Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi miêu tả các đặc điểm di truyền và khảo sát khả năng sinh trưởng, sức chống chịu stress, khả năng lên men rượu và vai trò của nấm men trong sản xuất rượu truyền thống của 10 chủng nấm men (Saccharomyces cerevisiae) phân lập từ nhiều loại men rượu. Kết quả các thí nghiệm đã cho thấy, các chủng nấm men nghiên cứu có sự khác nhau đáng kể về các đặc tính được khảo sát. Tốc độ sinh trưởng ở 30oC trong môi trường YPD mạnh nhất thuộc chủng SACNTB2. Khả năng chịu đông lạnh của chủng SACNCB là tốt nhất (90,29%). Khả năng chịu hạn cao nhất là chủng SACNSL1 (79,84%). Năng suất sinh khối ở môi trường YPD của tất cả các chủng đạt cực đại với nồng độ đường sucrose 15%. Nồng độ đường sucrose 25% gây stress thẩm thấu đối với nấm men làm tốc độ sinh trưởng của chúng chậm lại. Sinh trưởng của nấm men giảm xuống ở nồng độ cồn 5% và bị giới hạn ở nồng độ cồn 12%. Chủng SACNCB thể hiện khả năng chịu áp suất thẩm thấu cao trong các thí nghiệm xác định tốc độ sinh trưởng ở nồng độ đường cao, nồng độ cồn cao đồng thời chống chịu tốt ở thí nghiệm chịu đông lạnh. Khả năng lên men rượu của các chủng SACNSL1, SACNSL2, SANA1 rất kém, các chủng SACNCB, SACNTB1, SACNTB2, SABG lên men rượu tốt. Nấm men đóng vai trò quyết định đối với năng suất rượu truyền thống. Kết quả và các phương pháp mới trong nghiên cứu này có thể dùng làm cơ sở cho các nghiên cứu dùng để tuyển chọn các chủng nấm men có các đặc tính tốt, đồng thời phối trộn chúng với các chủng vi sinh vật khác ứng dụng trong sản xuất để nâng cao chất lượng sản phẩm, đặc biệt là các chế phẩm probiotic phục vụ chăn nuôi. Ngoài ra, các chủng nấm men này còn có thể nghiên cứu thêm để sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác như công nghiệp đồ uống có cồn, công nghiệp sản xuất bánh mì,v.v.
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-
-KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
Nghiên cứu tính chống chịu và khả năng lên men rượu của
một số chủng nấm men (Saccharomyces cerevisiae)
Sinh viên thực hiện : Đinh Thị Phương
Ngành : Công nghệ sinh học
Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Văn Giang
“Khóa luận đệ trình Khoa CNSH, Trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội là một phần yêu cầu của
trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học".
HÀ NỘI - 2011
Trang 2LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: thầy giáo TS.Nguyễn Văn Giang và thầy giáo TS Đặng Xuân Nghiêm về những hướng dẫn tận tình,chu đáo bên cạnh những kiến thức xã hội bổ ích khác
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Thầy giáo TS Phạm Hồng Thái đãgiúp tôi hoàn thành khóa luận này
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thị Bích Lưu và toàn thể cán bộ bộmôn Sinh học phân tử và Công nghệ vi sinh – khoa Công nghệ sinh học – Trường đạihọc Nông nghiệp Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thờigian thực tập
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong trường Đại học Nông nghiệp HàNội đã tận tình dạy bảo tôi trong 4 năm qua
Cuối cùng tôi xin cảm ơn tới những người thân trong gia đình đã luôn chăm lo,động viên tôi, và toàn thể bạn bè đã cộng tác giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đềtài tốt nghiệp
Sinh viên
Đinh Thị Phương
Trang 3MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii
DANH MỤC CÁC BẢNG iv
DANH MỤC CÁC HÌNH v
TÓM TẮT vi
PHẦN I MỞ ĐẦU 1
PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1 Giới thiệu chung về nấm men (Saccharomyces cerevisiae) 4
2.1.1 Nguồn gốc, phân loại: 4
2.1.2 Đặc điểm chính của nấm men 6
2.1.3 Yêu cầu về dinh dưỡng và ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng 9
2.1.4 Sức chống chịu của nấm men 11
2.1.5 Vai trò của S cerevisiae trong đời sống 13
2.2 Rượu và vai trò của nấm men trong sản xuất rượu 14
2.2.1 Rượu 14
2.2.2 Vai trò của nấm men trong sản xuất rượu 17
PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
3.1 Vật liệu 19
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19
3.1.2 Thiết bị 19
3.1.3 Hoá chất 20
3.2 Môi trường 20
3.3 Các phương pháp nghiên cứu 21
3.3.1 Phân lập các chủng nấm men S cerevisiae 21
3.3.2 Giữ giống 22
3.3.3 Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của S cerevisiae 22
3.3.4 PCR xác nhận các chủng nấm men 23
3.3.5 Xác định sự sinh trưởng theo mật độ quang 25
3.3.6 Đánh giá khả năng chịu lạnh 25
Trang 43.3.7 Đánh giá khả năng chịu khô hạn 27
3.3.8 Đánh giá khả năng chịu áp suất thẩm thấu 27
3.3.9 Đánh giá khả năng chịu mặn 28
3.3.10 Đánh giá khả năng chịu cồn 28
PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
4.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae 31
4.2 PCR xác nhận các chủng nấm men 32
4.3 Một số đặc điểm sinh học của các chủng nấm men nghiên cứu trong đề tài 33
4.4 Sự sinh trưởng theo mật độ quang của các chủng nấm men 37
4.5 Khả năng chịu lạnh của các chủng nấm men nghiên cứu trong đề tài 40
4.6 Khả năng chịu khô hạn của các chủng nấm men 43
4.7 Khả năng chịu áp suất thẩm thấu của các chủng nấm men nghiên cứu trong đề tài 45
4.8 Khả năng chịu mặn của các chủng nấm men nghiên cứu trong đề tài 49
4.9 Khả năng chịu cồn của các chủng nấm men nghiên cứu trong đề tài 51
4.11 Khả năng lên men rượu 53
4.12 Vai trò của nấm men trong quy trình sản xuất rượu truyền thống 55
PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57
5.1 Kết luận 57
5.2 Kiến nghị 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO 58
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
S cerevisiae/yeast : Saccharomyces cerevisiae.
YPD : Yeast peptone dextrose
OD : Optical density
DNA : Deoxyribonucleic acid
NST : Nhiễm sắc thể
PCR : Polymerase chain reaction
CO2 : Carbon dioxide
Trang 5GDP : Glycerol 3-phosphate dehydrogenase.
RNA : Ribonucleic acid
To : Thời điểm bắt đầu
ThS : Thạc sĩ
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1 Tên máy móc, thiết bị dùng trong đề tài 19
Bảng 2 Hóa chất sử dụng 20
Bảng 3 Kết quả phân lập các mẫu men rượu 30
Bảng 4 Các chủng nấm men dùng trong đề tài 31
Bảng 5 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng nấm men 33
Trang 6DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1 Một tế bào nấm men đang mọc chồi 6
Hình 2 Các tế bào nấm men và cấu tạo bên trong tế bào 6
Hình 3 Chu kỳ sống của nấm men 9
Hình 4 Sản phẩm của các phản ứng colony-PCR 32
Hình 5 Khuẩn lạc và tế bào nấm men 36
Hình 6 Đường cong sinh trưởng của các chủng nấm men ở 30o 38
Hình 7 Tỷ lệ sống sót của các chủng nấm men sau khi được đông đá và làm tan 41
Hình 8 Tỷ lệ sống sót của các chủng nấm men ở 30oC, độ ẩm 75% 43
Hình 9 Tốc độ sinh trưởng tại nồng độ đường 15% 45
Hình 10 Tốc độ sinh trưởng tại nồng độ đường 25% 45
Hình 11 Tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm men ở nồng độ muối NaCl 1M 48
Hình 12 Đường cong sinh trưởng tại nồng độ cồn 5% 51
Hình 13 Khả năng sinh CO2 của các chủng nấm men 53
TÓM TẮT
Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi miêu tả các đặc điểm di truyền và khảo sát khả năng sinh trưởng, sức chống chịu stress, khả năng lên men rượu và vai trò của nấm
Trang 7men trong sản xuất rượu truyền thống của 10 chủng nấm men (Saccharomyces
cerevisiae) phân lập từ nhiều loại men rượu.
Kết quả các thí nghiệm đã cho thấy, các chủng nấm men nghiên cứu có sự khácnhau đáng kể về các đặc tính được khảo sát Tốc độ sinh trưởng ở 30oC trong môitrường YPD mạnh nhất thuộc chủng SACNTB2 Khả năng chịu đông lạnh của chủngSACNCB là tốt nhất (90,29%) Khả năng chịu hạn cao nhất là chủng SACNSL1(79,84%) Năng suất sinh khối ở môi trường YPD của tất cả các chủng đạt cực đại vớinồng độ đường sucrose 15% Nồng độ đường sucrose 25% gây stress thẩm thấu đốivới nấm men làm tốc độ sinh trưởng của chúng chậm lại Sinh trưởng của nấm mengiảm xuống ở nồng độ cồn 5% và bị giới hạn ở nồng độ cồn 12% Chủng SACNCBthể hiện khả năng chịu áp suất thẩm thấu cao trong các thí nghiệm xác định tốc độ sinhtrưởng ở nồng độ đường cao, nồng độ cồn cao đồng thời chống chịu tốt ở thí nghiệmchịu đông lạnh Khả năng lên men rượu của các chủng SACNSL1, SACNSL2,SANA1 rất kém, các chủng SACNCB, SACNTB1, SACNTB2, SABG lên men rượutốt Nấm men đóng vai trò quyết định đối với năng suất rượu truyền thống
Kết quả và các phương pháp mới trong nghiên cứu này có thể dùng làm cơ sởcho các nghiên cứu dùng để tuyển chọn các chủng nấm men có các đặc tính tốt, đồngthời phối trộn chúng với các chủng vi sinh vật khác ứng dụng trong sản xuất để nângcao chất lượng sản phẩm, đặc biệt là các chế phẩm probiotic phục vụ chăn nuôi Ngoài
ra, các chủng nấm men này còn có thể nghiên cứu thêm để sử dụng rộng rãi trongnhiều ngành công nghiệp khác như công nghiệp đồ uống có cồn, công nghiệp sản xuấtbánh mì,v.v
Trang 8PHẦN I MỞ ĐẦU
Nấm men (Saccharomyces cerevisiae) đã được dùng để lên men rượu cũng như
nhiều đồ uống có cồn khác trong suốt hàng ngàn năm qua Nấm men cũng là vi sinhvật nhân chuẩn (Eukaryote) mẫu được sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu sinh học
tế bào, sinh học phân tử, di truyền học, v.v Chính vì vậy, nấm men chính là sinh vật
nhân chuẩn đầu tiên được giải trình tự toàn bộ genome vào năm 1996 S.cerevisiae ở
thể lưỡng bội chứa 16 cặp nhiễm sắc thể, có kích thước khác nhau từ 200 – 2.200 kb
So với các sinh vật nhân chuẩn đa bào khác nấm men có khoảng trên 6000 gen khácnhau mã hoá cho tất cả các phân tử protein được tổng hợp trong tế bào và nấm men có
bộ gen rất nhỏ gọn (Dujon, 1996)
S cerevisiae được sử dụng để lên men rượu, lên men bia, sử dụng trong sản
xuất rượu vang và sâm panh, sử dụng trong công nghệ thực phẩm để lên men bánh mỳ
v.v (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2001); Trong y học, S cerevisiae được dùng để sản
xuất insulin tái tổ hợp chữa bệnh tiểu đường, hay mới gần đây để sản xuất văc-xin
viêm gan B (Nguyễn Thị Phương Trang và cộng sự, 2007) Rất nhiều tác dụng của S.
cerevisiae được phát hiện và ứng dụng trong cho cuộc sống của con người Nghiên
cứu ứng dụng nấm men bắt đầu bằng việc phân lập, phân loại, chọn lựa, lai tạo cácchủng nấm men có các tính trạng kinh tế tốt để dùng vào sản xuất thực phẩm, đồ uống
có cồn cũng như thức ăn chăn nuôi (Myers và Attfield,1999; Meric et al., 1995; Trần Văn Hiếu và cộng sự, 2006; Đậu Ngọc Hào và Phạm Minh Hằng, 2000; Đậu Ngọc
Hào, 2000; Lê Thành Tâm, 1996; Lê Thành Tâm và cộng sự, 1989; Nguyễn Đình
Dũng và cộng sự, 1980) S cerevisiae còn được sử dụng để biểu hiện các protein hay enzyme tái tổ hợp phục vụ nhiều mục đích khác nhau (Ansen et al., 2009; Schoeman
et al., 1999) Ngày càng nhiều chủng nấm men S cerevisiae được lai tạo và biến đổi
gen với khả năng lên men nhanh hơn, chất lượng lên men tốt hơn, thành phần dinhdưỡng quý hơn và sức chống chịu cao với các điều kiện bất lợi của môi trường đãđược tạo ra
Trong sản xuất rượu nói riêng và sản xuất lên men nói chung, ngoài nguyên liệuban đầu, hệ vi sinh vật là một yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến màu sắc,
Trang 9mùi vị, hương vị của sản phẩm Vi sinh vật trong trong sản xuất rượu như: nấm men,nấm mốc, vi khuẩn, có vai trò trong hai quá trình chính là đường hóa và lên men.Trong đó nấm men đóng vai trò quan trọng nhất đối với lên men nhờ khả năng chuyểnđường thành rượu (Battcock and Ali, 1993; Nout and Aidoo, 2002) Khả năng sinhtrưởng, khả năng chống chịu và đặc biệt là khả năng lên men rượu của nấm men ảnh
hưởng trực tiếp đến chất lượng rượu Giống nấm men Saccharomyces cerevisiae có
nhiều ưu điểm: lên men nhanh và sâu các loại đường, kết lắng tốt do đó dễ tách sinhkhối nấm men ra khỏi dịch lên men, tạo mùi thơm đặc trưng cho rượu, bền vững vớirượu, acid và các chất sát trùng
Hiện nay sản phẩm rượu cổ truyền Việt nam chủ yếu vẫn được sản xuất ở quy
mô hộ gia đình, chất lượng thấp và tiểm ấn nhiều nguy cơ không đảm bảo vệ sinh antoàn thực phẩm Việc sử dụng bánh men làm nguồn giống vi sinh vật được sản xuấttheo kinh nghiệm tại các làng nghề với các chủng giống không được kiểm soát, hoạtlực thấp và chất lượng không đồng đều chính là nguyên nhân chính của các nhượcđiểm này Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật thuần khiết, có hoạt tính cao
và tính chống chịu tốt trong đó có nấm men để sản xuất rượu truyền thống cũng như ởquy mô công nghiệp góp phần nâng cao năng suất chất lượng sản phẩm
Vì thực tế nêu trên chúng tôi chọn đề đề tài: “Nghiên cứu tính chống chịu và
khả năng lên men rượu của một số chủng nấm men (Saccharomyces cerevisiae)”.
Đây là cơ sở để chọn tạo ra và bảo tồn những chủng nấm men tốt sử dụng trong côngnghệ lên men rượu và các ứng dụng khác trong công nghiệp đồ uống, công nghiệpthực phẩm
Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu chung:
Tuyển chọn và bảo tồn các chủng nấm men S cerevisiae có khả năng sinh
trưởng mạnh, có sức chống chịu tốt đồng thời lên men nhanh và hiệu quả để ứng dụngtrong công nghệ sản xuất đồ uống, công nghệ thực phẩm đặc biệt là trong sản xuấtrượu có chất lượng cao
Mục tiêu cụ thể:
Sưu tầm và phân lập được các chủng nấm men thuần
Mô tả các đặc điểm di truyền của các chủng nấm men dùng trong đề tài
Trang 10 Khảo sát tốc độ sinh trưởng của 10 chủng nấm men trong đề tài.
Đánh giá khả năng chống chịu của các chủng nấm men với các điều kiện bấtlợi
Khảo sát khả năng lên men rượu của các chủng nấm men
Tìm hiểu vai trò của nấm men trong quy trình lên men rượu truyền thống
Trang 11PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu chung về nấm men (Saccharomyces cerevisiae)
2.1.1 Nguồn gốc, phân loại:
Từ thời kỳ tiền sử, loài người đã biết ép nước quả và ngâm hạt để làm rượuvang, bia và làm nở bột nhờ quá trình lên men của nấm men Tinh bột hoặc đườngđược chuyển hoá thành rượu thông qua hoạt động của các enzyme do nấm men sinh ra.Quá trình lên men diễn ra ở nhiệt độ phòng với nhịp điệu bình thường, chậm Nhà báchọc Ðức Liebig (1803 - 1873) đã quan sát thấy một quá trình hóa học xảy ra trong quátrình lên men Ông khẳng định không có một “lực sống” nào tham gia vào quá trình ấy
và quá trình giống như sự chuyển hóa trong cơ thể sống, nhưng nó xảy ra không cóchất sống tham gia (John, 2004)
Ngay từ thời Leewenhoek, người ta đã biết nấm men bao gồm những hạt hìnhcầu nhỏ bé không có dấu hiệu của sự sống Vào những năm 1836 và 1837, các nhàsinh học, trong đó Schwann, đã quan sát thấy quá trình nảy chồi ở nấm men tạo nênnhững hạt cầu nhỏ bé mới là dấu hiệu biểu hiện rõ rệt của sự sống Các nhà sinh họcnói nhiều về những tế bào nấm men, nhưng Liebig đã bác bỏ những nhận định đó(John, 2004)
Nhà bác học Pháp là Louis Pasteur (1822 - 1895) đã bảo vệ bản chất sống củanấm men Năm 1856 những người Pháp nấu rượu vang đã mời ông làm cố vấn Rượuvang và bia được bảo quản lâu thường bị chua và gây thiệt hại lớn về kinh tế Các nhàhóa học có thể giúp đỡ được gì không? Pasteur đã phát hiện ra quy luật khá lý thú làrượu vang và bia được bảo quản tốt có chứa những tế bào nấm men tròn, nhỏ còn khichất nước đó bị chua thì những tế bào nấm men bị kéo dài ra Như vậy có hai loại nấmmen: loại tạo thành rượu và loại làm rượu chua dần Ðun nóng nhẹ sẽ giết chết các tếbào nấm men và làm ngừng quá trình gây chua Nếu người ta làm đúng lúc sau khi đãhình thành rượu nhưng chưa bắt đầu có sự gây chua thì có thể bảo quản được rượuvang Thực tiễn đã xác nhận những kết luận của Pasteur là đúng Khi nghiên cứu quátrình này, Pasteur đã làm sáng tỏ hai mặt của vấn đề Thứ nhất, các tế bào nấm men lànhững cơ thể sống, vì chỉ cần đun nóng nhẹ là có thể thủ tiêu khả năng lên men; tế bào
Trang 12vẫn còn, không bị phá hủy, nhưng trong chúng sự sống đã bị hủy diệt Thứ hai, chỉ cónhững tế bào nấm men sống mới gây ra sự lên men (John, 2004).
Ngày nay, khi đã có rất nhiều nghiên cứu về nấm men thì chúng ta biết
Saccharomyces là một chi nấm men được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp
đồ uống có cồn như bia và các loại rượu, ngành thực phẩm như bánh mỳ, thực phẩm
chức năng, y học, mỹ phẩm, v.v Saccharomyces có nghĩa là nấm đường và là loại vi
sinh vật được sản xuất với quy mô lớn nhất trên thế giới
Giống (chi) Saccharomyces có khoảng 40 loài và các loài được biết nhiều do
chúng được ứng dụng trong sản xuất bia, rượu hay trong việc làm nở bánh mỳ, v.v.Chúng hiện diện trong các sản phẩm có đường, trái cây chín, đất, phấn hoa, v.v
Các chủng nấm men nghiên cứu có vị trí phân loại theo Yelinov N (1996) như sau:
Lớp: Ascomycetes Bộ: Saccharomyateae Họ: Saccharomycetaceae Chi: Saccharomyces
Một số loài đại diện:
Trong đó loài được con người sử dụng phổ biến nhất là S cerevisiae.
Trang 132.1.2 Đặc điểm chính của nấm men
Hình thái bên ngoài:
Tế bào S cerevisiae đa số có hình bầu dục, hình ô van, hình elip Kích thước tế
bào theo đường kính lớn từ 5 - 10 μm và kích thước đường kính nhỏ từ 1 - 7 μm Kíchthước tế bào của nấm men thay đổi theo độ tuổi và mức độ đa bội Tế bào lưỡng bộithường lớn hơn tế bào đơn bội
Cấu tạo:
Nấm men S cerevisiae có cấu tạo tế bào khá phức tạp, gần giống như tế bào
thực vật với đầy đủ các thành phần cấu tạo như thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào
chất, ty thể, riboxom, nhân, không bào và các hạt dự trữ (Rosini et al., 1982; Dan et
al., 2000).
Hình 1 Một tế bào nấm men đang mọc chồi
Cell wall (thành tế bào), Nucleus (nhân), Mitochondria (ty thể), Vacuole (không bào), spindle (điểm mọc chồi) Nguồn http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/Yeast_Biol.
Hình 2 Các tế bào nấm men và cấu tạo bên trong tế bào
A: Hình ảnh các tế bào nấm men S cerevisiae; B: Cấu tạo bên trong tế bào nấm men Nguồn http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/Yeast_Biol.
Trang 14Thành tế bào: cấu tạo chủ yếu là polysaccharide như glucan, mannan và
chitin Trong và ở hai bề mặt thành tế bào có protein, lipoprotein và các enzyme khácnhau Trên thành tế bào có nhiều lỗ, qua đó các chất dinh dưỡng hòa tan đi qua thành
và màng tế bào vào trong tế bào để tham gia quá trình trao đổi chất trong tế bào
Nguyên sinh chất: Là chất lỏng nhớt, có độ nhớt gấp 800 lần so với nước,
có cấu tạo từ các chất protein, lipid và carbohydrate Các quá trình lên men quan trọngnhất đều xảy ra ở nguyên sinh chất
Nhân: Nhân tế bào nấm men là nhân điển hình, có màng nhân, bên trong là
chất dịch nhân có chứa hạch nhân Cũng như nhân tế bào của vi sinh vật bậc cao, nhân
tế bào nấm men ngoài DNA còn có protein và nhiều loại enzyme Hạch nhân của tếbào nấm men không phải chỉ gồm một phân tử DNA như ở vi khuẩn mà đã có cấu tạonhiễm sắc thể điển hình, có thể thực hiện quá trình phân bào nguyên nhiễm còn gọi làgián phân Quá trình gián phân gồm 4 giai đoạn như ở vi sinh vật bậc cao Số lượngnhiễm sắc thể trong tế bào nấm men đơn bội là 16 (Lodder, 1971)
Ty thể: Khác với vi khuẩn, nấm men đã có ty thể giống như ở tế bào bậc
cao, đó là cơ quan sinh năng lượng của tế bào Ty thể nấm men có hình bầu dục, đượcbao bọc bởi hai lớp màng, màng trong gấp khúc thành nhiều tấm răng lược hoặc nhiềuống nhỏ làm cho diện tích bề mặt của màng trong tăng lên Cấu trúc của hai lớp màng
ty thể giống cấu trúc của màng nguyên sinh chất Trên bề mặt của màng trong có dính
vô số các hạt nhỏ hình cầu Các hạt này có chức năng sinh năng lượng và giải phóngnăng lượng của ty thể Trong ty thể còn có một phân tử DNA có cấu trúc hình vòng, cókhả năng tự sao chép Những đột biến tạo ra tế bào nấm men không có DNA ty thể làmcho tế bào nấm men phát triển rất yếu, khuẩn lạc nhỏ bé Trong ty thể còn có cả cácthành phần cần cho quá trình tổng hợp protein như ribosome, các loại RNA và các loạienzyme cần thiết cho sự tổng hợp protein Các thành phần này không giống với cácthành phần tương tự của tế bào nấm men nhưng lại rất giống của vi khuẩn DNA của tythể rất nhỏ nên chỉ có thể mang thông tin tổng hợp một số protein của ty thể, số còn lại
do tế bào tổng hợp rồi đưa vào ty thể Người ta đã chứng minh được quá trình tự tổnghợp protein của ty thể Quá trình này bị kìm hãm bởi chloramfenicol giống như ở vi
Trang 15khuẩn, trong khi đó chất kháng sinh này không kìm hãm được quá trình tổng hợpprotein ở tế bào nấm men (Lodder, 1971).
Ribosome của tế bào nấm men có hai loại: 70S và loại 80S Loại 80S gồm 2
tiểu thể 60S và 40S nằm trong tế bào chất, một số khác gắn với màng tế bào chất Một
số nghiên cứu đã chứng minh rằng các ribosome gắn với màng tế bào chất có hoạt tínhtổng hợp protein cao hơn Loại 70S là loại ribosome có trong ty thể (Lodder, 1971)
Không bào: Trong không bào có chứa dịch tế bào, trong đó có muối hòa
tan, enzyme và các chất keo Ngoài ra trong không bào còn có chất béo, volutin,glycogen
Glycogen: hay còn được gọi là tinh bột động vật là chất dinh dưỡng dự trữ
của nấm men Chất béo không phải là cấu tử nhất thiết phải có trong tế bào Ở những
tế bào non chất béo có rất ít, tế bào càng trưởng thành thì lượng chất béo cũng tăngtheo
Volutin: là dẫn xuất của nucleic acid chứa nhiều phốt pho (Lodder, 1971).
Sinh sản:
S cerevisiae là điển hình của nấm dị tản lưỡng cực Dị tản là kiểu có sự lai nhau
giữa hai loại tế bào khác nhau như a với α tạo dạng dị hợp tử lưỡng bội a/α Ở nấmmen, trong điều kiện bình thường, sự hợp bào và hợp nhân chỉ xảy ra giữa các tế bàokhác nhau về giới tính là a và α do các allele khác nhau của locus MAT quy định Do
có sự tham gia của 2 allele nên gọi là lưỡng cực
Chu trình sống của nấm men gồm hai giai đoạn có thể chuyển đổi qua lại Tếbào có thể tồn tại ở cả dạng lưỡng bội và cả dạng đơn bội Trong cả hai trường hợp, tếbào mẹ sinh sản dinh dưỡng bằng cách tạo chồi giống hệt nó Thời gian sinh sản hìnhthành tế bào mới ở điều kiện tối thích là khoảng 30 - 40 phút, nhưng trong môi trườngbột cần 2,5 - 3 giờ Tốc độ sinh sản của nấm men phụ thuộc vào thành phần và nồng
độ chất dinh dưỡng của môi trường, nhiệt độ, pH và mức độ hiếu khí Nhiệt độ thíchhợp cho nấm men sinh sản là 29 - 31°C, pH thích hợp vào khoảng 5 - 5,8 ( Bùi Đức
Hợi và cộng sự, 2009)
Trang 16Hình 3 Chu kỳ sống của nấm men
Budding (bắt đầu nảy chồi), Haploid α (thể đơn bội α), haploid a (thể đơn bội a), conjugation (sự kết hợp), diploid a/α (thể lưỡng bội a/α), spore (bào tử) Nguồn:
http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/Yeast_Biol
Khi một chồi phát triển hoàn chỉnh sẽ tách ra khỏi tế bào mẹ, vị trí chồi rời tếbào mẹ gọi là điểm sinh sản hay sẹo Khi gặp điều kiện dinh dưỡng không thuận lợi thìcác tế bào khác giới sẽ kết hợp lại với nhau tạo thành hợp tử, sau đó tế bào tiếp hợplưỡng bội nẩy chồi cho ra một tế bào giống hệt nó và mang 16 cặp NST Trong điềukiện môi trường bất lợi, tế bào tiếp hợp giảm phân để hình thành 4 tế bào đơn bộitrong đó 2 tế bào đơn bội mang gen a và 2 tế bào đơn bội mang gen α Túi bào tử này
sẽ chờ khi nào môi trường dinh dưỡng thuận lợi để phát triển sinh sản theo hình thứcnảy chồi (Lodder, 1971) Bào tử nang bền với tác nhân bên ngoài như nhiệt độ cao,khô hạn, nhưng kém bền nhiệt hơn so với bào tử vi khuẩn, chúng thường chết ở nhiệt
độ 60oC
2.1.3 Yêu cầu về dinh dưỡng và ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng
Hiện nay người ta nhận thấy quá trình dinh dưỡng của nấm men gồm hai giaiđoạn: chất dinh dưỡng qua màng tế bào chất vào tế bào và chuỗi các phản ứng hoá họcbiến đổi chất dinh dưỡng để tổng hợp vật liệu cho tế bào Môi trường dinh dưỡng chứanhững thành phần có áp suất thẩm thấu khác nhau Các chất không điện ly như đường
Trang 17sucrose, rượu, axit hữu cơ, amino acid xâm nhập qua màng tế bào bằng cách khuếchtán theo gradient nồng độ hay vận chuyển thụ động, do sự khác nhau về nồng độ cácchất này giữa tế bào và môi trường Các ion tích điện trong môi trường như K+, Cl-,
Mg2+, Ca2+ và các ion kim loại khác có thể vào tế bào thụ động theo gradient nồng độhay được vận chuyển ngược lại gradient nồng độ (vận chuyển chủ động) Natri có ýnghĩa rất quan trọng trong sự tăng trưởng của tế bào nấm men Ion Natri là thành phầnduy nhất di chuyển vào tế bào bằng cả 2 cơ chế: thụ động và chủ động vào tế bào.Nấm men mang theo cả sucrose, amino acid, ngay cả khi không có sự chênh lệch nồng
độ các chất này giữa tế bào với môi trường
Thức ăn nuôi tế bào nấm men gồm các hợp chất nitơ, hợp chất khoáng, cáccarbohydrate, vitamin và các chất sinh trưởng (Bùi Đức Hợi và cộng sự, 2009) Trướchết, nấm men tiêu thụ các amino acid sau đó đến các sản phẩm thuỷ phân protein vàhầu như không thể đồng hoá các protein tự nhiên Các muối luôn là thành phần cầnthiết cho nấm men Nấm men đồng hóa gần hoàn toàn nitơ của amoniac, còn cácnitrite lại gây độc cho tế bào nấm men
Nấm men cần thức ăn khoáng có chứa phốt pho, kali, magiê, sắt, v.v cácvitamin và chất sinh trưởng để một phần tổng hợp trong nội bào, một phần để ở dạng
dự trữ Nấm men thường được dùng như là nguồn bổ sung đạm và vitamin vì nó có tới50% protein, giàu vitamin B1, B2, B6, pentotenic acid, folic acid, riboflavin, và biotin
(James et al., 1991).
Các carbohydrate cần cho nấm men như vật liệu xây dựng nên tế bào và nguồncung cấp năng lượng Nấm men tiêu hoá các carbohydrate khác nhau Nấm men tiêuhoá các carbohydrate khác nhau nhưng không tiêu hoá lactose và các polysaccaridecao hơn Chúng chỉ tiêu hoá trực tiếp các đường đơn giản (sucrose và maltose đượcthuỷ phân sơ bộ bằng enzyme của nấm men) (Lương Đức Phẩm, 2009)
Năng lượng hóa học cần thiết cho nấm men do sự chuyển hoá đường trong nộibào cung cấp Nấm men có thể phân huỷ đường bằng cách hô hấp hiếu khí hoặc lênmen rượu
Sự thuỷ phân đường trong điều kiện hiếu khí có thể biểu diễn bằng phươngtrình:
Trang 18C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + 2324.103 J
Sự lên men rượu được biểu diễn bằng phương trình:
C6H12O6 → 2CO2 + 2C2H5OH + 117,32.103 JQuá trình phân huỷ đường được biểu diễn một cách đơn giản như sau:
2.1.4 Sức chống chịu của nấm men
Trong đời sống ngoài tự nhiên cũng như trong các quy trình lên men nhân tạonấm men có khi phải trải qua các điều kiện bất lợi của môi trường như: đóng băng, tanbăng, nồng độ đường cao, nồng độ cồn cao, sự khô hạn, và các chất oxi hoá mạnh, v.v.Các đại phân tử trong tế bào gồm protein, nucleic acid và màng sẽ bị hư hỏng nặngtrong các điều kiện stress Điều này dẫn tới việc ức chế sự tăng trưởng của tế bào vàkhả năng lên men (Jun và Hiroshi, 2009) Để tránh các thiệt hại gây chết, các tế bàonấm men cần có nhiều cơ chế chống lại stress, ví dụ như sự cảm ứng stress biểu hiệnprotein, sự tích tụ các chất chống lại stress hay thay đổi thành phần của màng bằngviệc điều chỉnh sự biểu hiện gen mã hóa các enzyme tương ứng qua sự thúc đẩy bởicác stress
Các yếu tố về ngoại cảnh ảnh hưởng tới sinh trưởng phát triển của nấm men là:nhiệt độ, nồng độ oxi hoà tan hay độ hiếu khí, pH môi trường, hàm lượng sản phẩmchính tạo ra, thành phần môi trường và các điều kiện khác của môi trường nuôi cấycho sinh trưởng của nấm men nhiệt độ tối thích vào khoảng 29oC - 31oC nhưng với lên
Trang 19men lại không hoàn toàn như vậy Nhiệt độ lên men ở khoảng 30oC - 35oC, bắt đầu tích
tụ rượu etylic sớm, tốc độ lên men nhanh và kết thúc sớm nhưng không lên men đượchết đường (Lương Đức Phẩm, 2009) Nhiệt độ không những chỉ ảnh hưởng tới cường
độ lên men và sinh trưởng của nấm men mà còn ảnh hưởng tới sinh tổng hợp các sảnphẩm phụ và thứ cấp (Lương Đức Phẩm, 2009) Nhiệt độ càng cao càng dễ sinh vàtích tụ các sản phẩm loại này Điều này không có lợi cho chất lượng của sản phẩmchính Nhiệt độ và độ hiếu khí có quan hệ chặt chẽ với nhau Nấm men sinh trưởngmạnh mẽ ở khoảng thời gian đầu của quá trình lên men (sau pha tiềm phát) Trong thờigian này dịch lên men có lượng oxi hoà tan và nhiệt độ rất thích hợp cho nấm mensinh trưởng và lên men Nhiệt độ quá thấp cũng ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và
lên men của nấm men (Baguena et al., 1991; Almeida và Pais, 1996)
Độ hiếu khí được thể hiện bằng lượng oxi hoà tan trong môi trường, đơn vị tính
là mg O2/l lít môi trường Ở điều kiện nhiệt độ càng cao lượng oxi hoà tan càng thấp.Oxi hoà tan vào môi trường lỏng ở dạng bọt khí nhỏ làm kích thích sinh sản của nấmmen và tạo điều kiện cho tế bào nấm men hô hấp Trong môi trường có khuấy trộn vàthổi khí làm cho bọt khí phân tán nhỏ và đều hơn, do đó tế bào nấm men được tiếp xúcvới chất dinh dưỡng và oxi tốt hơn
pH của môi trường có ảnh hưởng tới đời sống của nấm men, trong quá trìnhnuôi thì pH giảm dần hay tăng độ chua do sự tạo thành CO2 và các axit hữu cơ trongquá trình (Lương Đức Phẩm, 2004)
Khí CO2 cũng như là chất trao đổi tự nhiên, ở nồng độ xác định nó có thể kìmhãm hoặc thậm trí đình chỉ sinh sản nấm men (Lương Đức Phẩm, 2004) CO2 cao làmquá trình hô hấp chậm lại
Rượu etylic được tích tụ khi nấm men sinh trưởng phát triển và chúng tích tụcàng ngày càng nhiều Hàm lượng rượu cao dần sẽ làm cho nấm men sinh trưởngchậm dần và đến một nồng độ nào đó có thể sẽ làm cho nấm men dừng hẳn sự phát
triển (Dan et al., 2000).
Thành phần môi trường nuôi cấy và lên men có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởngcủa nấm men và trao đổi chất trong tế bào, đặc biệt có thể quyết định cả hiệu suất lênmen hoặc chuyển hướng lên men từ sản phẩm này sang sản phẩm khác Đường và các
Trang 20chất hoà tan khác trong môi trường tạo áp suất thẩm thấu, áp suất thẩm thấu thườngchênh lệch giữa tế bào nấm men và môi trường nuôi cấy Sự chênh lệch này làm chocác chất dinh dưỡng dễ hoà tan vào môi trường tế bào qua màng và sản phẩm của tếbào hòa tan vào môi trường Áp suất thẩm thấu quá cao gây hiện tượng khô sinh lý teochất nguyên sinh dẫn tới nấm men không sinh trưởng được, áp suất thẩm thấu thườngchênh lệch giữa tế bào nấm men và môi trường nuôi cấy Sự chênh lệch này làm chocác chất dinh dưỡng dễ hoà tan vào môi trường tế bào qua màng và sản phẩm của tếbào hoà tan vào môi trường và tổng sinh khối giảm, thậm chí tế bào sẽ ngừng pháttriển.
Nhiều năm trở lại đây, nấm men được phát triển bằng cách sử dụng các kĩ thuậtnuôi cấy, sử dụng công nghệ sinh học để làm thay đổi mức độ hoạt động trao đổi chấtnhư quá trình chuyển hoá carbon, chuyển hoá nitơ, cũng như các phản ứng chống lại
stress của môi trường (Higgin et al., 2001; Tanaka et al., 2006).
2.1.5 Vai trò của S cerevisiae trong đời sống
S cerevisiae là nấm men không gây bệnh Các ngành khoa học: di truyền học,
sinh học phân tử, hóa sinh trao đổi chất, v.v đã dùng nó như một sinh vật mẫu trongcác thí nghiệm (Dynamac, 1990) Trong nhiều thế kỷ, khả năng sinh ethanol và CO2
của S cerevisiae được lợi dụng để sản xuất nước giải khát có cồn, ethanol (Irfana et
al., 2009) và bánh mỳ; ứng dụng nhiều trong y học (Dae-Kyun et al., 2006); sản xuất
thực phẩm chức năng, sản xuất thực phẩm chức năng, thức ăn chăn nuôi, v.v Ngày
nay, khoảng trên 2 triệu tấn S cerevisiae được dùng trên toàn thế giới mỗi năm (Bernard và Jack, 2003) Ngoài vai trò sinh học - công nghiệp quan trọng, S.
cerevisiae còn là đối tượng nghiên cứu có ý nghĩa, đặc biệt là làm mô hình mẫu để
nghiên cứu các sinh vật nhân chuẩn khác bao gồm cả con người (Johnson et al., 1998; Johnson et al., 2006). Nhiều gen liên quan tới chu kỳ phân chia tế bào của S
cerevisiae tương tự các gen ở người (Clare et al., 1996) Hiểu biết về những gen này
đã giúp phân lập và mô tả đặc trưng các gen gây bệnh ung thư ở người (Michael et al.,
2002; George và Gary, 1998) Đồng thời, hệ di truyền của nấm men được sử dụng rộngrãi, nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo là công cụ không thể thiếu được trong nghiên cứu
tổ chức vật chất của DNA người (Saha et al., 1998) Tháng 4 năm 1996, S cerevisiae
Trang 21trở thành sinh vật nhân chuẩn đầu tiên có bộ nhiễm sắc thể được giải mã hoàn toàn,việc này càng làm tăng thêm vai trò của nó trong nghiên cứu cơ bản (Dujon, 1996).
Ngoài việc sử dụng S cerevisiae trong chế biến thực phẩm, người ta còn sử dụng rộng
rãi nó để sản xuất các thành phần phân tử của tế bào như lipid, protein (Bigelis, 1985;Stewart và Russell, 1985)
2.2 Rượu và vai trò của nấm men trong sản xuất rượu
2.2.1 Rượu
Sản phẩm rượu đã được biết đến từ cách đây hơn ba thế kỉ (Smith và Ferdinand,1940) Rượu là những hợp chất hữu cơ có một hay nhiều nhóm OH nối với nguyên tửcacbon no (nếu hợp chất có nhóm OH ở nguyên tử cacbon không no của dãy mạch khôngvòng thì được xếp vào loại enol; hợp chất có nhóm OH ở cacbon của vòng thơmđược xếp vào loại phenol) Tuỳ theo số lượng nhóm OH có trong phân tử mà phân biệtmonol, điol, triol và poliol
Cồn (hay còn gọi là ethanol) có công thức hóa học là C2H5OH, là chất lỏngkhông màu, có mùi đặc trưng, vị cay, nhiệt độ sôi là 78,3oC, khối lượng riêng ở 15oC là0,79356g/m3, hóa rắn ở -114,15oC và tan trong nước với bất kì tỷ lệ nào
(http://encyclopedia2.thefreedictionary.com/ethanol)
Thường các loại đồ uống có chứa cồn được chia theo nồng độ cồn có bêntrong :
Kefia : sữa lên men, có nồng độ cồn khoảng 3%.
Bia : nồng độ cồn 1-12%, thường ở khoảng 5%.
Rượu vang : nồng độ cồn 7-14%, thường vào khoảng 12%.
Rượu mùi : nồng độ cồn 15-75%, thông thường dưới 30%.
Rượu mạnh : nồng độ cồn 30-55% Dân gian thường gọi là rượu.
Rượu chiếm một vị trí quan trọng trong đời sống con người Rượu là chất dinhdưỡng, nếu sử dụng trong chừng mực có tác dụng thư giãn cơ thể, giảm căng thẳng,tạo cảm giác hưng phấn, giúp ngủ ngon hơn, cải thiện lưu thông máu Sản phẩm rượuđược người dân khắp nơi trên thế giới sử dụng để tăng cường sức khỏe Hơn nữa, uốngrượu trong các dịp lễ tết là truyền thống đã có từ lâu đời và vẫn còn duy trì, phát triểncho đến ngày nay
Trang 22Các nguyên liệu trong sản xuất rượu
Các loại rượu truyền thống hiện nay sử dụng bánh men là rượu nếp than, rượucao độ và rượu cần Để sản xuất rượu người ta sử dụng các nguyên liệu sau đây:
Tinh bột: Nguyên liệu chính để sản xuất rượu là các loại ngũ cốc có hàm lượng tinh
bột cao thông dụng như gạo tẻ, gạo nếp, gạo lứt, gạo nương lúa mạch, ngô hạt,mầm thóc, sắn, hạt mít, hạt dẻ, hạt bo bo v.v Tuy một số vùng miền có nhữngnguyên liệu đặc trưng (như mầm thóc, ngô, hạt mít, hạt dẻ v.v.), nhưng nói chung cácloại gạo nếp cho thành phẩm rượu được ưa chuộng nhất trong cộng đồng tại khắp cácvùng miền do gạo rất thơm và rượu có độ ngọt nhất định Các loại gạo nếp như nếp cáihoa vàng, nếp bông chát, nếp ruồi, nếp mỡ, nếp mường, nếp sáp, nếp thơm, nếphương, nếp ngự, nếp quạ, nếp cái, nếp tiêu, nếp sột soạt, nếp ba tháng v.v được sửdụng nấu rượu cho thấy sự đa dạng và đôi khi là sự kén chọn hết sức cầu kỳ tại các giađình nghệ nhân làm rượu Rượu nấu bằng các loại gạo tẻ thường mang tính phổ thông,vùng miền nào cũng có thể sản xuất và tiêu thụ được, tuy nhiên có một số loại gạo tẻngon được lựa chọn nấu rượu như gạo cúc, gạo co, gạo trì, gạo ba trăng, gạo trăngbiển, gạo tứ quý, gạo nhe, gạo bắc thơm, gạo tám, gạo nàng hương v.v vẫn cho nhữngchén rượu quý ngọt ngào hương vị (Nguồn http://anhdao.vn/?page=ruou&id=37&idmenu=1&idsubmenu=3)
Ngoài ra người ta còn sản xuất rượu từ rỉ đường của các nhà máy đường Trong
rỉ đường, chất khô chiếm 80-85%, nước 15-20% Trong chất khô, đường chiếm 60%trong đó 25-30 % sacrose, 20-25% đường khử (glucose, fructose), còn lại là các chấtphi đường
Men rượu: Men rượu là hỗn hợp chất hữu cơ như lúa, ngô, sắn, khoai trong
đó có chứa các vi sinh vật phục vụ cho quá trình sản xuất rượu Men rượu được chialàm 2 loại:
Men rượu truyền thống chỉ được làm ở các hộ gia đình theo kinh nghiệm, chưađược đăng kí nhãn hiệu hàng hoá và chưa được chứng nhận an toàn thực phẩm Menrượu truyền thống được chế từ nhiều loại thảo dược (thuốc Nam, thuốc Bắc) như camthảo, quế chi, gừng, hồi, thạch xương bồ, bạch chỉ, xuyên khung, rễ ớt v.v theo những
Trang 23bí quyết, công thức riêng của từng gia đình Những công thức này cùng với kỹ thuật ủmen chất lượng nhiều khi không truyền cho người ngoài nhằm giữ bí quyết rượu củanghệ nhân độc nhất vô nhị Nhào trộn hỗn hợp với bột gạo, thậm chí cả bồ hóng và ủcho bột hơi nở ra sau đó vo, nắm từng viên quả nhỏ để lên khay trấu cho khỏi dính,đem phơi thật khô và cất dùng dần.
Men rượu công nghiệp là men rượu sản xuất ở quy mô công nghiệp của doanhnghiệp sản xuất đã có chứng nhận chất lượng của cơ quan quản lý có thẩm quyền Mọithông tin liên quan về sản phẩm là yêu cầu bắt buộc phải công bố như: thành phần, độ
36-vi.html)
http://ruoulangvan.craftb2c.com/product_detail/3728/14247/men-thuoc-bac-gom-Quy trình sản xuất rượu truyền thống
Nguyên liệu chính được nấu, đồ chín, đánh tơi và trộn với men rượu tán thậtnhỏ mịn cho đều khi nguyên liệu vẫn còn ấm Đem ủ trong chỗ ấm một thời gian nhấtđịnh khoảng vài ngày tùy theo thời tiết, loại nguyên liệu, loại men, vùng miền và kinhnghiệm người nấu rượu, sau đó đổ thêm nước (khoảng 2-3 lít nước/ 1kg gạo đem nấu)cho lên men tiếp trong 3-4 ngày nữa Sản phẩm đã lên men sau đó cho vào nồi chưngcất đun lửa đều để rượu bay hơi Trên miệng nồi có một ống nhỏ để dẫn hơi rượu vàmột phần hơi nước trong quá trình nấu ra ngoài, ống dẫn dài và một phần lớn độ dàicủa ống được ngâm trong bồn nước lạnh để hơi rượu ngưng tụ thành giọt lỏng chảyvào bình hoặc chai đựng rượu Nếu lấy ít rượu ta sẽ được "rượu nước đầu" hay rượu
Trang 24bọt, có nồng độ cao nhất (thường 15 lít gạo cho được khoảng 5 lít rượu có nồng độ caođến 64-65 độ) (Nguồn http://ruoulangvan.craftb2c.com/product_detail/3728/14249/chum-u-men-ruou-com-te.html).
Sơ đồ quy trình sản xuất rượu:
2.2.2 Vai trò của nấm men trong sản xuất rượu
Hệ vi sinh vật trong bánh men tham gia các quá trình chuyển hóa cơ chất: Giaiđoạn đầu vi khuẩn phát triển hình thành các axit hữu cơ (axit hoá dịch đường trước khilên men), pH giảm xuống tạo điều kiện cho các loài nấm mốc phát triển, nấm mencũng bắt đầu phát triển (tốc độ phát triển yếu hơn nấm mốc) Quá trình chuyển hóa
tinh bột thành đường: nhờ nấm mốc Aspergillus sp, Rhizopus sp, Mucor sp, tạo ra
Xử lý nguyên liệu
Nấu chín
Làm nguội
Trộn menNguyên liệu
Lên men
Chưng cất
Rượu etylic
Bã rượuBánh men
Trang 25amylase (α - amylase, glucoamylase) Quá trình chuyển hóa đường thành rượu nhờ các
loài nấm men Saccharomyces (Lương Đức Phẩm, 2004)
Trong quá trình sản xuất rượu, tế bào nấm men không có khả năng chuyển hoá
hồ tinh bột thành rượu Chúng chỉ có khả năng sử dụng đường, chuyển đường thànhrượu Vì vậy sau khi nấu để dịch hoá, dịch tinh bột cần được chuyển thành đườngtrước khi lên men Lên men là giai đoạn quan trọng cuối cùng và chủ yếu nhất của quátrình sản xuất rượu cồn Trong quá trình này nấm men thực hiện quá trình thuỷ phânđường phức tạp thành đường đơn giản Quá trình lên men do tác động của các tế bàonấm men như sau: đường và các chất dinh dưỡng của môi trường lên men được hấpphụ và khuyếch tán vào bên trong tế bào men để chuyển hoá qua các hợp chất trunggian và cuối cùng tạo thành rượu và khí CO2 Rượu và CO2 tạo thành được khuyếchtán qua màng tế bào ra môi trường bên ngoài Rượu hoà tan trong nước nên tan nhanhvào dung dịch lên men còn CO2 hoà tan kém trong nước nên chúng bị bão hoà trongdung dịch Khi dung dịch đã bão hoà CO2 thì CO2 tạo thành được bám quanh tế bàonấm men và lớn dần lên Lượng CO2 tích tụ lớn đến mức nào đó nó thắng khối lượngcủa tế bào nấm men thì tế bào nấm men được bọt khí CO2 kéo dần lên bề mặt dịch lênmen Khi lên đến mặt thoáng, CO2 được thoát ra và tế bào nấm men có khối lượng lớnhơn khối lượng riêng dịch lên men được lắng xuống Nhờ sự chuyển động lên xuốngnày mà quá trình lên men được tăng cường Sau khi quá trình lên men kết thúc sảnphẩm được chuyển qua thiết bị vắt li tâm lấy dịch qua giai đoạn chưng cất
Trang 26PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Là các mẫu nấm men rượu phân lập từ các loại men rượu truyền thống và menrượu công nghiệp thu thập ở các địa phương khác nhau trong nước
3.1.2 Thiết bị
Các dụng cụ thiết bị của phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ visinh Khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (bảng 1):
Bảng 1 Tên máy móc, thiết bị dùng trong đề tài
Tủ cấy vô trùng JSCB – 1500SB JSR Hàn Quốc
Tủ sấy dụng cụ JSOF - 100 JSR Hàn Quốc
Lò vi sóng EMG -8586V SANYO Nhật Bản
Nồi hấp HVE - 50 Hyrayama Nhật Bản
Máy đo pH bàn Meter S20 Mettler toledo Thuỵ Sỹ
Máy khuấy từ gia nhiệt VELP Italy/Châu Âu
Máy sản xuất đá lạnh cho thí nghiệm Evermed Italy
Bể ổn nhiệt JSWB - 22T JSR Hàn Quốc
Cân kĩ thuật độ chính xác 0.01 g Mettler Toledo Thuỵ Sỹ
Máy đo quang phổ tử ngoại và khả kiến Lamda - Scientific Australia
Tủ ấm nuôi cấy vi sinh vật Memmert Đức
Tủ lạnh sâu -20ºC Operon Hàn Quốc
Máy lắc thường JSSI – 100C JSR Hàn Quốc
Cân phân tích độ chính xác 0.1 mg Mettler Toledo Thuỵ Sỹ
Kính hiển vi phóng đại 1000 lần Leica Trung QuốcMáy li tâm lạnh Universal 320R Hettich Đức
Máy ủ ấm eppendorf Eppendorf Đức
Trang 27Enzyme Taq polymerase MIX Qiagen Mỹ
3.2 Môi trường
Môi trường phân lập và nuôi S cerevisiae
Thành phần 1 lít môi trường YPD lỏng (yeast peptone dextrone):
Trang 28Thành phần 1 lít môi trường YPD lỏng trong thí nghiệm chịu mặn:
3.3 Các phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phân lập các chủng nấm men S cerevisiae
Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể banđầu và đưa về dạng thuần khiết Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việcnghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật Vi sinh vật dạng thuần khiết là giống vi sinh vậtđược tạo ra từ một tế bào ban đầu
Nguyên tắc của quá trình phân lập vi sinh vật là tách riêng các tế bào vi sinhvật, nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để tạo các khuẩnlạc riêng, cách biệt nhau
Tiến hành:
Lấy khoảng 2g mỗi mẫu nấm men đem pha loãng Pha loãng liên tiếp mẫu bằngnước cất vô trùng ở nhiều nồng độ khác nhau nhằm có được các khuẩn lạc đơn riêng rẽ
Trang 29trên bề mặt đĩa thạch YPD Một thể tích dịch pha loãng ở mỗi nồng độ được cấy trảilên trên bề mặt đĩa thạch YPD với một lượng từ 50µl - 100µl Các đĩa thạch đã cấy trảiđược ủ trong điều kiện thích hợp, với nấm men ở 30oC trong 2 ngày, sau đó quan sát.Mỗi tế bào riêng biệt sẽ sinh sản và phát triển thành 1 khuẩn lạc trên bề mặt môi
trường (Dan et al., 2000).
3.3.2 Giữ giống
Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng: Các chủng nấm men đã được phânlập sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm để giữ giống (LươngĐức Phẩm, 2004) Mẫu được cấy theo kiểu zích zắc trên bề mặt thạch nghiêng và đượcnuôi ở 30oC trong 2 ngày Giống được giữ ở 4oC cấy chuyển hàng tháng và được hoạthóa trước khi nhân giống
Giống được giữ ở - 80oC bằng glycerol 87% với tỷ lệ 8 : 2,3 (800 µl mẫu : 230
µl glycerol 87%) Giữ giống theo cách này có thể giữ được vài năm và cần được hoạthoá trước khi nhân giống
3.3.3 Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của S cerevisiae
Các đặc điểm nuôi cấy, hình thái được đánh giá dựa trên các chỉ số: Khả năngphát triển, hình thái, màu sắc, bề mặt và mép khuẩn lạc; hình thái tế bào nấm men(Lương Đức Phẩm, 2009)
Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng trên môi trường YPD agar:
+ Khả năng phát triển của khuẩn lạc
3.3.4 PCR xác nhận các chủng nấm men
PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp chuỗi nhờ polymerase) làmột trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong lĩnh vực sinh họcphân tử Phương pháp này do Kary Mullis phát minh vào năm 1985, được giới thiệu
Trang 30lần đầu tiên tại hội thảo thứ 51 ở Cold Spring Harbor vào năm 1986, và ông đã đượcnhận giải thưởng Nobel hoá sinh học vào năm 1993.
Nguyên tắc của phương pháp PCR là dựa vào đặc tính hoạt động của DNApolymerase: cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt về hoạt động tổng hợp mộtmạch DNA mới từ mạch khuôn Như vậy nếu cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổsung với hai đầu của một trình tự DNA thì sẽ tổng hợp được đoạn DNA nằm giữa haimồi đó Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNAriêng biệt Đây thực sự là phương pháp thuận lợi cho việc xác định sự có mặt của mộtgen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao
Trong tế bào nấm men S.cerevisiae có 12 gen mã hóa cho một nhóm các protein(hydrophilin) có vai trò quan trọng đối với khả năng chống chịu mất nước của tế bào.YJL144W là một trong số 12 gen đó (Đặng Xuân Nghiêm, 2008) Việc sử dụng 1 mồi
có khả năng nhân bản đoạn gen YJL144W giúp xác định chính xác các chủng nghiên
cứu trong đề tài là chủng S cerevisiae Mồi sử dụng trong việc xác định này có tên là
YJL144W với kích cỡ khoảng 103 a.a
Thành phần phản ứng PCR (25µl): 20 µl nước cất vô trùng + 2,5 µl buffer + 1
µl mồi (Forward + Reverse) + 0.5 µl tế bào chứa DNA khuôn + 1 µl enzym Taq
Chương trình PCR gồm:
Nhiệt độ ban đầu: 95oC trong 5 phút
30 chu kỳ: 95oC trong 2 phút, 53oC trong 1 phút, 72oC trong 1 phútKết thúc: 72oC trong 10 phút
(Đặng Xuân Nghiêm, 2008) Điện di kiểm tra trên gel 1% agarose với 1kb marker
3.3.5 Xác định sự sinh trưởng theo mật độ quang
Phương pháp xác định nồng độ tế bào bằng máy so màu quang học được sửdụng rộng rãi Cơ sở của phương pháp này là tính chất hấp thụ hoặc làm lệch một phầnánh sáng của các dung dịch có vật chất lơ lửng Để đánh giá tốc độ phát triển của nấmmen ta có thể đo sự tăng sinh khối qua giá trị OD (optical density) Tất cả các thínghiệm được đo ở bước sóng trong khoảng 580 nm đến 660 nm
Tiến hành:
Trang 31Đo OD (λ = 620 nm) các mẫu nấm men được nuôi lắc 1 ngày để xác địnhlượng mẫu cần cho vào môi trường nuôi đo tốc độ sinh trưởng để OD ban đầu của cácmẫu này là bằng nhau Mỗi một mẫu được cho vào 50 ml môi trường đựng trong lọ đãhấp sẵn và lắc đều đem đo OD ở To với dung dịch chuẩn là môi trường YPD lỏng Saukhi đo xong đem nuôi lắc ở 30oC, 200 vòng/phút và 2 tiếng đo 1 lần với nồng độ phaloãng thích hợp sao cho OD luôn nằm trong khoảng từ 0,1 đến 0,5 để đảm bảo trị số
OD và số tế bào trong dịch đo là tỷ lệ tuyến tính
3.3.6 Đánh giá khả năng chịu lạnh
Khả năng chịu lạnh của nấm men là một đề tài rất rộng (Holmes và Hoseney,
1984; Hino et al., 1987) Khả năng sống sót và chất lượng lên men tốt của nấm men S.
cerevisiae bị ảnh hưởng bởi chu kỳ đóng băng - tan băng, tuổi tế bào nấm men, hàm
lượng đường trong nguyên liệu, hàm lượng protein (Hsu et al., 1979), hiệu quả chung phụ thuộc vào mỗi chủng nấm men (Hino et al., 1987).
Kumio et al đã làm thí nghiệm chịu lạnh của nấm men bằng cách để chúng ở
-20oC trong 3 ngày sau đó làm tan băng đá ở 30oC trong 10 phút Nấm men sau khi bịđóng băng và làm tan băng được nuôi trong môi trường YPD lỏng rồi được đo OD tại
λ = 620 nm Đồng thời, các mẫu nấm men cũng được nuôi với nồng độ pha loãng thíchhợp trên đĩa thạch ở 30oC trong 48 giờ
Tỷ lệ sống sót được tính toán từ số lượng các tế bào sống trước và sau khi đóngbăng
Trang 32 Thực tế khi tiến hành thí nghiệm cho thấy, trước pha ổn định trung bình sau nuôi lắc 2 giờ ở 200 vòng/phút, 30oC với môi trường YPD thì số lượng tế bào tăng gấp đôi
OD từ 0,1 đến 0,5 thì chỉ số OD và số tế bào là tuyến tính (Nguyễn Lân Dũng và Bùi Thị Việt Hà, 2009)
OD bằng 1 tương đương với 1,5.107 tế bào (Xiao, 2005)
Giả sử: Tổng số tế bào của mẫu là a
Số tế bào sống là x
Số tế bào chết là y
Ta có phương trình sau: x + y = a
Sau 2 giờ tổng số tế bào của mẫu là: 2x + y <=> 2x + (a – x)
Nếu coi thời gian nuôi là t (t = 2, 4, 6, 8, 10) thì số tế bào sống tương ứng với khoảng thời gian đó là: 2t/2.x
Thí nghiệm chịu lạnh được tiến hành bằng cách lấy mỗi mẫu 5 ml ở OD620
khoảng bằng 1 được nuôi lắc 1 ngày, đem li tâm sau đó tế bào nấm men được hòa 1,2 mlnước cất vô trùng vortex đều Dung dịch nấm men được hút lần lượt ra 6 ống eppendorfmỗi ống là 200 µl 3 ống được đưa vào tủ lạnh mát 4oC và 3 ống còn lại được đặt ngẫunhiên vào giá để ống eppendorf (giá này đã được đặt trước vào tủ - 20oC) trong tủ - 20oC(Dang, 2011) Sau 19 tiếng bỏ mẫu trong tủ - 20oC ra làm giảm lạnh đột ngột bằng cách
xả dưới vòi nước rồi để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Sau đó, mẫu ở từng ốngeppendorf được hút hết để cho lần lượt vào các lọ chứa 50 ml môi trường YPD lỏng
Trang 33Những lọ này sau đó được nuôi lắc ở 30oC, 200 vòng/phút và đo OD620 ở To, sau 2 tiếng
đo 1 lần với hệ số pha loãng thích hợp
3.3.7 Đánh giá khả năng chịu khô hạn
độ ẩm 75% Độ ẩm tương đối được duy trì bằng dung dịch muối NaCl bão hoà(Rockland, 1960) Sau 15 tiếng 200 µl môi trường YPD được cho vào mỗi ốngeppendorf, vortex nhẹ và để trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó dịch tế bào ở từngống eppendorf được pipette ra từng ống falcol chứa 7 ml môi trường YPD, lắc đều,đem đo OD620 ở To Sau 2 tiếng đo 1 lần với nồng độ pha loãng thích hợp, tất cả mẫuđược đo nuôi ở 30oC, lắc 200 vòng/phút
3.3.8 Đánh giá khả năng chịu áp suất thẩm thấu
Lượng đường và các chất hòa tan khác trong môi trường tạo nên những áp suấtthẩm thấu khác nhau, tạo chênh lệch áp suất giữa tế bào nấm men và tế bào nuôi cấy
Sự chênh lệch này làm cho các chất dinh dưỡng dễ hòa tan và thấm vào tế bào quamàng Độ chênh lệch càng lớn thì sự tích tụ sinh khối nấm men càng lớn, nhưng chỉtăng đến giá trị nhất định để cân bằng áp suất giữa tế bào và môi trường dinh dưỡng,đảm bảo hoạt động sống của tế bào Áp suất môi trường quá cao gây hạn sinh lí, teonguyên sinh chất tế bào, nồng độ đường cao quá thì tế bào không sinh sản, không lênmen Nồng độ thấp quá tế bào ngừng phát triển Đa số các loài nấm men thường hoạtđộng trong môi trường có hàm lượng đường dưới 20% Có một số chủng loại hoạtđộng ở môi trường có nồng độ cao hơn Khi nhân giống thường dùng môi trường cónồng đường thấp hơn 10%
Tiến hành:
Mỗi một mẫu nấm men nuôi lỏng đến pha ổn định được cho vào 50 ml môitrường được đựng trong lọ đã hấp sẵn và lắc đều, được điều chỉnh nồng độ bằng cách
Trang 34pha loãng môi trường YPD lỏng ở các nồng độ đường 15% và 25% (tương ứng với 2thí nghiệm ở 2 nồng độ đường khác nhau) sao cho OD620 ở To bằng 0,1 Các mẫu đượcnuôi lắc ở 30oC, 200 vòng/phút và 2 tiếng đo OD620 sau mỗi 2 tiếng 1 lần với nồng độpha loãng thích hợp
3.3.9 Đánh giá khả năng chịu mặn
Nồng độ muối NaCl 1,2M sẽ làm chênh lệch nồng độ ở trong và ngoài tế bào, tế
bào bị mất nước và co lại so với khối lượng ban đầu của nó (Albertyn et al., 1994).
Trong môi trường tự nhiên của nấm men áp suất thẩm thấu luôn ở trạng thái cân bằng
do có sự điều tiết ở bên trong tế bào Việc thay đổi đột ngột nồng độ chất tan đặc biệt
là NaCl hay đường sẽ làm ảnh hưởng tới các hoạt động sống của tế bào nấm men Ởthí nghiệm này chúng tôi tiến hành cho các tế bào nấm men tiếp xúc với môi trường cónồng độ muối NaCl cao để xét khả năng chịu áp suất thẩm thấu và stress ion của cácchủng nấm men trong nghiên cứu
Tiến hành:
Một lượng thích hợp mỗi mẫu được lấy cho vào 7 ml môi trường YPD lỏng, đo
và điều chỉnh OD620 cho đều nhau Muối NaCl được cho vào mỗi lọ để đạt nồng độ1M Các mẫu được nuôi lắc ở 30oC, 200 vòng/phút và đo OD620 sau mỗi 2 tiếng đo 1lần với nồng độ pha loãng thích hợp Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
3.3.10 Đánh giá khả năng chịu cồn
Cồn được tích tụ dần trong dịch lên men và chính nó lại là chất độc kìm hãmcác nấm men Khả năng chịu cồn của nấm men là nồng độ cồn ức chế sự phát triển vàhoạt động của nấm men khi nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC
Tùy theo khả năng chịu được nồng độ cồn khác nhau mà người ta sản xuất racác sản phẩm khác nhau
Trang 35sao cho OD620 ở To bằng 0,1 Các mẫu được nuôi lắc ở 30oC, 200 vòng/phút và đo
OD620 sau mỗi 2 tiếng 1 lần với nồng độ pha loãng thích hợp
3.3.11 Đánh giá khả năng lên men rượu
Để xác định khả năng lên men rượu của các chủng nấm men khác nhau, chúng
ta sử dụng phương pháp xác định hàm lượng CO2 giải phóng ra hoặc sản lượng rượuthu được khi sử dụng các chủng này lên men cơ chất
Nguyên tắc: dựa vào phương trình tổng quát của quá trình lên men
Tiến hành:
Đường sucrose được bổ sung vào môi trường đu đủ sao cho môi trường đạtnồng độ đường 15%, sau đó hấp khử trùng Mỗi một mẫu nấm men nuôi lỏng đến phaổn định được cho vào 50 ml môi trường trên Bịt kín miệng lọ và có ống dẫn khí trong
lọ vào bình đựng 200ml dung dịch Ba(OH)2 0,5M, các bình này được đặt trên máy lắcliên tục dể đảm bảo cho lượng khí CO2 sinh ra trong lọ phản ứng hết với Ba(OH)2
trong bình Sau 48 giờ đo khối lượng tăng thêm của bình Ba(OH)2 0,5M, từ đó suy ralượng CO2 sinh ra
Khả năng sinh ethanol
Khả năng lên men rượu thể hiện rõ ràng nhất qua sản lượng rượu thu được saukhi lên men và chưng cất Để sản xuất rượu, về nguyên tắc ta có thể dùng bất kỳnguyên liệu nào có chứa đường hoặc polysaccharide nhưng sau thủy phân sẽ biếnthành đường lên men được Trong quá trình sản xuất, để đảm bảo lợi nhuận cũng nhưthời gian thu hồi sản phẩm người ta chọn nguyên liệu đáp ứng những nhu cầu sau:
- Hàm lượng đường hoặc tinh bột cao, có khả năng đem lại hiệu quả kinh tế
- Vùng nguyên liệu phải tập trung và đủ thỏa mãn