LỰA CHỌN DUNG MÔI CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ THUỐC Y HỌC CỔ TRUYỀN

LỰA CHỌN DUNG MÔI CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ THUỐC Y HỌC CỔ TRUYỀN CÁCH LỰA CHỌN DUNG MÔI I. Dung môi chiết tách Do cấu tạo hóa học cả cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chất liệu đại phân tử tương đối trơ, không hòa tan trong dung môi hữu cơ, vì thế việc khảo sát hợp chất tự nhiên nghĩa là chiết lấy và khảo sát các chất biến dưỡng thứ cấp có trọng lượng phân tử nhỏ. Thông thường người ta muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái dầu có mức độ phân cực khác nhau, tuy nhiên, đôi khi cũng nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái nước. Điều này được thực hiện bằng cách chiết những hợp chất có trong cây lần lượt bằng các dung môi có tính phân cực tăng dần hoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp chất bằng cách sử dụng dung môi vạn năng methanol (có thể chiết hầu hết các loại hợp chất tự nhiên). Nguyên tắc tổng quát là lựa chọn dung môi và quy trình phù hợp để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây, điều này tùy thuộc vào đặc

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA HÓA 

-Bài tiểu luận:LỰA CHỌN DUNG MÔI CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ THUỐC Y HỌC CỔ TRUYỀN

Sinh viên thực hiện:

CÁCH LỰA CHỌN DUNG MÔI

I Dung môi chiết tách

Do cấu tạo hóa học cả cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chất liệu đại phân tử tương đối trơ, không hòa tan trong dung môi hữu cơ, vì thế việc khảo sát hợp chất

tự nhiên nghĩa là chiết lấy và khảo sát các chất biến dưỡng thứ cấp có trọng lượng phân tử nhỏ

Thông thường người ta muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái dầu có mức độ phân cực khác nhau, tuy nhiên, đôi khi cũng nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái nước Điều này được thực hiện bằng cách chiết những hợp chất có trong cây lần lượt bằng các dung môi có tính phân cực tăng dần hoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp chất bằng cách sử dụng dung môi vạn năng methanol (có thể chiết hầu hết các loại hợp chất tự nhiên)

Nguyên tắc tổng quát là lựa chọn dung môi và quy trình phù hợp để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây, điều này tùy thuộc vào đặc tính của chất biến dưỡng thứ cấp

có trong cây mà người khảo sát mong muốn tách cô lập (một vài hợp chất glycoside kém bền với nhiệt độ và nhạy với pH của môi trường…) Vì các hợp chất tự nhiên

có cấu trúc hóa học đa dạng, với tính chất phân cực khác biệt nên không thể có một quy trình tổng quát nào có thể áp dụng chung cho tất cả các nhóm, vì vậy trước khi tiến hành thực nghiệm cần phải thu thập đầy đủ các tài liệu tham khảo có liên quan trực tiếp trên cây mới có thể chọn được quy trình thích hợp

Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ cần chọn dung môi phù hợp, sử dụng kỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dầm, bằng máy chiết Soxhlet… Sau khi chiết, phần bã cây hoặc sinh khối còn lại được lọc bỏ, dung môi qua lọc được thu hồi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ thấp khoảng 30-40oC vì thực hiện ở nhiệt

độ cao có thể làm hư hại một vài hợp chất kém bền nhiệt

Cần chú ý quan sát quá trình cô quay có thể có tủa, lọc lấy tủa Nếu tủa này tan trong nước thì đó là muối vô cơ (vì nếu sử dụng ethanol để chiết bột cây, ethanol hòa tan luôn cả các loại muối vô cơ có trong cây), nếu tủa không tan trong nước nhưng tan trong dung môi hữu cơ thì đó là hợp chất hữu cơ, có thể tinh chế, thu được hợp chất tinh khiết Đây chỉ là một vài trường hợp đặc biệt khi hợp chất có hàm lượng cao trong cây Nhắc rằng khi một hợp chất cho kết tủa trong quá trình cô quay dung dịch thì trong dung dịch nước cái vẫn còn chứa rất nhiều hợp chất đó Thu hồi dung môi cho cao chiết thô, cao này có thể ở dạng khô, dạng dẻo sệt hoặc dạng dầu sệt tùy thuộc vào tính chất của các cấu tử có trong cao Cao cần loại bỏ hết dung môi còn sót lại để tránh các phản ứng phụ có thể có Thực hành bằng cách cân lọ chứa cao, lọ được đun cách thủy một khoảng thời gian, sau đó cân lại, nếu hai lần cân đều thấy lọ có trọng lượng suýt soát nhau là dung môi đã được đuổi hết ra khỏi cao

Không nên tồn trữ hợp chất trong dung môi hữu cơ vì một vài loại hợp chất có thể

có sự thay đổi không mong muốn trong cấu trúc hóa học

1 Lựa chọn dung môi để chiết tách

Chọn dung môi phải có tính trung tính , không độc, không quá dễ cháy, hòa tan được hợp chất khảo sát, sau khi chiết tách xong dung môi đó có thể được loại bỏ dễ dàng Cần tránh các dung môi độc như benzene hoặc dễ cháy do có nhiệt độ sôi thấp như dietyl eter, cacbon tetraclorur,…

Các dung môi có độ phân cực tăng dần theo tham số Snyder lực của dung môi

Tên dung môi Eo

(Al2O3)

Nhiệt độ sôi (oC)

Độ nhớt (mN.S.m-2)

Bước sóng hấp thu UV (nm)

-Các dung môi có độ phân cực tăng dần tùy theo hằng số điện môi và độ nhớt

Tên dung môi Chỉ

số phân cực

Chỉ số chiết suất (20oC)

Nhiệt độ sôi (oC)

Hằng

số điện môi ε (25oC)

Độ nhớt (mN.S.m-2)

Bước sóng hấp thu UV

Độ tan trong nước (% w/w)

Xylen 2,5 1,500 139 - 0,61 290 0,018

Người ta thường sử dụng các dung môi không hòa tan trong nước như các hydrocacbon (hexane, toluene), alcol (butanol), ceton (metyl etyl ceton), acetat (etyl, butyl), chloroform, clorur metylen Các loại dung môi này tương đối rẻ tiền,

có bán sẵn, độ nhớt thấp, tỉ trọng tương đối khác so với nước

Có thể sắp xếp độ phân cực của dung môi dựa vào Eo, tham số Snyder lực của dung môi Tham số này dựa trên năng lượng hấp thu của pha động là dung môi trên pha tĩnh là alumina Cũng có thể sắp xếp độ phân cực của dung môi theo hằng số điện môi, độ nhớt,…

2 Một số điều cần biết khi sử dụng dung môi để chiết tách hợp chất

- Các dung môi cần được chưng cất lại và tồn trữ trong những chai lọ bằng thủy tinh do trong dung môi thường hay chứa một số tạp bẩn mà thường gặp nhất là chất dẻo hóa Các chất làm dẻo thường gặp là dialkyl ptalat, n-butyl acetyl citrate, tri-n-butyl phosphate,… chúng lẫn vào dung môi thường được chứa trong các thùng làm bằng nhựa dẻo

- Methanol và chloroform thường chứa tạp chất là di(2-etylhexyl) ptalat và chất này thường bị nhầm lẫn rằng là hợp chất tự nhiên có chứa trong cây cỏ đang khảo sát

dù rằng hợp chất này có một số hoạt tính sinh học

Sở dĩ cô lập được di(2-etylhexyl) ptalat là do trước đó đã sử dụng một lượng lớn dung môi methanol, chloroform trong quá trình ngâm chiết cây cỏ ban đầu, sau đó

dung dịch chiết này được đuổi dung môi khiến cho một lượng chất làm dẻo hiện diện một cách đáng kể trong cao chiết

- Chloroform, diclorometan có thể tạo phản ứng với vài loại alkaloid như brucin, strychnine, ephedrine,… để tạo thành alkaloid dạng muối thứ cấp và một vài hợp chất giả khác Tương tự các vết HCl có thể gây ra sự phân hủy, sự khử nước, sự đồng phân hóa cho vài hợp chất hữu cơ

- Sử dụng methanol để chiết có thể cô lập được một số hợp chất giả tạo Khi chiết nóng cây Trechonaetes laciniata với dung môi methanol thay vì cô lập được hợp chất trechonolyd A thì đã cô lập được trechonolyd B (do trechonolyd A được metyl hóa khi được đun nóng trong methanol với sự hiện diện của vết acid)

- Dietyl eter ít được sử dụng để chiết vì có nhiệt độ sôi thấp dễ gây cháy, độc, có thể gây mê cho người sử dụng và có khuynh hướng tạo thành peroxide dễ gây nổ Peroxide này rất hoạt tính, có thể oxi hóa các hợp chất có mang nhiều nối đôi liên hợp như carotenoid Loại bỏ peroxide ra khỏi dietyl eter bằng cách lắc với FeSO4 rồi chưng cất lại

- Aceton có thể tạo dẫn xuất acetonid nếu hợp chất chiết có chứa nhóm cis-1,2-diol hiện diện trong môi trường acid

- Chiết bằng dung môi được điều chỉnh thành môi trường acid hoặc môi trường kiềm có thể chiết được hợp chất đặc trưng: các anthocyanin được chiết ra khỏi nguyên liệu cây tươi ban đầu bằng dung dịch methanol có chứa 1% acid clohidric Các alkaloid có thể được chiết bởi dung dịch acid hoặc kiềm

Chiết bằng môi trường acid hoặc kiềm có thể thủy giải các hợp chất glycoside (môi trường acid sẽ cắt đứt glycoside tại nối acetal làm mất đi phần đường) hoặc cắt đứt nối ester (môi trường kiềm)hoặc tạora sự chuyển vị

- Sau khi chiết, dung môi được thu hồi bằng máy cô chân không ở nhiệt độ

30-40oC, chưng cất ở nhiệt độ cao hơn có thể làm hư hại một số hợp chất kém bền nhiệt

3 Lựa chọn quy trình để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây

a Chiết hợp chất hữu cơ trọng lượng phân tử nhỏ, có tính thân dầu

- Trong hướng tổng hợp, sau khi thực hiện phản ứng xong, dù có qua một số bước

xử lý, sản phẩm thu được vẫn là hỗn hợp, thường gặp nhất là hỗn hợp có ba hợp chất, vì vậy vẫn phải sử dụng các phương pháp sắc ký khác nhau để tách riêng các hợp chất Quad trình theo dõi các sản phẩm thu được từ việc sắc ký tương đối dễ dàng vì đã dự đoán được cấu trúc hóa học của các hợp chất này

- Trong hướng hợp chất thiên nhiên, việc cô lập chất phức tạp hơn vì không biết được cây đang khảo sát có chứa các hợp chất với cấu trúc hóa học ra sao Biết rằng cây cỏ cần khảo sát hoặc dung dịch lên men vi sinh, đều có chứa nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại không phân cực đến loại rất phân cực, vì thế nếu muốn cô lập hợp chất mà áp dụng sắc ký cột trực tiếp ngay lên cao thô ban đầu sẽ rất khó đạt được kết quả mong muốn Vì thế người ta thường chuẩn bị một loạt các loại cao chiết có tính phân cực tăng dần, như thế mỗi loại cao chiết chứa tương đối ít hợp chất, giúp cho quá trình cô lập hợp chất tinh chất dễ dàng hơn Nhìn chung cô lập

được một hợp chất tinh chất để xác định cấu trúc hóa học hoặc thử nghiệm hoạt tính sinh học mất nhiều thời gian hơn

Muốn có các loại cao có độ phân cực khác nhau, sử dụng các dung môi chiết có độ phân cực khác nhau, dựa trên nguyên tắc chung là “ các chất giống nhau sẽ hòa tan nhau”: dung môi không phân cực hòa tan tốt các hợp chất không phân cực, dung môi có tính phân cực trung bình sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực

Dung môi thông dụng

Sử dụng trong Khả năng hòa tan Nhóm chức hóa học thường gặp phòng thí nghiệm trong các hợp chất hữu cơ

Dung Eter dầu hỏa AlcanNhóm

môi HexaneeAlcen, alcinchức

có BenzeneHợp chất thơm có

tính TolueneEtertính

phân Diclorometan Aldehyd, cetonphân

cực Chloroform Ester, amid cực

tăng Etyl acetat Hydroxy, amintăng

dần EthanolAcid carboxylycdần

Methanol

Butanol

Nước

Minh họa khái quát việc dung môi có độ phân cực khác nhau sẽ hòa tan ở nhiệt độ phòng các hợp chất có độ phân cực tương ứng (chỉ phù hợp với hợp chất đơn chức)

* Nhận xét :

+ Nếu dung môi được gia nhiệt khả năng hòa tan của nó sẽ tăng thêm và hòa tan được cả những hợp chất có độ phân cực mạnh hơn nó

+ Hình trên minh họa khả năng hòa tan của dung môi đối với một nhóm chức hóa học Trong khi đó, một hợp chất thiên nhiên thường có hai hay nhiều nhóm chức hóa học có tính phân cực khá khác biệt nhau, gây khó khăn trong việc lựa chọn dung môi thích hợp để hòa tan chất cần khảo sát

+ Dung môi không có tính chọn lọc cao

+ Quá trình sử dụng dung môi để hòa tan hợp chất, chiết lấy chất là quá trình áp dụng phương pháp chiết rắn – lỏng với nhiều kỹ thuật thực nghiệm khác nhau : từ nguyên liệu đầu tiên là cây cỏ hoặc dung dịch lên men các vi sinh vật, có nhiều kỹ thuật để có được các loại cao chiết khác nhau

Cao eter dầu hỏa Bột cây còn lại

Cao chloroform

Bột cây còn lại

Cao etyl acetat Bột cây còn lại

Cao methanol Bột cây còn lại Bột cây

Bột còn lại bỏ Cao nước

Sơ đồ 1: Sơ đồ tổng quát điều chế các loại cao có độ phân cực khác nhau từ nguyên liệu cây ban đầu, với mục đích cô lập các hợp chất có tính ái dầu

- Chiết kiệt với eter dầu hỏa

- Lọc, thu hồi dung môi

- Chiết kiệt với chloroform

- Lọc, thu hồi dung môi

- Chiết kiệt với etyl acetat

- Lọc, thu hồi dung môi

- Chiết kiệt với methanol

- Lọc, thu hồi dung môi

-Chiết với nước

- Lọc, thu hồi dung môi dung môi

Đầu tiên bột cây được chiết kiệt với eter dầu hỏa Dung dịch chiết này được gộp chung lại, thu hồi dung môi sẽ có được cao eter dầu hỏa chứa các loại hợp chất có tính không phân cực Bột cây còn lại được chiết tiếp với chloroform, thu hồi dung

môi, thu được cao chloroform chứa các loại hợp chất có tính phân cực trung bình Tiếp theo, bột cây được chiết với etyl acetat thu được cao etyl acetat chứa các loại hợp chất có tính phân cực khá Cuối cùng bột cây được chiết với methanol hoặc butanol thu cao methanol (hoặc butanol) chứa các loại hợp chất có tính phân cực mạnh

- Trong cao eter dầu hỏa hoặc cao hexane, cao dietyl eter : có thể có các

hydrocacbon béo và thơm, các thành phần của tinh dầu, các sterol thực vật, các chất màu thực vật như caroten,…

- Trong cao chloroform hoặc cao etyl acetat : có thể có các sesquiterpen, diterpen, coumarin, quinon, các aglycon do hợp chất glycoside bị thủy giải, các monoglycosid, một số alkaloid loại base yếu

- Trong cao methanol hoặc cao nước : có thể có các chất màu thực vật như clorophyl, các glycosid, các alkaloid ở dạng muối tứ cấp, kết hợp với các acid hữu

cơ, các acid hữu cơ, các muối amin, các tanin, các hydrat cacbon có trọng lượng phân tử nhỏ như monosacarid, olygosacarid, một số polysacarid như pectin, chất nhầy, chất gôm,…, các protein thực vật, các muối vô cơ NaCl, KCl, CaCl2…

Trong bất kỳ một loại hợp chất thiên nhiên nào, thí dụ alkaloid, steroid, flavonoid,

… cũng có thể có hợp chất có tính phân cực kém và loại hợp chất có tính phân cực mạnh là tùy vào việc hợp chất đó có mang nhiều nhóm thế có tính phân cực hoặc không phân cực

- Sơ đồ 1 là quy trình căn bản điều chế các loại cao có độ phân cực khác nhau Trong thực tế, nhất là trong các phòng thí nghiệm có kinh phí hạn chế, muốn nghiên cứu thành phần hóa học các hợp chất có trong cây, người ta thường sử dụng ngay dung môi vạn năng là ethanol hoặc methanol để chiết kiệt hết các hợp chất có trong bột cây Sau khi đuổi dung môi, thu được cao alcol thô Từ cao ethanol thô chứa tất cả các loại hợp chất hữu cơ có trong cây, sử dụng kỹ thuật chiết rắn – lỏng hoặc chiết lỏng – lỏng với các loại dung môi có tính phân cực khác nhau để điều chế các loại cao có độ phân cực khác nhau Nếu chủ đích muốn nghiên cứu các chất béo trong cây tốt nhất nên sử dụng ngay eter dầu hỏa hoặc hexane

b Chiết hợp chất hữu cơ trọng lượng phân tử nhỏ, có tính ái nước

Khảo sát các kết quả công bố trên Chemical Abstracts về việc cô lập các hợp chất hữu cơ mới trong tự nhiên cho thấy có khoảng 95% các hợp chất mới là loại hợp chất có tính thân dầu Việc này cho thấy có vẻ như trong thiên nhiên số lượng hợp chất có tính thân dầu nhiều hơn hợp chất có tính ái nước và điều này cũng cho thấy việc cô lập một hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ, có tính ái nước khó khăn hơn nhiều

Phẩm vật sinh học

Dung dịch đậm đặc

Phân đoạn chứa hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏPhân đoạn chứa hợp chất đại phân tử

Hợp chất có tính phân cực trung bình

Sơ đồ 2 : Sơ đồ tổng quát cô lập các hợp chất có tính thân nước – trọng lượng phân tử nhỏ

(tươi hoặc đông lạnh bằng nitơ lỏng)

-Chiết kiệt với nước hoặc dung dịch đệm hoặcMeOH

- Lọc, thu hồi dung môi ở chân không hoặc đông cô chân không chân không

Siêu lọc hoặc sắc ký gel

- Loại muối (nếu chiết bằng dung dịch đệm)

- Chiết pha rắn (nhựa XAD, C18, polyamid,…)

- Hoặc chiết với dung môi phân cực (butanol, alcol amyl,…)

Sắc ký với môi trường phân cực (Sephadex LH-20,…)

Trong phòng thí nghiệm, muốn chiết các hợp chất có tính ái nước, người ta nghĩ dung môi phù hợp nhất để chiết những hợp chất này ra khỏi nguyên liệu ban đầu chính là nước vì điều này theo đúng nguyên tắc “các chất giống nhau sẽ hoà tan nhau” Tuy nhiên, trong thực tế nhiều trường hợp sử dụng dung môi nước để chiết các phẩm vật sinh học tươi bằng phương pháp ngâm dầm đã thất bại, không thể chiết các hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ - có tính ái nước ra khỏi nguyên liệu thực vật, dù rằng chiết với nước là phương pháp giống với cách dân gian nấu cây

cỏ để có nước thuốc sắc, uống để chữa bệnh

- Một số khó khăn khi chiết bằng dung môi nước:

+ Nước có nhiệt độ sôi khá cao, áp suất hơi lại nhỏ nên sau khi chiết, rất khó đuổi nước ra khỏi dung dịch chiết Muốn đuổi nước mà vẫn bảo đảm chất lượng sản phẩm thì tốt nhất nên sử dụng kỹ thuật đông cô chân không

+ Nước không thể chiết được hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ - có tính ái nước

là do các hợp chất này hiện diện trong cây cỏ ở trong trạng thái được bảo vệ Sự bảo vệ rất đa dạng: hợp chất bám dính vào màng tế bào, được trữ ở bên trong tế bào thực vật, được che chắn bên ngoài bởi nguyên vật liệu có tính ái dầu,… Có thể khắc phục các khó khăn nêu trên bằng cách sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp các kỹ thuật sau: sử dụng chậu siêu âm, đun nóng, đông khô chân không, cho tiêu hủy bởi enzyme Điều này không xảy ra khi chiết các hợp chất có tính thân dầu bởi vì các dung môi hữu cơ có khả năng phá hủy màng tế bào thực vật

+ Dung dịch nước chiết là môi trường tốt cho sự phát triển các vi sinh vật: sau một thời gian tồn trữ dung dịch nước sẽ bị lên mốc Muốn tránh điều này phải giữ dung dịch chiết trong phòng lạnh hoặc cho thêm hoạt chất kháng nấm mốc vào dung dịch này

+Sự chiết bằng nước cũng có thể chiết luôn một số enzyme như peptidase, glycosidase, sulfatase, oxydase,… Quá trình chiết nước đã làm hoạt hóa các enzyme này vì thế nếu hợp chất cần khảo sát lại nhạy cảm với một trong các loại enzyme do enzyme phát huy tác dụng làm cắt đứt nối, hệ quả là sản phẩm thu nhận không còn giống như nguyên thủy của nó

Trong phòng thí nghiệm, muốn chiết các hợp chất có tính ái nước, người ta thường chọn một số dung môi hữu cơ có tính phân cực như ethanol, methanol hoặc hỗn hợp methanol – nước hoặc ethanol – nước,… mặc dù có thể các dung môi này không phải là dung môi tối ưu để hòa tan hợp chất đang mong muốn chiết Các dung môi này được lựa chọn vì chúng dễ chưng cất thu hồi hơn so với nước

Trong đa số trường hợp, muốn chiết (hoặc tách cao chiết thô thành các phân đoạn khác nhau) hợp chất hữu cơ trọng lượng phân tử nhỏ - có tính ái nước người ta thường sử dụng dung dịch đệm Tuy vậy, việc sử dụng dung dịch đệm cũng có nhược điểm như sau:

+ Muốn có thể chiết tốt các chất cần khảo sát, phải tìm cho ra được khoảng pH và nồng độ thích hợp của dung dịch đệm

+ Việc đuổi dung dịch đệm ra khỏi dung dịch để thu được cao chiết khô gặp nhiều khó khăn Để khắc phục việc này, có thể sử dụng một số loại dung dịch đệm có khả năng bay hơi, có thể được loại đi bằng kỹ thuật đông cô chân không hoặc nhờ máy

cô quay chân không, tuy vậy cũng không phải dễ dàng mà cần phải rửa nhiều lần với nước để loại hoàn toàn chất của dung dịch đệm

Một số dung dịch đệm có khả năng bay hơi