68 Bảng 3.3 Hiệu suất tách chiết các chất sạch từ Mần tưới 69 Bảng 3.4 Số liệu phổ NMR của hai chất EfD4.7 và EfD4.8: 74 Bảng 3.5 Số liệu phổ 1 H NMR (H và J) của EfD 10.1 và của hợp chất 8,9,10-

Trihydroxythymol đã được công bố trong tài liệu tham khảo [137] 79 Bảng 3.6 Số liệu phổ 13 C NMR của hợp chất axit o- coumaric 80 Bảng 3.7 Số liệu phổ 1 H NMR của hợp chất axit o- coumaric 81 Bảng 3.8 Số liệu phổ 1 H NMR (H và J) của EfD 10.3 và của kaempferol đã được

công bố 83 Bảng 3.9 Giá trị 1 H NMR spectra (H và J) của EfD 14.1 với 8,9-didydroxy -9

axetoxythymol đã được công bố 84 Bảng.3.10 Hiệu qủa ức chế sinh trưởng của cao chiết etanol Mần tưới lên M

aeruginosa và Ch vulgaris tại nồng độ 200 và 500 µg/mL 93 Bảng 3.11 Hiệu quả ức chế sinh trưởng của cao chiết phân đoạn etyl axetat và cao chiết

phân đoạn nước lên M aeruginosa và Ch vulgaris tại nồng độ 200 và 500 µg/mL 101 Bảng 3.12 Hiệu quả ức chế sinh sinh trưởng của chủng M aeruginosa dưới ảnh

hưởng của CuSO 4 5 µg/L và các cao chiết Mần tưới sau 72 giờ 104 Bảng 3.13 Giá trị LC 50 của cao chiết tổng etanol Mần tưới tại 24 và 48 giờ 117 Bảng 3.14 Giá trị DO và pH của mẫu phơi nhiễm cao chiết tổng etanol Mần tưới

tại 0 và sau 48h 119 Bảng 3.15 Giá trị DO và pH của mẫu phơi nhiễm cao chiết etyl axetat Mần tưới tại

0 và sau 48h 119 Bảng.3.16A Biến động thông số thủy lý mẫu nước Hồ Hoàn Kiếm quy mô 5L bổ

sung hoạt chất CuSO 4 và cao chiết etanol và etyl axetat Mần tưới 137 Bảng.3.16B Biến động của thông số thủy hóa mẫu nước Hồ Hoàn Kiếm quy mô 5L bổ

sung hoạt chất CuSO 4 và cao chiết etanol và etyl axetat Mần tưới 137

Bảng.3.17.A Biến động của thông số thủy lý mẫu nước Hồ Láng quy mô 5L bổ sung

hoạt chất CuSO 4 và cao chiết etanol và etyl axetat Mần tưới 138 Bảng.3.17 B Biến động của thông số thủy lý mẫu nước Hồ Láng quy mô 5L bổ sung

hoạt chất CuSO 4 và cao chiết etanol và etyl axetat Mần tưới 138 Bảng.3.18.A Biến động của thông số thủy lý mẫu nước Hồ Láng quy mô 300L bổ

sung hoạt chất CuSO 4 và cao chiết etanol Mần tưới 139 Bảng.3.18B Biến động của thông số thủy lý mẫu nước Hồ Láng quy mô 300L bổ

sung hoạt chất CuSO 4 và cao chiết etanol Mần tưới 139

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của phân tử microcystin [7] 5

Hình.1.2 Bùng phát tảo nở hoa trên thế giới: A Hồ Taihu, Trung Quốc B Hồ Atitlan, Guatamala C Lake Erie, Mỹ - Canada D Ichetucknee Springs, Florida, Mỹ E and F Hồ Taihu, Trung Quốc G Hồ Zaca, California, Mỹ H and I Sông St Johns, Florida Hồ J Liberty, Washington, Mỹ K Kênh Haarlem, Netherlands, L Lagoon gần sông St Lucie Florida [21] 9

Hình 1.3 Một số hồ tiêu biểu ở Việt Nam bùng phát tảo nở hoa [1, 29] 11

Hình 2.1 Cây Mần tưới (Eupatorium fortunei) [115] 47

Hình 2.2 Tập đoàn M aeruginosa chụp dưới kính hiển vi điện tử Microscope BX51 48

Hinh 2.3 Các tế bào M aeruginosa được phân lập trong phòng thí nghiệm chụp dưới kính hiển vi điện tử Microscope BX51 48

Hình 2.4 C vulgaris sử dụng trong phòng thí nghiệm 48

Hình 2.5 Lemna minor 49

Hình 2.6 Daphnia magna 49

Hình 2.7 Hồ Hoàn Kiếm 50

Hình 2.8 Hồ Láng 50

Hình 2.9 Thành phần loài Microcystis trong hồ Hoàn Kiếm (a-e) dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 200 lần); (f) dưới kính hiển vi huỳnh quang (độ phóng đại 1000 lần); a Microcystis botrys; b Microcystis wessenbergii; c Microcystis flos-aquae; d Microcystis viridis; e và f Microcystis aeruginosa [134] 18

Hình 2.10 Các loài Microcystis ở hồ Láng (A-F) A - Microcystis aeruginosa Kützing, B - Microcystis flos-aquae (Wittrock) Kirchner, C - Microcystis novacekii (Komárek) Compère, D - Microcystis smithii Komárek & Anagnostidis, E - Microcystis viridis (Braun) Lemmermann, F - Microcystis wesenbergii (Komárek) Komárek ex Komárek 19

Hình 2.11 Quy trình tạo cao chiết tổng từ mẫu thực vật tươi 55

Hình 2.11 Chiết phân đoạn hexan từ cao tổng 56

Hình 2.12 Chiết phân đoạn ethyl-axetat từ cao tổng 56

Hình 2.13 Quy trình tạo cao chiết tổng từ mẫu thực vật trong quy mô phòng 57

Hình 2.14 Quy trình tạo cao chiết tổng từ mẫu thực vật trong quy mô phòng 58

Hình 2.15 Quy trình phân lập các hợp chất sạch từ cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới 60

Hình 2.16 Thực nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các cao chiết từ cây Mần tưới lên sinh trưởng M.aeruginosa và Chlorella vulgaris 62

Hình 2.17 Thực nghiệm đánh giá hoạt tính diệt VKL độc của các chất sạch phân lập từ cây Mần tưới 64

Hình 2.18 Thực nghiệm đánh giá độc tố của cao chiết Mần tưới lên giáp xác D magna 64

Hình 2.19 Thực nghiệm nghiên cứu mẫu bèo Lemna minor dưới ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới 65

Hình 2.20 Thực nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới lên mẫu nước hồ tự nhiên quy mô phòng thí nghiệm 67

Hình 2.21 Thực nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới lên mẫu nước hồ tự nhiên quy mô ngoài trời 67

Hình 3.1 Cấu trúc hoá học và các tương tác HMBC chính của chất EfD4.7 69

Hình 3.2 Phổ HR-ESI-MS của chất EfD4.7 70

Hình 3.3 Phổ 1H NMR của chất EfD4.7 70

Hình 3.4 Phổ 13C NMR của chất EfD4.7 71

Hình 3.5 Phổ HSQC của chất EfD4.7 72

Hình 3.6 Phổ HMBC của chất EfD4.7 73

Hình 3.7 Cấu trúc hoá học và các tương tác HMBC chính của chất EfD 4.8 75

Hình.3.8 Phổ HR-ESI-MS của chất EfD4.8 75

Hình.3.9 Phổ 1H NMR của chất EfD4.8 76

Hình 3.10 Phổ 13C NMR của chất EfD4.8 76

Hình 3.11 Phổ HSQC của chất EfD4.8 77

Hình 3.12 Phổ HMBC của chất EfD4.8 78

Hình 3.13 Cấu trúc hợp chất EfD5.1 79

Hình 3.14 Cấu trúc hợp chất EfD1.8 80

Hình 3.15 Cấu trúc hợp chất EfD10.1 81

Hình 3.16 Cấu trúc hợp chất EfD10.3 82

Hình 3.17 Cấu trúc hợp chất EfD14.1 83

Hình 3.18 Ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới nồng độ 200 (A) và 500 µg/mL (B) lên sinh trưởng của M aeruginosa TC3 tính theo mật độ quang (tại bước sóng 680 nm) 87

Hình 3.19 Ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới nồng độ 200 (A) và 500 µg/mL (B) lên sinh trưởng của M aeruginosa TC3 tính theo hàm lượng chlorophyll a 88

Hinh 3.20 Sinh trưởng của M.aeruginosa dưới tác dụng của cao chiết tổng etanol Mần tướitính theo mật độ quang (A), hàm lượng chlorop hyll a (B) và mật độ tế bào (C) 91

Hinh 3.21 Sinh trưởng của C vulgaris dưới tác dụng của cao chiết tổng etanol Mần tưới tính theo mật độ quang (A), hàm lượng chlorophyll a (B) và mật độ tế bào (C) 93

Hình 3.22 Sinh trưởng của M aeruginosa dưới tác dụng của cao chiết phân đoạn etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) tính theo mật độ quang 95

Hình 3.23 Sinh trưởng của M.aeruginosa TC3 dưới tác dụng của cao chiết phân đoạn etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) tính theo hàm lượng chlorophyll a 96

Hình 3.24 Sinh trưởng của M.aeruginosa dưới tác dụng của cao chiết phân đoạn etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) theo mật độ tế bào 97

Hình 3.25 Sinh trưởng của C.vulgaris dưới ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) tính theo mật độ quang 98

Hình 3.26 Sinh trưởng của C.vulgaris dưới ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn

etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) Mần tưới theo hàm lượng chlorophyll a 99 Hình 3.27 Sinh trưởng của C vulgaris dưới ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn

etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) tính theo mật độ tế bào 100 Hình 3.28 Sinh trưởng của chủng M aeruginosa trong vòng 72 giờ tác dụng của

các cao chiết Mần tưới Tính theo mật độ quang 98 Hình 3.29 Sinh trưởng của chủng M.aeruginosa dưới tác dụng của các chất sạch

sau 72 giờ tính theo mật độ quang bước sóng 680 nm (A) và theo mật

độ tế bào (B) 106 Hình 3.30 Cấu trúc siêu hiển vi của tế bào M.aeruginosa TC3 (A) và C.vulgaris

(B) dưới kính hiển vi điện tử truyền qua 110 Hình 3.31 Ảnh hưởng của cao chiết lên cấu trúc siêu hiển vi của tế bào M

aeruginosa TC3 dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (A- cao chiết etanol, B- cao chiết phân đoạn etyl axetat, C- cao chiết phân đoạn nước, 111 Hình 3.32 Ảnh hưởng của cao chiết lên cấu trúc siêu hiển vi của tế bào

C.vulgaris dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (A- cao chiết etanol, B- cao chiết ethyl axetat, C- cao chiết nước, 3- sau 3 ngày, 6-sau 6 ngày, 10- sau 10 ngày) 113 Hình 3.33 Tỷ lệ cá thể sống/chết của D.magna sau 24 giờ (A) và 48 giờ (B) phơi

nhiễm với cao chiết tổng etanol Mần tưới 116 Hình 3.34 Tỷ lệ cá thể sống/chết của D.magna sau 24 giờ và 48 giờ phơi nhiễm

với cao chiết etyl axetat Mần tưới 116 Hình 3.35 Ảnh hưởng của cao chiết tổng etanol (A) và phân đoạn etyl axetat

Mần tưới (B) lên tổng số cánh bèo L.minor 122 Hình 3.36 Hình thái ngoài của cánh bèo L.minor sau 5 ngày phơi nhiễm cao

chiết tổng ethanol Mần tưới 123

Hình 3.37 Hình thái ngoài của cánh bèo L.minor sau 5 ngày phơi nhiễm cao

chiết tổng phân đoạn etyl axetat Mần tưới 123 Hình 3.38 Sinh khối tươi của bèo L.minor dưới tác động của cao chiết etanol (A) và

cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới (B) tại thời điểm bắt đầu (T0)

và sau 5 ngày (T5) 124 Hình 3.39 Hàm lượng sắc tố quang hợp của bèo L.minor dưới tác động của cao

chiết etanol (A) và cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới (B) tại thời điểm bắt đầu (T0) và sau 5 ngày (T5) 125 Hình 3.40 Sự biến đổi sinh khối thực vật nổi (theo hàm lượng chlorophyll a) của mẫu

đối chứng, mẫu CuSO4 và mẫu bổ sung cao chiết trong mẫu nước hồ Hoàn Kiếm 127 Hình 3.41 Biến động mật độ tế bào thực vật phù du nghiên cứu trên mẫu nước hồ

Hoàn Kiếm ngày T0 (A) và T10 (B) dưới ảnh hưởng của các cao chiết

Mần tưới 128 Hình 3.42 Sự biến đổi sinh khối thực vật nổi (theo hàm lượng chlorophyll a) của

mẫu đối chứng, mẫu CuSO4 và mẫu bổ sung cao chiết trong nước Hồ Láng 130 Hình 3.43 Biến động mật độ tế bào thực vật phù du nghiên cứu trên mẫu nước

Hồ Láng ngày T0 (A) và T10 (B) dưới ảnh hưởng của các cao chiết Mần tưới 131 Hình 3.44 Sự biến đổi sinh khối thực vật nổi (theo hàm lượng chlorophyll a) của

mẫu etanol Mần tưới trong nước Hồ Hoàn Láng quy mô ngoài trời 135 Hình 3.45 Mật độ tế bào thực vật phù du nghiên cứu trên mẫu nước Hồ Láng quy

mô ngoài trời ngày T0 (A) và ngày T10 (B) 136

1

MỞ ĐẦU

Ô nhiễm môi trường không khí, nước và đất đã trở thành vấn đề hàng đầu, gióng hồi chuông cảnh báo về sự suy giảm chất lượng cuộc sống và sức khỏe con người không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều nơi trên thế giới Ô nhiễm nguồn nước mặt là đặc biệt nghiêm trọng khi nhiều nơi trên thế giới người dân không có nước sạch để

sử dụng cho ăn uống và sinh hoạt kéo theo tỉ lệ tử vong và bệnh tật gia tăng vì sử dụng nguồn nước không đạt yêu cầu Nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến ô nhiễm nguồn nước mặt như xả trực tiếp các nguồn nước thải công nghiệp, nước thải sinh hoạt mà không qua xử lý hoặc lạm dụng quá mức phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật trong sản xuất nông nghiệp để nâng cao sản lượng lương thực đáp ứng sự gia tăng dân số thế giới trong những thập kỉ gần đây Hậu quả dẫn đến gia tăng nguồn dinh dưỡng (chủ yếu là nitơ và photpho) trong các thủy vực gây nên hiện tượng phú dưỡng mà kéo theo là “tảo nở hoa” hoặc “nở hoa của nước” Sự nở hoa của nước bản chất là sự phát triển ồ ạt của Vi khuẩn lam (VKL) và vi tảo, có khả năng sản sinh độc

tố kéo theo sự nhiễm độc và cái chết của thủy hải sản, động vật nuôi, động vật hoang

dã và con người [1] Sự nở hoa của nước thường gây ra những tác động xấu lên môi trường như làm đục nước, tăng giá trị pH, giảm hàm lượng oxy hòa tan, tăng độc tố đặc biệt là độc tố microcystin Kết quả điều tra ở các thủy vực nước ngọt cho thấy

trong các loài VKL độc gây hiện tượng nở hoa nước thì Microcystis aeruginosa chiếm

đến 90% và sản sinh ba loại độc tố nguy hiểm là độc tố gan (hepatotoxins), độc tố thần kinh (neurotoxins) và độc tố gây dị ứng da Điều nghiêm trọng là tần suất xuất hiện các loài VKL độc ngày càng tăng làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người và động vật nuôi, động vật hoang dã do sử dụng nguồn nước có VKL độc Do đó ngăn ngừa và giảm thiểu sự phát triển bùng nổ của VKL độc là vấn đề quan trọng cần phải được quan tâm

Các phương pháp xử lý ô nhiễm môi trường nước gây ra bởi VKL độc đã được nghiên cứu và áp dụng từ những phương pháp cơ học đơn giản như hớt váng, che sáng hay pha loãng nước hồ đến các phương pháp lý - hóa như dùng sóng siêu âm,

sử dụng ánh sáng cực tím, hoặc sử dụng các hợp chất hóa học diệt tảo, các hợp chất

2

có tính oxi hóa cao, các kim loại và nano kim loại Những phương pháp này bên cạnh những ưu điểm dễ thấy như hiệu quả tác động nhanh, rõ rệt trong thời gian ngắn nhưng còn tồn tại những hạn chế như tốn kém kinh phí triển khai hoặc gây ra sự ô nhiễm môi trường thứ cấp, tác động không chọn lọc lên các loài sinh vật do đó gây suy giảm đa dạng sinh học đặc biệt sử dụng hóa chất sau một thời gian quan sát thấy hiện tượng nhờn thuốc và vì thế chúng bị hạn chế triển khai ở quy mô thực tế Do đó phương pháp sinh học dùng các cao chiết có nguồn gốc thực vật để ức chế sinh trưởng VKL đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu vì tính hiệu quả và thân thiện với môi trường

Cây Mần tưới Eupatorium fortunei Turcz., thuộc họ Cúc (Asteraceae) là loài cây

cỏ lâu năm, được sử dụng trong dân gian như một loại thuốc chữa bệnh và được chứng minh hoạt tính kháng khuẩn trong nhiều nghiên cứu khác nhau Năm 2013, Nguyễn

Tiến Đạt và cộng sự đã tiến hành khảo sát và so sánh hoạt tính diệt VKL độc M aeruginosa của nhiều loại cao chiết từ các loài thực vật khác nhau tại Việt Nam cho

thấy cao chiết cây Mần tưới có hiệu quả nhất để kiểm soát bùng nổ VKL độc [2] Kết luận này được khẳng định bởi các công bố của Phạm Thanh Nga trong những năm tiếp theo [3] Tuy nhiên đây mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu khảo sát hoạt tính diệt VKL độc của cao chiết cây Mần tưới

Từ những lý do trên đề tài luận án tiến sỹ: “Nghiên cứu tác dụng ức chế của

cao chiết cây Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.) lên sinh trưởng của Vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa Kutzing trong các thủy vực nước ngọt”

đã được lựa chọn để thực hiện

Luận án đã đặt ra mục tiêu như sau: Tạo được cao chiết thực vật ức chế hiệu quả

sinh trưởng của Vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa Luận án có tính chất kế

thừa kết quả của những nghiên cứu trước và sẽ giải quyết nhiều vấn đề còn tồn tại Luận án đã đặt ra những nội dung như sau:

1 Xây dựng quy trình tạo cao chiết tổng, cao chiết phân đoạn, các chất sạch phân lập từ cây Mần tưới

2 Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng ức chế của cao chiết tổng Mần tưới lên sinh

trưởng của M aeruginosa và đánh giá an toàn sinh thái

3

3 Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng ức chế của cao chiết phân đoạn etyl axetat

và cao chiết phân đoạn nước Mần tưới lên sinh trưởng của M aeruginosa và đánh giá

an toàn sinh thái

4 Nghiên cứu phân lập và đánh giá hoạt tính diệt VKL độc M.aeruginosa của

07 hợp chất hóa học được phân lập từ cây Mần tưới

5 Nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng cao chiết để kiểm soát bùng nổ Vi khuẩn lam trong các mẫu nước hồ tự nhiên

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án

Ô nhiễm môi trường nước, đặc biệt hiện tượng phú dưỡng kéo theo sự bùng phát sinh khối VKL với việc giải phóng độc tố microcystin đã nhận được nhiều sự quan tâm, nghiên cứu trong thời gian gần đây Sử dụng cao chiết từ thực vật để kiểm soát bùng nổ sinh khối VKL thể hiện nhiều ưu điểm vượt trội so với các phương pháp truyền thống được áp dụng trước đây Kết quả của luận án cung cấp cơ sở khoa học, chứng minh tính

ưu việt khi áp dụng cao chiết thực vật như một hoạt chất ức chế và diệt chọn lọc VKL độc để kiểm soát bùng phát sinh khối VKL độc

Tính mới của luận án

- Tách chiết được 02 chất mới (7,8,9 - trihydroxythymol và

8,10-didehydro-7,9-trihydroxythymol) và đánh giá tác động của 02 chất này lên M aeruginosa trong dải

nồng độ từ 1,0 µg/mL đến 50,0 µg/mL với hiệu quả ức chế sinh trưởng ghi nhận từ 39,1÷41,2 % và 20,0 – 25,0 %, tương ứng sau 72 giờ

nồng độ 500 µg/mLở quy mô phòng thí nghiệm và hiệu quả trên 60 % ở quy mô ngoài trời với mẫu nước hồ tự nhiên Độc tính của cao chiết tổng etanol Mần tưới đối

với Daphnia magna và Lemna minor ghi nhận là thấp hơn so với M aeruginosa

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

4

1.1 Vi khuẩn lam độc và hiện tượng phú dưỡng trong các thủy vực nước ngọt

1.1.1 Vi khuẩn lam độc (VKL)

Vi khuẩn lam (Cyanobacteria, Cyanoprokaryota, Cyanophyta, Blue-green

microalgae) là một trong những sinh vật xuất hiện trên Trái Đất cách đây hàng tỷ năm

và mang nhiều tên gọi khác nhau trong quá trình nghiên cứu Từ năm 1854, Kopp đã coi vi khuẩn và tảo lam là một nhóm có chung nguồn gốc phát sinh Theo những đặc

điểm hình thái khác nhau, VKL được chia làm 4 bộ, Chlorococcales, Oscillatoriales, Nostocales và Stigonematales Theo các tài liệu công bố, hiện nay có khoảng 100 loài VKL độc nước ngọt thuộc 40 chi trong đó Microcystis đặc biệt là Microcystis aeruginosa, một trong những chi thường gặp nhất phổ biến nhất với tỉ lệ trên 75 %

[1, 4] Microcystis aeruginosa có dạng tập đoàn, dạng hình cầu hoặc mắt lưới với

các khoảng trống giữa các tế bào, tế bào phân bố trong tập đoàn có dạng hình cầu, màu xanh nhạt, xếp chồng lên nhau

Cấu trúc cơ thể, hình dạng và kích thước: Trong phân loại hiện đại, VKL và vi

khuẩn có nhiều những nét chung như sinh vật chưa có nhân điển hình, chỉ có chất nhân và nhiễm sắc thể Màng tế bào cấu tạo từ murein một loại gluco aminopeptid trong tế bào chất có nhiều riboxom, có khả năng đồng hóa được N2 tự do và có khả năng quang hợp Tế bào chứa sắc tố quang hợp và hấp thụ bước sóng từ 430-440 nm

và từ 660-680 nm [5] Ngược lại với vi tảo nhân thật, VKL không có màng nhân mà

chỉ có lớp màng peptidoglycan và chứa ribosom loại 70 S [1] Chi Microcystis thường

tồn tại dưới dạng tập đoàn gồm hàng nghìn tế bào riêng lẻ có kích thước từ 3-10 µm

dao động phụ thuộc vào từng loài

Dinh dưỡng và sinh sản: Phần lớn VKL là những cơ thể quang tự dưỡng hiếu

khí VKL có khả năng dự trữ các chất dinh dưỡng thiết yếu và đồng hóa bên trong

tế bào chất, có thể quan sát dưới kính hiển vi các hạt glycogen, giọt lipip, các hạt

cyanophycin, các thể polyphosphate hay carboxysome

VKL chỉ sinh sản vô tính Các loài dạng sợi thường sinh sản bằng cách phân đoạn các trichome hoặc hình thành các đoạn tảo (hormogonia) Đoạn tảo là những đoạn sợi sinh sản phân biệt Chúng được tạo thành nhờ chuyển động trượt và dần dần phát triển thành những trichome mới, các loài dạng sợi thường sinh sản bằng cách phân đoạn

5

Phân bố VKL: Sự phân bố của VKL phụ thuộc vào nhiều yếu tố thủy văn và

khí hậu của từng vùng đặc biệt là điều kiện dinh dưỡng của môi trường sống Đa số các loài VKL trong tế bào đều chứa không bào khí Đó là các thể nội bào dạng túi chứa khí giúp điều khiển sự nổi của tế bào giúp cho chúng có ưu thế trong cạnh tranh ánh sáng và dinh dưỡng VKL phân bố rộng, chúng có trong nước, đất, ở các

nơi khô hạn, trên cây, băng tuyết

Độc tố VKL: Neurotoxin là nhóm các chất độc thần kinh, hợp chất độc hại nhất

do VKL sản sinh ra và chúng can thiệp vào hệ thần kinh, gây tê liệt các cơ quan hô hấp, gây tử vong chỉ sau vài phút tác động Độc tố LD50-24 h (Lethal dose, 50%)của các nhóm là khác nhau nhưng nhìn chung là rất độc dao động từ 10 đến 200 μg/kg, độc nhất phải kể đến Saxitoxin với LD50-24 h là 10 μg/kg, LD50 của nhóm Microcystin-LR là 50 μg/kg [6] Microcystin là phân tử peptit có cấu trúc vòng, hiện nay ghi nhận hơn 80 loại biến thể cấu trúc, trong đó ba loại phổ biến nhất được trình

bày tại hình 1.1 [7] Microcystin có thể được tạo ra từ các loài thuộc chi Microcystis, Anabaena, Nostoc, Oscillatoria và Hapalosphon

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của phân tử microcystin [7]

VKL và độc tố của nó ảnh hưởng đến tất cả các loài trong hệ sinh thái bao gồm

vi khuẩn, tảo, động thực vật phù du, nhóm động vật không xương sống ở nước đặc

biệt nhóm loài Daphnia bao gồm gây độc cấp tính (trong vòng 48h) và mãn tính (sau

21 ngày) Tại nồng độ thấp microcystin hòa tan trong nước không gây ảnh hưởng độc

động giải trí từ 20.000 tế bào VKL/mL (tức hơn 10 µg/L nồng độ chlorophyll a) Khi tăng mật độ lên đến 20.000 – 50.000 tế bào/mL (10 - 50 µg/L nồng độ chlorophyll a)

VKL tác động rõ rệt và trên 100.000 tế bào/mL gây nguy hiểm cho con người, động vật nuôi và động vật hoang dã [6]

1.1.2 Hiện tượng phú dưỡng và phát triển bùng nổ sinh khối VKL độc

1.1.2.1 Hiện tượng phú dưỡng

Hiện tượng phú dưỡng (Eutrophication) là một thuật ngữ sinh thái được sử dụng cho quá trình làm giàu nước bởi các chất dinh dưỡng, đặc biệt là nitơ và photpho dẫn đến sự phát triển bùng nổ các loại VKL và vi tảo [12, 13] Năm 1931, Naumann lần đầu tiên đưa ra phân loại các hồ theo các cấp độ dinh dưỡng khác nhau như nhóm nghèo dinh dưỡng (oligotrophic), dinh dưỡng trung bình (mesotrophic), phú dưỡng (eutrophic) và phì dưỡng (hypertrophic) [1] Hakanson đã giới thiệu hệ thống phân loại các mức độ dinh dưỡng khác nhau dựa trên các chỉ tiêu như độ trong, hàm lượng

chlorophyll a, nitơ tổng, photpho tổng và VKL trong các môi trường nước ngọt (độ

muối: từ 0 đến 5%o), nước lợ (độ muối từ 5 đến 20 %o) và nước mặn (độ muối: > 20

%o) thành các nhóm nghèo dinh dưỡng, nhóm trung dưỡng, nhóm phú dưỡng và nhóm phì dưỡng [13, 14]

Nguyên nhân ban đầu của hiện tượng phú dưỡng được xác định là do mất cân bằng nguồn dinh dưỡng đầu vào, chủ yếu là các nguồn nước thải chưa qua xử lý của

hệ sinh thái, từ đó tạo ra ưu thế cạnh tranh của một số loài Bên cạnh yếu tố dinh dưỡng, hiện tượng phú dưỡng trong môi trường nước cũng chịu ảnh hưởng mạnh mẽ

Tại Việt Nam, theo các nghiên cứu gần đây, hầu hết các hồ Hà Nội và các tỉnh thành khác của Việt Nam ở trạng thái phú dưỡng, hàm lượng các chất dinh dưỡng (NH4+ ; NO3- ; PO43-mg/L) dao động ở các hồ khác nhau như hồ Ba Mẫu (8 – 10; 3 – 5; 7,3 – 10 mg/L) ), hồ Giảng Võ (7 – 10; 2 – 10; 3,2 - 6 mg/L) ); hồ Ngọc Khánh (8 – 9; 30 – 40; 3,2 – 5 mg/L) [16] Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Ngọc [17] tổng nitơ vô cơ trong các hồ được nghiên cứu ở Hà Nội dao động từ 0,34 -3,85 mg/L,

P tổng từ 0,23-1,77 mg/L Hàm lượng P tổng số trong các hồ nội đô tại Hà Nội trong quan trắc đều cao hơn so với một số hồ trên thế giới, như: hồ Dianchi (Trung Quốc) dao động 0,09 - 0,79 mg/L; hồ Tega (Nhật Bản) là 0,1 mg/L; hồ Ypakarai (Mỹ) dao động 0,15 – 0,3 mg/L Sự suy giảm chất lượng nước hồ ở trạng thái phú dưỡng cũng được ghi nhận ở nhiều nghiên cứu khác như hồ Xuân Hương, Đà Lạt [18] với nồng

độ nitơ tổng cao nhất đo được là 27,8 mg/L và nồng độ P tổng cao nhất là 1,52 mg/L Chính sự phú dưỡng của các hồ luôn ở mức cao khi gặp điều kiện nhiệt độ thích hợp đặc biệt vào tháng 3, 4 hoặc tháng 9,10 thường xuyên dẫn đến hiện tượng phát triển bùng nổ sinh khối VKL hay hiện tượng “nở hoa nước”

1.1 2.2.Hiện tượng bùng nổ sinh khối VKL độc

a Hiện tượng bùng nổ sinh khối VKL độc trên thế giới

Nở hoa của tảo gây hại đã được biết đến cách đây từ hơn 2000 năm Những người dân bản địa ở các vùng Bắc Mỹ, châu Phi và châu Úc đã từ lâu nhận thức được tính độc của VKL [6, 10, 19] Ngoài ra, các công trình nghiên cứu về bản chất hóa

8

học, đặc tính gây độc của các hoạt chất phân lập từ các mẫu nước nở hoa ngày càng gia tăng Sự ô nhiễm và bùng nổ tảo xảy ra thường xuyên hơn ở các quốc gia trên thế giới, trong đó ghi nhận ít nhất 25% trường hợp có sự giải phóng độc tố microcystin với nồng độ trên 10 µg/L, có tác động tiêu cực đến các loài thủy hải sản và sức khỏe con người khi sử dụng [20] Ở các quốc gia Châu Phi như Angola (2008), Lesotho (2009), Botswana (2010) cũng công bố xuất hiện bùng nổ tảo độc, đặc biệt Brazine ghi nhận hơn 100 bệnh nhân khi tiếp xúc với độc tố Những hồ chứa nước lớn khác trên thế giới như hồ Taihu (Trung Quốc) đến hồ Erie (America) xuất hiện tường xuyên tảo nở hoa nước [21] Hồ Krugersdrift, South Africa phát triển bùng nổ tảo trong các tháng hè năm 2004 dẫn đến hiện tượng cá chết hàng loạt do tích lũy hàm lượng độc

tố microcystin cao đến 43 µg/L [22] Năm 2007 trong vườn quốc gia Kruger National Park cũng ghi nhận hậu quả nặng nề gây chết toàn bộ sinh vật hoang dã do sử dụng nước đầm Nhlangezwane để uống với nồng độ độc tố cao đến 20000 µg/L Bùng nổ

các loài Microcystis cũng đã được quan sát thấy tại trong hồ Midmar

(Pietermaritzburg, KwaZulu Nata) năm 2007, tại Hồ chứa Loskop năm 2014 Nhìn chung khu vực Châu Á- Thái Bình Dương, 54% hồ hoặc hồ chứa bị phú dưỡng, tỉ lệ này tại Châu Âu, Châu Phi, Bắc và Nam Mỹ là 53, 28, 48 và 41% [23] Ảnh hưởng bùng phát tảo không chỉ gây thiệt hại về người, ảnh hưởng đến đa dạng sinh thái thủy vực mà còn gây những tổn thất về kinh tế, ví dụ tại Mỹ hậu quả của bùng nổ vi tảo làm tiêu tốn hằng năm hơn 2,2 tỉ USD [24]

9

Hình.1.2 Bùng phát tảo nở hoa trên thế giới: A Hồ Taihu, Trung Quốc B Hồ Atitlan, Guatamala C Lake Erie, Mỹ - Canada D Ichetucknee Springs, Florida, Mỹ E and F

Hồ Taihu, Trung Quốc G Hồ Zaca, California, Mỹ H and I Sông St Johns, Florida Hồ

J Liberty, Washington, Mỹ K Kênh Haarlem, Netherlands, L Lagoon gần sông St Lucie

Florida [21]

10

b Hiện tượng phát triển bùng nổ sinh khối VKL độc tại Việt Nam

Ở Việt Nam, nghiên cứu VKL độc mới được tiến hành trong hai thập niên trở lại đây Nhiều công bố ghi nhận sự phát triển bùng nổ của VKL trong hệ sinh thái nước ngọt ở nhiều thành phố và tỉnh thành khác nhau, như hồ Dầu Tiếng, Bình Dương [7], hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội [25, 26], hồ Núi Cốc, Thái Nguyên [27], hồ Xuân Hương, Đà Lạt [18], Sông Hương, Huế [28] Kết quả nghiên cứu cho thấy tại các hồ Ba Bể, Hồ Tây, Hồ Hoàn Kiếm, Hồ Thác Mơ, Hồ Núi Cốc, Hồ Láng, Hồ Dầu Tiếng, …đều quan sát thấy sự hiện diện của VKL độc chủ yếu là các loài thuộc

chi Microcystis [18] Tại các thủy vực nghiên cứu tại Hà Nội và một số tỉnh phía Bắc như Bắc Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Hà Tây, Hoà Bình và Hà Tĩnh, mật độ thực vật nổi (TVN) khá cao [1] Hàm

lượng chlorophyll a (là chỉ số sinh khối TVN dao động từ 0,17 g/L (hồ Sông Rác)

đến 5,43 µg/L (hồ Đại Lải) Mật độ VKL tại những hồ này thay đổi rất lớn phụ thuộc vào thời gian và địa điểm lấy mẫu khoảng 0,02 x103 TB/L (vào mùa khô, hồ Sông Rác) đến 3,121x103 TB/L (mùa khô, hồ Đồng Mô) Tỷ lệ VKL không độc, ví

dụ Spirulina, là không đáng kể trong quần thể VKL Tại những hồ đã khảo sát có

diện tích mặt nước lớn, ví dụ hồ Hòa Bình và hồ Núi Cốc hiện tượng nở hoa nước

thường gặp với hàm lượng chlorophyll a trung bình trong cả năm là 1,25 g/L và

1,05 g/L, tương ứng [1] (hình 1.3)

1.1.3 Các biện pháp kiểm soát phát triển bùng nổ sinh khối VKL độc

Các phương pháp để ngăn ngừa, giảm thiểu ảnh hưởng có hại của sự bùng phát sinh khối VKL độc có thể được phân loại theo các tiêu chí khác nhau như: (1) nơi áp dụng (nước mặt hoặc trầm tích); (2) mục đích tác động ( tác động gián tiếp thông qua giảm nồng độ các chất dinh dưỡng nitơ, photpho hoặc ức chế tiêu diệt trực tiếp các loài VKL); (3) đặc tính của các phương pháp (phương pháp cơ học- vật lý, phương pháp hóa học, phương pháp sinh học [19]

11

Hồ Xuân Hương, Đà Lạt Hồ Núi Cốc, Thái Nguyên (Ảnh

Hình 1.3 Một số hồ tiêu biểu ở Việt Nam bùng phát tảo nở hoa [1, 29]

1.1.3.2 Phương pháp vật lý

Thay đổi pH: Nghiên cứu cho thấy giá trị pH bằng 9, M aeruginosa có tốc độ

sinh trưởng tốt nhất, nhưng pH cao hơn có thể gây độc cho chính loài này và tại pH

là 5 làm sinh trưởng của M aerguginosa giảm rõ rệt Tuy nhiên sử dụng pH thấp để

kiểm soát bùng nổ vi tảo độc thì đồng thời cũng ảnh hưởng đến các loài sinh vật khác

[31] Dùng siêu âm: Sóng siêu âm với tần số lớn hơn 20 kHz được sử dụng để kiểm soát bùng nổ VLK M aeruginosa vì có thể gây ra sự tổn thương về cấu trúc và chức

năng tế bào [4, 32] Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là thân thiện với môi trường và có tính chọn lọc vì tác động đến các loài VKL thông qua hệ thống không bào khí làm cho tế bào không có khả năng nổi trên bề mặt, chìm xuống đáy Lee và cộng sự quan sát thấy khi sử dụng sóng siêu âm công suất 120 W, tần số 28 kHz sau

3 giây 80 % tổng số M aeruginosa bị chìm xuống, sau 30 giây lên đến 100 % Ngoài

ra sóng siêu âm còn có thể phân hủy độc tố microcystin - LR do M aeruginosa thải

ra môi trường từ đó hạn chế ảnh hưởng độc hại đến các loài xung quanh Nhược điểm của phương pháp này đó là cường độ siêu âm sử dụng trong phòng thí nghiệm khá cao, tốn kém khi triển khai ở thực tế với quy mô lớn và hiệu quả ức chế thấp vì 87 %

tế bào có thể phục hồi sau 60 giờ [4] Sử dụng ánh sáng cực tím: Tia cực tím đặc biệt

là tia cực tím sóng ngắn (UV-C tại bước sóng λ= 254 nm) [33] có hiệu quả cao trong việc

kiểm soát bùng nổ VKL M aeruginosa Tia UV-C gây ra những tổn hại nghiêm trọng

13

tế bào đặc biệt là cấu trúc phân tử ADN, ảnh hưởng đến quá trình sao chép và tổng

hợp protein Sakai cho rằng hầu hết các tế bào M aeruginosa bị chết sau 6 ngày khi bị

chiếu sáng với bức xạ UV-C 600 mJ/cm2 [34] Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là sự tác động không chọn lọc vì ánh sáng cực tím phá hủy cấu trúc tế bào không

chỉ đối với loài M aeruginosa mà còn với tất cả các tế bào sống khác trong hệ sinh thái nước ngọt

1.1.3.3 Phương pháp hóa học

Sử dụng hợp chất của kim loại: Các hợp chất muối nhôm (nhôm sunphat

Al2(SO4)3, nhôm clorit AlCl3, polime polyaluminum chloride) có thể ảnh hưởng đến VKL theo nhiều cách khác nhau như loại bỏ photpho, làm giảm chất dinh dưỡng trong môi trường từ đó gián tiếp tác động lên VKL, hoặc tác động trực tiếp do hình thành các hạt lơ lửng không tan gắn với VKL và sau đó lắng xuống đáy [35] Các muối sắt FeCl3, FeCl2, Fe2(SO4)3 được sử dụng rất rộng rãi để loại bỏ chất dinh dưỡng phốt pho trong nước mặt từ đó kiểm soát bùng nổ VKL Việc này được áp dụng ở hồ chứa Bautzen, Đức Trong những năm 1996, 1997, 113 và 99 tấn sắt bổ sung vào nước hồ

đã làm giảm phốt pho hòa tan trong nước hồ xuống 54 ÷ 72 % [36] Đồng là một trong những hợp chất diệt tảo thông dụng nhất, thường ở dạng đồng sunphat CuSO4 5H2O hoặc các sản phẩm thương mại như Cuprogarb 500, Cobre Sandoz BR, Clearigate, Cutrine-Plus [37] Nhược điểm chung của phương pháp này là tính không chọn lọc, ví dụ nghiên cứu chỉ ra tác động mạnh lên các loài sinh vật khác không

thuộc đối tượng tác động, đặc biệt loài Daphnia (48-h EC50 = 0,013 mg Cu/L), cá Danio rerio (48-h LC50 = 0,063 mg Cu/ L), sau đó là tảo lục Raphidocelis subcapitata

(IC50 48h = 0,119 mg Cu/L) Nhược điểm tiếp là sự lắng đọng và tích lũy kim loại này trong trầm tích Việc sử dụng lặp đi lặp lại để kiểm soát bùng nổ thực vật phù du có thể dẫn đến sự “nhờn thuốc”, làm phá vỡ tế bào VKL dẫn đến giải phóng độc tố mirocystin [38] hoặc làm giảm pH của nước hồ dẫn đến làm tăng tính độc của những kim loại khác trong môi trường axit [39] Sử dụng các hợp chất có tính oxi hóa mạnh: H2O2 là

một hợp chất oxi hóa mạnh, từ năm 1986 được áp dụng để kiểm soát bùng nổ vi tảo

Oscilatoria rubescens trong liền 3 thập kỉ do có ưu điểm nổi bật là hiệu quả diệt tảo

cao, dễ bị phân hủy thành nước và oxi, không gây ảnh hưởng phụ đến môi trường và

14

giá thành thấp Tuy nhiên, sự tác động không chọn lọc trên cá và trên Daphnia với tỉ

lệ gây chết 100 % sau 19 ngày phơi nhiễm tại nồng độ 2,5 ÷ 5,0 mg/L thấp hơn nồng

độ tối ưu để kiểm soát bùng nổ vi tảo là 6,6 mg/L [19] Nhược điểm thứ hai, thời gian tồn tại của H2O2 rất ngắn, dao động phụ thuộc vào nhiều yếu tố dẫn đến cần phải lặp lại nhiều lần gây tốn kém kinh tế Sử dụng hợp chất này với nồng độ cao còn gây nguy hiểm đến người sử dụng Năm 2013, Fan và cộng sự chứng minh rằng khi tiếp xúc với KMnO4 với nồng độ 5 mg/L trong vòng 6 giờ, 26 % tế bào VKL bị phá vỡ, độc tố microcystin bị phân hủy còn 16 µg/L sau 7 giờ xử lý, thấp hơn nhiều so với của mẫu đối chứng (44 µg/L) [40] Cơ chế tác động của KMnO4 là phá vỡ tế bào VKL kéo theo giải phóng độc tố microcystin và phân hủy độc tố nhờ tính oxi hóa mạnh O3 cũng được sử dụng vì tác động lên tế bào M aeruginosa bằng cách làm thay đổi tính thấm của màng tế bào dẫn đến làm tế bào chết, ví dụ khi xử lý bằng Ozôn với nồng độ tăng từ 2 mg/L đến 4 mg/L dẫn đến 32-41 % số tế bào bị phá vỡ [41] Nhược điểm của phương pháp này là sự ức chế không có tính chọn lọc, khi giải phóng độc

tố từ M aeruginosa có thể làm ảnh hưởng đến các loài sinh vật khác Sử dụng các hợp chất diệt cỏ: 2,4-D (2,4-dichlorophenoxiacetic axit) là hợp chất diệt cỏ trong

nông nghiệp đã được nghiên cứu để kiểm soát bùng nổ vi tảo độc M aeruginosa với giá trị IC50-96h là 71,20 mg/L [42] Sự phơi nhiễm 2,4-D ảnh hưởng đến hàm lượng

sắc tố quang hợp, thay đổi hoạt tính enzyme cũng như siêu cấu trúc tế bào M

aeruginosa từ đó làm giảm sinh khối rõ rệt Tuy nhiên hóa chất này lại làm tăng quá

trình tổng hợp độc tố microcystin Điều này gây bất lợi đến các loài sinh vật khác và liên quan đến sự ô nhiễm hợp chất diệt tảo trong môi trường nước Glyphosate (N-(phosphonomethyl) glycine) và Fenoxaprop-p-ethyl - hai chất diệt cỏ được áp dụng

để kiểm soát bùng nổ vi tảo độc trong hệ sinh thái nước ngọt [43] Nhưng các hóa chất diệt cỏ này lại gây ô nhiễm môi trường, sự tồn dư của chúng trong môi trường nước có thể gây lên ảnh hưởng không tốt cho những loài thủy sinh khác trong hệ sinh

thái nước ngọt Sử dụng vật liệu nano kim loại là một hướng mới trong nghiên cứu

kiểm soát ô nhiễm vi tảo độc Park và cộng sự chứng minh rằng vật liệu nano bạc được tổng hợp bằng phương pháp khử hóa học ức chế sinh trưởng chọn lọc đối với

VKL độc M aeruginosa tại nồng độ 1 mg/L với hiệu suất lên đến 87 % [44] Theo

15

nghiên cứu của Sankar [45] vật liệu nano đồng được sinh tổng hợp từ dịch chiết của

lá cây O vulgare ức chế sinh trưởng đến VKL M aeruginosa lên đến 89,7 % so với

mẫu đối chứng Vật liệu nano sắt Feo cũng là một hướng quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới Các hạt nano Feo có khả năng ức chế sinh trưởng hiệu quả, ngăn ngừa sự hình thành bùng phát VKL với giá trị EC50 là 50 mg/L do chúng có thể loại

bỏ phốt pho sinh học, phá hủy cấu trúc tế bào VKL, ngăn ngừa sự giải phóng microcystin từ đó gây chết tế bào [46] Mặc dù những ưu điểm của vật liệu nano được

kể trên, nhưng việc nghiên cứu và ứng dụng vật liệu nano kiểm soát bùng nổ tảo nở hoa cần được nghiên cứu toàn diện và cẩn thận do độc tính và tính chất của vật liệu nano trong thực tế còn bị ảnh hưởng bởi rất nhiều các yếu tố khác như khả năng giải phóng và hòa tan ion kim loại trong nước, khả năng hòa tan các hợp chất hữu cơ, khả năng tích tụ trong môi trường và trong các cơ thể sống [47, 48]

1.1.3.4 Phương pháp sinh học

Dùng chế phẩm vi sinh vật cạnh tranh dinh dưỡng: Vi sinh vật hữu ích thường được sử dụng bao gồm một số loài như: Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus; Lactobacillus casei; Lactobacillus rhamnosus; Lactobacillus bulgaricus, Carnobacterium, Vibrio alginolyticus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis; Bacillus megaterium; Bacillus polymyxa, Actinomycetes, Nitrobacteria, Nitrosomonas [1] Kiểm soát bùng nổ thông qua động vật phù du sử

dụng VKL làm nguồn thức ăn bao gồm các động vật nguyên sinh, giáp xác và rất

nhiều các động vật nhỏ Khi bổ sung động vật phù du (Daphnia magna, Ceriodaphnia Bosmina sp và Daphnia similis) khiến mật độ các loài VKL trong mẫu giảm mạnh từ đó góp phần kiểm soát bùng phát sinh khối [49] Cơ chế ức chế cảm nhiễm giữa các loài sinh vật: Ức chế cảm nhiễm là mối quan hệ giữa các loài trong

quần xã, trong đó một loài trong quá trình sinh trưởng tiết ra các hoạt chất kìm hãm

sự sinh trưởng và phát triển của loài khác Các chất ngoại bào của vi sinh vật loài

Aeromonas sp strain FM [50] là một ví dụ có thể gây ra những ức chế sinh trưởng

lên M aeruginosa Cao chiết, dịch chiết và hoạt chất diệt tảo có nguồn gốc thực vật: Thực vật dưới nước như Stratiotes aloides [51], Myriophyllaceae spicatum [52],

16

Phragmites communis [53], Ceratophyllum demersum và Najas marina sp Intermedia [54] ức chế tốt quá trình sinh trưởng VKL Ngoài ra, cao chiết từ các loài thực vật trên cạn như các loài thuộc họ Papaceraceae [55], Rutaceae [56], [57], Apiaceae [58], Asteraceae và Ephedraceae [59] được chứng minh có hiệu quả cao trong quá trình kiểm soát bùng nổ VKL Những nghiên cứu bắt đầu từ những năm

1990 tới nay chứng minh tiềm năng sử dụng các hoạt chất diệt tảo có nguồn gốc tự nhiên và có thể triển khai ở quy mô lớn, tuy nhiên để có thể đưa vào thực tế và giải quyết bài toán kinh tế thì vẫn còn đối mặt với nhiều thách thức và khó khăn [60]

Vấn đề này sẽ được tác giả luận án trình bày và phân tích kỹ ở phần 1.2

1.1.3.5 Các phương pháp kiểm soát bùng phát VKL độc tại Việt Nam

a Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

Năm 2010, Nguyễn Thị Hoài Hà và cộng sự đã nghiên cứu khả năng phân giải

độc tố của Microcystis sp bằng vi khuẩn Sphingomonas saccharolytica N7 được phân

lập từ hồ Hoàn Kiếm [26] Kết quả cho thấy Sphingomonas asaccharolytica N7 có

hoạt tính phân giải microcystin tương đối tốt Thời gian bán phân hủy đối với nồng

độ microcystin ban đầu 10 μg/L của chủng Sphingomonas N7 là 3, 4 giờ Tuy nhiên

nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm mà chưa nghiên cứu sự phân hủy độc tố ở mẫu nước hồ tự nhiên Năm 2013, Nguyễn Tiến Đạt và cộng sự đã

chứng minh cao chiết từ cây Mần tưới có độc tố chọn lọc lên VKL M aeruginosa

Nhưng tác giả chưa khảo sát ảnh hưởng của cao chiết thực vật đến các loài sinh vật khác trong môi trường, chưa đánh giá ảnh hưởng lên các thông số thủy lý, thủy hóa

của mẫu nước cũng như chưa lý giải cơ chế ảnh hưởng của cao chiết lên tế bào M aeruginosa Sử dụng vật liệu nano để kiểm soát bùng nổ vi tảo độc M aeruginosa

được Dương Thị Thủy và cs triển khai trong quy mô phòng thí nghiệm năm 2015 [61] Nhóm nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của nano bạc, nano đồng, nano

titandioxit và nano sắt lên sinh trưởng của M aeruginosa Kết quả cho thấy nano đồng tại nồng độ 1 mg/L có khả năng ức chế sinh trưởng chọn lọc lên đối tượng M aeruginosa so với Ch vulgaris Mặc dù vậy nghiên cứu cũng chưa đánh giá toàn diện

về mức độ an toàn sinh thái của vật liệu lên các đối tượng khác trong môi trường Hoặc sử dụng các loài thực vật như Bèo tây, Rau muống, Bèo tấm, Ngổ…để hạ hàm

17 lượng nitơ hoặc phốt pho trong nước có thể dẫn đến hiện tượng phú dưỡng của thủy vực từ đó gián tiếp kiểm soát bùng phát sinh khối VKL [62]

1.1.4 Phương pháp triển khai áp dụng ngoài thực tế tại các ao, hồ Việt Nam

Tại Việt Nam, nhiều phương pháp khác nhau đã được áp dụng để kiểm soát bùng nổ sinh khối VKL Phương pháp xử lý ban đầu là dùng vợt vải màn, vớt váng tảo chết, mỗi lần vớt có thể thu được từ 6-8kg, sau đó được đem chôn xuống đất và dùng vôi bột để khử trùng Thời gian đầu các nhà môi trường đã sử dụng hoạt chất đồng CuSO4 để diệt tảo, nhưng gây ảnh hưởng đến các loài khác nên sau đó hạn chế Tại Đà Lạt, năm 2010 áp dụng phương pháp thay nước ở hồ Xuân Hương để

xử lý tảo độc nhưng gây lãng phí tài nguyên nước, phá hủy hệ thủy sinh tự nhiên, ảnh hưởng đến các trầm tích trong hồ [63] Tại Hà Nội, Hồ Hoàn Kiếm hay còn gọi

là Hồ Gươm được các nhà quản lý và các nhà môi trường quan tâm hơn cả vì là nơi cung cấp nước, điều hòa không khí cho thành phố, đồng thời là nơi gắn liền với truyền thuyết văn hóa của người Việt Trong những năm gần đây, gia tăng các chất dinh dưỡng đã khiến nơi đây thường xuyên xảy ra hiện tượng bùng nổ tảo, trong đó

phổ biến là các nhóm loài VKL (chiếm đến 80-90%) trong đó chi Microcytis chiếm

tỉ lệ cao nhất, số lượng tế bào chi tảo Scenedesmus và các chi khác ngành tảo lục và

tảo mắt, tảo silic chiếm tỉ lệ không đáng kể (nhỏ hơn 1%) [25, 26, 64] Theo công

bố của Dương Thị Thủy và cộng sự, thành phần loài của chi Microcystis trong hồ Hoàn Kiếm rất đa dạng tập trung các loài như Microcystis botrys; Microcystis wessenbergii; Microcystis flos-aquae; Microcystis viridi s , M aeruginosa (Hình

1.4) Hai dạng Microcystin MC-RR, MC-LR được xác định trong các mẫu nước với nồng độ khá cao dao động từ 2,08 đến 46,00 µg MC/L và mẫu nước nở hoa đạt 0,11-0,18 µg MC/mg khối lượng khô

18

Hình 1.4 Thành phần loài Microcystis trong hồ Hoàn Kiếm (a-e) dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 200 lần); (f) dưới kính hiển vi huỳnh quang (độ phóng đại

1000 lần); a Microcystis botrys; b Microcystis wessenbergii; c Microcystis

flos-aquae; d Microcystis viridis; e và f Microcystis aeruginosa [65]

Năm 2009, trong khuôn khổ hợp tác khoa học Việt - Đức, thành phố Hà Nội đã tiến hành việc hút bùn thử nghiệm tại hồ Hoàn Kiếm nhằm cải thiện môi trường nước

hồ, loại bớt VKL độc và tạo điều kiện tốt hơn cho loài rùa quý hiếm sinh sống [1] Năm 2011, sử dụng sóng siêu âm bằng thiết bị Z9i-S100 đặt ngầm dưới mặt nước hồ Gươm vận hành liên tục trong 14 ngày đêm làm cho VKL chết hàng loạt, nổi thành từng đám trên mặt hồ và sau đó lắng xuống đáy hồ Tuy nhiên phương pháp này chỉ

19

“tảo nở hoa” và tạo lớp váng tảo trên bề mặt rõ nhất vào thời điểm tháng 6 khi đó

mật độ tập đoàn Microcystis lên đến (17,17 ± 3,81) × 103 tập đoàn/mL Tuy nhiên hiện thành phố cũng chưa có những biện pháp cải tạo phù hợp

Hình 1.5 Các loài Microcystis ở hồ Láng (A-F) A - Microcystis aeruginosa Kützing, B - Microcystis flos-aquae (Wittrock) Kirchner, C - Microcystis novacekii (Komárek) Compère, D - Microcystis smithii Komárek & Anagnostidis, E - Microcystis viridis (Braun) Lemmermann, F - Microcystis wesenbergii (Komárek)

Komárek ex Komárek

Năm 2012, xử lý ô nhiễm hồ Trúc Bạch, Hà Nội được Bộ Khoa học và Công nghệ tài trợ Quy trình xử lý nước hồ và bùn đáy bao gồm các công nghệ hoạt hóa nước, sử dụng thực vật thủy sinh, các chất khoáng hoạt hóa, chế phẩm diệt vi tảo, chế phẩm vi sinh và khuyến khích cộng đồng cùng tham gia Điểm nổi trội của dự án là

sử dụng các công nghệ thân môi trường [1] Năm 2017, hồ Hoàn Kiếm Hà Nội đã được nạo vét toàn bộ bùn ở để giảm hàm lượng dinh dưỡng trong hồ, từ đó dẫn đến hạn chế sự bùng nổ tảo tuy nhiên lại làm ảnh hưởng đến hệ thực vật trong hồ Trồng các loài thực vật thủy sinh (bèo tây, bèo cái, rau muống, bèo tấm, cải xoong ) là

20

phương pháp khác để loại bỏ các chất hữu cơ, chất rắn và tác nhân gây bệnh, ngoài

ra sinh khối thực vật có thể được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi, sản xuất phân bón hoặc làm nguyên liệu cho sản xuất etanol nhiên liệu Nhưng sự phát triển mạnh của các loài thực vật thủy sinh trong điều kiện dinh dưỡng và nhiệt độ tối ưu lại đặt ra những bài toán môi trường nếu không được kiểm soát tốt Xử lý nước hồ có thể bằng

vi sinh vật hữu hiệu Dưới tác động của vi sinh, mùi hôi thối sẽ được giảm đáng kể

và cải thiện điều kiện nuôi trồng thủy sản cho hồ mà không phải nạo vét, thay nước

hồ Năm 2013, Viện Công nghệ môi trường - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam chủ trì thực hiện Dự án xây dựng mô hình xử lý ao hồ bị ô nhiễm do nước thải sinh hoạt và chăn nuôi ở vùng nông thôn bằng chế phẩm vi sinh (Biomix 2) sinh tại Hà Nam Sau hơn 1 năm triển khai dự án kết quả cho thấy, nước các ao, hồ đã trong xanh trở lại, không còn mùi hôi, các kim loại nặng đã được xử lý, diệt được VKL độc và các vi sinh vật gây bệnh [66] Tuy nhiên để có thể thành công bằng việc

dùng chế phẩm, cần phải kết hợp đồng thời nhiều phương pháp khác như nạo vét lòng

hồ, sục khí bổ sung khí O2 và thiết kế các bè thủy sinh Ngoài ra thời gian áp dụng còn ngắn, chưa đánh giá được tính hiệu quả lâu dài và ảnh hưởng đến các loài sinh vật khác Các phương pháp nói chung vẫn trong thời gian thử nghiệm và chưa kiểm chứng sự tác động với môi trường thủy sinh Vì thế trong nhiều năm nay, bài toán giải quyết dứt điểm hiện tượng “tảo nở hoa” tại các thủy vực Việt Nam vẫn chưa có

lời giải hiệu quả

1.2 Sử dụng cao chiết thực vật và hoạt chất thiên nhiên để kiểm soát bùng nổ VKL độc

1.2.1 Hoạt tính sinh học của cao chiết và các hợp chất thiên nhiên

Trong vòng hai thập kỉ gần đây, xu hướng quay lại sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên bao gồm các hợp chất của phenolics, carotenoid, anthocyanin

và tocopherols để phòng, trị bệnh, chăm sóc sức khỏe trong mỹ phẩm làm đẹp, để kháng khuẩn và kháng nấm trở nên phổ biến [67] Các loài thực vật có thể tạo ra một lượng lớn hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học đa dạng, là nguồn nguyên liệu phong phú cung cấp các chất chống oxy hóa, như các hợp chất vitamin A, C, E và phenolic

21 như flavonoid, tannin và lignin [68] Những hoạt chất này giúp giảm tổn thương và kìm hãm quá trình oxy hóa trong thực phẩm bằng cách trì hoãn hoặc ức chế quá trình oxy hóa gây ra bởi các gốc tự do chứa oxy Beta carotene, axit ascorbic và nhiều phenolics đóng vai trò quan trọng trong việc trì hoãn lão hóa, giảm viêm và ngăn ngừa một số bệnh ung thư Ngoài ra các hợp chất sinh học phân lập từ thực vật còn

có tính kháng khuẩn, chống đông máu, chống oxy hóa, chống ung thư Theo các nghiên cứu được công bố hoạt tính sinh học của các cao chiết, các hợp chất hóa học

từ thực vật phụ thuộc vào nhiều yếu tố như dung môi tách chiết, công nghệ tách chiết, phân lập chất sạch, nhiệt độ, ánh sáng…

Ảnh hưởng của dung môi

Các nhà khoa học đã chứng minh ảnh hưởng của các dung môi lên quá trình tách chiết, phân lập các hợp chất hóa học từ các phần khác nhau của thực vật (thân,

rễ, lá) do đó ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học như khả năng diệt khuẩn, diệt nấm hoặc điều trị các tế bào ung thư [69-71] Ví dụ dung môi axetone và dung môi N, N dimethylformamide (DMF) phù hợp để chiết xuất các hợp chất chống oxy hóa trong khi dung môi metanol hiệu quả hơn khi tách phân lập các hợp chất phenol từ quả óc chó [67]. Hoặc cao chiết etanol của của cây Ivorian phân lập các hợp chất phenolics

với hàm lượng hơn so với cao chiết khác trong dung môi axetone, cồn và metanol [72] Theo Qiao phân đoạn etyl axetat ức chế sinh trưởng mạnh các vi sinh vật, đặc

biệt là Pseudomonas aeruginosa và Bacillus subtilis (với nồng độ ức chế thấp nhất

ghi nhận là 125 μg/mL và 62,5 μg/mL), trong khi phân đoạn cồn và dầu hỏa, nước thì chỉ đạt được mức gây ức chế trung bình và yếu [70]

Quy trình công nghệ tạo cao chiết và tinh sạch các hợp chất từ thực vật

Lựa chọn quy trình công nghệ và các phương pháp để tinh sạch hợp chất từ thực vật là một nhiệm vụ quan trọng trong hóa học các hợp chất thiên nhiên để thu được hiệu xuất tổng hợp cao cũng như tìm kiếm được các hoạt chất quý hiếm Bên cạnh đó loại bỏ dung môi còn tồn đọng trong cao chiết là khâu quan trọng góp phần giảm ảnh hưởng độc hại của dung môi trong mẫu khi tiến hành thực nghiệm, đặc biệt là các thử nghiệm về độc tính trên các loài sinh vật Ngày nay, máy cô quay chân không thường được sử dụng rộng rãi để loại bỏ dung môi khỏi cao chiết bằng phương pháp bay hơi

Nhiệt độ

Trong nhiều nghiên cứu, cao chiết cần phải bảo quản ở nhiệt độ thấp đến 40C [55] hoặc thấp hơn -5 đến -10 0C cho đến khi sử dụng trong thực nghiệm [75] Dưới ảnh hưởng của nhiệt độ cao, cao chiết có thể bị phân hủy và mất hoặc yếu đi hoạt tính kháng khuẩn Theo Gibson và cộng sự [76] khi mẫu rơm được xử lý nhiệt bằng cách

hấp thanh trùng thì không còn khả năng ức chế sinh trưởng của M aeruginosa Tương

tự, Yan xử lý mẫu cao chiết từ rễ cây Ephedra equisetina tại nhiệt độ 35 0C trong thời gian 7 ngày không quan sát thấy sự khác biệt giữa các mẫu thực nghiệm và mẫu đối chứng (p>0,05) [59]

Ánh sáng

Ánh sáng ảnh hưởng đến cấu trúc của các hợp chất thiên nhiên từ đó ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của chúng [59] Các cao chiết thực vật thường được bảo quản trong bóng tối, tránh ánh sáng hoặc ánh nắng tác động trực tiếp [55]

1.2.2 Nghiên cứu điển hình sử dụng cao chiết, dịch chiết thực vật kiểm soát bùng phát VKL độc

1.2.2.1 Dịch chiết từ rơm lúa mạch Hordeum vulgare

Nghiên cứu sử dụng rơm lúa mạch (Hordeum vulgare) như một hoạt chất diệt tảo,

kiểm soát sự bùng phát sinh khối thực vật phù du được triển khai từ đầu những năm

1990 Gibson và cộng sự sử dụng dịch chiết phân hủy rơm lúa mạch để ức chế sinh

trưởng của các loài Cladophorag lomerata, Chlorella vulgaris và Selenastrum capricornutum với hiệu quả ức chế lên đến 63 % sau 6 tháng triển khai tại 20 0C [76] Khi mẫu rơm được xử lý nhiệt bằng cách hấp thanh trùng, tác giả không quan sát thấy khả năng ức chế Nguyên nhân gây ra sự ức chế sinh trưởng theo Gibson là do các hợp hợp chất phenolic đặc biệt là tannin được giải phóng ra từ quá trình phân hủy

23

yếm khí rơm Tuy nhiên, Pillinger phản biện cho rằng 3 loài nấm như Pycnidiophora dispersa Clum (IMI 346597) và Z leucotricha (Speg.) Mall & Cain, Cladorrhinumfoecundissimum Sacc & Marchal được sinh ra trong quá trình phân hủy

hiếu khí rơm là nguyên nhân chính gây ra sự ức chế này [77] Năm 1993, Jonathan lặp

lại thí nghiệm trên M aeruginosa dưới tác dụng của dịch chiết phân hủy rơm ghi nhận

hiệu quả ức chế lên đến 95 % khi dùng 2,57 g sinh khối khô/m3 [78] Theo Jonathan và Pillinger, các hợp chất phenolic như axit p-coumaric, axit ferulic, axit tannic, đặc biệt là các hợp chất quinones như 2,6-dimethoxyphenol,2,6-dimethoxy-p-benzoquinon đóng

vai trò quan trọng tạo nên hoạt tính diệt khuẩn của mẫu rơm Năm 1996, Everall triển khai thử nghiệm dịch chiết rơm lên mẫu nước hồ thực tế với tỉ lệ 25 g/m3 và bước đầu ghi nhận những kết quả khả quan Thực nghiệm cũng khẳng định việc ứng dụng dịch chiết rơm lên mẫu nước hồ không làm ảnh hưởng đến chất lượng của nguồn nước cũng như ổn định các điều kiện lý hóa của hệ sinh thái [79]

Tuy nhiên năm 2003, Boylan chứng minh những hạn chế của phương pháp này như hiệu quả ức chế chỉ quan sát được sau 8-9 tuần triển khai, những tuần sau sinh khối thực vật phù du tiếp tục tăng mạnh đến tuần thứ 14 thì không còn quan sát được vai trò ức chế của dịch chiết [80] Ngoài ra trong suốt 12 tuần tác giả không quan sát thấy sự khác biệt sinh khối thực vật phù du giữa hai mẫu thực nghiệm bổ sung rơm với tỉ lệ 15 và 60 g/m3 Sự khác biệt hiệu quả ức chế của dịch chiết rơm so với kết quả của Everall, là do hàm lượng oxy hòa tan trong mẫu vì oxy đóng vai trò quan trọng thúc đẩy quá trình phân hủy rơm lúa mạch [79] Khi hàm lượng oxy hòa tan thấp đã làm giảm hiệu quả ức chế sinh trưởng của rơm lúa mạch lên các loài thực vật phù du Ferrier và cộng sự triển khai mẫu dịch chiết lên 12 loài VKL nước ngọt Các tác giả này thu được ba nhóm kết quả khác nhau như ức chế mạnh lên sinh trưởng cả

ba loài VKL độc nước ngọt trong đó có loài M aeruginosa, nhưng lại kích thích sinh

trưởng hoặc không thể hiện ảnh hưởng ức chế lên đối tượng khác Triển khai với 6 mẫu nước hồ tự nhiên, Ferrier và cộng sự cho rằng không có sự khác biệt giữa mẫu đối chứng và mẫu thực nghiệm và kết luận rằng dịch chiết của rơm lúa mạch không

có hiệu quả để kiểm soát bùng nổ sinh khối TVN trong các hệ sinh thái [81]

24 Năm 2009, Timothy tiến hành thực nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng lên sinh

trưởng VKL độc M aeruginosa của 3 loại cao chiết nước từ rơm lúa mạch được tạo

ra ở các điều kiện khác nhau về dung môi và thời gian ngâm chiết [82] Kết quả cho

thấy cả ba loại cao chiết đều vẫn thể hiện sự ức chế lên M aeruginosa với nồng độ

rất cao là 1720, 2400 và 3030 mg/L Tác giả cho rằng thời gian ngâm và dung môi chiết không làm ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của dịch chiết, đồng thời khẳng định vai trò của các hợp chất phenolic với khối lượng phân tử dao động từ 1000 đến 3000

Da trong hiệu quả diệt VKL Mặc dù rơm lúa mạch là đối tượng được nghiên cứu chi tiết và toàn diện nhất trong một thời gian dài bởi nhiều nhà khoa học khác nhau, nhưng các kết quả nghiên cứu được công bố còn chưa có sự thống nhất về hoạt tính

ức chế lên M aeruginosa, chưa đưa ra sự giải thích thỏa đáng về cơ chế tác động của

cao chiết lên tế bào VKL cũng như những ảnh hưởng đến các thông số thủy hóa và thủy lý của môi trường.chưa được nghiên cứu

1.2.2.2 Cao chiết từ rơm lúa gạo Oryza sativa

Rơm lúa gạo cũng là một đối tượng được các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu như một tác nhân phòng chống bùng nổ VKL độc, đặc biệt là ức chế sinh trưởng

M aeruginosa Park và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết metanol của rơm lúa gạo lên sinh trưởng của M aeruginosa với các nồng độ khác nhau từ 0,1

đến 10 mg/L, đồng thời đánh giá hoạt tính diệt tảo của 7 hợp chất hóa học (nồng độ 0,01 và 0,1 mg/L) được phân lập từ rơm trong 8 ngày thực nghiệm [75] Kết quả chứng minh hiệu quả ức chế sinh trưởng của cao chiết lên đến 98 % tại nồng độ 10 mg/L và axit salicylic có hoạt tính diệt tảo cao nhất so với các chất còn lại, sự trộn lẫn các hợp chất ví dụ như axit p-coumaric, axit salicylic và axit benzoic với nồng

độ 0,01 mg/L gây ức chế đến 60 %, cao hơn hẳn so với sự ức chế sinh trưởng VKL của từng chất riêng lẻ Sự ảnh hưởng của cao chiết lên các tế bào VKL ở dạng đơn

lẻ mạnh mẽ hơn khi VKL tồn tại dưới dạng các tập đoàn M aeruginosa [83]

Về tính an toàn sinh thái khi sử dụng cao chiết rơm như hoạt chất diệt tảo, Park

và cộng sự đã chứng minh cao chiết O sativa thể hiện sự ức chế có chọn lọc lên loài

VKL độc so với các loài khác không thuộc đối tượng tác động như tảo lục

(Ankistrodesmus convolutus và Scenedesmus quadricauda) và giáp xác (Daphnia

25

magna) thể hiện tính thân thiện và hứa hẹn sử dụng như một hoạt chất diệt tảo tiềm năng [84] Các hoạt chất hóa học phân lập từ cao chiết của O sativa cũng được các nhà khoa học quan tâm và đánh giá hiệu quả ức chế lên M aerugionsa Ateeque và

cộng sự đã thử nghiệm 5 chất sạch (nồng độ 1, 10 và 100 mg/L) lên sinh trưởng của

M aeruginosa và ghi nhận hiệu quả ức chế cao nhất 92,6 % tại nồng độ 100 mg/L

của hoạt chất oleioyl-β-D-arabinoside sau 6 ngày thực nghiệm [85] Tuy nhiên kết quả triển khai thử nghiệm cao chiết rơm lúa gạo lên các mẫu nước hồ tự nhiên cũng như triển khai thử nghiệm quy mô ngoài trời cũng chưa được công bố Các tác giả cũng chưa đưa ra được cơ chế tác động của cao chiết rơm lúa mạch cũng như của các

hoạt chất lên sinh trưởng của M aeruginosa

1.2.2.3 Cao chiết nước từ các loài cây họ Anh túc Papaveraceae

Mặc dù nghiên cứu về hiệu quả sử dụng cao chiết từ các loài cây họ

Papaveraceae lên sinh trưởng M aeruginosa không được nhiều nhà khoa học quan

tâm như hai đối tượng trên, tuy nhiên kết quả nghiên cứu khả quan và toàn diện của

Jancula và cộng sự năm 2007 [55] trở thành một ví dụ tiêu biểu cho phương pháp ứng dụng cao chiết thực vật để kiểm soát sự bùng nổ thực vật phù du nói chung và sinh

trưởng M aeruginosa nói riêng trong các hệ sinh thái nước ngọt Cao chiết nước của

rễ 5 loài cây Anh túc có khả năng kiểm soát tốt quá trình sinh trưởng của M

aeruginosa với giá trị EC50 dao động từ 57,11 đến 870,92 mg/L, trong đó là hai loài

Dicranostigma lactucoides (EC50 55,81 mg/L) và Chelidonium majus (EC50 57,11

mg/L) có tính kháng VKL tốt nhất tiếp theo là các loài Sanguinaria canadensis (EC50

122,01 mg/L, Stylophorum lasiocarpum (EC 50 161,69 mg/L) và Macleaya

microcarpa (EC 50 870,92 mg/L)

Để đánh giá độ an toàn sinh thái khi sử dụng cao chiết như hoạt chất diệt tảo cụ thể nghiên cứu sự tác động của cao chiết lên các loài sinh vật khác, hai loài tảo

Pseudokirchneriella subcapitata và Scenedesmus quadricauda, động vật phù du

Daphnia magna và bèo tấm Lemna minor được lựa chọn Đây là những loài sinh vật

có lợi rất nhạy cảm với sự ô nhiễm của môi trường và là đối tượng được sử dụng trong nghiên cứu đánh giá độc chất Trong 5 loại cao chiết từ 5 loài cây họ Anh túc

Papaveraceae nói trên, cao chiết từ C majus được quan tâm hơn vì độc tính của

26

chúng lên tảo P subcapitata, S quadricauda thấp hơn so với VKL với giá trị EC50

ghi nhận là 60,87 và 78,01 mg/L [84] Cao chiết C majus cũng ít độc hơn lên D magna với giá trị EC50> 500 mg/L sau 24 và 48 giờ phơi nhiễm và ít độc hơn lên L

minor với giá trị EC50 là 448,69 mg/L

Dựa vào các kết quả nghiên cứu trên, Jancula và cộng sự đã lựa chọn cao chiết

từ C majus để triển khai thử nghiệm với mẫu nước đầm thực tế trong điều kiện tự

nhiên để đánh giá ảnh hưởng ức chế của các cao chiết này lên nhóm TVN trong đó

Actinastrum sp., Dictyosphaerium sp., Mougotia sp., Nitzschia sp., Planktothrix agardhii là những loài chiếm ưu thế Sau 10 ngày thí nghiệm, tính theo phương pháp

đo hàm lượng chlorophyll a, giá trị EC50 của cao chiết lên thực vật phù du là 87,71 mg/L, cao hơn với giá trị EC50 trên VKL và vi tảo Để giải thích nguyên nhân gây ra

sự ức chế sinh trưởng của cao chiết các loài cây Họ Anh túc lên VKL, nhóm tác giả

đã tiến hành phân tích thành phần và tỉ lệ các alkaloids có trong 5 loại cao chiết Thực nghiệm cho thấy magnoflorine và coptisine được tìm thấy với tỉ lệ cao nhất trong cao

chiết của C majus với hiệu suất là 0,345 và 1,372 % theo sinh khối khô Các hợp chất

enzo[c]phenanthridine alkaloids này có thể là nguyên nhân gây ra khả năng ức chế

sinh trưởng M aeruginosa

Mặc dù nhóm tác giả đã lựa chọn được cao chiết C majus trong 5 cao chiết thử

nghiệm vì tiềm năng diệt VKL độc và an toàn đối với các loài khác trong môi trường,

đã phân tích thành phần hóa học để giải thích hoạt tính diệt khuẩn của các cao chiết này, tuy nhiên tác giả chưa đánh giá được ảnh hưởng của cao chiết đến các thông số môi trường khi áp dụng ở quy mô nước đầm hồ tự nhiên, chưa đánh giá ảnh hưởng

của cao chiết lên siêu cấu trúc tế bào M aeruginosa để đưa ra cơ chế giải thích ảnh

hưởng của cao chiết phù hợp

1.2.2.4 Cao chiết từ cây keo Acacia mearnsii

Năm 2012, Zhou và cộng sự nghiên cứu cao chiết từ cây keo đen để kiểm soát

sự bùng nổ VKL và các loài thực vật phù du trong mẫu nước hồ thực tế [86] Mô hình nghiên cứu được triển khai dưới hai hình thức – mô hình thí nghiệm thời gian ngắn – đánh giá vai trò của cao chiết ức chế bùng nổ VKL trong trường hợp khẩn cấp (1 tháng) và mô hình thí nghiệm thời gian dài (1 năm) - đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lên chất lượng môi trường nước cũng như hiệu quả kiểm soát bùng nổ vi tảo độc

27

trong thời gian dài Kết quả chỉ ra rằng, trong mô hình thí nghiệm ngắn, bổ sung 3,623 mg/L cao chiết một lần duy nhất trong ngày đầu tiên dẫn đến sự giảm đáng kể mật độ

tế bào và hàm lượng chlorophyll a của VKL sau thời gian 17 ngày Hiệu quả ức chế

giảm dần, sau 11 ngày hiệu quả ức chế là 59 % và giảm xuống còn 38% sau ngày thứ

14 thực nghiệm Theo tác giả điều này có liên quan đến việc tự phân hủy của các cao chiết theo thời gian Nồng độ lúc đầu của cao chiết cây keo đen trong nước sạch là 2 mg/L sau 3 ngày tốc độ phân hủy sinh học là 26 %, sau 6 ngày là 45 %, đến ngày thứ

15 là 80 % Trong mô hình thí nghiệm thời gian dài, cao chiết được bổ sung hằng tuần 1-2 mg/L để đảm bảo cao chiết có trong mẫu trong suốt quá trình thực nghiệm Kết quả cho thấy cao chiết có khả năng kiểm soát bùng nổ VKL độc rất hiệu quả đặc biệt là ở những giai đoạn đầu

Ngoài ra ảnh hưởng lên các loài động vật phù du và thực vật phù du cũng được nghiên cứu đồng thời Trong giai đoạn đầu có sự tăng rất mạnh sinh khối của các

chủng tảo đặc biệt chiếm ưu thế của Pseudanabaenaceae, Cryptophyceae và Navicula,

sau đó mật độ tế bào giảm dần Sau hai tuần bổ sung cao chiết vào mẫu nghiên cứu, các loài động vật phù du cỡ nhỏ (< 1mm) cũng suy giảm mạnh số lượng chỉ còn bằng 2,4 % so với số lượng ban đầu Tuy nhiên các loài động vật phù du cỡ lớn lại gia tăng

mạnh sinh khối, đặc biệt bộ Calanoida chiếm ưu thế, tăng đến 681% tại thời điểm

cuối thực nghiệm Các thông số của môi trường cũng bị ảnh hưởng bởi cao chiết thực vật, đặc biệt là giá trị pH

1.2.2.5 Cao chiết từ rễ cây Ephedra equisetina

Yan cho rằng cao chiết nước rễ cây E equisetina ức chế có hiệu quả lên sinh trưởng của thực vật phù du trong đó loài M aeruginosa chiếm ưu thế [59] Ở mẫu

đối chứng, hàm lượng chlorophyll a tăng lên từ 670 đến 1360 µg/L trong khi ở các

mẫu thực nghiệm có bổ sung cao chiết (nồng độ 10, 25, 50 và 75µg), giá trị này giảm dần từ 670 xuống 150 µg/L sau 5 ngày thực nghiệm Ảnh hưởng của cao chiết đến chất lượng nước hồ tự nhiên, đặc biệt lên các thông số thủy hóa, không thấy có sự khác biệt lớn giữa mẫu đối chứng và thực nghiệm (p>0,05): giá trị trung bình ghi nhận nitơ tổng (TN) (6,45 mg/L), photpho tổng (TP) (0,65 mg/L), tổng photphat hòa

28 tan (TDP) (0,23 mg/L), hàm lượng nitrat (NO3-N) (1,77 mg/L) và hàm lượng amoni (NH4-N) là 2,69 mg/L

Nhóm tác giả cũng đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lên quần thể cá trong mẫu nước hồ tự nhiên Dưới tác động của cao chiết, tỉ lệ sống sót và sinh sản của cá giữa mẫu đối chứng và thực nghiệm không có sự khác biệt lớn (p<0,05) Quan sát tương

tự trên đối tượng động vật phù du, thực vật bậc cao và vi khuẩn, mật độ tế bào của các loài còn cao hơn so với mẫu đối chứng mà nguyên nhân theo tác giả là từ việc

giảm mật độ của M aeruginosa, cũng như giảm nồng độ độc tố microcystin khi sử

dụng cao chiết dẫn đến làm sạch, trong môi trường nước taọ điều kiện cho các loài khác phát triển Ngoài ra, chỉ số đa dạng các loài cũng chứng minh rằng hệ sinh thái thủy sinh phục hồi đến một trạng thái tương đối ổn định và khỏe mạnh sau khi xử lý

bằng cao chiết E equisetina Thử nghiệm ảnh hưởng của cao chiết từ E equisetina lên sinh trưởng của M aeruginosa dưới ánh sáng (8000 ± 200 lux) và nhiệt độ cao (350C) trong 7 ngày Kết quả không quan sát thấy sự khác biệt giữa các mẫu thực nghiệm và mẫu đối chứng (p>0,05) Điều đó chứng minh rằng các hoạt chất trong

cao chiết có tác dụng diệt M aeruginosa đã bị phân hủy dưới điều kiện ánh sáng và

nhiệt độ cao Đặc biệt đối với các hoạt chất có nhóm hydroxyl gắn với C-3 của vòng benzene

Sau khi bổ sung cao chiết, đã quan sát thấy xác tế bào VKL lắng đọng ở đáy bình thí nghiệm Dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), các thành tế bào của

M aeruginosa vẫn còn nguyên vẹn trong cả mẫu đối chứng và mẫu thực nghiệm Tuy

nhiên, trong các mẫu thực nghiệm, màng thylakoid bị tách ra khỏi tế bào chất của VKL Các cấu trúc bên trong màng thylakoid bắt đầu bị tổn thương Điều này gợi ý rằng cái chết của VKL là do ''tấn công hóa học'' bởi các hợp chất flavonoid trong cao chiết đã đi qua màng tế bào gây tổn thương bên trong hơn là tác động tổn thương về mặt cơ học như các tia UV

1.2.2.6 Cao chiết từ các cây thuộc họ Myriophyllaceae

Nakai và cộng sự đã phân lập các hoạt chất từ cao chiết cây M spicatum và đánh giá ảnh hưởng của chúng lên sinh trưởng của M aeruginosa [87] Nhóm tác giả

phân lập được các hợp chất polyphenol như axit gallic (EC50 1,0 mg/L) và axit pyrogallic (EC50 0,65 mg/L) có khả năng hòa tan trong nước rất tốt do chứa các nhóm hydroxyl có khả năng tự oxi hóa trong môi trường và được coi là nguyên nhân chính