công nghệ di truyền chuyển hoá năng lượng

Các enzyme hạn chế➢ Loại II ➢ Các kiểu cắt của enzyme hạn chế ➢ Cắt đầu bằng blunt ends: cắt trên phân tử DNA ngaychính giữa palindrom, tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng ➢ Cắt đầu dính cohesi

CHƯƠNG 7.

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN

Nội dung

7.1 Các enzyme dùng trong công nghệ di truyền 7.2 Vector chuyển gen

7.3 Thư viện cDNA

7.4 Thư viện genomic DNA

7.5 Các kĩ thuật sử dụng trong công nghệ

di truyền

➢ Các enzyme sử dụng trong tạo dòng phân tử có thể chialàm bốn nhóm lớn sau đây:

7.1 Các enzyme dùng trong công nghệ di truyền 7.1.1 Các enzyme hạn chế

➢ Phân lập từ các sinh vật prokaryote, có khả năng phânhủy DNA của bacteriophage

➢ Các enzyme hạn chế có ba loại (type): I, II và III

➢ Cách gọi tên các enzyme hạn chế dựa trên các qui ướcquốc tế

7.1.2 Các enzyme hạn chế

➢ Loại II

➢ có trình tự nhận biết chuỗi nucleotide đặc hiệu

➢ cắt ngay tại vị trí nhận biết

➢ chỉ cần Mg+2 làm cofactor và không cần năng lượngATP

➢ sản phẩm là những đoạn DNA đặc hiệu có thể pháthiện bằng điện di trên gel agarose

➢ cắt DNA ở các vị trí nhận biết riêng biệt bao gồm từ 4-6cặp nucleotide có trình tự đối xứng đảo ngược nhau, các

đoạn ngắn này gọi là palindrome

EcoRI TaqI

7.1.1 Các enzyme hạn chế

7.1.1 Các enzyme hạn chế

➢ Loại II

➢ Các kiểu cắt của enzyme hạn chế

➢ Cắt đầu bằng (blunt ends): cắt trên phân tử DNA ngaychính giữa palindrom, tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng

➢ Cắt đầu dính (cohesive ends): Cắt bên này và bên kiacủa tâm đối xứng để tạo ra hai đầu lệch nhau một vàinucleotide là cơ sở của phương pháp tạo dòng gen

7.1.1 Các enzyme hạn chế

➢ Nếu vùng nhận biết của enzyme là 4 cặp bazơ sẽ sinh

ra các mảnh có kích thước là 44 = 256 bazơ ≈ 0,26 kb

được gọi là isochizomer

7.1.1 Các enzyme hạn chế

➢ Loại II

➢ Các đoạn được tạo ra nhờ một enzyme hạn chế này khigắn với các đoạn được tạo ra nhờ một enzyme hạn chếkhác đã hình thành các thể lai (hybrid) mà các enzyme bố

mẹ không thể nhận biết được

7.1.1 Các enzyme hạn chế

➢ Loại II

➢ Methyl hóa

➢ Sự methyl hóa (methylation) là gắn gốc methyl (CH3) ở

vị trí cần thiết nên không bị RE cắt

➢ Trong kỹ thuật gen, enzyme methyl hóa được gọi làmethylase enzyme Methylase được dùng để bảo vệđoạn DNA cần gắn vào

EcoRI

➢ Thời gian phản ứng từ 1 đến 2 giờ.

➢ Các chế phẩm DNA còn lẫn đệm chiết, phenol hoặc EtOH

sẽ làm giảm chất lượng hoạt động của enzyme

➢ Enzyme hạn chế được giữ ở -20 0C (hoặc -80 0C nếu bảoquản lâu dài)

7.1.1 Các enzyme hạn chế

➢ Loại III

➢ Bao gồm những enzyme sau khi nhận biết một trình tựDNA đặc hiệu thì cắt ở vị trí cách đó 20 nucleotide và tạo ramột số đầu cắt khác nhau

➢ Tuy rằng vị trí điểm cắt rất gần trình tự nhận biết củachúng nhưng khó đoán trước được các điểm cắt đó

➢ RE loại III cũng như RE loại I không được sử dụng rộngrãi trong công nghệ di truyền

7.1.2 Các loại Nuclease (các enzyme phân cắt)

7.1.2 Các loại Nuclease (các enzyme phân cắt)

➢ DNase I

➢ tách từ tụy bò

➢ là endonuclease có khả năng phân cắt phân tử DNAsợi đơn hoặc sợi đôi sau các bazơ pyrimidine để tạo hỗnhợp oligonucleotide có nhóm phosphate ở đầu 5’

➢ Khi có mặt Mg+2, DNase I tác dụng độc lập trên mỗi sợiDNA, và các vị trí cắt được phân bố ngẫu nhiên

➢ Khi có mặt Mn+2, DNase I sẽ cắt cả hai sợi DNA gầnnhư ở cùng một vị trí để tạo ra các đoạn DNA đầu bằnghoặc đầu lồi nhưng chỉ nhô ra một hoặc hai nucleotide

7.1.2 Các loại Nuclease (các enzyme phân cắt)

DNase I

7.1.2 Các loại Nuclease (các enzyme phân cắt)

➢ Nuclease SI

➢ tách từ nấm sợi Asp oryzae

➢ cắt DNA sợi đơn hoặc RNA để tạo ra đầu 5’monophosphate hoặc các oligonucleotide

➢ Một enzyme có hoạt tính tương tự nuclease S1 làmung-bean nuclease (endonuclease) được tách chiết từ

mầm đậu xanh (Phaseolus aureus)

7.1.2 Các loại Nuclease (các enzyme phân cắt)

7.1.2 Các loại Nuclease (các enzyme phân cắt)

➢Desoxyribonuclease III (Exonuclease III )

➢ tách từ vi khuẩn E coli

➢ Exo III xúc tác loại bỏ các 5’ mononucleotide từ đầu 3’

OH của DNA sợi đôi tạo thành các vùng sợi đơn dài trongDNA sợi đôi

➢ Exo III không cắt các DNA sợi đơn hoặc DNA sợi đôi

có đầu lồi 3’

7.1.2 Các loại Nuclease (các enzyme phân cắt)

7.1.2 Các loại Nuclease (các enzyme phân cắt)

➢ Enzyme ribonuclease ( RNase A và RNase H)

➢ RNase hiện diện ở mọi nơi, enzyme thương mại đượctrích ly từ tụy bò

➢ cắt liên kết phosphodiester ngay sau một bazơpyrimidine như uracil và cytosine của RNA mạch đơn

➢ RNase A bền nhiệt không mất hoạt tính ở 90°C trongmột giờ

➢ RNase H là enzyme xúc tác loại bỏ RNA Sau khiphiên mã ngược để tiếp tục tổng hợp mạch thứ hai củacDNA hình thành mạch DNA sợi đôi

➢ Bacteriophage T4 polynucleotide kinase

(Bacteriophage T4-infected E coli)

➢ Alkaline phosphatase (E coli và ruột bê)

7.1.3 Các enzyme tổng hợp

➢ Enzyme sao chép DNA → DNA

➢ Enzyme DNA - polymerase I

➢ Enzyme T4 DNA - polymerase

➢Enzyme Taq - polymerase

➢ Enzyme phiên mã ngược (Reverse transferase)

➢ Các enzyme tổng hợp RNA (RNA-polymerase)

➢ SP6 RNA-polymerase

➢ T3, T7 RNA-polymerase

➢ Enzyme terminal – transferase

7.2 Vector chuyển gen

7.2.1 Khái niệm về vector chuyển gen

7.2.2 Một số tính chất cần thiết của vector chuyển gen

7.2.3 Một số ứng dụng của vector chuyển gen

7.2.4 Các vật chủ thu nhận vector chuyển gen

7.2.5 Các loại vector chuyển gen

7.2.1 Khái niệm về vector chuyển gen

➢ Sự chuyển gen

➢ Để chuyển gen từ tế bào A (tế bào cho) sang tế bào B(tế bào nhận) chỉ có thể thực hiện bằng cách đính cácgen cần chuyển vào một yếu tố trung gian được gọi làđoạn dẫn

➢ Những đoạn dẫn này có khả năng hướng dẫn, vậnchuyển các đoạn gen cần nghiên cứu vào tế bào nhận.Đoạn dẫn này chính là các vector chuyển gen

7.2.1 Khái niệm về vector chuyển gen

➢ Vector

➢ Vector là phân tử DNA nhỏ (ngắn) dạng thẳng hoặcdạng vòng, trong đó, người ta sẽ cài một mảnh DNA cầnnghiên cứu

➢ Những mảnh DNA đã được cài gọi là đoạn cài (insert) hoặc DNA ngoại lai hoặc DNA lạ.

➢ Là những thực khuẩn thể hoặc các plasmid

7.2.2 Tính chất cần thiết của vector chuyển gen

❖ tự tái bản trong tế bào chủ và không phụ thuộc vào sự saochép bộ gen của tế bào chủ

❖ Mang các gen chỉ thị chọn lọc để dễ dàng phân biệt và tinhsạch vector của thể tái tổ hợp với các dạng khác

❖ có các vùng DNA không cần thiết cho sinh sản vi khuẩn

❖ biến nạp vào tế bào vật chủ một cách dễ dàng

❖ không có khả năng sống sót ngoài tế bào chủ và khôngchuyển vào tế bào chủ khác bằng con đường tiếp hợp

❖ phải tồn tại trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ và ít gây xáotrộn trong tế bào chủ

7.2.3 Một số ứng dụng của vector chuyển gen

❖ tách dòng để khuếch đại lượng lớn bản sao DNA xác định

❖ Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn DNA chưa biết

❖ Đưa gen mà con người cần nghiên cứu vào tế bào chủ

❖ Sản xuất protein từ gen được tạo dòng

❖ Sản xuất RNA với khối lượng lớn từ DNA tạo dòng

7.2.4 Các vật chủ thu nhận vector chuyển gen

❖ Vật chủ là vi khuẩn E coli và các vi khuẩn khác,

❖ Vật chủ là nấm men và nấm mốc,

❖ Vật chủ là tế bào thực vật bậc cao,

❖ Vật chủ là tế bào động vật có vú

7.2.5 Các loại vector chuyển gen

❖ Chỉ chứa rất ít gen chọn lọc

❖ Các plasmid được chuyển vào trong vi khuẩn sau khi

vi khuẩn được xử lý để tế bào có thể cho thấm qua nhất

thời đối với các phân tử DNA nhỏ Quá trình này là sự biến nạp (transformation).

7.2.5 Các loại vector chuyển gen

❖ Plasmid thế hệ thứ ba: pUC; pGEM3; pCR 2.1

✓ mạnh và đa năng, tiện sử dụng cho nhiều loại RE khácnhau với hàng chục trình tự nhận biết của chúng được nối

tiếp nhau thành một đoạn dài gọi là polylinker

❖ Bacteriophage λ vector

➢ Các bacteriophage có nhiều ưu điểm

➢ có hiệu quả cao trong việc chuyển DNA vào trong tếbào vi khuẩn

➢ một phần ba của genome phage λ là không cần thiếtcho sự xâm nhiễm và sinh sản của nó trong tế bào vậtchủ

➢ DNA sẽ không bị đóng gói trong vỏ λ trừ khi chúngđược chèn vào trong genome phage λ

7.2.5 Các loại vector chuyển gen

7.2.5 Các loại vector chuyển gen

❖ Bacteriophage λ vector

➢ Các gen cần thiết của genome phage λ được định vịtrong một cụm có thể loại bỏ các gen không cần thiếtbằng EcoRI

➢ DNA ngoại lai có đầu đính bổ sung cho đầu của cácđoạn DNA của phage λ cần thiết

➢ Các đoạn sợi đơn ngắn trong genome của phage λ: các

vị trí cos cần cho sự đóng gói DNA vào đầu phage

7.2.5 Các loại vector chuyển gen

➢ Các cosmid vector có các thành phần sau:

➢ (1) một điểm khởi đầu sao chép của plasmid (ori);

➢ (2) một số các vị trí cắt hạn chế đơn;

➢ (3) một hoặc hơn các gen chi thị chọn lọc;

➢ (4) các vị trí cos cho phép đóng gói DNA trong đầu của phage

7.3 Thư viện cDNA

❖ Thư viện cDNA (complementary DNA) là tập hợp các đoạnDNA bổ sung (cDNA) được tổng hợp từ mRNA của một bộphận trong cơ thể sinh vật

❖ Ưu điểm

✓ Các dòng cDNA chứa trình tự mã hóa liên tục của một gen

✓ Sự dồi dào cDNA làm giảm nhẹ đáng kể việc xác định đúng dòng mong muốn từ thư viện gen

7.3 Thư viện cDNA

❖ Xây dựng một thư viện cDNA gồm năm bước chính

➢ Tinh sạch mRNA từ RNA tổng số của một phần cơ thể sinh vật.

➢ Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất từ khuôn mẫu mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase).

➢ Gây biến tính thể lai mRNA-cDNA để phá hủy sợi mRNA bằng RNase H của E coli Tổng hợp sợi cDNA thứ hai từ khuôn mẫu sợi

cDNA thứ nhất nhờ enzyme DNA polymerase với primer là vòng cặp tóc của nó để thu được phân tử cDNA sợi đôi

➢ Cắt vòng cặp tóc bằng enzyme nuclease S1 và dùng enzyme Klenow sửa chữa hai đầu của sợi đôi cDNA để tạo ra đầu bằng.

➢ Gắn các đoạn nối (linker) vào hai đầu của cDNA sợi đôi trước khi tạo dòng trong vector thích hợp để xây dựng thư viện cDNA.

7.4 Thư viện genomic DNA

❖ Thư viện genomic DNA là một tập hợp các đoạn DNA cùngđại diện cho một genome nguyên vẹn (hoặc gần nguyên vẹn)của cá thể mà DNA được bắt nguồn từ đó

❖Ứng dụng của genomic DNA

➢ để lập bản đồ vật lý (physical mapping) của DNA

➢ xác định các gen gây bệnh hoặc các chuỗi DNA quantâm cho những phân tích khác

7.5 Các kĩ thuật sử dụng trong công nghệ di truyền 7.5.1 Kĩ thuật PCR

❖ Nguyên tắc của PCR

➢ tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn dựatrên cơ sở hoạt động của DNA-polymerase (Taqpolymerase) để tổng hợp sợi mới bổ sung

➢ PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàngtriệu lần các đoạn DNA có chiều dài khoảng từ 200-3.000bp

➢ Đoạn DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận diệnnhờ cặp primer đặc trưng (oligonucleotide) thường cóchiều dài khoảng 20 nucleotide

7.5.1 Kĩ thuật PCR

❖ Taq một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt

❖Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn DNA nói trên được nhânlên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra,phân tích trình tự hoặc tạo dòng

7.5.3 Phương pháp điện di DNA

❖ Nguyên tắc

➢ Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân

➢ để tách ly, phát hiện phân tử DNA nguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế và DNA của sản phẩm PCR

➢ Nucleic acid tích điện âm dịch chuyển qua bảng gel

từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) dưới tác dụng của điện trường

➢ Trên cùng một bản gel, có cùng một dòng điện những phân

tử DNA khác nhau về trọng lượng nên khác nhau về điện

thời gian như nhau

7.5.3 Phương pháp điện di DNA

7.5.3 Phương pháp điện di DNA

❖ Cách tiến hành

➢ Cân khoảng 1g agarose cho vào 100ml đệm TBE EDTA) hoặc TAE (Tris-acetate-EDTA) ở nhiệt độ phòng, khuấy đều và

(Tris-borate-để yên 1 phút, cho vào lò viba.

➢ Làm nguội gel xuống 50÷55°C, thêm 1µl ethidium bromid, đổ gel vào khuôn gel và lắp lược.

➢ Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược và đổ đệm chạy vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2÷5 mm.

➢ Nạp DNA mẫu và DNA chuẩn vào các giếng, đậy nắp và cắm điện cực.

➢ Điện di trong khoảng 30 phút với điện thế 100÷120V.

➢ Chụp hình ảnh gel dưới ánh sáng UV để xem kết quả

7.5.3 Phương pháp điện di DNA

7.5.3 Phương pháp điện di DNA

Hình 3.5 Hình ảnh điện di

những đoạn DNA được khuếch

đại bằng PCR của bố, mẹ, con

Hình 3.6 Sản phẩm PCR so sánh với DNA khuôn mẫu trên gel agarose