Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương (Luận văn thạc sĩ)

Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương (Luận văn thạc sĩ)Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương (Luận văn thạc sĩ)Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương (Luận văn thạc sĩ)Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương (Luận văn thạc sĩ)Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương (Luận văn thạc sĩ)Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương (Luận văn thạc sĩ)Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương (Luận văn thạc sĩ)Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương (Luận văn thạc sĩ)Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương (Luận văn thạc sĩ)Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương (Luận văn thạc sĩ)Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương (Luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐỖ THANH KIM HƯỜNG

TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN

GEN GmDREB7 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐỖ THANH KIM HƯỜNG

TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN

GEN GmDREB7 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG

Ngành: Di truyền học

Mã số: 8 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn là kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của GS.TS Chu Hoàng Mậu Các số liệu, kết quả sử dụng trong luận văn là trung thực và được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn và nhóm nghiên cứu

Tác giả luận văn

Đỗ Thanh Kim Hường

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn thạc sĩ này

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và TS Nguyễn Thị Hải Yến - Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi tiến hành các thí nghiệm trong đề tài luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của thầy cô và cán bộ Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục Sinh học; cảm ơn các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động viên, chia sẻ và giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành bài luận văn này

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2019

Tác giả luận văn

Đỗ Thanh Kim Hường

Tác giả luận văn

Đỗ Thanh Kim Hường

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN……… i

LỜI CẢM ƠN……… ii

TÀI TRỢ……… iii

MỤC LỤC……… iv

DANH MỤC CÁC BẢNG……… v

DANH MỤC CÁC HÌNH……… vi

DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT……… vii

MỞ ĐẦU……… 1

1 Đặt vấn đề……… 1

2 Mục tiêu nghiên cứu……… 2

3 Nội dung nghiên cứu……… 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài……… 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 4

1.1 Đặc tính chống chịu của thực vật……… 4

1.1.1 Tác động của các nhân tố phi sinh học đến thực vật………… 4

1.1.2 Cơ chế phân tử của đặc tính chống chịu các yếu tố bất lợi của thực vật……… 5

1.2 Họ nhân tố phiên mã AP2……… 6

1.2.1 Cây đậu tương……… 6

1.2.2 Nhân tố phiên mã DREB ở cây đậu tương……… 8

1.3 Vector biểu hiện gen thực vật và đánh giá hoạt động của vector chuyển gen trên cây thuốc lá mô hình……… 12

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 16 2.1 Vật liệu nghiên cứu……… 16

2.1.1 Vật liệu thực vật……… 16

2.1.2 Các loại vector và chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu……… 16

2.2 Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu……… 16

2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu……… 16

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu……… 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 17

2.3.1 Nhóm phương pháp phân lập và xác định trình tự nucleotide của gen GmDREB7……… 18

2.3.1.1 Tách chiết RNA tổng số và nhân bản gen GmDREB7 từ cDNA……… ……… 18

2.3.1.2 Tách dòng gen GmDREB7……… 19

2.3.1.3 Xác định trình tự nucleotide……… 21

2.3.2 Nhóm phương pháp thiết kế gen GmDREB7, vector chuyển gen và tạo dòng vi khuẩn A tumefaciens CV58 mang vector chuyển gen chứa gen GmDREB7………

21

2.3.3 Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua A tumefaciens 22 2.3.4 Nhóm phương pháp phân tích, xử lý số liệu……… 24

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN…… 25

3.1 Đặc điểm của gen GmDREB7 phân lập từ giống đậu tương

DT2008… 25 3.1.1 Kết quả nhân bản, tách dòng và giải trình tự gen

GmDREB7 25

3.1.2 Mối quan hệ di truyền giữa giống đậu tương DT2008 và các

mẫu đậu tương mang mã số BT092314, BT089389, NM001249580,

NM001248527, AY244760 trên GenBank………

31 3.2 Thiết kế gen và vector chuyển gen thực vật mang gen

3.2.2 Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen

GmDREB7 34

3.3 Chuyển gen và phân tích sự biểu hiện của gen GmDREB7 trên

3.3.1 Kết quả chuyển cấu trúc mang gen GmDREB7 vào cây thuốc

3.3.2 Phân tích sự có mặt và sự biểu hiện ở mức phiên mã của gen

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

1 Kết luận 41

2 Đề nghị 41

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Trình tự nucleotide của các cặp mồi PCR……… 19

Bảng 2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn……… 20

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn gen GmDREB7 vào vector tách

Bảng 2.4 Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá……… 24

Bảng 3.1 Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen

GmDREB7 giữa giống đậu tương DT2008 và trình tự nucleotide

Bảng 3.2 Các vị trí sai khác trong trình tự amino acid suy diễn từ gen

GmDREB7 giữa giống đậu tương DT2008 và trình tự nucleotide

mang mã số BT092314 trên GenBank……… 30

Bảng 3.3 Kết quả biến nạp cấu trúc pBI121_GmDREB7 vào cây

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121……… 13

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát……… 18

Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121_GmDREB7…… 22

Hình 3.1 Sơ đồ thiết kế cặp mồi DREB7-F/DREB7-R 25

Hình 3.2 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại đoạn gen

GmDREB7 từ cDNA của giống đậu tương DT2008……… 26

Hình 3.3 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR từ 4 dòng

Hình 3.4 Kết quả phân tích bằng BLAST trong NCBI……… 27

Hình 3.5 Sự sai khác về trình tự nucleotide của đoạn mã hóa nhân

tố phiên mã GmDREB7 phân lập từ giống đậu tương DT2008 so với

Hình 3.6 Trình tự amino acid suy diễn từ gen GmDREB7 của giống

đậu tương DT2008 so với trình tự amino acid suy diễn từ trình tự

Hình 3.7 Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự nucleotide của

đoạn mã hóa DREB phân lập từ giống đậu tương DT2008 và các trình

tự mang mã số BT092314, BT089389, NM 001249580, NM

001248527, AY244760 trên GenBank………

32

Hình 3.8 Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự amino acid suy

diễn của protein DREB từ giống đậu tương DT2008 và từ các trình tự

mang mã số BT092314, BT089389, NM 001249580, NM

001248527, AY244760 trên GenBank………… …

33

Hình 3.9 Trình tự đoạn gen GmDREB7 nhân tạo……… ……… 34

Hình 3.10 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt gen GmDREB7

trong vector pUC18 và sản phẩm cắt vector pBI121 bằng cặp enzyme

Hình 3.11 Sơ đồ cấu trúc vector pBI121_GmDREB7 sử dụng cho

Hình 3.12 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR từ khuẩn

Hình 3.13 Hình mô tả quá trình biến nạp gen GmDREB7 và tái sinh

tạo cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật lây nhiễm A

tumefaciens 37

Hình 3.14 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản gen

GmDREB7 trong các cây thuốc lá chuyển gen 39

Hình 3.15 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR trong các cây

thuốc lá chuyển gen 40

DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid (DNA bổ sung)

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

GM Môi trường tái sinh chồi

LB Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (Lysogeny Broth)

NCBI National Center for Biotechnology Information

(Trung tâm thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia)

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là một trong những cây trồng chiếm

vị trí quan trọng trong các cây nông nghiệp và trong đời sống của con người Đậu tương được xem là cây trồng khá nhạy cảm với các tác động của môi trường Trong những năm gần đây, biến đổi khí hậu và sự nóng lên của trái đất

đã ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây đậu tương Stress phi sinh học gây ảnh hưởng nghiêm trọng, đặc biệt là hạn và có thể làm giảm năng suất đậu tương khoảng 40%

Tính chống chịu các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh của thực vật nói chung

và của đậu tương nói riêng do nhiều gen quy định, sản phẩm của các gen này liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện khả năng chống chịu hoặc có chức năng

điều hòa nhóm gen chống chịu Trình tự cis và nhân tố trans giữ vai trò quan

trọng trong sự biểu hiện gen đáp ứng với tác động của các stress phi sinh học

Nhân tố trans - protein DREB có thể liên kết với trình tự cis để kích hoạt biểu

hiện gen khi có tín hiệu stress ở thực vật

Protein DREB là một phân họ của họ nhân tố phiên mã AP2/ERF, có chức năng điều khiển sự biểu hiện của một số gen cảm ứng với hạn hán, nhiễm mặn

và nhiệt độ thấp, tạo ra tính chống chịu các stress của ngoại cảnh ở nhiều loài

thực vật Thuộc tính chủ yếu của gen DREB là vùng bảo thủ AP2 liên kết với các nhân tố phản ứng với các stress Nhiều gen DREB đã được phân lập từ các loài thực vật khác nhau, như cây Arabidopsis, lúa (Oryza sativa L.), ngô (Zea mays L.), lúa mì (Triticum aestivum) và nhiều cây trồng khác Ở cây đậu tương, hai gen GmDREB6, GmDREB7 đã được xác định tồn tại trong hệ gen cây đậu

tương, tuy nhiên đặc điểm về cấu trúc gen cũng như hoạt động của các gen này

như thế nào và sản phẩm protein của chúng có liên quan trực tiếp đến nhóm chống chịu nào hay không đang là vấn đề cần tìm lời giải đáp

Cách tiếp cận kỹ thuật chuyển gen trong nghiên cứu chức năng của gen đang được ứng dụng ngày càng rộng rãi và nhiều gen mới trong hệ gen của cây đậu tương đã được giải mã chức năng Xuất phát từ những cơ sở trên chúng tôi

đã chọn và tiến hành đề tài: “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen

GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương” để phục vụ chuyển gen với mục đích

đánh giá hoạt động và chức năng sinh học của gen GmDREB7 ở cây đậu tương

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Phân tích được đặc điểm của gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương 2.2 Thiết kế được vector biểu hiện thực vật mang gen GmDREB7 của cây đậu

tương

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu thông tin, thiết kế cặp mồi PCR, nhân gen, tách dòng và xác định

trình tự gen GmDREB7 từ cây đậu tương

3.2 Nghiên cứu thiết kế gen và vector biểu hiện mang gen GmDREB7

3.3 Chuyển cấu trúc mang gen GmDREB7 vào cây thuốc lá

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1 Về mặt khoa học

Nghiên cứu góp phần làm rõ đặc điểm cấu trúc của gen GmDREB7 phân

lập từ cây đậu tương (giống DT2008) Những kết quả về tạo cây chuyển gen thêm một lần nữa khẳng định cơ sở khoa học của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện tính chống chịu các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh của cây trồng

4.2 Về mặt thực tiễn

Trình tự gen GmDREB7 phân lập được và các cây thuốc lá chuyển gen

được tạo ra có khả năng chống chịu tốt hơn so với cây đối chứng Qua đó, góp phần làm tiền đề cho việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chống chịu của cây trồng nói chung cũng như trong thực tiễn chọn giống cây trồng ở Việt Nam nói riêng

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc tính chống chịu của thực vật

1.1.1 Tác động của các nhân tố phi sinh học đến thực vật

Trong những thập kỷ gần đây, stress phi sinh học đã trở thành mối quan tâm chính trong sản xuất nông nghiệp Sự tăng trưởng và phát triển của thực vật trong các điều kiện stress có thể ảnh hưởng đến vụ mùa Thực vật có đặc điểm trạng thái sống đặc thù – bám trụ vào đất tại một chỗ, không di chuyển trong suốt quá trình phát triển cá thể Vì vậy, chúng thường xuyên đối mặt với điều kiện ngoại cảnh ngày càng nhiều tác động bất lợi lên quá trình sinh trưởng phát triển, gây ra những biến đổi và đặc biệt ảnh hưởng đến năng suất cây trồng [2] Ngày nay, do có sự biến đổi khí hậu toàn cầu nên môi trường ngày càng bị tác động nặng nề hơn

Các tác nhân gây stress sẽ tạo nên những khả năng thích ứng đặc trưng của thực vật Do đó, việc tìm hiểu cơ chế tác động của các tác nhân gây stress cũng như những phản ứng thích nghi của cây trồng có vai trò quan trọng trong trồng trọt Một số tác nhân gây stress có thể tác động riêng rẽ nhưng cũng có nhiều stress có thể phối hợp vớinhau tác động lên cơ thể thực vật Ví dụ stress thiếu nước thường liên kết với stress nhiễm mặn ở vùng rễ và stress nhiệt độ cao ở lá Một số yếu tố môi trường từ tác nhân bình thường chuyển sang tác nhân stress chỉ trong vài phút (ví dụ nhiệt độ), có những yếu tố môi trường phải mất nhiều ngày hay nhiều tháng mới trở nên tác nhân stress (nước trong đất, chất khoáng ) [2]

Đối với cây trồng, nhiệt độ tối ưu để phát triển bình thường là 23 - 28°C Nếu nhiệt độ trên 30°C thậm chí đến 35°C sẽ ảnh hưởng lớn đến cây Trường

hợp tương tự xảy ra nếu nhiệt độ xuống dưới 15°C, năng suất cây trồng sẽ giảm đáng kể Một yếu tố khác đóng vai trò vô cùng quan trọng, đó là nước Nước là nguyên liệu khởi đầu, sản phẩm trung gian và cũng là sản phẩm cuối cùng trong mọi quá trình trao đổi chất của tế bào Mọi quá trình phản ứng trong cơ thể đều được thực hiện trong môi trường nước Do đó, thiếu hay thừa nước đều ảnh hưởng xấu đến cây trồng Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã thống kê được thiệt hại hàng năm do hạn hán gây ra là rất lớn, có thể làm mất mùa, giảm đến trên 60% sản lượng [2]

1.1.2 Cơ chế phân tử của đặc tính chống chịu các yếu tố bất lợi của thực vật

Stress hạn, mặn và sốc nhiệt tác động xấu đến sự sinh trưởng, phát triển

và năng suất của nhóm cây trồng cạn Trong các điều kiện stress, thực vật vẫn

có những cơ chế để thích nghi đối với sự thay đổi cường độ khác nhau của

stress, tuy nhiên những cơ chế này vẫn chưa đủ để giúp thực vật chống chịu

Thực vật có nhiều cơ chế phản ứng khác nhau với các stress thông qua các con đường truyền tin và phản ứng tế bào, từ việc thay đổi biểu hiện gen, trao đổi chất trong tế bào cho đến những thay đổi lớn liên quan đến mức độ sinh trưởng và năng suất cây trồng Khi gặp các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh, những biến đổi trong quá trình phát triển và trao đổi chất sẽ làm thay đổi sự biểu hiện của gen Điều này bắt đầu từ việc nhận biết tín hiệu ở mức độ tế bào, lan truyền tín hiệu trong tế bào, sau đó lan truyền khắp cơ thể

Để chống chịu với stress, các phản ứng sinh hóa được kích hoạt trong cây trồng để tích lũy nhiều các loại chất dễ hòa tan như: đường, amino acid, glycine betaine và polyamine để giúp các cây trồng đối phó với stress [15] và giúp cây phục hồi sau một thời gian nhất định chịu tác động từ điều kiện môi trường [14]

Sự biểu hiện của các gen cảm ứng với stress có liên quan chặt chẽ với quá trình phiên mã Vì vậy, sự biểu hiện của các gen này chịu ảnh hưởng của cả môi trường trong và ngoài cơ thể, với nhiều mức độ điều hòa Các nhân tố phiên mã (Transcription factors - TFs) đóng vai trò điều khiển những thay đổi trong biểu hiện gen và phản ứng với các stress từ môi trường ngoại cảnh Hiện nay, các protein DREB là nhóm TF được nghiên cứu thành công nhất, bởi nó kích hoạt

sự biểu hiện của nhiều gen mục tiêu chịu trách nhiệm kiểm soát các yếu tố liên quan trong điều kiện phi sinh học [40]

1.2 Họ nhân tố phiên mã AP2

Họ AP2 là một nhóm lớn các nhân tố phiên mã ở thực vật, bao gồm bốn phân họ lớn: AP2, RAV, ERF và DREB [32] Phân họ protein DREB đặc trưng bởi miền bảo thủ AP2 chứa các vị trí liên kết với mạch DNA ở vùng promoter

Nhiều gen trong phân họ DREB đã được phân lập từ các loài thực vật, như cây Arabidopsis, lúa (Oryza sativa L.), ngô (Zea mays L.), lúa mì (Triticum aestivum) Tuy nhiên các công bố về chức năng của một số gen DREB chủ yếu ở cây Arabidopsis

Gen mã hóa nhân tố phiên mã chứa miền AP2 liên quan đến nhiều quá trình sinh học của thực vật bao gồm sự tăng trưởng, truyền tín hiệu, phản ứng với mầm bệnh và ứng phó với các stress phi sinh học như hạn hán, muối, Miền AP2 có khoảng 58 hoặc 59 amino acid, trong đó có một số amino acid liên kết với nhân tố đáp ứng sự mất nước (DRE) hoặc hộp GCC [25], [35]

1.2.1 Cây đậu tương

Đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill thuộc họ Đậu

(Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilinoideae), có bộ NST 2n = 40 Đậu tương

là một loại cây trồng cận nhiệt đới có nguồn gốc từ Đông Nam Á

Đậu tương là loại lương thực chính ở các nước châu Á đã từ lâu và đã được sử dụng làm loài thực vật mẫu cho các nghiên cứu về sinh lý thực vật, hóa sinh và sinh học phân tử Các phân tích sinh hóa cho thấy hạt đậu tương chứa

từ 38 - 40% protein, 12-25% lipid, các muối khoáng, các vitamin A, B1, B2,

và nhiều axit amin thiết yếu (cystein, tryptophan, methionine, lysine, ) [39] Bên cạnh giá trị về kinh tế và dinh dưỡng cao, cây đậu tương còn giữ vai trò quan trọng trong việc cải thiện đồ phì và sử dụng bền vững tài nguyên đất canh tác [32]

Đậu tương thuộc loại cây Hai lá mầm, thân thảo, là cây trồng cạn thu hạt, bao gồm các bộ phận: Rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt Rễ đậu tương là rễ cọc, gồm

rễ cái và các rễ bên, trên rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm từ nito của không khí [1] Nhiều nghiên

cứu cho thấy, những giống đậu tương có khả năng cộng sinh và có đủ nốt sần thường làm cho hàm lượng protein cao, cho nên trồng cây đậu tương có tác dụng cải tạo đất Trên thân có nhiều lông nhỏ, ít phân cành, có từ 8 - 14 đốt, các cành và lá mọc ra từ các đốt trên thân Đậu tương có 3 loại lá chính: Lá mầm, cặp lá đơn, lá kép có 3 lá chét, đôi khi 4 - 5 lá chét Đậu tương thuộc loại cây tự thụ phấn, hoa lưỡng tính, mọc thành chùm, mỗi chùm thường có 3 - 5 hoa có màu tím, tím nhạt hoặc trắng Quả đậu tương thuộc loại quả ráp, có nhiều lông bao phủ, khi chín vỏ quả có màu vàng hoặc xám đen Hạt có dạng hình tròn, bầu dục, tròn dài, tròn dẹt không có nội nhũ mà chỉ có một lớp vỏ bao quanh một phôi lớn Vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen đa số là hạt màu vàng Đặc biệt, màu sắc rốn hạt ở các giống

là không giống nhau, đây là biểu hiện đặc trưng của giống

Trong các gian đoạn sinh trưởng, đặc biệt là thời kì ra hoa, tạo quả nếu thiếu nước thì hoa và quả non sẽ rụng nhiều Giai đoạn phát triển của quả và

thước hạt và năng suất giảm đi đáng kể Do vậy, thời kì này được chứng minh

là thời kì bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất nếu thiếu nước [36]

Đậu tương là cây nhạy cảm với điều kiện ngoại cảnh, đặc biệt là hạn Khi nghiên cứu về đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về mặt sinh lý và di truyền

đã cho thấy rằng các đặc tính này liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hóa keo của chất nguyên sinh, quá trình trao đổi chất Tính chịu hạn của cây đậu tương là tính trạng đa gen và chúng thể hiện ở nhiều mặt như: sự phát triển nhanh của

bộ rễ, tính chín sớm tương đối,

Các cây họ Đậu nói chung và cây đậu tương nói riêng là loài cây trồng có nhu cầu về nước cao hơn các loài cây khác và không đồng đều qua các giai đoạn, chúng thuộc nhóm cây chịu hạn kém Do hàm lượng protein và lipid trong hạt cây đậu tương rất cao, để tổng hợp 1 kg chất khô cần 500 – 530 kg nước và trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nước của cây đậu tương cũng khá cao 50%, trong khi ngô chỉ là 30% và lúa là 20% [3]

1.2.2 Nhân tố phiên mã DREB ở cây đậu tương

Từ những năm 80 của thế kỷ XX, các nghiên cứu về DREB đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm, tiến hành giải trình tự gen DREB và so sánh trình tự gen này ở các loài thực vật khác nhau như: họ Cúc (Asteraceae),

hướng dương (Helianthus annuus), lúa mì (Triticum aestivum L.)…

Nhiều thành viên trong phân họ DREB đã được phân lập, mô tả và các nghiên cứu đã khẳng định chúng là những thành tố quan trọng, liên quan đến

sự phản ứng với các nhân tố phi sinh học ở thực vật bằng cách quy định biểu hiện gen thông qua các trình tự DRE/CRT [38] Một số thành viên của phân họ

gen DREB được xác định có trong hệ gen của cây đậu tương như: GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5, GmDREB6, GmDREB7 [28] Với trình tự và độ dài khác nhau nhưng mỗi gen

trong phân họ DREB đều có những biểu hiện mạnh khi đậu tương gặp các điều

kiện stress hạn, mặn, sốc nhiệt Trong khi nhóm DREB1 điều khiển tính chịu hạn, mặn và lạnh thì nhóm DREB2 lại có vai trò chủ yếu trong điều khiển tính chịu hạn, chịu nóng,…

Đặc điểm của gen DREB ở cây đậu tương đã được tiếp cận nghiên cứu từ

những năm đầu của thế kỉ XXI Chen và cs (2004) đã phân lập gen DREB1 từ mRNA của cây đậu tương có kích thước 705 bp [13] Gen DREB1 được phân

lập từ DNA của cây đậu tương bởi Charlson và cs (2009) cũng có kích thước

705 bp [8] Chen và cs (2007) đã phân lập gen GmDREB5 và gen GmDREB3

(2009) từ mRNA ở đậu tương với kích thước lần lượt là 927 bp [10] và 597 bp

[11] Liu và cs (2007) đã phân lập gen GmDREB6 từ mRNA ở cây đậu tương với kích thước là 693 bp [21] Tuy nhiên, việc nghiên cứu các gen DREB ở

cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng ở Việt Nam còn khá mới, chỉ

có một vài công bố về các gen DREB trong những năm gần đây, đó là các nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc và chức năng của gen DREB1 và DREB5 ở

cây đậu tương của nhóm tác giả Chu Hoàng Mậu và cs (2011) [4]

Đặc điểm của gen ứng cử viên GmDREB7

Trình tự gen mang mã số BT092314 trên GenBank phân lập từ mRNA

đậu tương là gen ứng cử viên được gán nhãn GmDREB7 Trình tự mang mã số

BT092314 do nhóm tác giả Cheung và cs (2009) nghiên cứu đã được đăng kí

mã số trên GenBank vào tháng 8/2009 Trình tự này có kích thước 793 bp, được

phân lập từ mRNA của cây đậu tương (Glycine max) và chưa rõ chức năng sinh

học Trình tự đoạn mã hóa của gen mang mã số BT092314 trên GenBank có kích thước 561 bp, từ vị trí nucleotide số 144 đến 704, với mã mở đầu là ATG

và mã kết thúc là TGA (Hình 1.1)

Hình 1.1 Thông tin về trình tự mang mã số BT092314 trên GenBank

Đặc điểm của trình tự amino acid suy diễn, vùng AP2 và các điểm DNA binding của trình tự mang mã số BT092314 trên GenBank

Trình tự gen mang mã số BT092314 trên GenBank là ứng cử viên gen

GmDREB7 mã hóa 186 amino acid Trình tự amino acid thuộc miền AP2 (Hình

1.2A) có 59 amino acid, từ vị trí amino acid số 64 đến 122, trong đó có 11

amino acid liên kết với promoter của nhóm gen chống chịu các stress phi sinh học, đó là các vị trí 66, 67, 69, 71, 73, 75, 79, 81, 88, 90, 93 (Hình 1.2B)

Bằng công cụ Tin sinh học, dựa trên bản đồ gen đậu tương đã xác định

được gen ứng cử viên GmDREB7 có vị trí trên NST số 12 (LOC100527471)

(Hình 3.1)

Hình 1.3 Vị trí của gen GmDREB7 trên nhiễm sắc thể 12 của đậu tương

1.3 Vector biểu hiện gen thực vật và đánh giá hoạt động của vector chuyển gen trên cây thuốc lá mô hình

Khả năng lây nhiễm một cách tự nhiên các trình tự DNA xác định của

Agrobacterium vào hệ gen thực vật đã được sử dụng vào việc phát triển các

vector biểu hiện để biến nạp vào thực vật Các vector này lợi dụng đặc tính bẩm

sinh của Agrobacterium là quá trình biến nạp trung gian (mediated

transformation process)

Ðặc điểm của kỹ thuật chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium là

bất kỳ DNA nào đã tạo dòng đều có thể được chuyển vào hệ gen của tế bào thực vật Hai lá mầm Trước đây, loại vector thường được đề cập đến là vector liên hợp (co-intergrative vector), tuy nhiên gần đây vector nhị thể (binary vector) là phổ biến hơn

Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêng biệt: Ti plasmid và vector T – DNA Hệ vector được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản Loại vector vận tải mang GOI giữa đoạn ngoại biên của T –

DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào

tế bào thực vật Plasmid hỗ trợ được cải biến từ các Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối nhưng

vẫn duy trì khả năng xâm nhập vào tế bào thực vật Để tái bản trong A tumefaciens, vector nhị thể được thiết kế gồm các phần sau: (i) Vị trí ghép nối

đa điểm; (ii) Đoạn khởi đầu tái bản ở cả E coli và A tumefaciens; (iii) Gen

chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực vật; (iv) Gen có khả năng vận

chuyển (oriV, oriT, trfA); (v) Đoạn T – DNA ngoại biên Ngoài ra, còn một số

thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận chuyển T – DNA [24], [5], [34]

Vector chuyển gen pBI121 có kích thước 14,75 kb, được cấu trúc bởi các

thành phần như 35S-promoter, chứa gen GUS với cặp enzyme giới hạn XbaI/SacI, gen NPTII mã hóa protein kháng kháng sinh kanamycin (Hình 1.4)

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121

Cây thuốc lá là cây trồng vừa có giá trị kinh tế, vừa là cây mô hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học và trong sự phát triển ban đầu của sinh học phân tử thực vật [43] Trong một nghiên cứu của nhóm tác giả tại Nhật Bản (2002) đã phát hiện ra rằng, nguồn gốc của cT-DNA trong bộ gen của loài

thuốc lá Nicotiana glauca hoang dã là T-DNA của Ri plasmid loại mikimopine (pRi) chứa trong Agrobacterium rhizogenes Đây là bằng chứng rõ ràng đầu

tiên về mối quan hệ ký sinh – vật chủ trong quá trình tiến hóa ban đầu của cây

thuốc lá Nicotiana [42]

Thuốc lá là loại cây được sử dụng phổ biến nhất để biểu hiện gen chuyển

cấp lượng mô sống đáng kể và có hệ thống nuôi cấy tế bào được thiết lập tốt Nhiều protein vi khuẩn tham gia vào quá trình tổng hợp các sản phẩm thương mại hiện đang được thiết kế để sản xuất trong thuốc lá Enzyme vi khuẩn được tổng hợp trong thuốc lá có thể tăng cường bảo vệ, chống lại các stress phi sinh học và mầm bệnh [45] Thuốc lá cũng được sử dụng như một mô hình cho tính nhạy cảm với các bệnh thực vật, sinh tổng hợp pyridine alkaloid (như nicotine), stress oxy hóa… [44]

Thuốc lá được sử dụng rộng rãi như một hệ thống cây mô hình trong nghiên cứu chuyển gen vì nhiều lý do: Di truyền phân tử của nó được hiểu rõ, lập bản đồ gen của nó gần như được hoàn tất,… Cây thuốc lá có thể sinh trưởng, phát triển tốt trong ống nghiệm, trong điều kiện nhà kính và tạo ra một lượng lớn sinh khối Thuốc lá cũng được coi là một trong những hệ thống tốt nhất để biến đổi lục lạp, giúp tăng cường hơn nữa hiệu quả đối với sự biểu hiện của protein tái tổ hợp Cây thuốc lá biến đổi gen cũng là mô hình lý tưởng cho nghiên cứu các chức năng sinh học cơ bản, chẳng hạn như tương tác mầm bệnh, phản ứng môi trường, điều hòa sinh trưởng và lão hóa [45]

Trong thực tế, nhiều nghiên cứu về biểu hiện mạnh của nhân tố phiên mã DREB cảm ứng với stress đã được nghiên cứu nhằm mục đích kích hoạt sự biểu hiện của các gen mục tiêu có trình tự DRE trong các promoter của chúng

và kết quả cho thấy cây chuyển gen có khả năng chống chịu stress tốt hơn cây không chuyển gen

Gen DREB1A có thể biểu hiện tốt ở nhiều cây trồng khác nhau Sự biểu hiện mạnh các AtDREB1A trong cây thuốc lá, cây lúa mì, cây lúa, cây lạc đã chứng minh khả năng chịu hạn tốt hơn và tăng cường sự biểu hiện của gen LEA

ở trong điều kiện nhà kính [8], [19], [28]

Sự tác động đồng thời của hạn và nhiệt độ cao đến sinh trưởng của các cây trồng mạnh mẽ hơn các stress đơn lẻ [25], [30], [31] Phân tích sự phiên mã và trao đổi chất ở cây thuốc lá, về mặt sinh trưởng, đã chỉ ra rằng phản ứng của cây đối với sự kết hợp của nhân tố hạn và nhiệt độ cao một phần có sự chồng chéo lên nhau, nhưng chính điều này cũng nhằm chống lại các stress đơn lẻ

Gen DREB2A là một ví dụ cho vai trò điều hòa biểu hiện gen dưới sự tác động

đồng thời của hạn và nhiệt độ cao lên thực vật [31]

Trong một nghiên cứu khác, gen GmDREB2 được biểu hiện mạnh trong

môi trường có hạn, mặn, nhiệt độ thấp và ABA [13] Trong cây thuốc lá chuyển

gen, sự biểu hiện của gen GmDREB2 đã làm tăng sự tích lũy hàm lượng prolin

[20]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Giống đậu tương DT2008 được sử dụng làm vật liệu phân lập gen do Viện

Di truyền Nông nghiệp cung cấp DT2008 là giống lai giữa giống DT2001 và giống HC100 (gốc Mexico) kết hợp với phương pháp đột biến thực nghiệm và chọn lọc theo tiêu chuẩn thích ứng với chống chịu Giống DT2008 có khả năng chống chịu tổng hợp với nhiều yếu tố bất lợi trong sản xuất như hạn, úng, nhiệt

độ, đất nghèo dinh dưỡng,

Cây thuốc lá Nicotinana tabacum K326 in vitro do Phòng thí nghiệm

Công nghệ tế bào thực vật thuộc Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên cung cấp, sử dụng để nhận gen

2.1.2 Các loại vector và chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu

Vector tách dòng pBT, vector chuyển gen pBI121 chứa promoter 35S do Phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 do Phòng Công nghệ

Tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp

2.2 Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu

Các loại kít thao tác phân tử: Kít GeneJET PCR Purification để tinh sạch sản phẩm PCR, kít để tách chiết plasmid từ vi khuẩn Các loại enzyme như