Nghiên cứu thu nhận enzym endolysin tái tổ hợp lyssa và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn staphylococcus aureus trong bảo quản sữa

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAMVIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ XUÂN CÔNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME ENDOLYSIN TÁI TỔ HỢP LYSSA VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN STAP

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ XUÂN CÔNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME ENDOLYSIN TÁI TỔ HỢP

LYSSA VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG BẢO QUẢN SỮA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS KHUẤT HỮU TRUNG

HÀ NỘI – NĂM 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME ENDOLYSIN TÁI TỔ HỢP

LYSSA VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG BẢO QUẢN SỮA

Người hướng dẫn : PGS.TS KHUẤT HỮU TRUNG Học viên thực hiện : LÊ XUÂN CÔNG

Lớp : K20

Hà Nội - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi

dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Khuất Hữu Trung Các số liệu và tài liệu

được trích dẫn trong luận văn là trung thực Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã được công bố trước đó.

Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình.

Hà Nội, 06 tháng 8 năm 2018

Học viên

Lê Xuân Công

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TSKhuất Hữu Trung, ThS Nguyễn Thị Hồng Hải cùng toàn thể các cán bộ Bộmôn Vi sinh – Viện Di truyền Nông nghiệp đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôihoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trong khoa Công Nghệsinh học, Viện Sinh Thái và Tài Nguyên Sinh Vật đã tận tình truyền đạt kiếnthức trong hai năm tôi học tập Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trìnhhọc không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu luận văn mà còn là hànhtrang quí báu để tôi bước vào đời một cách vững chắc và tự tin

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người đãluôn ở cạnh tôi, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Cuối cùng tôi kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành côngtrong sự nghiệp cao quý Đồng kính chúc các Cô, Chú, Anh, Chị trong Bộ môn

Vi sinh – Viện Di truyền Nông nghiệp luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiềuthành công tốt đẹp trong công việc

Hà Nội, ngày 6 tháng 8 năm 2018

Học viên

Lê Xuân Công

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 13: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus 3

1.1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus ở Việt Nam 5

1.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 6

1.2.1 Giới thiệu vê Staphylococcus 6

1.2.2 Hình thái và đặc điểm sinh hóa 10

1.2.3 Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố 14

1.2.4 Tính kháng thuốc kháng sinh 15

1.3 Enzym tái tổ hợp 15

1.3.1 Hệ thống biểu hiện: 15

1.3.2.18Các vector biểu hiện 18

1.4 Tổng quan về enzym endolysin 21

1.4.1 Giới thiệu về enzym endolysin 21

1.4.2 Vai trò và ứng dụng 23

1.4.3 Tổng hợp nhân tạo endolysin kháng khuẩn 24

1.4.4 Ứng dụng của endolysin trong công nghệ sinh học thực phẩm 26

1.5 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzym endolysin 27

1.5.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 27

1.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 27

1.5.3 Ảnh hưởng của pH 28

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP28 NGHIÊN CỨU 28

2.1 Vật liệu 29

2.2 Hóa chất và thiết bị 29

2.3 Phương pháp nghiên cứu 30

2.3.1 Phương pháp biểu hiện gen LysSA trong vi khuẩn E.coli 30

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu tối ưu các điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn E.coli BL21 tái tổ hợp đến sinh trưởng và biểu hiện endolysin 31

2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh của enzyme endolysin LysSa tái tổ hợp 31

2.3.4 Phương pháp điện di SDS-PAGE 32

2.3.5 Phương pháp tinh sạch enzyme endolysin bằng cột sắc ký ái lực 34

2.3.6 Xác định hoạt độ của enzym endolysin tái tổ hợp 34

2.3.7 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng của endolysin LysSa với vi khuẩn gây bệnh có trong sữa với các nồng độ endolysin và các thời gian bổ sung endolysin

35

2.3.8 Phương pháp đánh giá chất lượng sữa tươi nguyên liệu sau khi bổ sung enzyme endolysin LysSa 35 2.3.9 Phương pháp đánh giá chất lượng sữa tươi thanh trùng sau khi bổ sung

enzyme endolysin LysSa 35

Chương 3: KẾT QUẢ 36 3.1 Nghiên cứu tối ưu các điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn E.Coli BL21 tái tổ hợp

3.4 Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Staphylococus aureus của enzym

endolysin LysSa tái tổ hợp 44

3.4.1 Đánh giá hoạt tính kháng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 46 3.4.2 Phổ kháng khuẩn của enzym endolysin 47

3.5 HoNK \l "_Toc3793088"vi khuẩn gây bệnh của endolysin LysSapháp phá tế bàodolysin LysSan LysSa với 49 3.6 Chất lượng sữa tươi nguyên liệu sau khi bổ sung enzyme endolysin LysSa 51 3.7 Hoạt tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh có trong sữa tươi thanh trùng của endolysin

LysSa 52 3.8 Chất lượng sữa tươi thanh trùng sau khi bổ sung enzyme endolysin LysSa 53

M5AGER

Hiện nay ngộ độc thực phẩm đã và đang là mối lo ngại nghiêm trọng chosức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới Nguyên nhân là do con người sử dụngcác loại thực phẩm đã bị nhiễm các loài vi khuẩn gây bệnh hay độc tố củachúng Mặc dù đã có công nghệ hiện đại, các phương pháp thực hành sản xuấttốt (GMP), kiểm soát chất lượng và vệ sinh cũng như an toàn sản xuất và đánhgiá rủi ro (HACCP), nhưng số lượng các trường hợp bị ngộ độc và bị bệnh dothực phẩm vẫn tăng lên trong suốt thập kỷ qua Ở châu Âu, mỗi năm ước tính

có hơn 380.000 người dân bị bệnh do sử dụng các sản phẩm thực phẩm nhiễm

vi khuẩn, các loại vi khuẩn gây bệnh như: Staphylococcus aureus, Salmonella, Listeria.

Staphylococcus aureus là tác nhân phổ biến gây nhiễm trùng bệnh viện

cũng như trong cộng đồng dân cư với tỷ lệ mắc và tử vong cao trên toàn thế

giới S aureus khi nhiễm độc thức ăn, đồ uống do tiếp xúc giữa người mang

mầm bệnh sẽ có thể dẫn đến và viêm ruột cấp do các thức ăn có chứa độc tố

ruột của S aureus, gây mất nước và điện giải có thể dẫn tới sốc S aureus là

một trong những nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện Những

chủng S aureus gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường có khả năng kháng lại nhiều kháng sinh S.aureus còn gây hội chứng sốc nhiễm độc do tiết ra độc tố

gây sốc Theo một số cơ quan quản lý thực phẩm châu Âu, các vi sinh vật gây

bệnh phổ biến có nguồn gốc từ thực phẩm bao gồm Salmonella, Escherichia coli O157:H7, S aureus và Listeria cùng với một số loài khác Sử dụng các

chất hóa học để bảo quản thực phẩm ít được chấp nhận vì nhiều chất bảo quảnhóa học đã làm ảnh hưởng lâu dài tới sức khỏe cộng đồng Trong số các chấtbảo quản sinh học được biết hiện nay, endolysin hiện đang thu hút sự quan tâmcủa các nhà khoa học do nó có khả năng diệt và ức chế các vi sinh vật gây bệnh.Endolysins (hay tên gọi khác là lysins) là các enzym thủy phân có nguồngốc từ thực khuẩn thể (bacteriophage) có tác dụng phá hủy peptidoglycan của

thành tế bào vi khuẩn trong giai đoạn cuối chu trình sinh sản của thực khuẩnthể Các enzyme này làm giảm độ mạnh cơ học của thành tế bào dẫn đến dunggiải tế bào và giải phóng ra các thực khuẩn thể thế hệ tiếp theo Do đó khi cómặt endolysins chúng có thể phân hủy lớp peptidoglycan của thành tế bào củamọi vi sinh vật khi chúng tiếp xúc, dẫn đến vi sinh vật bị chết Do vậy chúngđược coi như là một chất thay thế kháng sinh thực phẩm có tính tác động chọnlọc, không thay đổi đặc điểm cảm quan, kết cấu của thực phẩm và rất an toàncho con người

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu thu nhận enzym Endolysin tái tổ hợp LysSa và đánh giá hoạt

tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus trong bảo quản sữa.”

1 MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu tối ưu các điều kiện nhân nuôi chủng tái tổ hợp E.coli BL21,

thu nhận enzyme endolysin LysSa và đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây

bệnh Staphylococcus aureus của endolysin LysSa tái tổ hợp trong bảo quản

sữa

2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng, xác định các điều kiện tối ưu cho chủng E.coli

BL21 sinh trưởng và biểu hiện enzym endolysin LysSa:

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

- Ảnh hưởng của nhiệt độ

- Ảnh hưởng của pH

- Ảnh hưởng của chất cảm ứng IPTG

2.2 Nghiên cứu thu hồi và enzyme endolysin LysSa

- Nghiên cứu phương pháp thu hồi enzyme endolysin LysSa

- Nghiên cứu tinh sạch enzyme endolsin LysSa

2.3 Đánh giá được hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus trong

bảo quản sữa

Chương 1

Thương 1N TÀI LIsữ

1.1.Tình hình ngu LIsữaus tính khánStaphylococcus aureus

1.1.1 Tình hình ngus aureusc ph hình ngus aureuscus aureus trên theusius

Theo WHO/FAO (tháng 5/2005), ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng rất lớnđến sức khỏe con người và kinh tế, làm 1,5 tỉ lượt người bệnh, ở các nước côngnghiệp 30% dân số bị ngộ độc thực phẩm hàng năm Trên thế giới, vụ ngộ độclớn đầu tiên có liên quan đến tụ cầu xảy ra vào năm 1884 ở Michigan (Mỹ) dophomai Tiếp đến là ở Pháp vào năm 1894 do thịt từ bò bị bệnh Khô bò bịnhiễm tụ cầu cũng từng gây ngộ độc ở Kalamazoo, Michigan vào năm 1907.Năm 1914, ở Philippines, Barbert xác định rằng sữa lấy từ bò bị viêm vú đã gây

ra ngộ độc ở người Năm 1930, Dark lại xác định được vụ ngộ độc do S aureus từ bánh giáng sinh (Reginald Bennett, 2001) Ở Pháp, số vụ ngộ độc

báo cáo từ năm

1999-2000 cho thấy: 32% số vụ là do sản phẩm sữa và đặc biệt là phô mai, 22%

do thịt, 15% do xúc xích, bánh pate; 11% do các và hải sản; 11% do trứng và

sản phẩm trứng; 9,5% do gia cầm (Haeghebaert và cs., 2002) Ngộ độc do S aureus đứng hàng thứ hai sau Salmonella (bảng 1.1) Những thực phẩm bị

nhiễm tụ cầu và gây ngộ độc thường gặp là thịt, cá, gà và sản phẩm của chúng,rau cải, trứng, nấm, sữa và sản phẩm từ sữa, kem, phomai, thực phẩm lên

men…(Normanno G và cs, 2004) Ở Đài Loan, S aureus chiếm 30% trong số

các vụ dịch từ năm 1986 đến năm 1995 Vào tháng 6 năm 2000, vụ ngộ độcthực phẩm do tụ cầu tại một trường trung học ở Taichung County làm 10 trong

số 356 học sinh có biểu hiện ngộ độc 2-3 giờ sau khi ăn sáng (Wei H.L vàChiou C.S., 2001) Tại Brazil, vào tháng 2 và tháng 5 năm 1999 đã xảy ra hai

vụ dịch làm 378 người bị ngộ độc do dùng phomai và sữa tươi có nhiễm tụ cầu

(Simeão L.C và cs, 2001) Tại Pháp, năm 1997 người ta tìm thấy S aureus là

tác nhân gây ra 569 trong tổng số 1142 vụ ngộ độc thực phẩm ( Rosec J.P và

4Gigaud O., 2002) Ở Nhật, từ năm 1994 đến năm 1998, số trường hợp ngộ độc

do tụ cầu chiếm 3,1-11,9% tổng số các vụ

ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Ngày 17/6/1999, 21 trong số 53 công nhân saukhi ăn trưa tại căn tin công ty ở Shizuoka Prefecter thì có biểu hiện bệnh, trong

đó có 8 trường hợp phải nhập viện (Norinaga M và cs, 2000)

Bảng 1.1 Các tác nhân vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm ở Pháp

năm 1999-2000 (%)

Sốch

Các loại thực phẩm liên quan đến ngộ độc thực phẩm do S.aureus cũng

rất khác nhau ở mỗi quốc gia Chẳng hạn ở Mỹ, 50% số vụ ngộ độc được báocáo từ năm 1969-1990 là từ các sản phẩm thịt, các món ăn từ thịt và đặc biệt làthịt muối;

22% trường hợp là do gia cầm, các món ăn từ gia cầm, 8% từ sữa và sản phẩmsữa; 7% do cá và tôm cua, ghẹ; 3,5% do trứng Số vụ ngộ độc báo cáo từ năm1975-1982 cho thấy: 36% do thịt; 12,3% do salad; 11,3% do gia cầm; 5,1% dobánh nướng, bánh bao và chỉ có 1,4% do sữa và sản phẩm hải sản 17,1% thựcphẩm liên quan vụ ngộ độc không được biết (Genigeorgis, 1989) Sự khác biệtnày là do thói quen ăn uống cũng rất khác nhau theo từng nước Tụ cầu gây rakhoảng

14% trong các vụ ngộ độc thực phẩm; và hàng năm, Mỹ mất khoảng 1,5 tỉ đô lacho những vụ ngộ độc do tụ cầu Trong các loại độc tố gây ra các vụ ngộ độc thì

6SEA là loại độc tố chiếm tỷ lệ cao nhất (77,8%), SED (37,5%) và SEB (10%)(Normanno G.và ctv, 2004).

Hầu hết các vụ ngộ độc do tụ cầu là do quá trình chế biến hoặc bảo quảnthực phẩm không tốt Tụ cầu thường nhiễm trực tiếp vào thực phẩm do tayngười chế biến bị trầy xước hay do ho, hắt hơi Việc bảo quản thực phẩm ởnhiệt độ không phù hợp cũng rất quan trọng, một khi thực phẩm đã nhiễm tụcầu, chúng sẽ tăng nhanh số lượng do tụ cầu phát triển được trong khoảng nhiệt

độ rất lớn, từ 7-48oC Điều đáng lo ngại độc tố được tạo ra trong suốt quá trìnhphát triển của tụ cầu nhưng lại không gây ảnh hưởng đến cảm quan của thựcphẩm, do đó ít được chú ý (Mary K S và cs, 2002)

1.1.2 Tình hình ng vn bị trầy xước hay do ho, hắt hơi Việc bảo quản

Theo đánh giá của tổ chức Y tế thế giới, hàng năm Việt nam có khoảngtrên 3 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn hại trên 200 triệu USD Trong nhữngnăm gần đây số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta ngày càng gia tăng Năm 2000

có 213 vụ ngộ độc thực phẩm với 4233 người mắc 59 người tử vong (Bùi ThếHiền, Tô Thị Thu và cs,

2003) Theo số liệu từ cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, trongnhững vụ dịch được tổng kết từ năm 1997 đến 2002 thì ngộ độc thực phẩm dotác nhân vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao từ 40-45% trong các loại gây ngộ độc, trong

số đó có nhiều vụ được xác định tác nhân là Staphylococcus aureus (Nguyễn Đỗ

Phúc và cs, 2003) Từ năm 2002 đến 2004 theo số liệu của trung tâm y tế dựphòng đã có 77 vụ ngộ độc thực phẩm mà phần lớn nguyên nhân là do thức ăn

bị nhiễm khuẩn, chiếm

66% (Nguyễn Lý Hương và cs, 2005) Từ dữ liệu của Hội nghị tổng kết dự ánbảo đảm chất lượng vệ sinh an tòan thực phẩm của Cục vệ sinh an toàn thựcphẩm năm 2006, số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta là 164 vụ (tăng 14,6% sovới năm

2005), làm 7.135 người bị ngộ độc (tăng 65,8% so với năm 2005), trong đó có

64 vụ (38,8%) là do vi sinh vật gây ra (Hội nghị tổng kết dự án đảm bảo an tòan

vệ sinh thực phẩm, tháng 3/2007, Cục vệ sinh an tòan thực phẩm, Bộ Y tế) Quacác cuộc khảo sát tình hình vệ sinh thức ăn đường phố và các thực phẩm chế

biến sẵn tại các chợ cho thấy mức độ nhiễm Staphylococcus aureus là rất cao,

phù hợp với các kết quả xét nghiệm trong các vụ ngộ độc tại thành phố HồChí Minh trong

những năm qua Đáng chú ý hơn cả là ở các mẫu bánh mì thịt nguội là 16/30mẫu (53%), các mẫu thịt quay là 18/20 mẫu (90%) (Nguyễn Đỗ Phúc và cs,2003; Nguyễn Lý Hương và cs, 2005

Một số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta liên quan đến S.aureus và độc tố

ruột của chúng đó là vụ ngộ độc thực phẩm của cán bộ, sinh viên khoa Địa chất

và Sinh học trường Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM vào ngày 27/7/2006trong chuyến đi thực tế và đã ăn trưa tại Nha Trang (Khánh Hòa) Chiều cùngngày, nhiều cán bộ sinh viên đau đầu, tiêu chảy, ói mửa, tất cả 105 người phảivào bệnh viện để cấp cứu Nguyên nhân được xác định là do thức ăn chế biếnkhông hợp vệ sinh, để lâu nên đã nhiễm tụ cầu vàng và đã sinh độc tốenterotoxin

Sau đó những vụ ngộ độ thức ăn do tụ cầu được phát hiện và nói đếnnhiều hơn (Đỗ Thị Hòa, 2006) Ở Thành phố Hồ Chí Minh vụ ngộ độc xảy ratại Trường Tiểu học Thanh Đa - Khu phố II Cư xá Thanh Đa, P.27, Q BìnhThạnh ngày

03/5/2006, có khoảng 20 cháu bị ngộ độc Sau khi ăn khoảng 30 phút các cháu

có triệu chứng đau bụng, nôn ói, nhức đầu Qua xét nghiệm cho thấy trong mẫuchất nôn đã có độc tố tụ cầu khuẩn nhóm A

Vụ ngộ độc ở nhà trẻ Hồng Nhung, thị trấn Đông Dương - H Phú Quốc,Kiên Giang ngày 2/9/2006 Thức ăn gồm có yaourt, cơm, thịt xào Các triệuchứng cũng tương tự như nôn ói, đau bụng Kết quả kiểm tra cho thấy phần lớn

các mẫu thực phẩm đầu nhiễm S.aureus từ 101 vi khuẩn/gam đến 107 vi khuẩn

/gam Trong đó độc tố được phát hiện có trong mẫu yaourt, độc tố nhóm C(Nguyễn Thị Kê, 2006)

1.2 Vi khuhu1Staphylococcus aureus

1.2.1 Gi hylococcê Staphylococcus

Staphylococcus là lọai cầu khuẩn, bao gồm cả loài hiếu khí

(Micrococcus, Planococcus và Deinococcus), loài kị khí tuỳ nghi

(Staphylococcus, Stomacoccus, Streptococcus, Leuconostos, Pedio coccus,

Aerococcus và Gemella) và giống kị khí (Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus,

Phân loại của vi khuẩn Staphylococcus như sau:

Hiện nay có 32 loài Staphylococcus (bảng 1.2) Hàm lượng G+C trong

giống từ 30-39 mol% Một vài loài khác hiện nay đang được nghiên cứu

Có thể chia Staphylococcus thành 3 nhóm:

- Nhóm cho phản ứng coagulase dương tính

- Nhóm cho phản ứng coagulase âm tính và nhạy với Nobovicine

- Nhóm cho phản ứng coagulase âm tính và kháng với Nobovicine

Trong số các loài Staphylococcus thì Staphylococcus aureus là loài

thường gặp nhất, chúng thuộc nhóm cho phản ứng coagulase dương tính Tên

Staphylococcus có nguồn gốc từ tiếng Latinh, staphylo (chùm nho) và coccus

(hạt)

Staphylococci là những tế bào hình cầu Gram (+), đường kính 0,5-1,5µm,

có thể đứng riêng rẽ, từng đôi, bốn con, chuỗi ngắn (3-4 tế bào) hoặc chùmkhông theo một trật tự nào cả Sự hình thành chùm thường xảy ra trong quátrình vi khuẩn phát triển trên môi trường đặc, do kết quả của sự phân chia tế

bào quá nhiều Staphylococci không di động, không sinh nha bào, nang thì có

mặt trong những tế bào còn non, nhưng biến mất khi tế bào ở giai đoạn pha ổnđịnh Màu sắc khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc như tryptic soy agar

(TSA) có thể màu kem đến màu hồng sáng Các loài Staphylococcal là hiếu khí

hoặc kị khí tuỳ nghi và có cả quá trình hô hấp và lên men Staphylococci thunhận năng lượng thông qua sự chuyển hoá glycosis, hexose monophosphate

và chu trình

1880, Alexxander Ogston (bác sĩ phẫu thuật người Scốt-len) và Louis Pasteur

đã chứng minh áp xe viêm mủ là do cầu khuẩn gây ra Ogston đã theo dõi hai

loại cầu khuẩn: một loại tạo thành chuỗi gọi là Streptococcus và một loại đứng thành chùm gọi là Staphylococcus Ogston tin tưởng vào sự khám phá của mình

và đặt tên cho cầu khuẩn đứng chùm là Staphylococcus Ogston được công nhận là người khám phá và đặt tên cho tụ cầu – Staphylococcus vào năm

1882 Năm

1884, Rosenbach là người phân lớp Staphylococci dựa trên cơ sở tên của nhà

khoa học Ogston và đặt tên cho cầu khuẩn tạo khuẩn lạc màu vàng là

Staphylococcus pyrogen aureus (Scott E.M và cs, 2000).

Phần lớn các loài Staphylococcus cư trú phổ biến ở da và màng nhầy Một vài loài tìm thấy một số vị trí cố định như loài S apcapitis chỉ tìm thấy vùng đầu và vùng trán Các loài Staphylococcus tìm thấy ở người bao gồm: S.aureus, S.epidermidis, S.hominis, S.haemoliticus, S.warneri, S.captis, S.saccharolyticus, S.auricularis, S.simulans, S.saprophyticus, S.cohnii và S xylosus Staphylococci cư trú trên da người chiếm tỷ lệ 65-90% các chủng phân

lập được

S.aureus là loài phổ biến nhất trong giống Staphylococcus Trong điều

kiện kị khí sự phát triển của vi khuẩn cần có amino acid và vitamin, nhưng

trong điều kiện hiếu khí cần có thêm uracil và các nguồn carbon S.aureus phát

triển tốt nhất ở điều kiện hiếu khí, nhiệt độ tối thích cho sự phát triển là 35oC,nhưng có thể phát triển được trong khoảng nhiệt độ từ 10 đến 45oC, khoảng pH

có thể phát triển từ 4,5 đến 9,3, nhưng pH tối thích khoảng 7,0 đến 7,5

 Phân lập và phát hiện Staphylococcus:

Kiểm tra trực tiếp trên kính hiển vi với những dịch lỏng vô trùng (máu,dịch não tuỷ) Kết quả được xác nhận là cầu khuẩn Gram (+) có nghĩa tương

đồng là Staphylococci.

Nhiều môi trường đặc dùng để phát hiện Staphylococci, đặc biệt là S.aureus.

Môi trường chọn lọc S.aureus sử dụng một số hoá chất độc hại để tăng

khả năng chọn lọc Thành phần môi trường gồm có NaCl, tellurite, lithiumchloride và nhiều kháng sinh khác nhau Một số môi trường dùng để phân lập

và xác định mức nhiễm S.aureus >100 vi khuẩn/g thực phẩm là môi trường

staphylococcal

110, thạch VogelJohnson, thạch Egg yolk-sodium azide, thạch polymixin-egg yolk và BairdParker

tellurite-Phần lớn những môi trường chọn lọc thích hợp cho S.aureus bình thường

không bị tác động Tuy nhiên do sự tác động của quá trình chế biến, bảo quản,

điều kiện bất lợi, bị tác động đến ngưỡng gần chết thì việc tăng sinh S.aureus cần có những tác nhân chọn lọc S aureus có thể không phát triển trên những

môi trường tăng sinh chọn lọc truyền thống Môi trường Baird-Parker là môitrường thích hợp nhất cho việc tăng sinh những tế bào bị tổn thương

Các loài Staphylococcal có thể xác định qua một vài đặc điểm như hình

thái khuẩn lạc, sự tạo thành coagulase, tan huyết, đề kháng novobiocin, sự tạothành acetoin, sử dụng nguồn carbonhydrat điều kiện hiếu khí Trên môi trườngkhông chọn lọc như TSA (tryptic soy agar), thạch dinh dưỡng, phần lớn các loàistaphylococcal phát triển mạnh sau 18-24 giờ/35oC với đường kính khuẩn lạc 1-

3 mm Dựa vào hình thái và màu sắc khuẩn lạc có thể trợ giúp xác định các loài

Staphylococcal (Scott E.M và cs, 2000).

16

Hình 1.1 Hình thái Staphylococcus aureus

Hình 1.2 Tụ cầu Staphylococcus

aureus gram dương dưới kính hiển vi

S.aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có enzyme

catalase phân giải oxy già giải phóng oxy và nước:

Cata

H2O2 H2O + O2

S aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme coagulase Đây được xem là tính chất đặc trưng của S.aureus, là tiêu chuẩn để phân biệt S.aureus với các tụ cầu khác Có hai dạng coagulase:

coagulase ―cố định‖ (―bound‖ coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase

―tự do‖ (―free‖ coagulase) được phóng thích khỏi thành tế bào Có haiphương pháp để thực hiện thử nghiệm coagulase là thực hiện trên lam kính vàtrong ống nghiệm Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagulase ―cốđịnh‖ bằng cách phản ứng trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống nghiệmphát hiện những coagulase ―tự do‖ bằng phản ứng gián tiếp với fibrinogen quacộng hợp với những yếu tố khác trong huyết tương tạo thành từng khối haythành cục (Collin C.H và cs, 1995) [9]

Huyết tương Khối Fibrin

Cơ chế thông thường biểu diễn quá trình đông tụ huyết tương như sau:

Prothrombin

Ca2+ Thrombokinase enzymThrombin

Coa

Fibrinogen Fibrin

Ngoài ra, chúng còn cho phản ứng DNAse, phosphatase dương tính, có

khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose Tất cả các dòng S aureus đều nhạy với Novobicine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường

chứa đến 15% muối NaCl (Trần Linh Thước, 2002)

Một số dòng S aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch

máu, vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vòng tan

máu hẹp hơn so với đường kính khuẩn lạc Hầu hết các dòng S.aureus đều tạo

sắc tố vàng, nhưng các sắc tố này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non màthường thấy rõ sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng Sắc tố được tạo ranhiều hơn trong môi trường có hiện diện lactose hay các nguồn hidrocacbonkhác mà vi sinh vật này có thể bẻ gãy và sử dụng (Collin C.H và cs, 1995)

Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S aureus có

màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sángrộng 2-5 mm (do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng thủyphân lòng đỏ trứng của lethinase) (Rosamund M B và cs, 1995; Mary K S và

cs, 2002) Trên môi trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trườngChapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làmvàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol) (Mary K

S và cs, 2002)

Môi trường Baird parker Môi trường Chapman

Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc S.aureus trên 2 môi trường nuôi cấy

Đa số các dòng S aureus có thể tổng hợp một hay nhiều enterotoxin

trong môi trường có nhiệt độ trên 15oC, nhiều nhất khi chúng tăng trưởng ở nhiệt độ

35-37oC (Trần Linh Thước, 2002)

Bảng 1.3 Những đặc tính của S aureus, S epidermidis và Micrococci

(Reginald W B và cs, 2001) Đ

rất rộng, từ 7- 48oC, với nhiệt độ cực thuận là 30-45oC; khoảng pH 4,2-9,3, với

độ pH cực thuận là 7-7,5; và trong môi trường chứa trên 15% NaCl Tụ cầu bềnvững khi có nồng độ đường cao, nhưng bị ức chế bởi nồng độ 60%; nồng độ từ

33-55%, tụ cầu vẫn phát triển, trong khi các vi khuẩn khác như Shigella và Salmonella bị ức chế Ngoài ra, chúng còn có khả năng bám dính tốt trên nhiều

loại tế bào và máy móc thiết bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy

khô và lọc thấm Chính nhờ những đặc điểm trên giúp S aureus có sự phân bố

rộng, chủ yếu được phân lập từ da, màng nhày, tóc và mũi của người và động

vật máu nóng S aureus được cho là vi khuẩn khá mạnh có thể sống tốt bên

ngoài kí chủ Vi khuẩn này còn có mặt trong không khí, bụi và trong nước dùchúng thiếu tính di động và rất nhạy với thuốc kháng sinh và chất diệt khuẩn

Tuy nhiên, S aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt ở

60oC từ 2-50 phút tùy từng loại thực phẩm và là vi sinh vật cạnh tranh yếu, dễ bị các

người Sự hiện diện với mật độ cao của S aureus trong thực phẩm cho thấy điều

kiện vệ sinh của quá trình chế biến kém, kiểm soát nhiệt độ trong các công đoạnchế biến không tốt Tuy nhiên, điều đó không đủ bằng chứng để cho rằng thực

phẩm đó sẽ gây độc, điều đó chỉ xảy ra khi S aureus được phân lập tạo độc tố Ngược lại, chỉ với một lượng nhỏ S aureus tạo độc tố cũng có thể gây ngộ độc.

1.2.4 Tính kháng thug có thể gây

Hầu hết các dòng S aureus kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau.

Một vài dòng kháng với tất cả các loại kháng sinh ngoại trừ vancomycin, vànhững dòng này ngày càng tăng Những dòng MRSA (Methicilin resistant

Staphylococcusaureus) rất phổ biến và hầu hết các dòng này cũng kháng với

nhiều kháng sinh khác.Trong phòng thí nghiệm, người ta đã tìm thấy plasmid

kháng vancomycin ở Enterococcus faecalis có thể chuyển sang S aureus, và

người ta nghĩ rằng việc chuyển này có thể xảy ra ngoài tự nhiên, trong đường

tiêu hóa chẳng hạn Ngoài ra, S aureus còn kháng với chất khử trùng và chất

tẩy uế (Kenneth Todar, 2005).Từ khi sử dụng penicillin vào những năm 1940,tính kháng thuốc đã hình thành ở tụ cầu trong thời gian rất ngắn Nhiều dònghiện nay đã kháng với hầu hết kháng sinh thông thường, và sắp tới sẽ kháng cảnhững kháng sinh mới Việc thay thế kháng sinh cũ bằng vancomycin đã dẫnđến sự gia tăng các dòng kháng vancomycin VRSA (Vancomycin Resistant

Staphylococcusaureus) (Kenneth Todar, 2005).

Khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại Thành phố Hồ Chí Minh năm

2005 cho thấy các chủng S aureus phân lập từ bệnh phẩm cho thấy có đến

1.3.1.1 Hệ thống biểu hiện gen ở sinh vật nhân sơ (vi khuẩn)

Hiện nay tế bào E.coli là hệ thống tế bào chủ được sử dụng rộng rãi nhất

vì rất dễ nuôi cấy, dễ giữ, nhân giống, cảm ứng dễ dàng bằng cách sử dụngIPTG Ngoài ra do đặc tính sinh trưởng nhanh nên rất nhanh chóng thu đượcprotein mong muốn, việc tinh chiết rất đơn giản nhờ sử dụng hệ thống sắc ký áilực

E.coli là vi khuẩn Gram âm, hình que, dài khoảng 1µm, không gây bệnh thường gặp trong đường ruột của người E.coli có nhiễm sắc thể dạng vòng nằm

trong vùng nhân Kích thước của phân tử khoảng 4.106 bp Các quá trình biểuhiện gen như phiên mã, dịch mã được xảy ra đồng thời Sau khi được phiên mãthì mARN sẽ được sử dụng để dịch mã mà không qua quá trình sửa đổi sauphiên mã do vậy hệ thống này rất thích hợp cho việc biểu hiện các gen khi cácgen này không có quá trình biến đổi sau dịch mã Đặc biệt nhiều năm qua, các

đặc điểm về di truyền và sinh lý của E coli đã được nghiên cứu rất cặn kẽ Trên thị trường đã thương mại nhiều chủng E coli cùng nhiều loại vector cải tiến trở

thành vật chủ hữu hiệu trong kĩ thuật tách dòng và biểu hiện gen

Tuy nhiên ở hệ biểu hiện E coli cũng bộc lộ một số nhược điểm như E coli không có khả năng sản xuất hiệu quả các loại protein có kích thước quá lớn

hoặc quá nhỏ Các gen của sinh vật nhân chuẩn không thể biều hiện được hoặc

có biểu hiện được nhưng không được cải biến chính xác Đồng thời các proteinthường biểu hiện ở dạng thể vùi do việc tổng hợp protein một cách ồ ạt haythiếu các phân tử đặc hiệu giúp cuộn xoắn cấu trúc, điều này tuy có thuận lợicho quá trình tinh sạch protein nhưng sau đó protein rất khó phục hồi hoạt tính

sinh học (Yin et al., 2007) Ngoài ra, trong nghiên cứu sản xuất các protein trị liệu bằng E coli luôn tiềm ẩn nhiều nguy cơ gây ra phản ứng phụ trên người và

động vật bởi một số chất (nội độc tố) sinh ra trong quá trình biểu hiện

Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã cho thấy, hiệu suất tổng hợp một số

protein ngoại lai trong E coli rất cao nếu sử dụng plasmid phù hợp Chính vì vậy, E coli vẫn đang là hệ biểu hiện được sử dụng rồn rãi nhất trong việc tạo

protein tái tổ hợp

1.3.1.2 Hệ thống tế bào chủ nhân chuẩn

Các tế bào chủ nhân chuẩn có phổ tồn tại rất rộng từ các vi sinh vật nhânchuẩn bậc thấp như nấm men, nấm mốc, tảo cho đến các sinh vật đa bảo phứctạp như động vật, thực vật Hệ thống nay có mức độ biểu hiện cao, các protein

dễ tinh chiết bằng cách sử dụng các đuôi đặc biệt được gắn vào trong các vectornhư His, Myc Đồng thời rất thuận tiện trong việc thu protein mà không phảiphá vỡ tế bào Ngoài ra các protein biểu hiện ở dạng tan, lại không bị ảnhhưởng bởi các biến đổi hậu dịch mã nên rất thuận lợi cho các nghiên cứu tươngtác protein

Nấm men (S.cerevisiae) được sử dụng rộng rãi trông công nghệ di truyền.

Chúng có thể nuôi cấy quy mô lớn để thu sinh khối tế bào Một số nấm men có

promotor mạnh và plasmid YAC biều hiện gen S.cervisiae có khả năng biến

đổi sau dịch mã như đường hóa, phosphoril hóa… để protein có đầy đủ hoạt

tính sinh học Đặc biệt, S.cerevisiae bình thường tổng hợp ít loại protein của

bản thân nó, nếu đưa gen lạ tổng hợp protein mới thì sản phẩm dễ làm tinh

sạch.Các vi nấm khác cũng được sử dụng như A nidulans, N crassa hoặc P pastoris.

Các tế bào chủ thực vật được sử dụng chủ yếu là các loài tảo đơn bào như

loài Chramydomonas Rainhardii Loài này có đầy đủ các đặc tính ưu việt của vi

sinh vật cộng với cấu trúc và chức năng của tế bòa thực vật do vậy chúng ngàycàng được sử dụng rộng rãi trong thao tác di truyền Tuy nhiên người ta cũngcòn dùng các tế bào thực vật nuôi cấy trong những môi trường thích hợp để làm

tế bào chủ

Đối với các tế bào động vật mặc dù việc nuôi khá phức tạp nhưng trongnhững điều kiện cần thiết cho sự biểu hiện ra các protein có hoạt tính sinh họcngười ta vẫn sử dụng Ví dụ như: tế bào thận của khỉ xanh châu Phi, của chuộtđồng nhỏ, phôi người, tế bào tử cung chuột bạch, tế bào côn trùng để nuôi

Baculovirus biều hiện protein người, tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans.

1.3.2.Các vector bis elega

Vector biểu hiện là vector có thể mang gen ngoại lai mong muốn, chophép thực hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và sự dịch mã củacác mRNA của chúng trong hệ biểu hiện, từ đó tổng hợp protein mong muốn từgen ngoại lai Vector có thể là các DNA plasmid, cosmid hay phage…đây làcác DNA có khả năng nhận đôi, phiên mã, dịch mã độc lập với DNA của vậtchủ Vector phải chứa gen mã hóa cho protein chức năng dùng làm dấu hiệuchọn lọc (thường là gen kháng kháng sinh)

Một trong những vector đang được sử dụng khá phổ biến và hiệu quả

trong việc biểu hiện protein trong E coli hiện nay là pET nhờ khả năng sản xuất

hàng loạt protein, thao tác sinh học phân tử dễ dàng, chứa promoter T7 có đặctính dựa trên promoter mạnh và có tính đặc hiệu cao Vector pET28a là thànhviên đại diện trong họ pET do Novagen cung cấp Nó chứa các vùng cần thiếtcho biểu hiện gen trong vi khuẩn (hình 1.4): 1 gen kháng Kanamycin chọnlọc, 1 vùng MCS chứa nhiều vị trí cắt phục vụ quá trình cắt nối gen, 1 vùngpromoter T7 polymerase, 2 vùng chứa nhãn Histidin (Hig-tag) giúp cho quátrình tinh chiết protein tái tổ hợp Đặc biệt là trên vector này chứa 1 chuỗi lacoperator sát đầu

3’ của T7 promoter, giúp ngăn cản sự biểu hiện của gen đích khi chưa cảmứng IPTG và rất có ý nghĩa khi protein biểu hiện là độc với tế bào

Hình 1.4 Vector pET21b và các vùng chức năng quan trọng

1.3.3 Cơ chế cảm ứng biểu hiện bằng IPTG trong E.coli

Bộ gen của vi khuẩn E coli được biến đổi để có thể chứa gen mã hóa T7

polymerase (T7 gen 1) và gen lacI (tạo lac repressor) T7 gen 1 bị kiểm soát bởilac promoter Khi không có sự hiện diện của IPTG trong môi trường, lacrepressor sẽ liên kết với lac operator làm cho lac promoter bị bất hoạt và gen

mã hóa T7 polymerase không được biểu hiện

Vector pET được thiết kế có T7 promoter và vùng MCS nằm sau T7promoter Gen mục tiêu được thiết kế chèn vào vector ở vùng MCS để đượckiểm soát biểu hiện bởi T7 promoter Ngoài ra, trên vector pET cũng có vị trílac operator và gen lacI mã hóa cho lac repressor để kiểm soát sự biểu hiện củaT7 promoter Khi có IPTG, IPTG sẽ gắn vào lac repressor ở vị trí làm protein

này thay đổi cấu hình và không thể gắn vào lac operator Nhờ đó promoterđược hoạt

hóa, gen mã hóa cho T7 polymerase được biểu hiện và tạo T7 polymerase.IPTG cũng giải phóng T7 promoter trên vector pET ra khỏi sự kiểm soát củalac repressor Enzyme T7 tạo thành sẽ gắn vào T7 promoter đã được hoạt hóagiúp biểu hiện gen mục tiêu đã được tạo dòng vào vector.

Hình 1.5 Sơ đồ cơ chế điều hòa của T7 promoter

1.4 T.Sơ đồ cơ chế điều hòa của

1.4.1 Giồ cơ chế điều hòa của T7 pr

1.4.1.1 Khái niệm

Endolysins (hay tên gọi khác là lysins) là các enzym thủy phân có nguồngốc từ thực khuẩn thể (bacteriophage) có tác dụng phá hủy peptidoglycan củathành tế bào vi khuẩn trong giai đoạn cuối chu trình sinh sản của thực khuẩnthể Các enzyme này làm giảm độ mạnh cơ học của thành tế bào dẫn đến dunggiải tế bào và giải phóng ra các thực khuẩn thể thế hệ tiếp theo Do đó khi cómặt endolysins chúng có thể phân hủy lớp peptidoglycan của thành tế bào củamọi vi sinh vật khi chúng tiếp xúc, dẫn đến vi sinh vật bị chết, do vậy chúngđược coi như là một chất kháng sinh thực phẩm có tính tác động chọn lọc,không thay đổi đặc điểm cảm quan, kết cấu của thực phẩm và rất an toàn chocon người

1.4.1.2 Cấu tạo

Nhìn chung lysin có cấu trúc gồm hai domain bao gồm domain xúc tác ởđầu N và domain gắn với vách tế bào ở đầu C Domain ở đầu N được phânthành

4 nhóm khác nhau phụ thuộc vào vị trí phân tách bao gồm: (a) acetylmuramidases (lysozymes) và (b) N-acetyl-β-D-glucosaminidases(glycosidases) có tác dụng thủy phân liên kết β-1-4 glycosidic ở một nửa phân

N-tử đường của vách tế bào (c) N-acetylmuramoyl-L-alanine amidases có tácdụng tách liên kết amide nối nửa phân tử đường và peptide của vách tế bào vikhuẩn (d) L-alanoyl-D-glutamate endopeptidases và interpeptidebridge-specificendopeptidases có tác dụng là cầu nối đặc hiệu giữa các peptide củapeptidoglycan trong vách tế bào (Hình 1.6) (Fenton và cs, 2010) Domain liênkết ở đầu C của hầu hết các lysin có trách nhiệm gắn enzym với một cơ chất đặchiệu trong vách tế bào vi khuẩn thông qua liên kết không cộng hóa trị của cácgốc carbohydrate

Hình 1.6 Cấu trúc điển hình của vách peptidoglycan

của vi khuẩn Gram dương.

Các vị trí phân cắt của các loại endolysin được đánh dấu từ 1 đến 4, trong

đó (1) acetyl muramidases; (2) acetyl-β-D-glucosaminidases; (3) acetylmuramoyl-L-alanine amidases; (4) L-alanoyl-D-glutamate endopeptidases

N-và interpeptide bridge-specific endopeptidases

1.4.1.3 Tính chất của endolysin

Một số loại endolysin có hoạt tính ổn định trong thời gian dài như Cp1-1hoạt tính bền ở 4oC trong 6 tháng và ở 37oC trong 3 tuần (Loeffler và cs, 2003)[20] Endolysin KZ144 và EL188 vẫn duy trì hoạt tính khi bảo quản ở 4oC trong

Trong nông nghiệp, endolysin có thể sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học

để phòng trừ một số bệnh hại cà chua do Streptomyces scabies, Clavibacter michiganensis và Xanthomonas campestris Trong chế biến sữa, endolysin sử

dụng như chất bảo quản thực phẩm dùng để tiêu diệt các loài vi khuẩn bền nhiệt

(như Bacillus spp và Paenibacillus spp.) và vi khuẩn chịu lạnh như Pseudomonas spp., giúp sữa thanh trùng không thối hỏng và kéo dài thời hạn

của sản phẩm

Đối với vật nuôi, endolysin có thể dùng để kiểm soát các bệnh đườngruột ở gia súc, gia cầm mà không làm thay đổi hệ vi sinh đường ruột (như lysin

Ply2626 kiểm soát vi khuẩn gây bệnh C perfringens ở gia cầm) (Zimmer và cs,

2002) [34] Ngoài ra, endolysin có thể kiểm soát vi khuẩn gây bệnh viêm vú ởtuyến vú của gia súc lấy sữa, phòng trừ nhiễm chéo thực phẩm trong quá trìnhlấy sữa và giết mổ gia súc (ví dụ như endolysin Ply700 và LysH5 kiểm soát vi

khuẩn gây bệnh Streptococcus uberis và S aureus) (Celia và cs, 2008; Obeso

và

cs, 2008) Trong công nghiệp lên men, endolysin như Ply511 có thể được sử

dụng để kiểm soát vi khuẩn Listeria monocytogenes làm hỏng sữa (Gaeng và cs, 2000) hoặc sử dụng lysine CTP1 để kiểm soát vi khuẩn clostridium trong quá

trình chế biến phomat (Mayer và cs, 2010)

1.4.3 T T quá trình ch chiến phomat (Mayer v

Trong tự nhiên, endolysin dung giải hiệu quả và nhanh chóng tế bào vikhuẩn chủ nhằm đảm bảo sự tồn tại của thực khuẩn thể Tuy nhiên, trong thực

tế vẫn có thể cải thiện được tác dụng của endolysin để sử dụng trong thực phẩmhoặc trong điều trị bệnh ở người bằng công nghệ protein Công nghệ này baogồm việc trao đổi các domain hoặc đột biến ngẫu nhiên làm thay đổi đặc điểmliên kết và dung giải peptidoglycan

Tái tổ hợp domain

Cấu trúc của endolysin thực khuẩn thể cùng với hiểu biết về cấu trúc tinhthể và tin sinh giúp chúng ta có thể thiết kế được các tổ hợp protein chức nănggồm nhiều module có nguồn gốc duy nhất (Schmelcher và cs, 2010) Mỗidomain trong các cấu trúc dung hợp như vậy có chức năng riêng cho thấy kỹthuật phân tử có thể tạo ra các công cụ mới có đặc điểm mong muốn để pháthiện và kiểm soát mầm bệnh Ngoài ra, cũng có các thể tái tổ hợp tự nhiên như

endolysin PlyPSA từ thực khuẩn thể của vi khuẩn Listeria hoặc endolysin Pal từ

thực khuẩn thể của phế cầu khuẩn cho thấy rằng truyền gen ngang do quá trìnhtrao đổi tái tổ hợp của các module endolysin xảy một cách tự nhiên trong quầnthể thực khuẩn thể hoặc giữa thực khuẩn thể và vi khuẩn chủ (Hendrix, 2002).Endolysin PlyPSA có đặc điểm của domain gắn với vách tế bào (CBD) và

tương đồng với lysine của thực khuẩn thể vi khuẩn Listeria, trong khi đó

domain có hoạt tính enzyme (EAD) liên quan đến domain amidase từ thực

khuẩn thể của Bacillus và Clostridium Các phát hiện này củng cố cho ý tưởng

tạo ra các chất kháng khuẩn và công cụ chẩn đoán nhân tạo Diaz và cs (1990)

đã đặt nền móng cho kỹ thuật phân tử endolysin bằng cách chứng minh rằngtrao đổi các domain chức năng