công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme

Con đường trao đổi chất • Thiếutăng; thừa giảm Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme 3 Nguyên lý của quá trình điều hòa • Điều hòa hoạt độ: bản thân enzyme đó hoạt động bình thường hay

2 Tuyển chọn và cải tạo giống VSV cho enzyme có hoạt lực cao

3 Phương pháp bảo quản giống VSV

4 Môi trường nuôi cấy VSV sinh tổng hợp enzyme

5 Các phương pháp nuôi cấy VSV

Con đường trao đổi chất

• Thiếutăng; thừa giảm

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme 3

Nguyên lý của quá trình điều hòa

• Điều hòa hoạt độ:

bản thân enzyme đó hoạt động bình thường hay giảm hoạt động do bị

ức chế

• Điều hòa sinh tổng hợp enzyme

số lượng các enzyme được sản xuất ra ít hay nhiều

Điều hòa hoạt độ

• Nhiều loại enzyme thường không sử dụng hết khả năng xúc tác

của chúng

• Làm tăng tốc độ của quá trình chuyển hóa khi có nhu cầu cần

thiết của tế bào

• yếu tố không đặc hiệu: pH, thế năng oxy hóa khử, lực ion, nhiệt độ

• hợp chất có tác dụng đặc hiệu với trung tâm hoạt động: cơ chất, coenzyme

• chất có tác dụng dị lập thể

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme 5

Điều hòa hoạt độ theo cơ chế dị lập thể

• khi sản phẩm chuyển hóa cuối cùng của một dãy phản ứng hóa học

xúc tác bởi nhiều enzyme có thể tác dụng hoạt hóa hay ức chế lên

enzyme xúc tác phản ứng đầu tiên là một enzyme dị lập thể

• Enzyme dị lập thể thay đổi hoạt độ xúc tác thông qua sự thay

đổi cấu hình không gian của enzyme, của trung tâm hoạt động

khi gắn với các chất điều hòa dị lập thể

• Nếu làm tăng hoạt độ gọi là chất điều hòa dương, nếu làm giảm

hoạt độ gọi là các chất điều hòa âm

Ức chế ngược - ức chế dị lập thể

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme 7

Điều hòa hoạt độ theo cơ chế biến đổi dạng HĐ và KHĐ

Điều hòa sinh tổng hợp enzyme

Trong cơ thể thường tồn tại hai loại enzyme:

• Enzyme thường trực hay enzyme cơ cấu (constitutive

enzymes) là những enzyme tham gia thành phần cơ bản của

hoạt động tế bào, gồm tất cả các loại enzyme xúc tác quá trình

chuyển hóa của tế bào và lúc nào cũng có trong tế bào

• Enzyme cảm ứng (inductive enzymes) bình thường có lượng

rất ít, không đáng kể, chúng sẽ được tăng lên nhanh chóng khi

đưa vào môi trường chất xác định

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme 9

Hiện tượng cảm ứng (induction)

• Là hiện tượng làm tăng lượng enzyme của tế bào (ngược lại

với hiện tượng trấn áp)

• Trong số các enzyme do vi sinh vật tổng hợp, có những

enzyme bình thường chỉ được tổng hợp rất ít ỏi nhưng khi thêm

một số chất nhất định vào môi trường nuôi cấy thì hàm lượng

của chúng có thể tăng lên rất nhiều lần Monod và Cohn (1925)

gọi các enzyme này là enzyme cảm ứng, chất gây nên hiệu quả

này là gọi là chất cảm ứng

Hiện tượng cảm ứng

• Các enzyme cảm ứng thường là những enzyme xúc tác cho

quá trình phân giải như: protease, amylase, pectinase,

penixilinase, β-galactosidase ở tế bào E coli

• Sự cảm ứng thường có tính chất dây chuyền

• Sự cảm ứng có tính đa hướng và tính hợp đồng

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme 11

Hiện tượng trấn áp (ức chế )- repression

• Là hiện tượng làm giảm quá trình sinh tổng hợp do sản phẩm

cuối cùng của quá trình nuôi cấy

• Hiện tượng này thường gặp đối với các enzyme xúc tác quá

trình sinh tổng hợp một chiều như: quá trình sinh tổng hợp axit

amin, nucleotit

Ví dụ về cơ chế trấn áp

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme 13

Cơ chế hiện tượng cảm ứng

Cơ chế hiện tượng cảm ứng

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme 15

Có chất cảm ứng

Cơ chế hiện tượng kìm hãm

Điều hoà tương tác giữa RNA - polymerase với promotor

• AMPv (AMP vòng) có tác

dụng kích thích đối với quá

trình sao chép mã của các

operon phân giải nhờ một

protein đặc biệt làm trung

gian gọi là protein nhận

AMPv, hay còn gọi là protein

hoạt hoá phân giải CAP

(catabolite activator protein)

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme 17

Điều hoà tương tác giữa RNA - polymerase với promotor

• Khi AMPv kết hợp với CAP

tạo thành phức hợp có tác

dụng hoạt hoá promotor làm

cho RNA - polymerase dễ

Kết luận

Trong tế bào có những cơ chế điều chỉnh rất phức tạp và rất có

hiệu quả, đảm bảo cho sự liên hệ thông tin chặt chẽ giữa bộ máy

di truyền của tế bào và các quá trình chuyển hóa vật chất trong

tế bào

Nhờ các cơ chế này mà nồng độ nội bào của các phân tử nhỏ có

thể kiểm tra sự tổng hợp các phân tử enzyme

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme 19

Nguyên lý trao đổi chất của VSV trong sinh tổng hợp enzyme

Để thực hiện quá trình đồng hóa và dị hóa đó, VSV phải tổng

hợp các enzyme tương ứng

• Các enzyme đồng hóa được tổng hợp trong tế bào và chỉ thực

hiện các hoạt động đồng hóa xảy ra trong tế bào

• Các enzyme dị hóa được tổng hợp trong tế bào nhưng có thể

hoạt động trong tế bào (enzyme ngoại bào – exoenzyme) hoặc

ngoài tế bào (enzyme dị bào – endoenzyme)

Nguyên lý trao đổi chất của VSV trong sinh tổng hợp enzyme

• Theo nghĩa rộng, enzyme nội bào còn bao gồm cả các loại

enzyme tham gia tổng hợp, enzyme tham gia phản ứng oxy

hóa và các enzyme tham gia chuyển hóa vật chất trong tế bào

• Phần lớn những enzyme ngoại bào thuộc enzyme cảm ứng Do

đó, việc điều khiển sinh tổng hợp enzyme này ta áp dụng quy

luật cảm ứng sẽ thu được những kết quả như mong muốn

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme 21

Nguyên lý điều khiển quá trình kỹ thuật sản xuất enzyme trong

quy mô công nghiệp

• Điều khiển genotype

• Điều khiển biểu hiện phenotype

3 Phương pháp bảo quản giống VSV

4 Môi trường nuôi cấy VSV sinh tổng hợp enzyme

5 Các phương pháp nuôi cấy VSV

6 Tách và làm sạch chế phẩm enzyme

Phân lập

• Trong điều kiện tự nhiên : môi trường khắc nghiệt nhất, tồn

tại giống có hoạt tính cao

• Trong điều kiện sản xuất.

• Trong mẫu đã hư hỏng

Đặc điểm chủng được phân lập trong tự nhiên

• Không có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme thật sự mạnh

• Cần có thời gian thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp

• tập trung ở vùng môi trường có chứa nhiều cơ chất tương ứng

• Trong quá trình sinh sản và phát triển, VSV tự nhiên luôn xảy ra

thường biến và đột biến Những đột biến có lợi thường tồn tại bền

vững nên việc tìm kiếm các đột biến kiểu này rất có ý nghĩa

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme 25

Đặc điểm giống phân lập trong điều kiện sản xuất

• Đã thích nghi với điều kiện sản xuất không cần phải qua giai

đoạn sản xuất thử, thí nghiệm

• Có đặc điểm sinh hóa cao hơn các chủng hoang dại

• Mật độ tế bào VSV có trong điều kiện sản xuất thường rất cao

Do đó khả năng thu nhận được các chủng có khả năng sinh

tổng hợp enzyme cao thường rất cao

Kỹ thuật nâng cao chất lượng giống

• Phương pháp gây đột biến : dùng tác nhân vật lý hay hóa học để

tác động lên tế bào VSV

• Phương pháp biến nạp : biến đổi tính trạng di truyền của VSV dưới

ảnh hưởng của DNA trong dịch chiết nhận từ tế bào của VSV khác

• Phương pháp tiếp hợp gene : Vật liệu di truyền chuyển từ tế bào

cho sang tế bào nhận khi 2 tế bào tiếp xúc với nhau

• Phương pháp tải nạp:Vật liệu di truyền chuyển từ tế bào cho sang

tế bào nhận nhờ vai trò trung gian của thực khuẩn thể

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme 27

Phương pháp bảo quản giống

• Cấy chuyền: vi khuẩn, nấm men (1-3 tuần)

• Làm khô: Trong môi trường tối thiểu có độ ẩm thấp (<5%), VSV có

bào tử có thể bảo tồn khả năng sinh tổng hợp enzyme trong một

thời gian dài Phương pháp này chỉ có hiệu quả đối với VSV có khả

năng sinh bào tử

• Đông khô: (giảm đến giới hạn ngưng phát triển vsv)-10 năm, đắt tiền

Môi trường nuôi cấy VSV sinh tổng hợp enzyme

• Nguồn Cacbon

• Nguồn Nito

• Nguồn khoáng và vi lượng

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme 29

Các loại môi trường nuôi cấy

Là môi trường gồm các chất với liều lượng

xác định (qua tìm hiểu, nghiên cứu)

Dùng các loại phế liệu, nguyên liệu có chứa các nguồn C, N,

khoáng, các yếu tố sinh tổng hợp trưởng

Loại môi trường này được sử dụng cho mục

đích nghiên cứu

Các nguyên liệu này lại có sẵn, rẻ tiền được sử dụng rất nhiều trong

công nghiệp sản xuất

Tinh bột, cellulose, đường, axit, rượu, nguồn

Nitơ vô cơ hoặc hữu cơ (axit amin,

Cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch ép hoa quả, rau, khô dầu, bã rượu, rỉ đường, sản phẩm phân huỷ nấm men bia, trấu, lõi

Các phương pháp nuôi cấy VSV

• Nuôi cấy bề mặt

• Nuôi cấy chìm

• Nuôi cấy chìm hai bước

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme 31

Phương pháp nuôi cấy bề mặt

 Thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát

triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm

 Dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh, bột ngô, mảnh hạt bo bo

có chất phụ gia là trấu

 Bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ, photpho, nitơ hữu cơ và các

chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc

bã rượu

Quy trình công nghệ

Nguyên liệu Kiểm tra, định lượng Phối trộn

Thanh trùng bằng nhiệt Làm nguội, làm tơi Gieo giống VSV Chuyển vào dụng cụ nuôi cấy Nuôi cấy, theo dõi, xử lý

Nuôi cấy giống

- dùng nước trộn với nguyên liệu rồi thanh trùng

- làm ẩm sơ bộ rồi thanh trùng sau đó dùng nước vô trùng để

điều chỉnh lại độ ẩm của khối nguyên liệu

Thanh trùng bằng hơi nhiệt

Làm cho môi trường được tinh khiết hơn

về phương diện vsv và làm cho chín (biến hình) môi trường (tinh bột, protein) Thông thường người ta thanh trùng bằng hơi nước trực tiếp ở nhiệt độ 120- 1300C trong 2-3h

Làm nguội và làm tơi môi trường

Khối môi trường vừa hấp xong còn nóng và dính bết Vì vậy phải

làm nguội và làm tơi để thuận tiện cho việc gieo giống và phân phối vào

Nuôi cấy nấm mốc giống

Tạo đủ lượng bào tử giống cho toàn bộ môi trường nuôi

cấy Quy trình công nghệ thực hiện tương tự như trong sản

xuất lớn nhưng các điều kiện kỹ thuật đặc biệt và khắc khe

hơn: nguyên liệu phải tốt, giàu chất dinh dưỡng hơn, điều kiện

nuôi cấy khống chế nghiêm ngặt hơn, thời gian nuôi cấy dài

hơn (gần gấp đôi) để nấm mốc hình thành nhiều bào tử và đều

Quá trình nuôi cấy (kéo dài 33-48h/mẻ gồm 3 giai đoạn)

• Giai đoạn 1 (Từ khi nuôi đến giờ nuôi thứ 10-12): trương nở bào tử và

xuất hiện cuống nấm, W = 55-60%,  =96-100%, T=30-32 o C

• Giai đoạn 2 (kéo dài trong 10-18h): phát triển mạnh, dẫn đến hiện tượng kết

bánh môi trường bị khô xốp, tăng hàm lượng CO2, T=38-40 o C Để khống chế

nhiệt độ thích hợp 28-30 o C cần thông gió (quạt) và bão hoà ẩm không khí

phòng nuôi

• Giai đoạn 3 (kéo dài trong 10-20h ): tạo ra enzyme nhiều nhất Cường độ

trao đổi chất giảm đi chút ít, nhiệt toả ra ít hơn nên tốc độ bốc hơi nước của

môi trường nuôi cấy cũng giảm theo

Phương pháp nuôi cấy chìm

►Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất chủ yếu

trong đa số trường hợp là tinh bột

►Đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối

►Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy chìm 1 bước (1pha) gồm: chuẩn

bị môi trường nuôi cấy, nuôi cấy nấm mốc giống, nuôi cấy nấm mốc

sản xuất

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Sau khi đã phối trộn đúng tỉ lệ các thành phần sẽ được khuấy

trộn kỹ rồi thanh trùng bằng hơi nhiệt (trực tiếp hay gián tiếp

bằng nồi 2 vỏ), nhiệt độ 118-125 o C, thời gian 15-60 phút, sau đó

được làm nguội đến nhiệt độ 30 o C thì tiến hành gieo cấy nấm mốc

giống vào

Nuôi cấy nấm mốc giống

• Ở cấp PTN: tiệt trùng môi trường làm nguội, cấy giống rồi nuôi trên

máy lắc (150-200 lần/phút), T=46-50h

• Ở cấp phát triển giống trung gian: sục khí vô trùng với lưu lượng

15-20m 3 /m 3 h, T= 36-40h, V dịch men giống = 10% V dịch men sản xuất

Nuôi cấy nấm mốc sản xuất

• Trong quá trình nuôi cấy cần phải sục khí vô trùng và khuấy trộn,

tiếp dầu phá bọt nếu có hiện tượng tạo bọt trào ra khỏi nồi lên

men

• T =1-4 (ngày) tuỳ theo giống vi sinh vật

• Khống chế pH, chế độ sục khí và bảo đảm vô trùng

• Tác dụng của hệ thống thổi khí:

• Làm xáo trộn môi trường

• Thúc đẩy VSV sinh sản và phát triển

• Hạn chế những ảnh hưởng xấu của các chất khí được tạo ra trong quá

trình trao đổi chất

• Tác dụng của hệ thống khuấy trộn

• làm các thành phần môi trường và tế bào VSV không bị lắng xuống, từ đó

làm tăng khả năng tổng hợp enzyme

• làm tăng khả năng tan của oxy

• làm tăng nhanh quá trình sinh sản sản vô tính do tác động cơ học

Thiết bị lên men với bộ đảo trộn cơ học

• V= 63 m3

• Thép kép có nắp hình nón

• Trên nắp: bộ khuấy đảo, nạp liệu, chất khử

bọt, nạp và thải không khí

Phương pháp nuôi cấy chìm 2 bước

Vi sinh vật được nuôi trong thiết bị đầu tiên (pha thứ nhất – pha sinh

trưởng) để phát triển đến mức độ cần thiết, sau đó được chuyển sang

thiết bị lên men tiếp theo (pha thứ hai – pha tạo enzyme) có thành

phần khác với thiết bị đầu để sinh tổng hợp enzyme

Công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme 47

Sản xuất enzyme α - manozilostreptomixinase

• Phát minh quá trình lên men chất kháng sinh streptomixin bởi xạ khuẩn

Streptomyces griseus vào năm 1944 bởi Schatz, Bugie và Waksman

• Pha thứ nhất: Tế bào Streptomyces griseus được nuôi trong môi trường dinh

dưỡng có khuấy trộn và sục khí trong 17h ở nhiệt độ 28 0 C để tạo nhiều bào tử Sau

đó bào tử được rữa sạch và chuyển sang thiết bị tiếp theo

• Pha thứ 2: Tiếp tục nuôi cấy để sinh tổng hợp enzyme α- manozilostreptomixinase

trong 18-24h Lúc này tốc độ phát triển của vi khuẩn chậm lại, nhưng sự chuyển

vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực

tiếp Tốn ít năng lượng thiết bị, dụng cụ nuôi cấy

đơn giản, có thể thực hiện ở qui mô gia

đình, trang trại cũng như ở qui mô lớn đến

20T/ngày

Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm

vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thất

lớn Điều kiện nuôi cấy không cần vô trùng

tuyệt đối, nếu có nhiễm trùng phần nào chỉ

cần loại bỏ canh trường phần đó

Nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết hơn

Năng suất thấp, khó cơ khí hoá, tự động

hoá, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế

phẩm ở các mẻ không đồng đều

Dễ cơ khí hoá, tự động hoá, năng suất cao, dễ tổ chức sản xuất tiết kiệm diện tích sản xuất