KẾT QUẢ bảo QUẢN LẠNH mẫu TINH DỊCH BÌNH THƯỜNG và THIỂU TINH NẶNG KHI sử DỤNG máy NICOOL LM1O và PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG TINH VIÊN

So sánh kết quả bảo quản lạnh mẫu tinh trùng thiểu tinh nặng khi hạ nhiệt bằng máy Nicool LM10 và phương pháp đông tinh viên...63 4.3.1... Chất lượng tinhtrùng trong bảo quản lạnh phụ th

NGUYỄN THỊ HẰNG

KẾT QUẢ BẢO QUẢN LẠNH MẪU TINH DỊCH BÌNH THƯỜNG VÀ THIỂU TINH NẶNG KHI SỬ DỤNG MÁY NICOOL LM1O VÀ PHƯƠNG PHÁP

ĐÔNG TINH VIÊN

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

HÀ NỘI - 2018

NGUYỄN THỊ HẰNG

KẾT QUẢ BẢO QUẢN LẠNH MẪU TINH DỊCH BÌNH THƯỜNG VÀ THIỂU TINH NẶNG KHI SỬ DỤNG MÁY NICOOL LM1O VÀ PHƯƠNG PHÁP

ĐÔNG TINH VIÊN

Chuyên ngành : Mô phôi thai học

của bản thân, em còn được sự hướng dẫn giúp đỡ tận tình của các thầy cô, anh chị, bạn bè và Nhà trường cùng những người thân trong gia đình

Trước hết em xin bày tỏ lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trường Đại học Y

Hà Nội, Phòng quản lý đào tạo sau đại học, Bộ môn Mô học – Phôi thai học

và Bộ môn Y sinh học – Di truyền đã tạo điều kiện cho em được học tập,

nghiên cứu, hoàn thành luận văn này.

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS Nguyễn

Khang Sơn và PGS Nguyễn Mạnh Hà – những người thầy đã cho em

những phương pháp luận, chỉ bảo em nhiều kiến thức chuyên ngành và tạo mọi điều kiện thuận giúp đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS Nguyễn Thị

Bình – người thầy đã cho em những ý kiến quý báu và cũng là người đã trực

tiếp tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm nghiên cứu.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Hội đồng thông qua đề cương và Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã đóng góp cho em nhiều ý kiến quý báu, giúp đỡ em sữa chữa thiếu sót của luận văn.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị trong Bộ môn Mô học – Phôi thai học đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình nghiên cứu

Cuối cùng, em xin bày tỏ biết ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu hoàn thành đề tài này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Nguyễn Thị Hằng

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kếtquả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố trongbất kì công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hằng

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ

BQL Bảo quản lạnh

CSF Cryosurvival factor / Chỉ số sống sót sau bảo quản lạnh

DNA Desoxyribonucleic acid

IUI Intra Uterine Insemination/ Bơm tinh trùng vào buồng tử cungIVF In Vitro Fertilization/ Thụ tinh trong ống nghiệm

ICSI Intra – cytoplasmic Sperm Injection/ Bơm tinh trùng vào bào

tương noãn

PR Progressive Motility / Di động tiến tới

NP Non-progressive Motility/ Di động không tiến tới

WHO World Health Organization / Tổ chức Y tế thế giới

HOS Hypo-osmotic Swelling

CPA Cryoprotectant Agent/ Chất bảo vệ lạnh

TESA Testicular Sperm Aspiration/ Lấy tinh trùng từ tinh hoàn

OPS Open – pulled Straw/ Cọng rạ đặc biệt

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình vô sinh trên thế giới và tại Việt Nam 3

1.1.1 Tỷ lệ vô sinh trên thế giới và tại Việt Nam 3

1.1.2 Vô sinh nam 4

1.2 Xét nghiệm tinh dịch đồ 5

1.2.1 Các chỉ số cần đánh giá của xét nghiệm tinh dịch đồ 5

1.2.2 Giá trị tiên lượng của các chỉ số tinh dịch đồ 7

1.3 Bảo quản lạnh tinh trùng người 7

1.3.1 Lịch sử phát triển của bảo quản lạnh tinh trùng người 7

1.3.2 Cơ sở khoa học của phương pháp bảo quản lạnh 10

1.3.3 Các phương pháp bảo quản lạnh 13

1.3.4 Bảo quản lạnh số lượng ít tinh trùng 17

1.4 Những nghiên cứu về phương pháp đông tinh viên 20

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

2.3 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu 22

2.6 Kĩ thuật và công cụ thu thập số liệu 23

2.6.1 Kĩ thuật thu thập số liệu: thu thập số liệu dựa trên biểu mẫu nghiên cứu23 2.6.2 Công cụ thu thập số liệu 23

2.7 Quy trình thu thập số liệu 24

2.7.1 Quy trình xét nghiệm tinh dịch 24

2.7.2 Quy trình bảo quản tinh trùng 24

2.8 Sai số và cách khống chế 28

2.8.1 Sai số do nghiên cứu viên: 28

2.8.2 Sai số do thao tác kỹ thuật: 28

2.9 Quản lý và phân tích số liệu 28

2.10.Đạo đức trong nghiên cứu 29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 31

3.1 So sánh kết quả bảo quản lạnh các mẫu tinh dịch bình thường khi hạ nhiệt bằng máy Nicool LM10 và phương pháp đông tinh viên 31

3.1.1 Đặc điểm mẫu tinh dịch nghiên cứu 31

3.1.2 So sánh kết quả bảo quản lạnh khi hạ nhiệt bằng máy Nicool LM10 và phương pháp đông tinh viên ở mẫu tinh dịch bình thường 33

3.1.3 Đánh giá mối tương quan giữa một số chỉ số trước bảo quản đến chất lượng tinh trùng sau bảo quản. 37

3.2 So sánh kết quả bảo quản lạnh mẫu tinh dịch thiểu tinh nặng khi hạ nhiệt bằng máy Nicool LM10 và phương pháp đông tinh viên 43

3.2.1 Đặc điểm mẫu tinh dịch nghiên cứu 43

3.2.2 So sánh kết quả bảo quản lạnh khi hạ nhiệt bằng máy Nicool LM10 và phương pháp đông tinh viên ở mẫu tinh dịch thiểu tinh nặng 45

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 50

4.1.2 Cân bằng với môi trường bảo vệ lạnh 51

4.1.3 Đóng gói và hạ nhiệt độ 53

4.1.4 Lưu trữ 55

4.1.5 Rã đông 55

4.2 So sánh kết quả bảo quản lạnh mẫu tinh dịch bình thường khi hạ nhiệt bằng máy Nicool LM10 và phương pháp đông tinh viên 56

4.2.1 Mật độ 57

4.2.2 Tỷ lệ sống 57

4.2.3 Tỷ lệ di động 58

4.2.4 Tỷ lệ tinh trùng có hình thái bình thường 59

4.2.5 Đánh giá mối tương quan giữa một số chỉ số trước bảo quản đến chất lượng tinh dịch sau bảo quản 61

4.3 So sánh kết quả bảo quản lạnh mẫu tinh trùng thiểu tinh nặng khi hạ nhiệt bằng máy Nicool LM10 và phương pháp đông tinh viên 63

4.3.1 Tổng số tinh trùng và tỷ lệ thu hồi tinh trùng 63

4.3.2 Tỷ lệ tinh trùng sống 64

4.3.3 Tỷ lệ di động 66

KẾT LUẬN 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các chỉ số của xét nghiệm tinh dịch đồ 6

Bảng 1.2 Các loại tinh dịch đồ bất thường theo WHO 2010 6

Bảng 3.1 Chất lượng tinh trùng của mẫu nghiên cứu trước BQL 32

Bảng 3.2 Chất lượng tinh trùng của 3 nhóm sau bảo quản lạnh 33

nhóm 35

Bảng 3.5 So sánh tỷ lệ tinh trùng có hình thái bình thường sau BQL của 3 nhóm 36

Bảng 3.6 So sánh chỉ số CSF sau bảo quản lạnh của 3 nhóm 36

Bảng 3.7 Chất lượng tinh trùng mẫu thiểu tinh nặng trước BQL 44

Bảng 3.8 Chất lượng tinh trùng của 3 nhóm sau bảo quản lạnh 45

Bảng 3.9 So sánh tổng số tinh trùng và tỷ lệ tinh trùng sống sau BQL của 3 nhóm 46

Bảng 3.10 So sánh tổng số tinh trùng di động, di động tiến tới sau BQL của 3 nhóm 47

Bảng 3.11 So sánh tỷ lệ tinh trùng có hình thái bình thường sau BQL của 3 nhóm 48

Bảng 3.12 So sánh chỉ số CSF sau bảo quản lạnh của 3 nhóm 48

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân bố mẫu tinh dịch bình thường theo lứa tuổi 31

Biểu đồ 3.2 Mối tương quan giữa mật độ tinh trùng và chất lượng tinh trùng sau bảo quản ở nhóm đông lạnh chậm 37

Biểu đồ 3.3 Mối tương quan giữa mật độ tinh trùng trước bảo quản và chất lượng tinh trùng sau bảo quản ở nhóm đông viên có CPA 38 Biểu đồ 3.4 Mối tương quan giữa mật độ tinh trùng trước bảo quản và chất

lượng tinh trùng sau bảo quản ở nhóm đông viên không có CPA 39

đông lạnh chậm 40

Biểu đồ 3.6 Mối tương quan giữa tỷ lệ tinh trùng có hình thái bình thường trước bảo quản đến chất lượng tinh trùng sau bảo quản ở nhóm đông tinh viên có CPA 41

Biểu đồ 3.7 Mối tương quan giữa tỷ lệ tinh trùng có hình thái bình thường trước bảo quản đến chất lượng tinh trùng sau bảo quản ở nhóm đông tinh viên không có CPA 42

Biểu đồ 3.8 Phân bố mẫu tinh dịch thiểu tinh nặng theo lứa tuổi 43

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tỷ lệ vô sinh trên thế giới 3

Hình 1.2 Quá trình hạ nhiệt độ bằng máy Nicool LM10 14

Hình 1.3 Ảnh hưởng của tốc độ làm lạnh đến tế bào đông lạnh 16

Hình 1.4 Các dụng cụ được sử dụng trong BQL số lượng ít tinh trùng 19

Hình 2.1 Các bước kĩ thuật đông tinh viên 27

Hình 2.2 Các bước kĩ thuật rã đông của đông tinh viên 28

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vô sinh là tình trạng ngày càng phổ biến hiện nay và không có dấu hiệungừng gia tăng với ước tính gần 15% cặp vợ chồng trên thế giới gặp tìnhtrạng này [1] Vô sinh có thể do nam, do nữ, do cả vợ và chồng hoặc vô sinhkhông rõ nguyên nhân Trong trường hợp vô sinh nam, có tới 90% là do bấtthường tinh trùng như không có tinh trùng, số lượng tinh trùng ít, tinh trùng diđộng yếu hay tinh trùng dị dạng… [2] Trước tình hình trên, một trong nhữnggiải pháp hiệu quả giúp nâng cao khả năng có con cho các cặp vợ chồng làbảo quản lạnh tinh trùng để sử dụng cho các kĩ thuật hỗ trợ sinh sản như bơmtinh trùng vào buồng tử cung (Intra Uterine Insemination – IUI), thụ tinhtrong ống nghiệm (In Viro Fertilization – IVF) hay đặc biệt là bơm tinh trùngvào bào tương noãn (Intra – cytoplasmic Sperm Injection – ICSI) với trườnghợp số lượng tinh trùng ít

Bảo quản lạnh (BQL) tinh trùng người là một kỹ thuật thường quy đãđược áp dụng ở các trung tâm hỗ trợ sinh sản hay các ngân hàng tinh trùngvới mục đích lưu giữ tinh trùng trước khi tiến hành thụ tinh nhân tạo hay thụtinh trong ống nghiệm Phương pháp này đặc biệt quan trọng trong trườnghợp nam giới trước khi xạ trị, hóa trị liệu hoặc mắc một số bệnh như đái tháođường hay bệnh tự miễn, có thể dẫn đến tổn thương tinh hoàn hoặc rối loạnchức năng xuất tinh, hoặc những trường hợp hiến tinh trùng Ngoài ra, bảoquản tinh trùng còn được chỉ định cho những người chồng phải đi công tác xakhông thể thực hiện các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản với mẫu tinh dịch tươi BQLđược coi là thành công nếu tinh trùng trở lại hoạt động sống bình thường,không bị tổn thương về cấu trúc cũng như chức năng khi đưa về nhiệt độ37°C [3] Tuy nhiên có một thực tế là chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnhgiảm cả về tỷ lệ sống, khả năng di động cũng như sự đứt gãy DNA Một thách

thức đặt ra cho các bác sĩ là làm thế nào để tinh trùng sau rã đông bị ảnhhưởng ít nhất để thực hiện được các kĩ thuật hỗ trợ sinh sản Chất lượng tinhtrùng trong bảo quản lạnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố: chất lượng tinh trùngtrước bảo quản, môi trường bảo quản, phương pháp bảo quản, nhiệt độ bảoquản

Hai phương pháp đông tinh được áp dụng hiện nay trên thế giới và tạiViệt Nam là đông lạnh chậm và thủy tinh hóa Phương pháp thủy tinh hóa làmột tiến bộ trong bảo quản mô và tế bào nhưng vẫn chưa được áp dụng phổbiến bằng phương pháp đông lạnh chậm Trong phương pháp thủy tinh hóa,các nhà nghiên cứu đã sử dụng các dụng cụ khác nhau để bảo quản tinh trùngnhằm hạn chế tối đa thất thoát tinh trùng cũng như đảm bảo chất lượng tinhtrùng sau rã đông, như: màng trong suốt của noãn, cryoloop, cryotop, tảo,cọng rạ đặc biệt, vi giọt…Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhượcđiểm riêng, được áp dụng tùy từng điều kiện cụ thể Trong số đó, phươngpháp thủy tinh hóa sử dụng vi giọt hay còn gọi là phương pháp đông tinh viên

là phương pháp đơn giản, hiệu quả, chi phí thấp [4], [5] Ở Việt Nam, hầu nhưchưa có trung tâm hỗ trợ sinh sản nào sử dụng phương pháp này

Với mong muốn tìm được một phương pháp bảo quản tinh trùng, đặc biệtvới các mẫu tinh trùng thiểu tinh nặng có hiệu quả nhất, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu: “So sánh kết quả bảo quản lạnh mẫu tinh dịch bình thường và

thiểu tinh nặng khi sử dụng máy Nicool LM10 và phương pháp đông tinh viên” với 2 mục tiêu:

1 So sánh kết quả bảo quản lạnh các mẫu tinh dịch bình thường khi

hạ nhiệt bằng máy Nicool LM10 và phương pháp đông tinh viên.

2 So sánh kết quả bảo quản lạnh các mẫu tinh dịch thiểu tinh nặng khi hạ nhiệt bằng máy Nicool LM10 và phương pháp đông tinh viên.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình vô sinh trên thế giới và tại Việt Nam

1.1.1 Tỷ lệ vô sinh trên thế giới và tại Việt Nam

Hình 1.1 Tỷ lệ vô sinh trên thế giới (WHO, 2010) [6]

Theo WHO, vô sinh là tình trạng không có thai sau một năm chung sống

vợ chồng mà không dùng biện pháp tránh thai nào đồng thời tần suất giao hợp

ít nhất 2 lần một tuần

Theo thống kê của WHO năm 2010 có khoảng 15% tức là gần 120 triệucặp vợ chồng gặp tình trạng này Tỷ lệ vô sinh cao nhất ở các nước Đông Âu,Bắc Phi và Trung Á Trong khi đó, các nước châu Mỹ La tinh có tỷ lệ vô sinhthấp nhất (hình 1.1) [6] Kết quả nghiên cứu của Ali.H (2006) cho thấy ở ẢRập tỷ lệ vô sinh là 10-15%, trong đó vô sinh nam chiếm 50% [7] TheoBoivin và cộng sự (2007), các nước kém phát triển có tỷ lệ vô sinh dao động

từ 6,9% - 9,3% [7] Năm 2008, Oakley và cộng sự nghiên cứu 60.000 phụ nữtại Anh nhận thấy có 16% phụ nữ đã từng phải đi khám vì hiếm muộn, trong

đó có 8% phụ nữ phải điều trị [8] Sau đó 1 năm, Wilkes và cộng sự thống kêthì tỷ lệ vô sinh phải điều trị đã tăng lên 9% [9].

Tại Việt Nam, theo Trần Thị Phương Mai (2001), tỷ lệ vô sinh chiếmtrên 10%, do nam giới là 30% [10] Kết quả nghiên cứu của Trần Thị TrungChiến (2002) cho thấy tỷ lệ vô sinh dao động từ 10 – 18%, tỷ lệ vô sinh nam

và nữ tương đương nhau và ngày càng gia tăng [11] Nguyễn Viết Tiến vàcộng sự điều tra 14.396 cặp vợ chồng trên cả nước trong độ tuổi sinh đẻ năm

2012 rút ra tỷ lệ vô sinh ở Việt Nam là 7,7%; trong đó 3,9% là vô sinh nguyênphát; 3,8% là vô sinh thứ phát [12] Về nguyên nhân, vô sinh do nam chiếmgần 35%, nguyên nhân do nữ chiếm 30%, 20% do cả vợ và chồng, còn lại15% trường hợp là không rõ nguyên nhân [1]

1.1.2 Vô sinh nam

Theo thống kê ở Anh, nguyên nhân vô sinh do nam giới dao động từ 19 –57% các cặp vợ chồng hiếm muộn [9].Tại Việt Nam, nghiên cứu của NguyễnThị Được và Nguyễn Thị Thanh Mai (2001) trên 220 cặp vợ chồng vô sinhđến khám tại phòng khám sản Đại học Y Thái Bình nhận thấy tỷ lệ vô sinh dochồng chiếm 43,2% [13] Nguyên nhân chính gây giảm sinh tinh có thể do ditruyền, các biến chứng của những bệnh gây giảm chức năng sinh tinh của tinhhoàn hoặc biến chứng viêm tắc đường dẫn tinh Nguyên nhân gây vô sinhnam bao gồm nguyên nhân trước tinh hoàn, tại tinh hoàn và sau tinh hoàn.Các nguyên nhân trước tinh hoàn bao gồm suy vùng dưới đồi, tăng prolactinmáu, do bệnh lý tuyến giáp, tăng hormon tuyến thượng thận, đái tháo đường[14]…Nguyên nhân tại tinh hoàn gồm các trường hợp tinh hoàn lạc chỗ, suytinh hoàn, biến chứng teo tinh hoàn do quai bị, giãn tĩnh mạch thừng tinh,xoắn tinh hoàn…Các bệnh teo ống dẫn tinh bẩm sinh, tắc ống phóng tinh,xuất tinh ngược dòng và rối loạn cương dương… là nguyên nhân vô sinh sautinh hoàn [15]

Như vậy vô sinh nam chiếm khoảng 35%, trong đó hơn 90% các nguyênnhân đều dẫn đến kết quả gây bất thường tinh trùng Người ta ước tính các bấtthường của tinh trùng về sản xuất hay hoạt động chức năng chiếm từ 35 –50% các trường hợp vô sinh [16] Trước tình hình trên, tinh dịch đồ là một xétnghiệm quan trọng nhằm đánh giá chất lượng của tinh trùng, qua đó khái quátkhả năng sinh sản của nam giới.

1.2 Xét nghiệ m tinh dịch đồ

Tinh dịch đồ là xét nghiệm giúp khái quát khả năng sinh sản của namgiới Kết quả tinh dịch đồ cùng các dữ liệu từ phía người vợ sẽ giúp các nhàlâm sàng quyết định phương án điều trị cho một cặp vợ chồng hiếm muộn

Đa số các trung tâm hỗ trợ sinh sản trên thế giới và trong khu vực đềuđánh giá xét nghiệm tinh dịch đồ theo Cẩm nang của Tổ chức y tế thế giới(WHO) Phiên bản đầu tiên được phát hành năm 1980 Theo thời gian, cácphiên bản mới ra đời lần lượt thay thế cho các phiên bản cũ, các thông số củatinh dịch đồ cũng thay đổi dựa trên những nghiên cứu toàn cầu Gần đây nhất,năm 2010, WHO đã xuất bản một Cẩm nang về khảo sát và xử lý tinh trùngngười và hiện đang được các trung tâm hỗ trợ sinh sản trên thế giới cũng nhưViệt Nam áp dụng

Xét nghiệm tinh dịch đồ khảo sát cả đại thể và vi thể chất lượng tinhtrùng, các chỉ số cần đánh giá theo bảng dưới đây:

Bảng 1.1 Các chỉ số của xét nghiệm tinh dịch đồ [17], [18]

Thời gian ly giải 15 - 30 phút/tủ ấm

Bảng 1.2 Các loại tinh dịch đồ bất thường theo WHO 2010

Aspermia Không có tinh dịch

Azoospermia Không có tinh trùng trong tinh dịch

Oligospermia Thể tích xuất tinh thấp (thể tích tinh dịch <1,5 ml)

Oligozoospermia Mật độ tinh trùng ít (mật độ tinh trùng <15 triệu/ml)

Asthenozoospermia Tinh trùng yếu (di động PR<32%)

Teratozoospermia Tinh trùng dị dạng

Oligo-astheno-teratozoospermia Tinh trùng ít, yếu, dị dạng

Hematospermia Tinh dịch có máu (có hồng cầu trong tinh dịch)

Tinh dịch đồ hiện được xem là xét nghiệm đầu tay và quan trọng để khảosát chức năng sinh sản của nam giới Nhìn chung, tất cả các thông số của tinhdịch đồ đều quan trọng Tuy nhiên, các giá trị thường được quan tâm là mật

độ tinh trùng, tỷ lệ di động, tổng số tinh trùng di động, tỷ lệ tinh trùng sống,

tỷ lệ tinh trùng có hình thái bình thường

Ba phương pháp điều trị vô sinh phổ biến hiện nay là IUI, IVF và ICSI.Trong IUI, mật độ và độ di động của tinh trùng thường có giá trị tiên lượngthấp về tỷ lệ thành công Trong khi đó, tổng số tinh trùng di động được sửdụng nhiều hơn, có thể do liên quan số lượng tinh trùng sau lọc rửa TrongIVF, hình dạng bình thường của tinh trùng có giá trị cao trong tiên lượng khảnăng có thai sau điều trị Một nghiên cứu tiến hành phân tích gộp năm 1998,

có trên 90% nghiên cứu tìm thấy mối tương quan thuận giữa hình dạng bìnhthường của tinh trùng với tỷ lệ thụ tinh và có thai [16] Hiện nay, tuy kĩ thuậtICSI được coi là giải pháp hiệu quả cho các cặp vợ chồng vô sinh do chấtlượng tinh trùng kém, vẫn có nghiên cứu cho thấy tỷ lệ tinh trùng có bấtthường nhiễm sắc thể cao hơn ở những tinh trùng có hình thái bất thường.Như vậy, tinh dịch đồ có vai trò rất quan trọng trong chẩn đoán, tiênlượng và điều trị vô sinh nam Với một số nguyên nhân, giải pháp hiệu quảgiúp các cặp vợ chồng có con là bảo quản lạnh tinh trùng để sử dụng cho các

kĩ thuật hỗ trợ sinh sản Lúc này, một vai trò rất lớn của các chỉ số trong xétnghiệm tinh dịch đồ là đánh giá chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh

1.3 B ảo quản lạnh tinh trùng người

Bảo quản lạnh là kĩ thuật mà trong đó các mẫu bảo quản được lưu giữ ởnhiệt độ rất thấp, thường ở -196°C Tại nhiệt độ này, các hoạt động chuyểnhóa, tuần hoàn của tế bào sẽ bị ngưng trệ hoàn toàn Bảo quản lạnh được coi

là thành công nếu tinh trùng trở lại hoạt động sống bình thường, không bị tổnthương cấu trúc và chức năng khi trở lại nhiệt độ 37°C [3] Tinh trùng là loại

tế bào dễ bảo quản do: lượng nước ít (50%), kích thước nhỏ, nồng độ proteincao, ít bào quan, vật chất di truyền đã được đóng gói và nhân được cô đặc,histon được thay thế bằng protamine, màng có tính thấm cao, tỷ lệ diệntích/thể tích cao…

Trường hợp bảo quản lạnh tinh trùng người đầu tiên được báo cáo từ

1776, khi Spallazani đưa ra bằng chứng về khả năng tinh trùng còn sống saukhi đưa xuống nhiệt độ làm lạnh bằng cách đông lạnh trong tuyết [16] Năm

1937, Bernstein và Petropavloski bảo quản thành công tinh trùng của bò, cừu,ngựa, heo rừng ở -21°C [19] Jahnel năm 1938 đã công bố phương pháp làmlạnh tinh trùng người [19] Năm 1942, Hoagland và Pincus đã mô tả quá trìnhlàm lạnh nhanh tinh trùng người và thỏ bằng vòng làm lạnh Sau bảo quản có40% tinh trùng vẫn sống [19] Bảo quản lạnh tinh trùng chỉ thật sự phát triểnkhi Polge và cộng sự phát hiện vai trò của glycerol dùng làm môi trường bảo

vệ lạnh giúp cải thiện khả năng sống của tinh trùng vào năm 1949 [20] Cùngnăm đó, Smirnov đã bảo quản thành công tinh trùng thỏ trong ni-tơ lỏng [20].Năm 1953, em bé đầu tiên ra đời từ tinh trùng bảo quản lạnh [21] Năm 1964,

4 em bé đã ra đời bằng tinh trùng bảo quản bằng ni-tơ lỏng ở -196°C [20].Theo Sherman, đến 1976, trên thế giới có khoảng 1500 em bé ra đời bằng tinhtrùng đông lạnh [22] Tại Việt Nam, bệnh viện Từ Dũ đã bảo quản lạnh thànhcông tinh trùng năm 1995, tạo tiền đề cho ca thụ tinh trong ống nghiệm đầutiên sau đó 2 năm [21]

Trong thời gian gần đây, kĩ thuật bảo quản tinh trùng phát triển khánhanh cùng với sự ra đời của các ngân hàng tinh trùng Bảo quản tinh trùng

có mục đích chính là thành lập ngân hàng tinh trùng trong trường hợp hiếntinh trùng cho các trường hợp bất thường tinh trùng nặng, không có tinhtrùng, bà mẹ đơn thân, các cặp vợ chồng đồng tính và bảo tồn khả năng sinhsản của nam giới Kĩ thuật này đặc biệt quan trọng với các bệnh nhân ung thưtrước khi điều trị hóa chất, xạ trị dẫn đến suy tinh hoàn hay rối loạn chức năngphóng tinh Bên cạnh đó, quá trình điều trị một số bệnh tự miễn hay đái tháođường cũng có thể gây tổn thương tinh hoàn, từ đó hoạt động sinh tinh sẽ bịảnh hưởng Do đó các trường hợp bảo quản lạnh tinh trùng nên được tiến

hành để dự phòng suy tinh hoàn sau điều trị Bảo quản tinh trùng trong cáctrường hợp không mắc bệnh lý ác tính còn được triển khai trước khi phẫuthuật thắt ống dẫn tinh, làm việc trong môi trường độc hại, dự phòng khi chấtlượng tinh trùng có nguy cơ giảm dần trong trường hợp mất đoạn nhỏ trênNST Y [23] Bảo quản tinh trùng cũng được chỉ định cho các trường hợp córất ít tinh trùng di động hay hoạt động sinh tinh không ổn định Ngoài ra bảoquản lạnh tinh trùng còn giúp tăng tính thuận tiện và an toàn cho các kĩ thuật

hỗ trợ sinh sản trong trường hợp người chồng khó lấy mẫu vào ngày làm thủthuật, đi công tác xa nhà, khi mật độ tinh trùng quá ít hay trường hợp chỉ cóvài tinh trùng trong các thủ thuật lấy tinh trùng từ mào tinh hoàn, tinh hoàn…Mục tiêu của bảo quản lạnh tinh trùng theo Hiệp hội Ngân hàng mô Hoa

Kỳ là sau bảo quản lạnh, tỷ lệ tinh trùng di động phải đạt trên 50% so vớitrước bảo quản [22] Tại Việt Nam, Hồ Mạnh Tường đánh giá chất lượng tinhtrùng bằng chỉ số sống sót sau bảo quản lạnh (Cryosurvival Factor - CSF):

- Với mẫu tinh trùng có mật độ ≥ 50 triệu/ml và tỷ lệ di động ≥ 50% thì

để tìm tinh trùng sống, vì có thể dùng tinh trùng này sử dụng cho ICSI [25]

Nguyên tắc của phương pháp bảo quản lạnh là làm giảm nhiệt độ môitrường chứa mẫu tế bào hay mô xuống nhiệt độ rất thấp, thường là -196°C

Tại nhiệt độ này, môi trường nước trong và ngoài tế bào đều biến thành thểrắn, hầu hết các hoạt động sinh học bên trong tế bào bao gồm các phản ứngsinh hóa và trao đổi chất đều bị ngừng lại tạm thời Nhờ đó, tế bào sống ở giaiđoạn tiềm sinh và có thể bảo quản trong thời gian dài Năm 2005, JosephFeldschuh báo cáo trường hợp 2 trẻ ra đời từ tinh trùng bảo quản lạnh sau 21năm và 28 năm của cùng một mẫu tinh dịch [26] Yogev L và cộng sự (2010)nghiên cứu 2525 mẫu tinh dịch bảo quản lạnh trong thời gian từ 6 tháng – 15năm đã đưa ra kết luận thời gian không ảnh hưởng đáng kể đến số lượng tinhtrùng di động tiến tới (10,8±3,3 triệu/ml so với 12,3±2,9 triệu/ml) [27].

Với điều kiện nhiệt độ thấp, các phân tử nước, các chất hòa tan trongmôi trường xung quanh cũng như các vật chất bên trong tế bào tồn tại dướidạng kết hợp (dạng tinh thể và dạng kính), do đó, không có bất kì yếu tố nào

từ môi trường bên trong và bên ngoài có thể tác động đến tế bào giai đoạnnày Tuy nhiên, nhiệt độ cơ thể của đa số loài, nhất là ở động vật có vú đượckiểm soát chặt chẽ Vì vậy, khi hạ nhiệt độ của các tế bào về dưới mức 0°C cóthể đưa tế bào vào một môi trường không sinh lý Hậu quả là các tổn thương

có thể xảy ra ở tất cả các giai đoạn của quá trình hạ nhiệt độ Trong quá trìnhlàm lạnh và rã đông, một số thay đổi của môi trường trong và ngoài tế bàoảnh hưởng đến cấu trúc, chức năng, sự toàn vẹn và khả năng sống của tế bào

Một chu kì bảo quản lạnh thường trải qua ba giai đoạn quan trọng:

(1) Đưa tế bào từ nhiệt độ sinh lý (37°C) xuống nhiệt độ rất thấp -196°C(làm lạnh)

(2) Lưu trữ mẫu trong ni-tơ lỏng

(3) Đưa tế bào từ nhiệt độ thấp của ni-tơ lỏng trở về nhiệt độ sinh lý khicần để tế bào tiếp tục phát triển (rã đông)

Trong quá trình làm lạnh, tùy theo từng giai đoạn hạ nhiệt mà các tổnthương trên tế bào có thể khác nhau Khi tế bào được làm lạnh xuống từ -5°Cđến -15°C, hiện tượng hình thành tinh thể đá từ các phân tử nước tinh khiếttrong môi trường ngoại bào và nội bào sẽ xuất hiện Sự hình thành tinh thể đá

có thể gây tổn thương cơ học lên màng tế bào và các bào quan bên trong Đây

là giai đoạn tổn thương lớn nhất và quan trọng nhất mà tế bào phải trải quatrong quá trình làm lạnh và rã đông Khi nhiệt độ càng giảm, số lượng phân tửnước chuyển thành tinh thể đá càng tăng, lượng nước ở thể lỏng giảm dần,hậu quả là nồng độ chất tan trong môi trường ngoại bào tăng gây mất cânbằng áp lực thẩm thấu giữa nội bào và môi trường Hậu quả là nước bên trong

tế bào bị rút ra ngoài và kích thước tế bào bị co nhỏ, nếu co nhỏ quá mức, sựtổn thương màng tế bào sẽ không thể phục hồi Tăng nhiệt độ tiềm tàng cũng

là một hậu quả của sự hình thành các tinh thể đá Các phân tử nước chuyển từthể lỏng sang thể rắn sẽ giải phóng thoát ra một nhiệt lượng Sự thay đổi nhiệt

độ đột ngột này có thể làm ảnh hưởng cấu trúc và chức năng của tế bào saukhi rã đông, thậm chí tế bào có thể chết ngay trong quá trình làm lạnh

Ở nhiệt độ lưu trữ mẫu là -196°C, tế bào ít bị ảnh hưởng bất lợi nhất.Tuy nhiên, những phản ứng tạo thành những gốc tự do và các sản phẩm đứtgãy có thể xảy ra Nguyễn Phương Thảo Tiên (2007) nhận thấy khả năng diđộng, khả năng sống sau bảo quản lạnh ở những mẫu tinh trùng bình thường

đã được lọc rửa giảm có ý nghĩa thống kê với p< 0,001; tỷ lệ bất thường vềhình thái vi thể tăng sau bảo quản lạnh [28] Nghiên cứu tổn thương do lạnhlên chức năng ty thể, độ di động, hình thái và khả năng sống; Esteves (2007) đãđưa ra kết luận: sau rã đông, tỷ lệ tinh trùng có hình thái bình thường giảm 37%(p< 0,001); tất cả các thông số khác giảm tương tự [29] Năm 2010, Yogev L.nghiên cứu ảnh hưởng của bảo quản lạnh lên sự toàn vẹn DNA của tinh trùng

34 bệnh nhân nam bình thường và 166 bệnh nhân nam vô sinh thấy sự toàn vẹnDNA ở mẫu bình thường cao hơn ở mẫu bất thường (p<0,001) [27]

Để hạn chế các tổn thương trên, nhất là khả năng thụ tinh kém sau rãđông của tinh trùng, người ta thường sử dụng các chất bảo vệ đông lạnh(Cryoprotectant agent - CPA) CPA là những chất có khả năng hòa tan trongnước và gây cản trở sự chuyển trạng thái giữa nước và đá Chúng tương tácvới những phân tử sinh học với vai trò thay thế nước trong tế bào, nhờ đó hạnchế sự hình thành tinh thể đá nội bào khi nhiệt độ xuống thấp Một vai tròkhác của CPA là bảo vệ tế bào khi ở nhiệt độ thấp do hạn chế sự gia tăng nồng

độ của các chất hòa tan, bảo vệ màng tế bào khi các phân tử nước ngoại bàobắt đầu chuyển sang dạng tinh thể [16] Có 2 loại CPA thường được sử dụng

là CPA có khả năng thẩm thấu và CPA không có khả năng thẩm thấu quamàng tế bào Một điểm cần lưu ý là bên cạnh những lợi điểm đã nêu, hầu hếtcác CPA đều là những chất gây độc cho tế bào Người ta thấy rằng độc tínhcủa CPA tỷ lệ thuận với nồng độ và thời gian tiếp xúc, nhất là khi ở nhiệt độsinh lý Trong các loại chất bảo vệ lạnh, glycerol là CPA có khả năng thẩmthấu từ lâu đã được sử dụng trong bảo quản lạnh của hầu hết các loại với nồng

độ 5 – 20% Sau này, các tác giả đã bổ sung thêm các chất khác cùng glycerol

để tăng hiệu quả như bột lòng đỏ trứng gà, acid amin, abumin, GEYC…TrịnhSinh Tiên nghiên cứu bảo quản lạnh tinh trùng dùng môi trường GEYC vàSperm Freeze cho thấy chỉ số sống sót của hai môi trường là tương đươngnhau, cao hơn có ý nghĩa thống kê so với môi trường chỉ sử dụng glycerolđơn thuần [30] Hiện nay ở các trung tâm hỗ trợ sinh sản chủ yếu dùng môitrường Sperm Freeze

Hiện nay hai phương pháp phổ biến được áp dụng trong bảo quản lạnhtinh trùng là đông lạnh chậm và thủy tinh hóa Sự khác biệt chính của haiphương pháp này nằm ở chỗ có hay không có sự hình thành tinh thể đá nộibào cũng như ngoại bào Tuy nhiên phương pháp thủy tinh hóa hiện chưađược áp dụng rộng rãi bằng đông lạnh chậm

a Phương pháp đông lạnh chậm

Đông lạnh chậm còn gọi là phương pháp trữ lạnh có kiểm soát tốc độlàm lạnh Phương pháp này được giới thiệu đầu tiên vào những năm đầu thậpniên 70 trên mô hình phôi chuột Trong phương pháp đông lạnh chậm, mẫu tếtinh trùng được làm lạnh với tốc độ hạ nhiệt chậm, từ nhiệt độ sinh lý xuốngnhiệt độ rất thấp trước khi đưa mẫu vào lưu trữ trong nitơ lỏng Trước khi hạnhiệt độ mẫu trữ sẽ được thêm CPA (như glycerol và lòng đỏ trứng) với nồng

độ tăng dần ở nhiệt độ phòng và để cân bằng trong vài phút Trong quá trìnhnày, một lượng lớn nước trong tế bào sẽ bị mất ra ngoài Sau đó tinh trùngđược nạp vào cryovials hoặc ống hút và tiến hành quá trình hạ nhiệt độ.Sherman J.K (1999) cho rằng hạ nhiệt độ tốc độ từ 1 - 25°C/ phút là tốt nhất[22] Các cách hạ nhiệt độ của phương pháp này bao gồm hạ nhiệt độ bằngtay trong hơi ni tơ lỏng trong hộp xốp hoặc trong cổ bình, hạ nhiệt độ bằngmáy bán tự động như máy Nicool LM10 hoặc bằng máy tự động theo chươngtrình như Minicool 40PC, Planner Hiện nay bộ môn Mô phôi - Trung tâm hỗtrợ sinh sản và công nghệ mô ghép, Đại học Y Hà Nội cùng một số cơ sở hỗtrợ sinh sản lớn đều sử dụng máy hạ nhiệt độ bán tự động Nicool LM10 (hình1.2) theo 3 giai đoạn:

 Từ nhiệt độ phòng xuống đến -10°C trong 6 phút: 5,8°C/phút

 Từ -10°C xuống -120°C trong 20 phút: 5,5°C/phút

 Từ -120°C xuống -196°C trong 5 phút: 15,2°C/phút

Hình 1.2 Quá trình hạ nhiệt độ bằng máy Nicool LM10

Khi có nhu cầu sử dụng, tinh trùng được lấy ra khỏi bình lưu trữ mẫu để rãđông Quá trình rã đông thực hiện bằng cách nhúng trực tiếp tube chứa tinh dịchvào trong nước ấm 37°C hoặc ở trong tủ ấm 37C để đưa nhiệt độ mẫu tinhtrùng nhanh chóng về nhiệt độ phòng Sau đó, các chất bảo vệ đông lạnh sẽ đượcloại bỏ trước khi sử dụng tinh trùng cho các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

Ưu điểm của phương pháp đông lạnh chậm là tính an toàn cao do đượcthiết lập dựa trên sự cân bằng về tốc độ làm lạnh và nồng độ CPA Trong đônglạnh chậm, nồng độ CPA được sử dụng thấp (1-1,5mol/l) và chỉ kết hợp một chất

có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào nên độc tính với tế bào thấp Vì ưu điểmnày, nhiều trung tâm hỗ trợ sinh sản đã áp dụng rộng rãi phương pháp này Tuynhiên, ưu điểm cũng chính là nhược điểm Do nồng độ CPA sử dụng không caonên dung dịch đông lạnh không có khả năng tạo chênh lệch áp suất đủ lớn đểkhử nước bên trong tế bào một cách triệt để Tinh thể đá nội bào vẫn có khả năngtạo ra trong quá trình hạ nhiệt độ Ngoài ra, để thực hiện phương pháp đông lạnh

chậm cần tốn chi phí trang bị và bảo trì hệ thống máy hạ nhiệt độ, được điềukhiển một cách chính xác tốc độ làm lạnh.

b Phương pháp thủy tinh hóa

Khác với đông lạnh chậm, bảo quản lạnh bằng thủy tinh hóa có nhữngđiểm khác biệt rất đặc trưng Thủy tinh hóa là phương pháp trữ lạnh không cânbằng được thiết lập dựa trên nguyên lý cơ bản là không có sự hình thành tinh thể

đá bên trong và ngoài tế bào Toàn bộ vật chất (bao gồm cả các phân tử nước)bên trong và môi trường bên ngoài tế bào sẽ chuyển thành dạng kính và hoàntoàn không có sự hình thành tinh thể đá Do đó, phương pháp thủy tinh hóa cònđược gọi là phương pháp trữ lạnh không tạo đá Bản chất của quá trình này làhóa rắn dung dịch ở nhiệt độ rất thấp bằng cách gia tăng rất nhanh độ nhớt đểdung dịch đạt đến trạng thái ổn định và bất biến Quá trình này đòi hỏi tốc độlàm lạnh cực nhanh, có thể lên đến hàng chục nghìn độ/phút

Năm 1938, Luyet và Hodapp đã trữ lạnh thành công tinh trùng ếch bằngthủy tinh hóa [31] Bốn năm sau, Shaffner tiến hành trữ lạnh tinh trùng gà bằngphương pháp biến đổi của Luyet Tuy nhiên, những thử nghiệm này cho tỷ lệsống sau rã đông rất thấp do tại thời điểm đó, người ta không thể đạt được tốc độlàm lạnh nhanh như mong muốn [32] Vào những năm 1980, Rall và Fahy đãthực hiện thủy tinh hóa thành công tế bào phôi nhờ sử dụng nồng độ chất bảo vệlạnh cao, tối thiểu là 50% để đạt quá trình thủy tinh hóa ổn định [32] Từ đó, trữlạnh tinh trùng người bằng phương pháp thủy tinh hóa được thực hiện tương tự.Tuy nhiên, theo một số tác giả, quy trình thủy tinh hóa này không phù hợp chobảo quản tinh trùng vì nồng độ chất bảo vệ lạnh quá cao tạo ra tác động thẩmthấu và các biến đổi hóa học nguy hiểm gây tổn thương cho tế bào Tinh trùngcủa động vật có vú rất nhạy cảm với chất hóa học nên không thể bảo quản thànhcông bằng phương pháp thủy tinh hóa thông thường

Năm 2004, Vladimir I và cộng sự đã nghiên cứu phát triển kĩ thuật bảoquản lạnh tinh trùng bằng thủy tinh hóa không cần chất bảo quản bằng cáchnhúng trực tiếp dịch treo có chứa tinh trùng vào nitơ lỏng Nghiên cứu này sosánh độ di động, toàn vẹn DNA, khả năng thụ tinh giữa hai phương pháp thủytinh hóa không dùng chất bảo quản và đông lạnh chậm Kết quả cho thấy cả haiphương pháp đều làm giảm 40% độ di động của tinh trùng (p<0,05), độ di độngkhác biệt không có ý nghĩa thống kê [19] So với các loài động vật có vú khác,tinh trùng người có kích thước nhỏ và độ ổn định trong quá trình trữ lạnh caohơn Do đó, theo Isachenko và cộng sự (2007), thủy tinh hóa không dùng chấtbảo quản có khả năng thành công [4] Nhiều dụng cụ có thể sử dụng trong thủytinh hóa như cryoloop, cọng rạ đặc biệt (open-pulled straw), cryotop…Sau này,nhiều nghiên cứu đã báo cáo hiệu quả của phương pháp thủy tinh hóa so vớiphương pháp đông lạnh chậm Phương pháp thủy tinh hóa là phương pháp gâygiảm tỷ lệ sống và tỷ lệ di động ít hơn phương pháp đông lạnh chậm Các yếu tốhình thái, chất lượng không khác biệt phương pháp đông lạnh chậm Tuy nhiênvới việc không sử dụng chất bảo quản lạnh, thủy tinh hóa có nhược điểm là mỗilần trữ lạnh, chỉ một thể tích nhỏ tinh dịch có thể sử dụng nên chưa được ápdụng rộng rãi

Hình 1.3 Ảnh hưởng của tốc độ làm lạnh đến tế bào đông lạnh [33]

1.3.4 Bảo quản lạnh số lượng ít tinh trùng

Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) được báo cáo thành công lầnđầu tiên trên người vào năm 1992 [34] Đây được xem là cuộc cách mạng trongđiều trị vô sinh nam Với ICSI, người chồng có thể có con của chính mình dù bịbất thường tinh trùng nặng, thậm chí không có tinh trùng Số liệu cho thấy từ khi

có ICSI, số lượng xin tinh trùng đã giảm đi đáng kể, có trên 95% trường hợp vôsinh nam có thể có con của chính mình Các trường hợp không có tinh trùng cóthể có con của chính mình nhờ phẫu thuật lấy tinh trùng từ mào tinh(Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration - PESA) hay từ tinh hoàn(Testicular Sperm Aspiration - TESA) Tuy nhiên việc phẫu thuật nhiều lần cóthể gây ra một số bất lợi cho người chồng như viêm, tụ máu, tổn thương mạchnuôi, xơ hóa mào tinh và tăng chi phí điều trị [35] Do đặc tính của tinh trùng lấy

từ phẫu thuật, việc trữ lạnh bằng các phương pháp thông thường không mang lạihiệu quả cao khi rã đông Thách thức đặt ra là khi tinh trùng thu hồi có số lượng

ít, tỷ lệ di động và tỷ lệ sống đều thấp thì phương pháp bảo quản lạnh thôngthường không phải tối ưu vì dễ mất tinh trùng trong xử lý, đông và rã đông Yêucầu đặt ra là phải làm sao để bảo quản được số lượng ít tinh trùng, thậm chí mộttinh trùng duy nhất để tránh việc lặp lại đông – rã đông trên một mẫu tinh dịch

Có nhiều phương pháp sử dụng dụng cụ để bảo quản lạnh số lượng ít tinhtrùng Một số dụng cụ có thể sử dụng:

 OPS (Open-pulled straw) (hình 1.3-a): cọng rạ có đường kính nhỏ hơnđường kính nguyên thủy thường dùng trong đông lạnh chậm Cọng rạ đặc biệtđược tạo ra bằng cách sử dụng cọng rạ nguyên thủy, làm nóng và kéo nhỏ kíchthước bằng tay, sau đó cắt ở vị trí có kích thước nhỏ nhất, nhờ đó thể tích môitrường chứa tinh trùng sau khi hút vào cọng rạ rất nhỏ Phương pháp này đơn

giản, dễ áp dụng tuy nhiên không thích hợp cho các trường hợp thiểu tinh TheoIsachenko, phương pháp này dễ gây thất thoát tinh trùng [36].

 Cryotop (hình 1.3-b): được phát minh vào năm 2000, là phương pháp

dễ sử dụng và có hiệu quả cao nhất, ứng dụng đầu tiên trong kĩ thuật đông phôi.Cấu tạo một cryotop gồm một bản phim mỏng bằng nhựa dẻo trong suốt đượcbảo vệ bởi một nắp nhựa và được gắn với một cán cầm bằng nhựa cứng Tinhtrùng được đặt trên bề mặt bản phim với lượng môi trường rất nhỏ, sau đó toàn

bộ mẫu được nhúng trực tiếp vào ni-tơ lỏng Với cryotop, thao tác thực hiện dễdàng hơn, tốc độ đông lạnh rã đông cũng nhanh hơn giúp tăng tỷ lệ sống của tinhtrùng hơn OPS Tuy nhiên, phương pháp này cũng làm tăng nguy cơ lây nhiễmchéo [37]

 Vòng trữ lạnh Cryoloop (hình 1.3-c): gồm một vòng tròn rỗng bằngnhựa mềm, gắn với cán nhựa hoặc kim loại Đầu tiên vòng sẽ được nhúng vàomôi trường thủy tinh hóa, do có độ sánh cao môi trường này sẽ tạo thành lớpmàng mỏng trong phần rỗng của vòng tròn Tinh trùng được đặt ngay trên lớpmàng mỏng này và nhúng vòng trữ lạnh vào một ống nhựa nhỏ có chứa ni-tơlỏng Phương pháp dùng cryoloop cho tỷ lệ phục hồi cao, không cần chuẩn bịtrước tuy nhiên tăng nguy cơ lây nhiễm chéo [38]

 Lưới trữ lạnh (hinh 1.3-d): được làm bằng kim loại dẫn nhiệt Tinhtrùng được đặt lên bề mặt của lưới, phần lớn môi trường sẽ được hút đi qua cácmắt lưới bằng cách đặt lưới lên một màng lọc, nhờ đó dung dịch chứa CPA khihóa rắn sẽ gắn chặt tinh trùng vào lưới một cách an toàn

 Màng trong suốt của noãn sau khi đã loại bỏ bào tương bên trong (hình1.3-e): kĩ thuật này được giới thiệu lần đầu tiên bởi Cohen và cộng sự năm 1997bằng cách sử dụng một màng trong suốt rỗng để lưu trữ một vài tinh trùng riêng

lẻ sau lọc rửa Màng trong suốt được cân bằng trong chất bảo quản lạnh làglycerol, sau đó được đặt trên một cọng rạ, được hàn kín đầu, hạ nhiệt độ bằnghơi ni-tơ lỏng rồi trữ lạnh trong ni-tơ lỏng Ưu điểm của phương pháp ở khả

năng hồi phục tinh trùng cao khoảng 59 - 92%, ít thất thoát tinh trùng Tuy nhiên

kĩ thuật này ảnh hưởng đến khả năng lưu trữ tinh trùng, cần có nguồn cung cấpcũng như có khả năng lẫn DNA lạ [38], [38]

 Tảo Volvox Globator: tinh trùng sau khi được cân bằng với chất bảo vệlạnh sẽ được cho vào khối tảo bằng pipet ICSI, sau đó được làm lạnh bằng quytrình thông thường Ưu điểm của phương pháp là chi phí thấp, đơn giản, tỷ lệ thuhồi sau rã động là 100% và tỷ lệ di động xấp xỉ 60% Tuy nhiên để sử dụngphương pháp này cần có nguồn cung cấp và tinh trùng có khả năng lẫn vật liệu

1.4 Những nghiên cứu về phương pháp đông tinh viên

Phương pháp đông tinh viên chưa được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trênthế giới cũng như tại Việt Nam

Năm 2000, Gil – Salom đề cập lần đầu tiên đến kĩ thuật thủy tinh hóa sửdụng vi giọt Một số lượng ít tinh trùng sau khi được thêm chất bảo quản lạnh sẽđược đông nhanh trong ni-tơ lỏng Mẫu tinh trùng này được sử dụng cho ICSI.Kết quả cho thấy tỷ lệ có thai lâm sàng tương tự như mẫu tinh dịch tươi [40].Vào năm 2004, Isachenko và cộng sự lần đầu tiên mô tả phương pháp mới -thủy tinh hóa tinh trùng không dùng chất bảo vệ lạnh có khả năng thẩm thấu,nhưng kết quả của họ đưa ra là tỷ lệ di động và tỷ lệ đứt gãy DNA của phươngpháp này so với hạ nhiệt độ chậm tương đương nhau [19] Để rồi 4 năm sau đó,

họ tiếp tục gợi ý phương pháp thủy tinh hóa mới để bảo quản số lượng ít tinhtrùng bằng cách nhỏ trực tiếp từng giọt 30µl tinh dịch vào nitơ lỏng Kết quả đưa

ra gợi ý phương pháp đông tinh viên là phương pháp đơn giản, an toàn mà hiệuquả [4]

Năm 2010, Jin L và cộng sự nghiên cứu phương pháp đông tinh viên tinhtrùng lấy từ mào tinh mà không dùng CPA Ông thử nghiệm trên 22 mẫu tinhdịch, mỗi mẫu chia làm 2 nhóm bảo quản lạnh thông thường và đông tinh viênkhông dùng CPA Kết luận cho thấy tỷ lệ đứt gãy DNA không tăng lên ở cả 2phương pháp nhưng tỷ lệ sống của phương pháp đông tinh viên khác biệt có ýnghĩa thống kê [41]

Đến năm 2014, Azam Agha – Rahimi so sánh hiệu quả của phương phápđông nhanh bằng hơi nitơ lỏng và đông tinh viên có và không có CPA Kết quảcho thấy các thông số tinh dịch đồ đều đạt mục tiêu sau bảo quản nhưng khácbiệt không có ý nghĩa thống kê giữa 2 phương pháp Tỷ lệ đứt gãy DNA ở nhómđông tinh nhanh cao hơn nhưng không có ý nghĩa so với đông tinh viên Ngoài

ra, phương pháp đông tinh viên không dùng CPA có tỷ lệ hồi phục cao hơn đông

tinh viên có CPA Từ đó, tác giả đưa ra kết luận đông tinh viên có tiềm năng lớn

để bảo quản tinh trùng và có thể không cần dùng CPA [5]

Bảo quản lạnh tinh trùng là một kĩ thuật mang lại nhiều lợi ích cho việcđiều trị vô sinh cũng như bảo tồn khả năng sinh sản của nam giới Sự phát triểncủa các kĩ thuật hỗ trợ sinh sản đã làm cho vai trò của bảo quản lạnh tinh trùngngày càng trở nên quan trọng Việc lựa chọn và cải tiến phương pháp bảo quản

để có được phương pháp bảo quản tối ưu, nhất là với các mẫu tinh dịch bấtthường nặng là một vấn đề mang tính thực tiễn cao, đặt ra yêu cầu cần có thêmnhiều nghiên cứu về bảo quản lạnh tinh trùng người hơn nữa

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

30 mẫu tinh dịch bình thường và 30 mẫu tinh dịch thiểu tinh nặng (theo WHO2010) tại Trung tâm hỗ trợ sinh sản và công nghệ mô ghép, Bệnh viện Đại học

Y Hà Nội và Bộ môn Y sinh học Di truyền, Đại học Y Hà nội

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn

 Các mẫu tinh dịch có tinh dịch đồ bình thường:

- Thể tích tinh dịch ≥ 1,5ml.

- Mật độ tinh trùng từ 40 – 50 triệu/ml.

- Tỷ lệ di động trong giới hạn bình thường theo tiêu chuẩn WHO 2010.

 Các mẫu tinh dịch đồ thiểu tinh nặng:

- Thể tích tinh dịch ≥ 1 ml.

- 30 mẫu tinh dịch bình thường theo tiêu chuẩn lựa chọn.

- 30 mẫu tinh dịch thiểu tinh nặng theo tiêu chuẩn lựa chọn.

Phương pháp chọn mẫu: chọn mẫu thuận tiện

2.4 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu labo có đối chứng

2.5 Các biến số nghiên cứu

Các chỉ số được nghiên cứu trước và sau bảo quản lạnh bằng 2 phươngpháp gồm:

 Tỷ lệ tinh trùng có hình thái bình thường (%)

 Tỷ lệ thu hồi tinh trùng (%)

 Chỉ số CSF di động tiến tới = (% tinh trùng di động tiến tới sau bảoquản: % tinh trùng di động tiến tới trước bảo quản) x 100

 Chỉ số CSF di động = (% tinh trùng di động sau bảo quản: % tinh trùng

di động trước bảo quản) x 100

 Chỉ số tinh trùng sống = (% tinh trùng sống sau bảo quản: % tinh trùng

sống trước bảo quản) x 100

2.6 Kĩ thuật và công cụ thu thập số liệu

Biểu mẫu nghiên cứu chi tiết có trong phụ lục

2.7 Quy trình thu thập số liệu

Mẫu tinh dịch được xét nghiệm theo tiêu chuẩn của WHO 2010 Đánhgiá chất lượng mẫu tinh dịch và lựa chọn những mẫu tinh dịch đủ những tiêuchuẩn trên

Đánh giá hình thái: Nhuộm bằng Giemsa theo quy trình của Trung tâm Hỗ

trợ sinh sản và Công nghệ Mô ghép – Bệnh viện Đại học Y Hà Nội

Nhỏ 10μl lên lam kính, dùng lam khác kéo làm lam đàn, để khô trong nhiệt độphòng

 Nhỏ Ethanol tuyệt đối cố định, để khô ở nhiệt độ phòng

 Nhỏ 10μl giemsa phủ kín lam đàn Để trong vòng 1 phút

 Rửa sạch dưới vòi nước, để khô ở nhiệt độ phòng

 Phân tích hình dạng với độ phóng đại 1000 lần

Đánh giá tỷ lệ tinh trùng sống: phương pháp nhuộm Eosin

Nguyên lý: Những tinh trùng còn sống được đánh giá qua tính nguyênvẹn của màng bào tương tinh trùng Khi tinh trùng chết, màng bào tương đầutinh trùng bị tổn thương nên đầu tinh trùng sẽ bắt màu thuốc nhuộm Eosin, cómàu hồng Tinh trùng sống không bắt màu thuốc nhuộm sẽ trắng sáng

Kỹ thuật:

 Nhỏ 30 μl tinh dịch lên lam kính

 Nhỏ thêm 20 μl Eosin 1%, trộn đều 2 giọt trong 30 giây, đậy lamelle

 Đếm tổng số 200 tinh trùng dưới vật kính 40x, trên nhiều vi trường đểxác định tinh trùng sống

Mẫu tinh dịch sau khi được xét nghiệm được chia thành 2 lô:

- Lô 1: mẫu tinh dịch bình thường

- Lô 2: mẫu tinh dịch thiểu tinh nặng

Với lô 1, các mẫu tinh dịch được chia thành 3 phần, mỗi phần 0,5ml tinhdịch được đông tinh bằng 3 phương pháp: đông lạnh chậm hạ nhiệt bằng máyNicool LM10 (nhóm 1), đông tinh viên có sử dụng môi trường bảo quản(nhóm 2), đông tinh viên không sử dụng môi trường bảo quản (nhóm 3)

Với lô 2, các mẫu tinh dịch được đem ly tâm với tốc độ 1200v/10 phút,hút bỏ dịch nổi, còn giữ lại 0,9ml chia thành 3 phần, mỗi phần 0,3ml đượcđông bằng 3 nhóm tương tự như trên

Môi trường bảo quản lạnh: Sperm Freeze (Ferti- Pro, Bỉ)

a Bảo quản tinh trùng bằng máy Nicool LM10 (nhóm 1)

 Cân bằng với môi trường bảo vệ lạnh

 Tinh dịch tươi sau khi ly giải hoàn toàn được bổ sung dung dịchSperm FreezeTM bằng cách nhỏ từng giọt vào tinh dịch và lắc đều (7 giây/1giọt), theo tỉ lệ 0,7 ml/1 ml tinh dịch Sau đó, để mẫu cân bằng ở nhiệt độphòng thí nghiệm 15 phút.

 Hạ nhiệt độ: Sử dụng máy Nicool 10 hạ nhiệt độ từ từ

 Điều chỉnh nhiệt độ hạ theo khuyến cáo sử dụng của nhà sản xuất:

 5 phút: hạ từ nhiệt độ thường đến -10°C

 5 phút: hạ nhiệt độ -10°C đến - 80°C

 10 phút: hạ nhiệt độ -80°C đến -120°C

 5 phút: hạ nhiệt độ -120°C đến -196°C

 Hạ các mẫu bảo quản chìm trong nitơ lỏng

 Lưu trữ: chuyển mẫu từ máy Nicool 10 vào các cane có số thứ tự vàdìm vào bình trữ nitơ đông tinh

 Rã đông:

Sau 1 tuần, lấy mẫu ra khỏi ni-tơ lỏng, để mẫu ở nhiệt độ phòng (24-26°)trong 5 phút, sau đó đưa vào nước ấm 37° trong 10 phút nữa Sau khi mẫutinh dịch đã rã đông hoàn toàn, tiến hành nhỏ 1 ml môi trường Ferticult từnggiọt vào mẫu tinh dịch và lắc đều Ly tâm 1500 vòng/10 phút (Với lô 2, ly tâm1200v/10 phút) Hút bỏ dịch nổi, để lại 0,5ml (lô 2: 0,3ml), lắc đều và tiếnhành xét nghiệm chất lượng sau bảo quản

b Quy trình bảo quản bằng phương pháp đông tinh viên có sử dụng môi trường bảo vệ lạnh (Nhóm 2):

 Cân bằng với môi trường bảo vệ lạnh:

- Tinh dịch tươi sau khi ly giải hoàn toàn được bổ sung dung dịchSperm FreezeTM bằng cách nhỏ từng giọt vào tinh dịch và lắc đều (7 giây/1giọt), theo tỉ lệ 0,7 ml/1 ml tinh dịch Sau đó, để mẫu cân bằng ở nhiệt độphòng thí nghiệm 15 phút

 Đông lạnh:

Dùng xilanh 1 ml hút toàn bộ tinh dịch rồi nhỏ từng giọt 10µl trực tiếpvào cốc đựng ni-tơ lỏng cho tới khi hết toàn bộ lượng tinh dịch Dùng kẹp vôtrùng gắp toàn bộ các hạt tinh dịch đông lạnh vào cryovial loại 1,8ml đã ghiđầy đủ thông tin và được giữ trong ni-tơ lỏng Đậy nắp và để sang bình trữ

 Rã đông

Sau bảo quản lạnh 1 tuần, vẫn giữ cryovials trong ni tơ lỏng, gắp từnghạt tinh dịch vào ống Falcon chứa 1ml Ferticutl được giữ trong nước 37º, lắccho tan, tiếp tục đến khi hết số lượng hạt tinh dịch Ly tâm 1500 vòng/10 phút(Với lô 2, ly tâm 1200v/10 phút) Hút bỏ dịch nổi, để lại 0,5ml (lô 2: 0,3ml),lắc đều và tiến hành xét nghiệm chất lượng sau bảo quản

c Quy trình bảo quản bằng phương pháp đông tinh viên không sử dụng môi trường bảo vệ lạnh (Nhóm 3)

 Đông lạnh:

Dùng xilanh 1 ml hút tinh dịch rồi nhỏ từng giọt 10µl trực tiếp vào cốcđựng ni-tơ lỏng cho tới khi hết toàn bộ lượng tinh dịch Dùng kẹp vô trùnggắp toàn bộ các hạt tinh dịch đông lạnh vào cryovial loại 1,8ml đã ghi đầy đủthông tin và được giữ trong ni-tơ lỏng Đậy nắp và để sang bình trữ

Rã đông:

Sau bảo quản lạnh 1 tuần, vẫn giữ cryovials trong ni tơ lỏng, gắp từnghạt tinh dịch vào ống Falcon chứa 1ml Ferticutl được giữ trong nước 37º, lắccho tan, tiếp tục đến khi hết số lượng hạt tinh dịch Ly tâm 1500 vòng/10 phút(Với lô 2, ly tâm 1200v/10 phút) Hút bỏ dịch nổi, để lại 0,5ml (lô 2: 0,3ml),lắc đều và tiến hành xét nghiệm chất lượng sau bảo quản

Hình 2.1 Các bước kĩ thuật đông tinh viên

Hình 2.2 Các bước kĩ thuật rã đông của đông tinh viên 2.8 Sai số và cách khống chế

 Nghiên cứu viên lựa chọn mẫu tinh dịch không đạt tiêu chuẩn theoWHO 2010

 Cách khắc phục: 2 nghiên cứu viên tiến hành đánh giá kết quả xétnghiệm một mẫu tinh dịch cùng thời điểm một cách độc lập Sau đó gửi kếtquả cho nghiên cứu viên phụ trách tổng hợp số liệu, đánh giá và nhập vàobiểu mẫu nghiên cứu

 Trong quá trình tiến hành các kỹ thuật xét nghiệm có thể xảy ra sai số

do sự khác biệt thao tác giữa các nghiên cứu viên

 Cách khắc phục: Tập huấn và chuẩn hoá quy trình kỹ thuật xét nghiệmcho các nghiên cứu viên tham gia nghiên cứu

2.9 Quản lý và phân tích số liệu

Kết quả xét nghiệm sau khi thu thập được làm sạch bởi nghiên cứu viêntrước khi nhập vào biểu mẫu nghiên cứu

Các số liệu được nhập và phân tích bằng phần mềm SPSS 20.0

Các thống kê mô tả và thống kê phân tích được thực hiện

Kiểm định giả thuyết với khoảng tin cậy 95%

2.10 Đạo đức trong nghiên cứu

Nghiên cứu chỉ nhằm mục đích bảo vệ và nâng cao chất lượng tinhtrùng sau bảo quản lạnh Mẫu tinh dịch nghiên cứu được lấy từ bệnh nhân đếnlàm xét nghiệm tinh dịch đồ tại Trung tâm Hỗ trợ sinh sản và Công nghệ môghép – Bệnh viện Đại học y Hà Nội và Bộ môn Y sinh học Di truyền, Đại học

Y Hà nội, được sự cho phép của Giám đốc trung tâm và sự đồng ý của bệnhnhân Thông tin bệnh nhân sẽ được giữ kín tuyệt đối Mẫu tinh dịch sẽ đượchuỷ bỏ ngay sau quá trình nghiên cứu

SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

Bảo quản lạnh sâu

Rã đông và đánh giá lại chất lượng tinh dịch sau bảo

quản lạnh 1 tuần

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ

Từ tháng đến tháng 9/2017 đến tháng 7/2018, 60 mẫu tinh dịch nghiêncứu đã được lấy tại phòng xét nghiệm của Trung tâm Hỗ trợ sinh sản và Côngnghệ Mô ghép, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội và Bộ môn Y sinh học - Ditruyền, Đại học Y Hà Nội Những mẫu tinh dịch này được đánh giá dựa theotiêu chuẩn WHO 2010 và đáp ứng được tiêu chuẩn chọn mẫu nghiên cứu,được bảo quản lạnh sâu ở nhiệt độ - 196ºC trong nitơ lỏng theo 3 phươngpháp: đông lạnh chậm, đông tinh viên có chất bảo quản lạnh và đông tinh viênkhông có chất bảo quản lạnh

3.1 So sánh kế t quả bảo quản lạnh các mẫu tinh dị ch bình thường khi

hạ nhiệt bằng máy Nicool LM10 và phương pháp đông tinh viên

3.1.1 Đặc điểm mẫu tinh dịch nghiên cứu

3.1.1.1 Phân bố mẫu nghiên cứu theo lứa tuổi

Nhận xét: Nhóm có độ tuổi 25 đến 35 tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất với 63,3% và

nhóm tuổi ≤25 chiếm tỷ lệ thấp nhất Nhóm độ tuổi trên 35 chiếm tỷ lệ 30%

Độ tuổi trung bình của đối tượng nghiên cứu là 33,7 8,02, lớn tuổi nhất là

62, nhỏ nhất là 20 Đây cũng là độ tuổi thường gặp của bệnh nhân đến khám

vô sinh

3.1.1.2 Đặc điểm chung về đại thể

30 mẫu nghiên cứu đều đồng nhất về các đặc điểm đại thể:

3.1.1.3 Chất lượng tinh trùng của mẫu nghiên cứu trước bảo quản lạnh

Bảng 3.1 Chất lượng tinh trùng của mẫu nghiên cứu trước BQL (n= 30)

Nhận xét: Chất lượng tinh trùng của các mẫu nghiên cứu đáp ứng đủ

những tiêu chuẩn lựa chọn đặt ra, các thông số về mật độ và độ di động đềunằm trong giới hạn bình thường theo tiêu chuẩn WHO 2010 Mật độ tinhtrùng trung bình của mẫu nghiên cứu là 45,3  4,18 triệu/ml, trong đó mẫu có