Nghiên cứu phân tích cấu trúc và hàm lượng một số hợp chất có trong nấm hương (Lentinula edodes) bằng các phương pháp phân tích hiện đại (Luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu phân tích cấu trúc và hàm lượng một số hợp chất có trong nấm hương (Lentinula edodes) bằng các phương pháp phân tích hiện đại (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân tích cấu trúc và hàm lượng một số hợp chất có trong nấm hương (Lentinula edodes) bằng các phương pháp phân tích hiện đại (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân tích cấu trúc và hàm lượng một số hợp chất có trong nấm hương (Lentinula edodes) bằng các phương pháp phân tích hiện đại (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân tích cấu trúc và hàm lượng một số hợp chất có trong nấm hương (Lentinula edodes) bằng các phương pháp phân tích hiện đại (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân tích cấu trúc và hàm lượng một số hợp chất có trong nấm hương (Lentinula edodes) bằng các phương pháp phân tích hiện đại (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân tích cấu trúc và hàm lượng một số hợp chất có trong nấm hương (Lentinula edodes) bằng các phương pháp phân tích hiện đại (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân tích cấu trúc và hàm lượng một số hợp chất có trong nấm hương (Lentinula edodes) bằng các phương pháp phân tích hiện đại (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân tích cấu trúc và hàm lượng một số hợp chất có trong nấm hương (Lentinula edodes) bằng các phương pháp phân tích hiện đại (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân tích cấu trúc và hàm lượng một số hợp chất có trong nấm hương (Lentinula edodes) bằng các phương pháp phân tích hiện đại (Luận văn thạc sĩ)

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

DƯƠNG THÚY QUỲNH

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH CẤU TRÚC VÀ HÀM LƯỢNG

MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG NẤM HƯƠNG

(LENTINULA EDODES) BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2019

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

DƯƠNG THÚY QUỲNH

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH CẤU TRÚC VÀ HÀM LƯỢNG

MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG NẤM HƯƠNG

(LENTINULA EDODES) BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 8.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 TS Nguyễn Hữu Tùng

2 PGS.TS Dương Nghĩa Bang

THÁI NGUYÊN - 2019

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu phân tích cấu trúc và

hàm lượng một số hợp chất có trong nấm hương (Lentinula edodes) bằng

các phương pháp phân tích hiện đại”, em đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo

nhiệt tình của các thầy cô giáo, gia đình và bạn bè đồng nghiệp

Em xin bày tỏ sự biết ơn đặc biệt đến TS Nguyễn Hữu Tùng - Trưởng nhóm nghiên cứu Hóa dược và Hoạt chất sinh học, Trường Đại học Phenikaa PGS TS Dương Nghĩa Bang - Trưởng phòng Hành chính - Tổ chức, Trường

ĐH Khoa Học - ĐH Thái Nguyên TS Lê Đăng Quang - Giám đốc trung tâm nghiên cứu triển khai các hoạt chất sinh học, Viện Hóa học Công nghiệp Việt Nam; đã hướng dẫn em tận tình, chu đáo trong suốt quá trình làm luận văn, giúp em hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phạm Thế Chính - Trưởng Khoa Hóa học cùng các thầy, cô tại khoa Hóa học trường ĐH Khoa học - ĐH Thái N và các bạn trong lớp cao học K11 đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu cùng toàn thể cán bộ giáo viên Trường THPT Hàm Long - Bắc Ninh đã tạo điều kiện thuận lợi về thời gian và công việc để em hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên,

cổ vũ, khích lệ tinh thần trong suốt thời gian qua

Mặc dù đã có nhiều cố gắng trong quá trình thực hiện đề tài, song không thể tránh những hạn chế và thiếu sót Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô giáo và bạn bè đồng nghiệp

Tác giả luận văn

Dương Thúy Quỳnh

Trang 4

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT a DANH MỤC HÌNH ẢNH b DANH MỤC BẢNG BIỂU d

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc 3

1.1.1 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) 3

1.1.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR 4

1.1.3 Phương pháp phổ khối lượng (MS) 6

1.1.4 Phân tích hàm lượng các chất bằng HPLC 8

1.2 Giới thiệu về nấm hương (Lentinula edodes) 10

1.3 Lentinan 11

1.3.1 Đặc điểm cấu tạo 11

1.3.2 Hoạt tính và ứng dụng của Lentinan 13

1.4 Phương pháp chiết tách Lentinan 16

1.4.1 Một số phương pháp chiết tách phổ biến 16

1.4.2 Định hướng lựa chọn phương pháp chiết tách Lentinan 18

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 19

2.1 Đối tượng, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 19

2.1.1 Đối tượng 19

2.1.2 Hóa chất 19

2.1.3 Thiết bị 19

2.2 Thực nghiệm 20

2.2.1 Phân tích hàm lượng Lentinan 20

2.2.2 Phương pháp tạo mẫu phân tích Lentinan 22

2.2.3 Phân tích xác định cấu trúc của Lentinan 22

Trang 5

2.2.4 Xác định hàm lượng tổng Phenolic 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Xây dựng đường chuẩn β-glucan 25

3.2 Kết quả nghiên cứu quá trình tạo mẫu Lentinan 25

3.2.1 Nghiên cứu lựa chọn dung dịch đệm cho quá trình tạo mẫu Lentinan ở giai đoạn 2 26

3.2.2 Nghiên cứu lựa chọn pH dung dịch đệm cho quá trình tạo mẫu Lentinan ở giai đoạn 2 27

3.2.3 Qui trình tạo mẫu Lentinan 29

3.3 Phân tích xác định cấu trúc của Lentinan 33

3.3.1 Đặc điểm mẫu M2 trên cơ sở phương pháp phổ hồng ngoại IR 33

3.3.2 Phân tích chất M2 trên cơ sở phương pháp ESI-MS/MS 34

3.3.3 Phân tích các dữ liệu thu được trên cơ sở phương pháp NMR 36

3.3.4 Phân tích khối lượng phân tử của Lentinan (M2) bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (Gel Permeation Chromatography) 40

3.3.5 Tổng hợp dữ liệu phổ của Lentinan (M2) 42

3.4 Phân tích xác định hàm lượng tổng Phenolic 42

KẾT LUẬN 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

Trang 6

DANH MỤC CHỮ VIẾT TĂT

13C- NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C Nuclear

Magnetic Resonance) DMSO Dimethyl sulfoxide

1H- NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H Nuclear Magnetic

Resonance)

IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

MS Phổ khối lượng (Mass Spectrometry)

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic

Resonance) ESI-MS Phổ khối lượng Ion hóa (Electrospray Ionization Mass

Spectrometry) HSQC Phổ NMR 2 chiều HSQC (Heteronuclear Single Quantum

Coherence) HMBC Phổ NMR 2 chiều HMBC (Heteronuclear Multiple Bond

Correlation)

Trang 7

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Phổ hồng ngoại của 7 - hidroxy - 4- metylcoumarin 3

Hình 1.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat 5

Hình 1.3 Sơ đồ thiết bị phân tích HPLC 8

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc Lentinan [13] 12

Hình 1.5 Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử AFM ( Atomic force microscope) và ảnh của Lentinan trong dung dịch 250C [32] 12 Hình 1.6 Mô hình phân tử xoắn kép ba theo chiều phải của β-glucan (Lentinan) [29] 12

Hình 1.7 Liên kết β-1,3 glicozit và β-1,6 glicozit [24] 13

Hình 1.8 Cơ chế kháng u của Lentinan [32] 14

Hình 2.1 Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ D-glucose 21

Hình 3.1 Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quangvào nồng độ D-glucose 25

Hình 3.2 Qui trình tạo mẫu Lentinan (giai đoạn 1) 30

Hình 3.3 Qui trình tạo mẫu Lentinan (giai đoạn 2) 31

Hình 3.4 Qui trình tạo mẫu Lentinan 32

Hình 3.5 Phổ IR của mẫu M2 34

Hình 3.6 Phổ ESI-MS (negative-mode) của mẫu M2 chế độ MS/MS 34

Hình 3.7 Phổ LCMS-QTOF của mẫu Lentinan tiêu chuẩn từ nấm hương [37] 35

Hình 3.8 Phân tử Lentinan dạng β-D-glucan polysaccharide với mảnh m/z 1151 tương ứng mắt xích C42H72O36 35 Hình 3.9 (A) Mảnh phân nhánh với liên kết β-D-1→6 glucosic và liên kết

β-D-1→3 glycosidic trong chuỗi chính của lentinan Tương tác HMBC [ ] của liên kết trong chuỗi chính (B) Cấu trúc

Trang 8

chuỗi xoắn helix tạo thành từ 3 chuỗi đơn single của lentinan

trong dung môi nước và DMSO [41] 37

Hình 3.10 Phổ 1H-NMR của M2 ghi trong D2O tại tần số 500 MHz ghi trên máy Bruker AM 500 FT-NMR 38

Hình 3.11 Phổ 13C-NMR của các tín hiệu carbon thuộc mẫu M2 Mẫu ghi trong dung môi D2O tại tần số 125 MHz trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM 500 FT-NMR 38

Hình 3.12 Phổ 13C-NMR của mẫu M2 và phần giãn rộng từ δ 72-75.5 ppm 39

Hình 3.13 Phổ HSQC của các tín hiệu cross-peak của mẫu M2 39

Hình 3.14 Phổ HMBC của các tín hiệu cross-peak thuộc mẫu M2 40

Hình 3.15 Khối lượng phân tử ước tính của M2.1 (B) 40

Hình 3.16 Đường chuẩn định lượng biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ acid gallic 42

Trang 9

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Một số loại β-glucan[10] 13

Bảng 3.1 Kết quả lựa chọn dung dịch đệm cho quá trình tạo mẫu Lentinan

ở giai đoạn 2 26Bảng 3.2 Kết quả lựa chọn pH dung dịch đệm photphat trong quá trình tạo

mẫu Lentinan ở giai đoạn 2 28

Bảng 3.3 Tín hiệu 1H-NMR và 13C-NMR của chất M2 ghi trong dung

môi D2O 38

Bảng 3.4 Tổng hợp dữ liệu phổ của Lentinan (M2) 41

Trang 10

MỞ ĐẦU

Hiện nay, các phương pháp phổ không chỉ ứng dụng trong phạm vi ngành hóa học mà còn ở nhiều ngành khác nhau như hóa sinh, y dược, nông nghiệp, dầu khí, vật liệu, môi trường Sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp phổ

đã giúp cho việc nghiên cứu trong các ngành khoa học đặc biệt là hóa học các hợp chất thiên nhiên trở nên dễ dàng hơn, phát triển nhanh hơn Trước đây, để chứng minh cấu tạo của một chất có thể mất nhiều thời gianthậm chí có khi kéo dài nhiều năm thì nay có thể thực hiện sau vài giờ, sở dĩ làm được như vậy là nhờ sự hỗ trợ của các phương pháp vật lý hiện đại

Để phân tích cấu trúc của các hợp chất hữu cơ có thể sử dụng các phương pháp phổ như phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại khả kiến, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng Mỗi phương pháp cho phép xác định một số thông tin khác nhau của cấu trúc phân tử và hỗ trợ lẫn nhau trong việc xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ

Bên cạnh đó, cùng với sự phát triển ngày càng cao của khoa học kĩ thuật

và kinh tế xã hội, đời sống tinh thần và vật chất của con người ngày càng được nâng cao và không ngừng được cải thiện Theo đó, vấn đề đảm bảo tính “Sạch

- An toàn - Tốt cho sức khỏe” của các sản phẩm sử dụng trong cuộc sống ngày càng được chú trọng Các loại sản phẩm ấy có thể cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng đa lượng, vi lượng thiết yếu cho cơ thể, bên cạnh đó chúng phải có tính phòng và chữa bệnh

Nấm ăn là một trong số các loại thực phẩm đáp ứng được mục tiêu đó Từ hàng ngàn năm nay, nấm là một loại thực phẩm được ưa chuộng từ lâu đời và hiện nay được xếp vào nguồn cung cấp thực phẩm chức năng của nhiều quốc

gia trên thế giới Trong số đó, nấm hương (Lentinula edodes) là một loại thực

phẩm được xem là “Thịt sạch - Rau sạch” có giá trị dinh dưỡng cao Nấm hương chứa khá nhiều các nguyên tố đa lượng, vi lượng, khoáng cũng như các acid amin

Lentinula là một β-glucan từ nấm hương, polysacarit mang hoạt tính sinh học -

chất tăng cường miễn dịch mới phổ biến nhất hiện nay

Trang 11

Vài thập kỷ trở lại đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học và hóa dược liệu, các chế phẩm β-glucan nguồn gốc từ nấm tự nhiên, nấm nuôi trồng, nấm men được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng phổ biến trong các sản phẩm chống ung thư và sản phẩm tăng cường chức năng

miễn dịch Hàng năm, lượng nấm hương sử dụng để sản xuất Lentinan ở Nhật

khoảng vài trăm ngàn tấn có giá trị lên tới trăm triệu USD, với qui trình tách

chiết công nghiệp cho ra sản phẩm Lentinan chất lượng cao phân bố trên toàn

thế giới [4,5] Trong khi đó ở Việt Nam có nguồn nấm hương dồi dào, trồng rất nhiều tại các tỉnh thành nhưng chủ yếu dùng làm thực phẩm, và xuất khẩu chưa phát triển làm nấm dược liệu Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi đề xuất đề tài:

“Nghiên cứu phân tích cấu trúc và hàm lượng, một số hợp chất có trong nấm

hương (Lentinula edodes) bằng các phương pháp phân tích hiện đại” nhằm tách

chiết, tinh chế và phân tích cấu trúc những hợp chất thiên nhiên có trong nấm hương, nâng cao giá trị của nấm hương

Trang 12

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

1.1.1 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)

Phổ hồng ngoại [1,2] được sử dụng để nhận biết các chất (kiểm tra độ tinh khiết), để xác định các nhóm chức (phân tích cấu tạo), để định lượng hợp chất hữu

cơ và để nghiên cứu tác dụng tương hỗ nội phân tử và ngoại phân tử…

Để kiểm tra độ tinh khiết người ta đem so phổ đồ của chất với phổ đồ mẫu

có sẵn trong phổ đồ bản hoặc thư viện phổ (sử dụng phần mềm máy tính) Nói chung để nhận biết một chất chưa biết bằng phương pháp phổ hồng ngoại, điều quan trọng là phải biết giải thích phổ

Trong trường hợp thông tin cấu trúc dự đoán chưa đủ tin cậy thì cần dựa vào các phương pháp phổ khác hoặc bằng mẫu thử hóa học thích hợp

Ngoài ra, trên cơ sở của định luật Lambert - Beer phổ hồng ngoại còn được ứng dụng trong phân tích định lượng

Hình 1.1 Phổ hồng ngoại của 7 - hidroxy - 4- metylcoumarin

Đường cong biểu diễn cường độ hấp thụ với số sóng của bức xạ hồng ngoại được gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp thụ ứng với những dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử hay liên kết nhất định

Trang 13

Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo được đối chiếu với các dao động đặc trưng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân tử Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của các phân

tử khác nhau thì khác nhau, tương tự như sự khác nhau của các vân ngón tay

Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thường được làm dẫn chứng cho hai hợp chất giống nhau

Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu được chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trưng Các pic nằm trong vùng từ 4000 - 1600 cm-1 thường được quan tâm đặc biệt, vì vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, như OH, NH, C=O, C≡N… nên được gọi là vùng nhóm chức Vùng phổ từ 1300 - 626 cm-1 phức tạp hơn và thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định nhóm chức Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm-1 được gọi là vùng vân ngón tay

1.1.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR và 13 C-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) [3,4] là phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ Phương pháp phổ biến được

sử dụng là phổ 1H-NMR và 13C-NMR Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13C có momen từ Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường Đó là spin hạt nhân

có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2

Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt

nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau Đặc trưng cho các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt

nhân 1H thì: 106(ppm)

o

x TMS

Trang 14

Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học được định nghĩa một các tổng quát như sau:

) ( 10

o

x chuan

có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học của mỗi hạt nhân khác nhau Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường yếu hơn sẽ có

độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn

Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có mặt trong chất được khảo sát Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên

mà được tính bằng phần triệu (ppm) Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12

ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm

Hình 1.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat

Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân

không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần Nguyên nhân gây nên sự tách

Trang 15

tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có

từ tính ở cạnh nhau Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết Giá trị J

phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên kết ngăn giữa các tương tác

Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa các

hợp phần của một vân phổ Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có thể rút

ra kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau

1.1.3 Phương pháp phổ khối lượng (MS)

Phương pháp phổ khối lượng (MS) [3,5] là một phương pháp phân tích công cụ quan trọng để phân tích thành phần và cấu trúc của các hợp chất vô cơ

và hữu cơ Trong phương pháp phổ khối lượng, các phân tử của mẫu chất được ion hóa và được phân mảnh Các ion xuất hiện được phân tách theo số khối của chúng và được ghi nhận dưới dạng các tín hiệu trên phổ Vị trí của tín hiệu cho biết số khối và cường độ của tín hiệu cho biết hàm lượng tương đối của ion tương ứng

a Cơ sở lí thuyết

Như đã biết trong các phương pháp phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân người ta giữ nguyên phân tử để nghiên cứu thì ở phương pháp phổ khối lượng người ta lại “phá hủy” phân tử để nghiên cứu chúng

Trong phương pháp phổ khối lượng, trước tiên mẫu chất được làm bay hơi, sau đó các phân tử bị bắn phá bởi chùm electron phóng ra từ catot của một ống phóng điện với năng lượng cao và bị ion hóa

Để có thể giải phóng ra được một electron ra khỏi phân tử, electron va chạm phải có một động năng tối thiểu bằng năng lượng ion hóa của phân tử (7-15eV)

Giả sử phân tử (ABC) với A, B, C có thể là một nguyên tử hay nhóm nguyên tử va chạm với các electron có năng lượng cao hơn năng lượng ion hóa, đầu tiên xảy ra sự ion hóa phân tử [25]:

Trang 16

(ABC) + 1e  (ABC)+ + 2e (a)

(ABC) + e  (ABC)Z+ + (z+1)e (b)

(ABC) + e  (ABC)- (c)

Ở quá trình (a) sự va chạm với electron đã loại phân tử một electron Vì

ở các phân tử hữu cơ các electron đều ghép đôi nên phân tử mất một electron thì ion được tạo thành có một electron độc thân

Ở quá trình (b) phân tử bị mất Z electron (Z = 2, 3) khi đó tạo ra ion phân

tử mang điện tích Z+

Ở quá trình (c) phân tử nhận một electron và trở thành anion gốc Hai quá trình (b) và (c) có xác suất rất thấp Do đó quá trình (a) là quan trọng nhất và trong hầu hết các trường hợp chỉ có sự tách một electron ra khỏi phân

(ABC)-tử và từ đó các ion hầu hết là ion dương hóa trị 1

Các ion sinh ra được phân tách, rồi ghi lại tín hiệu theo tỉ số khối lượng, điện tích (m/Ze) của chúng Trong máy phổ khối lượng chỉ những ion dương mới đến được bộ phận tách, còn ion âm thì bị giữ lại ở buồng ion hóa, các phân

tử trung hòa thì được hút ra ngoài

Vì xác suất tạo thành các ion có Z>1 là rất nhỏ và vì e là điện tích electron, được quy ước bằng 1 đơn vị điện tích, nên thông thường(m/Ze) hay (m/e) chính

là số khối của ion

b Ứng dụng của phổ khối

- Xác định các hợp chất chưa biết bằng cách dựa vào khối lượng của phântử hợp chất hay từng phần tách riêng của nó

- Xác định kết cấu chất đồng vị của các thành phần trong hợp chất

- Xác định cấu trúc của một hợp chất bằng cách quan sát từng phần tách riêng của nó

-Xác định công thức phân tử dựa vào phân tử khối chính xác hoặc dựa vào cường độ tương đối của ion phân tử đồng vị

Trang 17

1.1.4 Phân tích hàm lượng các chất bằng HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) [6] là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhừ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường Chính vì thế mà các thuốc không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký Sắc ký thường được hoàn thành trong một thời gia ngắn (khoảng 30 phút) Chỉ những thành phần có hệ số chọn lọc khác nhau mới có thể phân tích được bằng HPLC Ngày nay HPLC đã và đang được sử dụng nhiều trong lĩnh vực phân tích hóa học nói chung cũng như trong kiểm tra chất lượng thuốc và phân tích sinh dược nói riêng

Hình 1.3 Sơ đồ thiết bị phân tích HPLC

(1) Bình chứa pha động: Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào

đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần

để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%

(2) Bộ khử khí Degases: Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai trừ các

bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi dẫn đến sai kết quả phân tích

Trang 18

(3) Bơm cao áp: Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình

chia tách sắc ký Bơm phải tạt được áp suất cao khỏang 250-600 bar và tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10 ml/phút

(4) Bộ phận tiêm mẫu: Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích

bơm có thể thay đồi

(5)Cột sắc ký:Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều

dài cột thay đổi từ 5-25 cm đường kính trong 1-10 mm, hạt nhồi cỡ 5µm,…Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký

0,3-(6) Đầu dò: Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho

các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất phân tích mà người ta lựa chọn lọai đầu dò phù hợp.Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…

(7) Bộ phận ghi nhận tín hiệu: Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát

hiện.Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak như tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính toán, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tích

(8) In dữ liệu: Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in

kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển

Ngày nay, phương pháp HPLC được ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh vực phân tích định tính cũng như định lượng các thành phần trong dược phẩm, thực phẩm, môi trường, hóa chất,… Thiết bị HPLC cũng ngày càng phát triển và hiện đại hơn nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo và sản xuất thiết

bị phân tích.Để đảm bảo chất lượng kết quả phân tích nhiều loại chỉ tiêu trên các nền mẫu khác nhau, đáp ứng được nhu cầu phân tích đa dạng của khách hàng, CASE cũng đã đầu tư các hệ thống HPLC hiện đại của các hãng nổi tiếng trên thế giới trong sản xuất thiết bị phân tích như Shimadzu (model 10A, 20A),

Trang 19

Agilent (LC 1200), Dionex (UltiMate 3000), Thermo, Mehtrom…với hầu hết các đầu dò như quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS), huỳnh quang (RF), khúc xạ (RI), đo độ dẫn (sắc ký ion-IC), khối phổ (MS),… Các hệ thống HPLC này đều có gắn các bộ chích mẫu tự động nhằm nâng cao tính chính xác và có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu

1.2 GIỚI THIỆU VỀ NẤM HƯƠNG (LENTINULA EDODES)

Nấm hương (còn gọi là nấm đông cô) là loại nấm ăn có nguồc gốc bản địa ở Đông Á

Tên khoa học: Lentinula edodes

Đặc điểm phân loại[10,11]:

có những vảy nhỏ màu trắng Thịt nấm màu trắng, cuống hình trụ Nấm mọc trên những cây có lá to và thay lá mỗi mùa như dẻ, sồi, phong[10,11]

Thành phần hóa học

Trong 100g nấm hương khô (phần ăn được) chứa 13 g nước, 19 g protein, 1,8g lipit, 54g hydratcacbon, 7,8g chất xơ, 4,9g chất khoáng Vitamin trong

Trang 20

nấm hương: B1, B2, B12, PP, provitamin D Ngoài ra, còn chứa 9 loại axit amin không thay thế: Isoleuxin, Leuxin, Lysin, Metionin, Phenylalamin, Valin, Tyrosin, Trytophan, Alanin

Hơn nữa trong nấm hương và hệ sợi nấm hương có tới 40 loại enzyme

Một số enzym đáng chú ý: enzym β-(1-3)-glucozidaza, kitinaza, lipoidaza,

ligninaza, pepsin, loxintinaza, pectinaza, saccaraza, transferaza, hemixenlulaza, amylotransferaza, inulaza, glycozidaza, insulinaza, asparaginaza, peroxydaza, lactaza, tyrozin oxydaza,…[20,26,28] Theo Mizuno yếu tố tạo nên hương thơm, vị ngon của nấm là monosodium glutamat, nucleotit, amino axit tự do, chuỗi peptit, axit hữu cơ (axit malic, axít fumalic, axít glutaric, axit oxalic, axit lactic,… ) và đường [22]

Các nhà khoa học đã chiết xuất được chất Lentinan và Lentinula Edodes

Mycelium (LEM) từ nấm hương Đây là 2 chất chính tạo nên tác dụng dược lý

của loại nấm này [22]

1.3 LENTINAN

1.3.1 Đặc điểm cấu tạo

Lentinan là một β-glucan có chứa liên kết glycosidic β -1,3/β -1,6 Đó là

một polysacarit gồm các β-D-glucopyranose liên kết với nhau, trong đó cách 5 liên kết (1-3)-β-D-glucopyranose lại có hai nhánh liên kết (1-6) -β-

glucopyranose

Trọng lượng phân tử: xấp xỉ 500.000 Da

Công thức phân tử: (C6H10O5)n

Độ quay riêng: 14-220 (NaOH)

Danh pháp hóa học: β-

D-glucopyranosyl-(1→6)-[β-D-glucopyranosyl-

(1→3)-[β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranose

Lentinan có cấu trúc điển hình của chuỗi xoắn kép ba [16,18,25,30]

Các (1,3)-β-D-glucan khác nhau bởi khối lượng phân tử, chiều dài mạch

chính, mức độ phân nhánh và chiều dài mạch nhánh.Kiểu cấu tạo mạch của các

glucan có sự phân biệt khá lớn theo nguồn gốc của chúng

(1,3)-β-D-glucan của nấm thường là một mạch phân nhánh dạng xương cá với mạch ngắn nối vào mạch chính bằng dây nối 1→6 [12, 29]

Trang 21

Hình 1.4.Sơ đồ cấu trúc Lentinan[13]

Hình 1.5 Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử AFM ( Atomic force

microscope) và ảnh của Lentinan trong dung dịch 25 0 C[32]

Hình 1.6 Mô hình phân tử xoắn kép ba theo chiều phải của β-glucan

(Lentinan)[29]

Trang 22

Các (1,3)-β-D-glucan của nấm men có cấu tạo tương tự của nấm nhưng

1.3.2 Hoạt tính và ứng dụng của Lentinan

Hoạt tínhcủa Lentinan

Do Lentinan là một (1,3)/(1,6)-D-glucan nên nó mang hoạt tính của glucan Hoạt tính sinh học được chú ý nhiều nhất của (1,3)-β-D-glucan là tác

β-dụng trên hệ miễn dịch Nó có tác β-dụng kích thích miễn dịch không đặc hiệu

(1,3)-β-D-glucan có tác dụng làm tăng đáp ứng miễn dịch ở các bạch cầu và các

tế bào biểu mô mà tác dụng chủ yếu là điều hòa sản xuất cytokine [12,32]

Trang 23

Các nghiên cứu in vitro cho thấy một số (1,3)-β-D-glucan làm gia tăng các hoạt tính chức năng của đại thực bào kích thích tiết TNF-α, làm hoạt hóa

chức năng kháng khuẩn của bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính, làm tăng đáp ứng miễn dịch bởi gia tăng sản xuất cytokine tiền viêm, bùng phát oxy hóa

và sản xuất chemokin Các đặc tính này giúp cơ thể chống lại sự nhiễm khuẩn cũng như tiêu diệt các tác nhân gây bệnh [12,14,16,19]

(1,3)-β-D-glucan làm tăng sản xuất đại thực bào, bạch cầu và các tế bào

tiêu diệt ung thư tự nhiên của cơ thể cũng như tăng hoạt tính của các tế bào

T-helper, làm tăng mức IL-1, và TNF-α [12]

(1,3)-β-D-glucan cũng được nghiên cứu sử dụng cùng với các hóa chất

trị ung thư làm tăng hiệu quả điều trị [12,14,16]

(1,3)-β-D-glucan có tác dụng làm giảm sự tăng đường huyết, đặc biệt là

sau bữa ăn do chúng làm chậm lại sự rỗng dạ dày dẫn tới làm cho việc hấp thu glucose điều hòa hơn, làm gia tăng sản xuất IL-1α ở các đại thực bào và tăng

tiết IL-2, IL-4 ở tế bào tụy (1,3)-β-D-glucan làm tăng sự nhạy cảm với insulin

của các cơ quan [12]

Hình 1.8 Cơ chế kháng u của Lentinan [32]

Trang 24

(Colony Stimulating Factor: nhân tố kích thích dòng tế bào;General Potentiation of Host

Resistance: tăng khả năng đề kháng của vật chủ; liver: gan; serum protein: protein huyết

thanh; anaphylatoxin: độc tố phản vệ; activated macrophage: đại thực bào được hoạt hóa; non specific:không đặc hiệu; complement C3: tế bào bổ sung C3; destruction: tiêu

diệt; antibodies: kháng thể; tumor antigens: kháng nguyên khối u;

Null (K): tế bào không có hiệu lực)

Nguồn β-glucan trong tự nhiên

(1,3)-β-D-glucan có trong : nấm Phục linh (94%), nấm Linh chi, nấm

hương, nấm Tọa kê, nấm Múa, nấm men bia, cám lúa mạch(7%), yến mạch(5%), lúa mạch đen (2%), lúa mì (<1%) Ngoài ra, còn có trong một số loài rong biển Thường có trong thành tế bào thực vật, hạt ngũ cốc, nấm men, nấm và vi

khuẩn[10,11] Hàm lượng β-glucan có trong các loại nấm ăn dao động trong

khoảng 0,22 - 0,53 g/100 g chất khô [10,19]

Ứng dụngcủa Lentinan

Ứng dụng của Lentinan (β-glucan) trong thực phẩm và y dược:

Gần đây, Lentinan (β-glucan) được khai thác sử dụng nhiều làm tăng

hoạt tính sinh học của thực phẩm chức năng như bổ sung sợi hòa tan tạo các sản phẩm cô đặc, các sản phẩm từ ngô, đồ ăn nhanh, pho mát hàm lượng chất béo thấp kiểu Cheddar hoặc các sản phẩm pho mát mặn, sữa chua, vv β-glucan được sử dụng làm phụ gia thực phẩm để tăng sự tiêu hóa và chữa rối loạn tiêu hóa [24,25,28], do khả năng giữ nước cao, không tạo gel, không bị phân hủy bởi enzym tiêu hóa ở người

Hiện nay ở Ireland lưu hành sản phẩm Megazyme chứa Lentinan

(β-glucan) làm chất tăng cường hệ thống miễn dịch cho cơ thể [22].Các công ty của Nhật như Công ty Ajinomoto, Yamanouchi từ sợi nấm hương bào chế ra Lentinan như là một dược phẩm chống ung thư, đặc biệt trong điều trị ung thư

dạ dày cho hiệu quả cao, tiêm với liều 25 mg/kg trong 10 ngày liên tục

[15,18,23] Ở Châu Âu có sản phẩm Lentinex chứa Lentinan được sử dụng rất

phổ biến [28]

Trang 25

Ngoài ra, thị trường thế giới lưu hành các loại β-glucan có nguồn gốc từ nấm men, yến mạch, nấm dược liệu, vd: GlycaNova (Na Uy) [ 22,28]

Ứng dụng của β-glucan trong mỹ phẩm: β-1,3-glucan còn có khả năng

cảm ứng hoạt tính của tế bào Langerhans khi bôi lên da, làm se lỗ chân lông, giảm số lượng, độ sâu, độ dài của nếp nhăn, cảm ứng tổng hợp collagen và elastin, giảm màu đỏ, giảm kích thích và sự khô da, giảm số lượng và kích cỡ tổn thương trên da, có thể thêm vào kem bôi da, mỹ phẩm thuốc mỡ, kem cạo râu,vv…[10]

Ứng dụng của β-glucan trong nuôi trồng thủy sản: Có một số nghiên cứu

sử dụng β-glucan như một chất kích thích hệ thống miễn dịch tiềm năng trong

nuôi trồng thủy sản [8]

1.4 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH LENTINAN

1.4.1 Một số phương pháp chiết tách phổ biến

Bản chất Lentinan là β-glucan - một polysaccarit do đó các phương pháp tách chiết β-glucan cũng dựa trên nguyên lý chung tách chiết các polysaccarit

Cơ bản có 2 phương pháp tách chiết β-glucan là phương pháp hóa học và

phương pháp enzyme [20,23,27,31]

- Phương pháp hóa học: thường sử dụng natri hydroxide (NaOH) hay kali hydroxide (KOH), hoặc natri hydro cacbonat (NaHCO3), hoặc natri cacbonat (Na2CO3) để chiết β-glucan Sau đó tiến hành ly tâm thu hồi và tinh chế Phương

pháp hóa học thích hợp với các mẫu phân tích chứa lớn hơn 20% glucan tổng

số Theo nghiên cứu của Mỹ các phương pháp này đạt hiệu suất thu hồi 80%, quy trình đơn giản, không tốn kém tuy nhiên thời gian tách chiết lâu

50 Phương pháp enzym: sử dụng enzym β50 1,350 glucanaza để tách chiết β50

β-glucan sau đó tiến hành tinh chế Phương pháp enzym thích hợp với các mẫu

phân tích có chứa hàm lượng β-glucan thấp Phương pháp này đạt hiệu suất thu

hồi hơn 80%, thời gian tách chiết ngắn nhưng yêu cầu về thiết bị hiện đại, chi

phí cao

Trang 26

Mặt khác, do Lentinan có cấu trúc chuỗi xoắn kép ba và có trọng lượng

phân tử độ lớn thích hợp nên nó mang hoạt tính sinh học giá trị: kháng u, kháng

vi rút [29,33].Trong hỗn hợp nước/dimethyl sulfoxide (DMSO), hoặc dung dịch NaOH hoặc ở nhiệt độ trên 1400C thì cấu trúc xoắn kép ba của Lentinan

bị biến đổi thành chuỗi xoắn đơn do các tác nhân biến tính làm gián đoạn liên

kết hydro trong cấu trúc xoắn kép ba Mức độ biến tính cấu trúc Lentinan thể hiện ở độ quay riêng Lentinan tinh khiết trong nước có độ quay riêng 250 Có

tác động của DMSO (100%) độ quay riêng của Lentinan là -160 Lentinan trong

dung dịch NaOH 1% độ quay riêng là -20 Sau khi Lentinan được xử lý bằng

DMSO (100%) hoặc NaOH 1% đem làm sạch bằng phương pháp thẩm tích thì

độ quay riêng tăng, đạt giá trị 170-200 Khi đó tùy trường hợp mà hoạt tính

kháng u, kháng vi rút của Lentinan bị giảm đáng kể hay mất hoàn toàn [29]

Như vậy, không phải dễ dàng đưa ra được phương pháp chiết tách

Lentinan phù hợp mà không ảnh hưởng tới hoạt tính sinh học của nó

Phương pháp chiết bằng kiềm: thường sử dụng dung dịch NaOH/NaBH4

để chiết β-glucan [7] Tuy nhiên, kiềm cũng làm biến đổi đáng kể cấu trúc xoắn

kép ba của β-glucan tạo thành các phân tử bất hoạt [29]

Dùng sóng siêu cao (400 MPa) làm tăng tốc độ chiết và thời gian chiết được rút ngắn rất nhiều Nhưng theo nghiên cứu gần đây chứng minh rằng nếu

sử dụng sóng siêu cao tới 500 MPa có thể làm phân ly hoặc biến tính một số đại phân tử Đặc biệt, trong quá trình chiết bằng sóng siêu cao các polysacarit

như Lentinan có thể bị thay đổi trật tự sắp xếp cấu trúc [30]

Hiện nay sử dụng chất lỏng ion để chiết tách Lentinan từ nấm hương là

phương pháp mới nhất, không làm ảnh hưởng tới cấu trúc và hoạt tính của

Lentinan.Chất lỏng ion là muối hữu cơ có dạng lỏng khi ở nhiệt độ dưới 1000C,

áp suất hơi thấp, tính ổn định nhiệt cao, có khả năng solvate các phân tử phân cực cũng như không phân cực [21] Tuy nhiên, ứng dụng của chất lỏng ion vào công nghiệp chiết tách còn khá mới và giá các chất lỏng ion tương đối đắt

Dựa vào phân tích thấy rằng sử dụng những phương pháp trên để chiết

tách Lentinan từ nấm hương đều có những ưu nhược điểm nhất định Do đó,

Trang 27

tùy mục đích sử dụng hoặc tùy điều kiện trang thiết bị ở mỗi nơi mà đưa ra

phương pháp chiết hợp lý, hiệu quả và kinh tế nhất

1.4.2 Định hướng lựa chọn phương pháp chiết tách Lentinan

Qua quá trình nghiên cứu thăm dò và tham khảo tài liệu, chúng tôi có

định hướng sử dụng nước ở nhiệt độ thích hợp và etanol để chiết tách, thu hồi

Lentinan Tuy nhiên, cần có nghiên cứu so sánh với phương pháp khác để đưa

ra phương án thích hợp nhất

Theo tác giả Mizuno (1999), để chiết Lentinan trước tiên, bột nấm hương

khô được làm nóng liên tục trong cồn 80% để chiết và loại các chất trọng lượng

phân tử thấp Phần nấm sau khi chiết bằng etanol đem chiết lần lượt bằng nước

nóng 1000C, 3h; 1% ammonium oxalate (100oC, 6h) và 5% NaOH (80oC, 6h)

để thu được các phần chiết thô Tinh chế tiếp bằng các kỹ thuật: thu hồi etanol,

kết tủa phân đoạn, kết tủa bằng axit axetic, sắc ký trao đổi ion, lọc gel và sắc

ký ái lực [23] Thực hiện chiết Lentinan theo phương pháp này thời gian chiết

khá dài (≥15 ngày), cần nhiều thiết bị tinh vi, và rất nhiều loại hóa chất khác

nhau, khá phức tạp,hiệu suất chiết thấp, nên giá thành sản phẩm cao

Ở Việt Nam, các nhà nghiên cứu tại Viện công nghệ sinh học (2005) đã

đưa ra qui trình tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men sử dụng NaOH

3,3% ở 750C trong 18 giờ, rồi tinh chế tiếp bằng NaOH 3% ở 750C, cồn và

dietylete [7] Qui trình này dùng kiềm hai lần để chiết nên không thể tránh khỏi

ảnh hưởng của kiềm tới sự biến đổi cấu trúc xoắn kép ba của β-glucan tạo thành

các phân tử bất hoạt, do đó chất lượng sản phẩm cũng bị giảm đáng kể Giá

thành sản phẩm khá cao

Nhóm nghiên cứu đề tài này chỉ dùng nước và etanol 950 để chiết

Lentinan từ nấm hương, chiết hai lần lặp lại, có sử dụng nitơ lỏng, sấy đông

khô, thời gian chiết khoảng 6 ngày Phương pháp chiết chỉ dùng những thiết bị

đơn giản phù hợp điều kiện Việt Nam và dung môi thân thiện môi trường

Trang 28

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng

- Nấm hương khô (Lentinula edodes ) thu mua tại Sapa (Lào Cai)

- Tai nấm mặt trên màu nâu đến nâu nhạt,

mặt dưới có nhiều bản mỏng xếp lại màu ngà

- Thịt nấm màu trắng ngà

- Cuống hình trụ dài khoảng 0,5-1 cm, màu

nâu sáng

- Đường kính tai nấm khoảng 2-3 cm

- Trung bình 100 g nấm khô có khoảng

+ Hóa chất chiết tách: Etanol; Etyl axetat; Metanol; Diclometan;

Clorofom; Axit axetic; Ammonium oxalat; 1-Butanol; n-Hexan; Axit boric;

Nhựa trao đổi ion DEAE-Cellulose (diethylaminoethyl-cellulose) (Sigma

- Cân điện EB-2800 (Nhật);

- Máy cất quay chân không (RV10 control D, IKA-Đức);

Trang 29

- Máy ly tâm HERMLE Z300 của Đức;

- Máy ghi phổ khối VARIAN 920-MS (Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ VN);

- Máy ghi phổ NMR Bruker AM 500 FT-NMR (Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ VN)

- Một số thiết bị, dụng cụ cần thiết khác

2.2 THỰC NGHIỆM

2.2.1 Phân tích hàm lượng Lentinan

- Chiết xuất nhanh β-glucan từ quả thể nấm hương khô

Cân 100 mg quả thể nấm hương khô và 10 ml nước cất đem hấp ở nhiệt độ

121oC, áp suất 1at trong 15 phút Sau đó ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong

15 phút Lọc qua giấy lọc Whatman Dịch lọc thu được pha trộn với 4 lần etanol 95%, lắc mạnh và để qua đêm ở 4oC Sau đó ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút Phần nổi lên được bỏ đi và phần huyền phù phía dưới được ủ với NaOH 1M ở 60 oC trong 1h Lượng β-glucan được xác định bằng phương pháp

phenol-sulfuric [9]

- Phương pháp xác định hàm lượng Lentinan (β-glucan)

Phương pháp phenol-sulfuric xác định Lentinan (β-glucan) dựa trên việc

hấp thụ tại bước sóng 490 nm của phức chất tạo bởi phenol và cacbohydrate

Hàm lượng β-glucan được xác định bằng cách so sánh với một đường chuẩn

Sử dụng máy quang phổ hấp thụ, chọn bước sóng 490 nm, xây dựng đường chuẩn, đo các mẫu phân tích Tùy từng điều kiện phương pháp phenol-sulfuric

có độ chính xác đến ± 2% [9]

- Xây dựng đường chuẩn

Quy trình lập đường chuẩn β-glucan như sau:

- Pha phenol 4%: cân 4g phenol, hòa tan trong bình định mức 100 ml bằng nước cất, sau khi phenol tan hết, thêm nước cất đến vạch định mức

- Cân 1g D-glucose tinh khiết (chất chuẩn), hòa tan trong bình định mức 1lít bằng nước cất sau khi glucose tan hết, thêm nước cất đến vạch định mức Tạo dung dịch chuẩn với nồng độ 1 mg/ml (1000 ppm)

Trang 30

- Từ dung dịch chuẩn pha thành dãy chuẩn với các nồng độ: 0,2 mg/ml; 0,1 mg/ml; 0,05 mg/ml; 0,02 mg/ml; 0,01mg/ml; tương ứng với các nồng độ

200 ppm; 100 ppm; 50 ppm; 20 ppm; 10 ppm

- Lấy 5ml mỗi nồng độ chất chuẩn đưa vào các lọ 10 ml

- Thêm lần lượt vào tất cả các lọ chuẩn 0,5 ml dung dịch phenol 4% sau

đó thêm lần lượt vào tất cả các lọ 2,5 ml dung dịch H2SO4 96%

- Chuyển dãy chuẩn ra các cuvet và đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng

là 490 nm

Hình 2.1 Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào

nồng độ D -glucose

- Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ

D-glucose để xác định hàm lượng β-glucan tổng số được thể hiện trên hình 2.1

Dãy chuẩn với các nồng độ: 10 ppm, 20 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm đều tạo thành các điểm nằm hoặc rất gần đường thẳng y = 0,0026x + 0,0056 Đường chuẩn có hệ số tuyến tính R2 = 0,9996

- Tính toán xác định hàm lượng β-glucan trong quả thể nấm hương khô

+ Từ đường chuẩn xác định được nồng độ mẫu phân tích

+ Hàm lượng β-glucan được tính theo công thức sau:

y = 0.0026x + 0.0056

R 2 = 0.9996

0 0.1

Trang 31

Hàm lượng β-glucan (%) = 100

) (

8 10 ) (  3 

g KLMPT

g x

Trong đó: x là số gam xác định từ đường chuẩn

8 là hệ số pha loãng KLMPT là khối lượng mẫu ban đầu đem phân tích = 0,1g + Giá trị trung bình được tính từ 3 mẫu song song

Số liệu được xử lý thống kê bằng Microsoft Excel

2.2.2 Phương pháp tạo mẫu phân tích Lentinan

Giai đoạn 1: Chất chiết thô có hàm lượng Lentinan 46,20% hòa vào nước,

có bổ sung than hoạt tính 1-3% (w/v), khuấy đều trong 1 giờ để loại bớt chất màu Đem ly tâm 3000 vòng/phút, loại bỏ cặn, thu dịch Bổ sung etanol 95% vào dịch đó với tỉ lệ dịch lọc/etanol = 1/2 (v/v), khuấy đều, để yên 30 phút Ly tâm 5000 vòng/ phút thu kết tủa A, rửa kết tủa A hai lần bằng etanol Đông lạnh

bằng nitơ lỏng, đông khô 24 giờ, thu được Lentinan có hàm lượng khoảng

80-82% (Sản phẩm A)

Giai đoạn 2: Sản phẩm A đem hòa vào đệm pH thích hợp tạo thành dung dịch B có nồng độ 5-10% (w/v) Dung dịch B cho chảy qua cột nhựa trao đổi anion LX-67, tốc độ dòng chảy 5-7 ml/phút, protein trong dung dịch A sẽ hấp phụ vào cột Phần dịch chảy ra khỏi cột gọi là dung dịch C Thêm etanol 95% lạnh 5oC vào dung dịch C theo tỉ lệ dung dịch C/etanol = 1/3 Khuấy đều, để lắng trong 24 h ở nhiệt độ 5oC Sau đó, ly tâm 5000 vòng/ phút, thu kết tủa,

rửa kết tủa hai lần bằng axeton Thu được mẫu Lentinan (M2) tinh khiết > 95%

2.2.3 Phân tích xác định cấu trúc của Lentinan

2.2.3.1 Phân tích cấu trúc của Lentinan bằng phương pháp Phổ khối

(ESI-MS)

Lấy 1 mg chất mẫu chất M2 đã chuẩn bị ở trên được pha trong 1 ml dung

dịch DMSO, lắc đều để tạo thể thống nhất Sau đó mẫu được đưa vào máy ghi phổ khối VARIAN 920-MS tại Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam để ghi phổ MS

Trang 32

ESI-TOF-MS (negative): m/z 1151.4629 [M-H]-, 989.3976 glucose-H2O]-, 989.3976 [M-H-2×glucose-2×H2O]-, 827.3315, 665.2624,

[M-H-503.1983, 341.1331, 179.0696

2.2.3.2 Phân tích cấu trúc của Lentinan bằng phương pháp Phổ NMR

Lấy 25 mg mẫu chất M2 hòa tan vào 0,8 ml CDCl3 trong ống NMR loại (tubes NMR của Aldrich) dài 20,3 mm, đường kính 5 mm Lắc đều cho mẫu tan hết vào dung môi tạo thành hệ đồng nhất Mẫu được đo trên máy Bruker-Advance 500 MHz với TMS là chất chuẩn, tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

1 H-NMR (D2O, 500 MHz)δ ppm: 5.89 (1H, br s), 4.42 (1H, t, J = 9.5 Hz),

4.34 (1H, m), 4.31 (1H, m), 4.29 (1H, m), 4.11 (1H, m), 4.09 (1H, m)

13 C-NMR (D2O, 125 MHz) δ ppm: 101.9, 101.7, 79.6, 75.4, 73.7, 73.5,

62.8

2.2.3.3 Phân tích cấu trúc của Lentinan bằng phương pháp Phổ IR

Cân 2 mg mẫu M2 và 100 mg KBr vào cối mã não, trộn đều và được

nghiền mịn thành hỗn hợp đồng nhất bằng chày của cối mã não Hỗn hợp này được đưa vào thiết bị ép viên thủy lực 50 tấn của hãng HP, sau đó mẫu được

đo trên máy Spectrum Two Perkin Elmer tại Phòng Hóa dược, Viện Hoá học - Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam

IR (KBr): 3367.98, 2931.77, 1645.22, 1458.32, 1423.57, 1368.04,

1079.77, 1019.68, 765.86, 575.03 (cm-1)

2.2.3.4 Phân tích xác định khối lượng phân tử trung bình của Lentinan

Khối lượng phân tử trung bình của Lentinan xác định bằng phương pháp

sắc ký thẩm thấu gel (Gel Permeation Chromatography - GPC) Phép đo GPC được thực hiện trên thiết bị HPLC Agilent 1100, với cột Shodex SB-806HQ và detector RID (refractive index detector) tại Khoa Y Dược ĐHQGHN Nhiệt

độ của cột được giữ ở 60°C Mẫu M2 được chuẩn bị với nồng độ ban đầu 1 mg/mL, thể tích bơm mẫu 20 µL với tốc độ dòng 1 mL/min Sử dụng dung môi sắc ký là NaCl tại nồng độ 1 mg/mL

Trang 33

Định dạng
Số trang	66
Dung lượng	2,68 MB