XÁC ĐịNH NGƯờI LÀNH MANG GEN BệNH TRONG GIA ĐÌNH BệNH NHÂN β THALASSEMIA

Bệnh nhân thể nhẹ dị hợp tử vớimột đột biến trên gen β-globin, là người lành mang gen bệnh thường không có biểu hiện lâm sàng, cơ thể phát triển bình thường, có thiếu máu nhược sắctrên c

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh thalassemia gây thiếu máu tan máu là bệnh thường gặp ở trẻ emViệt Nam và cũng là bệnh đơn gen phổ biến nhất trên thế giới Bệnh có haibiểu hiện nổi bật là thiếu máu và ứ sắt trong cơ thể Trẻ bị bệnh thalassemiathường chậm phát triển thể chất, hiện tại chưa có phương pháp điều trị khỏibệnh, chủ yếu là điều trị triệu chứng suốt đời Tại Việt Nam, tỷ lệ người manggen bệnh phân bố trong cả nước và khác nhau tùy từng địa phương, từngnhóm dân tộc Đặc biệt, tỷ lệ mang gen bệnh rất cao ở các dân tộc ít ngườinhư: Mông (25%), Catu (14%), Tày (11%), Pako (8.33%) [1]

Theo thống kê, cả nước hiện mới quản lý được khoảng 20.000 bệnhnhân, trung bình mỗi năm có khoảng 2.000 trẻ sinh ra bị bệnh Tổ chức y tếthế giới WHO đã xác định thalassemia là vấn đề sức khỏe nghiêm trọng vàkhuyến cáo các nước Đông Nam Á nên chọn thalassemia là một trong những

ưu tiên về di truyền người

β-thalassemia do đột biến gen β-globin, nằm trên cánh ngắn NST 11, gâygiảm hoặc mất tổng hợp chuỗi β- globin Cho đến nay, có khoảng hơn 200 độtbiến đã được tìm thấy trên gen β-globin Ở người Việt Nam, theo một nghiêncứu của M.L Saovaros Svasti và cộng sự năm 2002cho thấy có 8 đột biến gây

ra 95% các trường hợp β-thalassemia [2].

Dựa vào biểu hiện lâm sàng, bệnh β-thalassemia chia làm 3 thể chính:thể nhẹ, thể trung gian, thể nặng Bệnh nhân thể nặng hay còn gọi là thểCooley, đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép hai đột biến khác nhau sẽ bị thiếumáu nặng, có chất lượng cuộc sống thấp Bệnh nhân thể nhẹ dị hợp tử vớimột đột biến trên gen β-globin, là người lành mang gen bệnh thường không

có biểu hiện lâm sàng, cơ thể phát triển bình thường, có thiếu máu nhược sắctrên công thức máu Những người này có thể kết hôn và truyền gen bệnh cho

con cái, đây chính là nguồn phát tán gen bệnh chủ yếu trong cộng đồng.Bệnh hiện chưa có phương pháp điều trị triệt để, liệu pháp gen và ghép tếbào nguồn đã có những bước đầu thành công tuy nhiên những cách này khátốn kém và không phải lúc nào cũng thực hiện được.

Bệnh β-Thalassemia được chẩn đoán xác định dựa vào đặc điểm lâmsàng và các xét nghiệm huyết học Các xét nghiệm di truyền phân tử xác địnhcác đột biến trên gen β-globin là điều kiện cần thiết để khẳng định rõ thểbệnh, phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh nhằm hạnchế những thai nhi bị bệnh là một biện pháp thiết yếu và hữu hiệu nhằm giảm

tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng Kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR đã được sửdụng khá rộng rãi để phát hiện đột biến gen gây bệnh β-thalassemia do có độchính xác cao, giá thành rẻ và ít phức tạp Ở Việt Nam việc áp dụng các kỹthuật sinh học phân tử tại các labo khác nhau để xác định đột biến gen cácbệnh lý di truyền ngày càng được khuyến khích mở rộng để giúp ích cho công

tác chẩn đoán và phòng bệnh Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Xác định người lành mang gen bệnh trong gia đình bệnh nhân β-Thalassemia”

được thực hiện với 2 mục tiêu:

1 Xác định người lành mang gen β-globin dị hợp tử trên các thành viên gia đình bệnh nhân β-thalassemia.

2 Mô tả một số đặc điểm huyết học ở người lành mang gen bệnh.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. MỘT SỐ HIỂU BIẾT CƠ BẢN VỀ HỒNG CẦU, HEMOGLOBIN

VÀ BỆNH β-THALASSEMIA

1.1.1 Hồng cầu

Hồng cầu là những tế bào không nhân, soi tươi giống như những chiếcđĩa lõm hai mặt, màu vàng rạ, trên phiến kính nhuộm giemmsa, thấy hồng cầuhình tròn, màu hồng, ở giữa nhạt màu hơn

Kích thước hồng cầu: 7-7,5 micromet, dày 2,3 micromet

Thể tích hồng cầu: 90-100m3

Đời sống trung bình hồng cầu: 100-120 ngày

Nơi sản sinh hồng cầu: tủy xương

Nơi phân hủyhồng cầu: hồng cầu già bị phân hủy chủ yếu tại lách, tủyxương và gan Hàng ngày có khoáng 0,85-1% tổng số hồng cầu già bị phânhủy (tan máu sinh lý) và một tỉ lệ tương tự hồng cầu non được sinh ra để thaythế

Nhiệm vụ cơ bản của hồng cầu là vận chuyển oxy tới các tổ chức, các

mô, các tế bào trong cơ thể thông qua vai trò của huyết sắc tố hay hemoglobinviết tắt là Hb chứa trong hồng cầu [3]

1.1.2 Hemoglobin bình thường

Định nghĩa:

Hemoglobin là thành phần chủ yếu của hồng cầu, là một phân tử protein

có sắc tố hem làm cho hồng cầu có màu đỏ Hemoglobin có khả năng kết hợp

và phân ly với oxy và CO2 để vận chuyển các khí này trong cơ thể

Mỗi cấu trúc hemoglobin bao gồm bốn tiểu đơn vị polypeptid được liênkết với nhau bởi các liên kết như: liên kết ion, liên kết hydro, tương tác kỵnước, lực Van-der-waals và sắc tố hem trong mỗi tiểu đơn vị Mỗi nhóm hem

có chứa một nguyên tử Sắt tích điện dương (Fe+2) có thể liên kết thuận nghịchvới các phân tử oxy Lúc này cấu trúc hình thái của hemoglobin cũng thay đổi

để thích hợp với việc liên kết và vận chuyển oxy đến các khu vực khác nhautrong cơ thể

Cấu trúc của hemoglobin gồm 2 phần: Phần globin và phần hem Phần hem: Hem là phần tạo nên màu đỏ của hồng cầu, có cấu trúc chungcho nhiều loài Hem có cấu tạo là một vòng protoporphyrin và một nguyên tửsắt hóa trị 2(Fe+II) [5] Nhân protoporphyrin gồm 4 vòng pyrol gắn với nhauqua liên kết allyl (-CH=), và chứa các thành phần như methyl (-CH3), vinyl (-CH=CH2), propionic (-CH2-CH2-COOH) Nguyên tử sắt nằm ở trung tâm,nhờ hai liên kết chặt chẽ với hai nguyên tử nitơ và hai liên kết giả với hainguyên tử nitơ khác

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc phân tử hemoglobin ở người trưởng thành

-Cấu trúc bậc 4 của hemoglobin [nguồn: vtv.vn]

Đây là cấu trúc không gian ba chiều của phân tử hemoglobin: 2 phân tử α

là màu xanh ngọc, hai phân tử β là màu đỏ, nhóm hem là màu xanh lá cây.

Phần globin: Globin có bản chất là protein Ở người, globin được cấutạo bởi bốn chuỗi polypeptid, giống nhau từng đôi một Mỗi một chuỗipolypeptid gắn với một hem Vì vậy mỗi phân tử hemoglobin có hai đôi chuỗipolypeptid và bốn hem đều có khả năng vận chuyển được bốn phân tử oxy [4].Trong quá trình phát triển của cơ thể, các loại chuỗi polypeptid có sự chuyểnđổi, loại này thay thế loại kia ở từng giai đoạn của cuộc sống, các loại chuỗipolypeptid được ký hiệu bằng chữ Hy Lạp α, β, , δ Tùy từng loại chuỗipolypeptide mà quyết định loại hemoglobin khác nhau.

Các loại hemoglobin sinh lý

Sự tổng hợp chuỗi polypeptid và thành phần các hemoglobin sinh lý thay

đổi qua các thời kỳ và lứa tuổi khác nhau [4], [5], [6]

Hình 1.2 Các loại hemoglobin ở người [7]

Như vậy ở thời kỳ đầu của bào thai, các chuỗi polypeptid , α,  đượctổng hợp là chủ yếu, chuỗi  được tổng hợp rất sớm và mất đi nhanh chóng

Sau tháng thứ 2 chuỗi α và  được tổng hợp là chính cà HbF tồn tại chủ yếunhư như thành phần Hb chủ yếu của bào thai.

Sau đẻ chuỗi  giảm nhanh chóng nhường chỗ cho chuỗi β Vì vậy sau

đẻ HbF giảm đi nhanh chóng, thay vào đó lượng HbA1 tăng lên Đến cuối nămthứ nhất HbF chỉ còn dạng vết, HbA1 đạt cao trên 95%

Chuỗi δ được tổng hợp chủ yếu ở thời kỳ sau khi đẻ, với lượng tăng dầnđến tuổi trưởng thành Ở người lớn thì thành phần Hb chỉ còn 2 loại HbA1

(97-99%) và HbA2 (1-3%)

Ở giai đoạn cuối của bào thai, huyết sắc tố F (α2γ2) chiếm khoảng 80%

Ở trẻ sơ sinh, huyết sắc tố F vẫn chiếm tỉ lệ cao, tỷ lệ này giảm dần vàđược thay thế bằng huyết sắc tố A

Bảng 1.1 Các chuỗi hemoglobin theo lứa tuổi [7]

Hb sinh lý Cấu trúc

globin

Thời kỳ xuất hiện

Hb Porland  2  2 Phôi thai 2-3 tuần

Hb Gower1  2  2 Thai 2-3 tuần, có trong 2 tháng đầu của thai

HbGower 2  2  2 Xuất hiện và có cùng Hb Gower1

HbF  2  2 Bào thai 5 tuần, Hb chủ yếu ở thai nhi

HbA2  2  2 Thai nhi gần đẻ, Hb ở người bình thường

HbA1  2  2 Bào thai 6 tuần, Hb chủ yếu ở người bình thường

HbF chiếm ưu thế trong máu bào thai, có ái lực với oxy cao hơn HbA,cho phép hồng cầu bào thai vận chuyển được một lượng oxy thích hợp trongđiều kiện phân áp oxy thấp của môi trường thai nhi Khi đứa bé ra đời, phổi

trở thành cơ quan trao đổi khí, HbA dần dần thay thế cho HbF Khi đứa trẻđược 6 tháng tuổi, sự thay thế này sẽ hoàn tất [8], [9], [10].

Các chuỗi polypeptid đều có cấu trúc từ các acid amin được sắp xếp theomột trình tự chặt chẽ, cấu trúc không gian (cấu trúc bậc III, IV) của các cơquan quan trọng đảm bảo chức năng vận chuyển khí của hemoglobin Cácchuỗi  có 141 acid amin, còn các chuỗi α, β,  có 146 acid amin

Sự điều hòa tổng hợp các chuỗi polypeptid của globin được thực hiện bởicác gen điều hòa (regulator gen), theo một quy trình phức tạp, những gen nàynằm ở các nhiễm sắc thể khác nhau Gen điều khiển tổng hợp chuỗi α (gọi tắt làgen α) nằm trên nhánh ngắn của đôi nhiễm sắc thể 16 Còn gen điều khiển tổnghợp chuỗi β nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 11 (11p15.5) [11]

1.1.3 Phân loại bệnh hemoglobin

Bệnh hemoglobin là nhóm bệnh di truyền phổ biến của loài người.Những thay đổi bệnh lý phần lớn khu trú ở phần globin của phân tửhemoglobin, gây nên nhóm bệnh gọi là bệnh hemoglobin và được xếp thànhhai nhóm:

 Nhóm hemoglobin bất thường: do sự thay đổi cấu trúc của các

chuỗi polypeptid ở phần globin Sự thay đổi của các acid amin, gây nên sựbiến đổi cấu trúc của chuỗi polypeptid, từ đó có thể làm thay đổi tính chất lý,hóa của phân tử hemoglobin gây bệnh hemoglobin Ví dụ: Bệnh HbE (acid amin

ở vị trí thứ 26 trong chuỗi β-globin là glutamin bị thay thế bởi lysine) [12]

 Nhóm thalassemia: Do sự thay đổi về số lượng của các chuỗi globin,

thiếu hụt một loại chuỗi globin nào đó trong hai loại α và β Nếu sự thiếu hụt

ở chuỗi β được gọi là β-thalassemia Nếu thiếu hụt ở chuỗi α được gọi là

α-thalassemia Trường hợp hai chuỗi α và β bị thiếu hụt hơn bình thường đượcgọi là α //β thalassemia [13].

Cơ chế bệnh sinh của bệnh thalassemia:

Năm 1944 Valentin và Neel cho rằng: Thalassemia là một bệnh di truyềngen lặn trên nhiễm sắc thể thường Những thay đổi gen kiểm soát sự tổng hợphemoglobin như đột biến điểm, đứt đoạn, trao đổi đoạn dẫn đến thay đổi sốlượng hoặc chất lượng chuỗi polypeptide của globin

Bệnh thalassemia ở nhóm nguyên nhân có sự thay đổi về số lượng củacác chuỗi globin.Trong bệnh thalassemia có một hiện tượng chung nhất là sựthiếu hụt một loại chuỗi polypeptid của phần globin, gây ra thừa tương đốihoặc tuyệt đối loại chuỗi kia Nếu sự thiếu hụt chuỗi β gọi là bệnh β-thalassemia, khi chuỗi β giảm thì chuỗi α nối với β bị giảm và chuỗi α còn dư

sẽ tăng nối với chuỗi δ và chuỗi γ Còn nếu thiếu hụt chuỗi α thì gọi là bệnh thalassemia, khi chuỗi α-globin giảm, β-globin tăng nối với globin còn lại.Hiện tượng này xảy ra ở các mức độ khác nhau phụ thuộc vào từng thể bệnh,song hậu quả của nó là 2 quá trình:

α Hiện tượng thứ nhất: giảm tổng hợp hemoglobin

Quá trình bệnh lý thứ nhất là hậu quả trực tiếp của việc thiếu hụt tổnghợp phần globin Vì thiếu một loại chuỗi polypeptid nào đó mà việc tổng hợpglobin bị giảm Biểu hiện là hồng cầu nhược sắc và tăng sinh các hồng cầunon trong tủy Ở thể nhẹ sự mất cân bằng giữa các chuỗi α và β không nặng

nề thì hậu quả sự giảm tổng hợp hemoglobin là biểu hiện rõ rệt củathalassemia Ở những người dị hợp tử thì biểu hiện chủ yếu là hồng cầu nhỏnhược sắc và tăng sinh hồng cầu non trong tủy

- Hiện tượng thứ 2: mất cân bằng giữa hai loại globin

Hiện tượng này là hậu quả thứ hai của việc thiếu hụt một loại chuỗiglobin nào đó Việc thiếu hụt một loại chuỗi globin sẽ gây ra dư thừa loại kia.Trong β-thalassemia do thiếu hụt chuỗi β gây dư thừa chuỗi α globin.Trong α-thalassemia do thiếu hụt chuỗi α gây dư thừa chuỗi β globin.Trong bệnh β-thalassemia , các chuỗi α dư thừa sẽ tạo nên những hạt tủarơi xuống màng hồng cầu nguyên sinh chất của các hồng cầu trưởng thành vàhồng cầu non trong tủy.

Đối với các hồng cầu ở máu ngoại vi các hạt tủa này làm cho màng hồngcầu mất độ mềm dẻo, hồng cầu trở thành một tế bào cứng đờ nên khó vượtqua các màng lọc ở lách Mặt khác các hạt tủa này ở màng hồng cầu làm chomàng này tăng diện tích tiếp xúc và dễ bị các tác nhân oxy hóa phá hủy mànghồng cầu Các tủa này còn làm cho tính thấm màng hồng cầu thay đổi gây nênmất kali ở bên trong tế bào ra huyết tương Những tác hại của những hạt tủalàm cho hồng cầu bị vỡ sớm gây nên hiện tượng tan máu [14]

Trong tủy xương các hạt tủa trên gắn lên nguyên sinh chất, màng củahồng cầu non làm cho hồng cầu non chết trước khi trưởng thành Điều nàylàm tăng sinh mạnh hồng cầu non trong tủy, gây biến dạng xương, tăng hấpthu sắt gây ra nhiễm sắt trong cơ thể Hiện tượng hồng cầu non bị chết sớmkhông đến được giai đoạn trưởng thành như trên gọi là hiện tượng sinhhồng cầu không hiệu quả và là cơ chế chủ yếu gây ra những biến đổi lâmsàng và huyết học ở những bệnh nhi β-thalassemia thể nặng

Hình 1.3 Cơ chế hình thành triệu chứng lâm sàng trong thalassemia [7]

Giảm tổng hợp chuỗi globin (β

Tăng tạo bilirubin

Tăng hấp thụ sắt Tăng sinh máu Tăng sinh hệ liên võng Tắc vi mạch

Vàng da

Vàng da

Sỏi mật

Sỏi mật loét

1.1.4 Hậu quả bệnh thalassemia

* Thiếu máu mạn nặng: Do đời sống hồng cầu bị giảm, thay đổi hình

dang, chất lượng Tủy xương tăng tổng hợp hồng cầu non nhưng bị mất bù,

* Tăng sản tủy xương: Thiếu oxy mô gây tăng sản xuất erythropoietin, tủy

tăng hoạt động để tạo hồng cầu non nên bị rộng ra, vỏ xương mỏng đi gâybiến dạng hộp sọ tạo ra u trán, u chẩm, xương chi mỏng dễ gãy,răng dễ sâu

* Quá tải sắt: Khi quá tải sắt, độ bão hòa sắt cao trên 50%, dễ dàng bị thay

đổi trạng thái từ sắt III sang sắt II sinh ra các ion hình thành các gốc tự do, làm tếbào chết và hình thành tổ chức sợi Các tổ chức bị tổn thương do quá tải sắt là:Các tuyến nội tiết như tuyến tụy gây bệnh tiểu đường typ 2, tuyến giápgây suy giáp, trục hạ đồi tuyến yên làm dậy thì muộn, suy thượng thận, thiểunăng cận giáp

Tim bị tổn thương gây suy tim Gan bị ảnh hưởng làm gan to, xơ gan Dasạm, tăng sắc tố da

* Cường lách: Do đời sống hồng cầu ngắn, giảm bạch cầu, tiểu cầu

1.1.5 Bệnh β-thalassemia

Định nghĩa

Bệnh thalassemie là bệnh thiếu máu tan máu di truyền rất hay gặp, đượcđặc trưng bởi sự khiếm khuyết trong quá trình tổng hợp chuỗi globin ảnhhưởng đến sự trưởng thành về đời sống hồng cầu gây thiếu máu tán huyếtmãn tính bắt đầu từ lúc nhỏ tuổi

Thalassemia là một dạng bệnh của hemoglobin (Hb) trong đó chuỗi globin giảm hoặc không được tạo thành gọi là bệnh α-thalassemia, hoặc chuỗi

α-globin giảm hoặc không được tạo thành gọi là bệnh thalassemia Bệnh

β-thalassemia là bệnh di truyền đơn gen hay gặp nhất Ở Việt Nam.

Lịch sử phát hiện

β-thalassemia được phát hiện tương đối sớm từ năm 1910 bởi JameHenrick và năm 1925 bởi Lee và Cooley trên 5 bệnh nhi Những biểu hiệnlâm sàng được coi như những chứng cớ phát hiện đầu tiên của bệnh với triệuchứng: thiếu máu kèm theo lách to, gan to giống như bệnh mà Von jacksch

mô tả năm 1989 Năm 1927 Cooley phát hiện thêm 2 trường hợp nữa ngoàitriệu chứng như trên còn thấy da bị sắc tố, xương sọ dày lên có biến đổi sứcbền hồng cầu Đó là những trường hợp β- thalassemia mô tả đầu tiên sau nàygọi là thiếu máu Cooley

Tiếp những phát hiện của Cooley rất nhiều nghiên cứu được công bốnhất là nghiên cứu ở Italia của Rietti năm 1925, Greppi (1928), Michcheli(1935), Wintrobe và cộng tác viên năm 1940

Năm 1936 Whipple và Brodford đã đề nghị từ “Thalassemia” để gọibệnh mà Cooley đã mô tả

Lịch sử nghiên cứu

Năm 1940, Wintrobe và cộng sự cho rằng bệnh thiếu máu Cooley là thalassemia thể nặng; các biểu hiện lâm sàng mà Cooley mô tả đầu tiên lànhững biểu hiện của hiện tượng thiếu máu tan máu mạn tính (vàng da, láchto), nhiễm sắt và biến dạng xương

Để chứng minh có hiện tượng tan máu, ngay từ năm 1950, Hamiltondùng phương pháp đánh dấu hồng cầu Cr51 xác định đời sống hồng cầu ởbệnh nhân thalassemia thể nặng bị rút ngắn, thời gian bán hủy hồng cầu 2 - 7ngày Angelovoy A và cộng sự (1968), nghiên cứu đời sống hồng cầu ở nhữngtrẻ em thiếu máu Cooley thu được kết quả tương tự Thời gian sống của hồngcầu rút ngắn bằng 1/3 so với thời gian sống của hồng cầu bình thường Quathực nghiệm với nhiều nghiên cứu đã xác định rằng sở dĩ hồng cầu trong β-thalassemia bị vỡ sớm là do khuyết tật bên trong hồng cầu [15]

Những công trình nghiên cứu sau này đều thấy có sự biến đổi khá đặcbiệt ở hồng cầu Theo Aksoy và cộng sự, hemoglobin trung bình hồng cầu 18-

22 pg(picogam) [16], thể tích hồng cầu trung bình 55-81fl (feltolit) Modell vàcộng sự thấy hemoglobin trung bình hồng cầu trong bệnh β-thalassemia 15-26

pg và thể tích hồng cầu trung bình 57-75fl [17] Các tác giả đều thống nhất sở

dĩ hồng cầu nhược sắc và thể tích hồng cầu trung bình nhỏ là do sự thiếu hụttổng hợp mạch β-globin dẫn đến giảm tổng hợp hemoglobin Hồng cầu chứa

ít hemoglobin làm cho áp lực keo bên trong hồng cầu giảm, lượng dịch bêntrong hồng cầu ít đi

Nghiên cứu hình dạng hồng cầu, Fessas, Yataganas…đều thấy hồng cầubiến dạng nặng, to nhỏ không đều, nhiều hồng cầu hình bia và hình giọt nước,hồng cầu mỏng, hồng cầu bắt màu không đều và hồng cầu có hạt kiềm

Tại Việt Nam, năm 1963, lần đầu tiên Bạch Quốc Tuyên và cộng sự đãxác định các trường hợp hemoglobin bất thường tại Việt Nam [18] Tác giả đã

mô tả bệnh cảnh lâm sàng và biến đổi huyết học ở những người bệnh này Từ

dó việc nghiên cứu bệnh hemoglobin ở nước ta được chú ý và dần dần được

mở rộng

Nguyễn Khắc Hân Hoan và cộng sự đã nghiên cứu tầm soát và chẩnđoán trước sinh đột biến gen thalassemia từ 01/12/2007 đến 31/3/2010 tạiBệnh viện Từ Dũ: các thai phụ và chồng được tầm soát tình trạng mang genbệnh thalassemia bằng xét nghiệm huyết đồ và loại trừ nguyên nhân thiếu sắt,các cặp dương tính được điện di Hb và thực hiện chẩn đoán trước sinh tìm độtbiến gen cho vợ, chồng và thai Có 26965 thai phụ tham gia tầm soát với 1058trường hợp được khảo sát đột biến (gồm thai phụ, chồng và thai) Kết quảphát hiện được đột biến α-thalassemia chiếm 65,8%, có 21,4% thai mang kiểugen thalassemia nặng; khả năng phát hiện bệnh của chỉ số MCH < 28pg là98,7% và MCV < 80fl là 92,3% [19]

Trần Danh Cường và cộng sự đã nghiên cứu từ tháng 8/2011 đến tháng3/2012 tại Trung tâm chẩn đoán trước sinh, Bệnh viện Phụ sản Trung ương:sàng lọc trên những gia đình có tiền sử đẻ con bị bệnh β-thalassemia, cả bố và

mẹ đều mang gen đột biến, tiến hành chọc hút ối để xét nghiệm chẩn đoánthalassemia ở thai Kết quả là tỷ lệ β-thalassemia nặng chiếm 18,2%; tỷ lệ thainhi mang gen bệnh là 54,5% và tỷ lệ thai nhi bình thường là 27,3% [20].Nguyễn Khắc Hân Hoan và cộng sự đã nghiên cứu chẩn đoán trước sinhbệnh thalassemia tại Bệnh viện Từ Dũ trên 290 trường hợp thai của các cặp

vợ chồng mang đột biến gen α hoặc β-thalassemia, được chọc ối và tìm alenđột biến bằng kỹ thuật ARMS, gap-PCR, enzym hạn chế và MLPA Kết quảphát hiện được 207 thai mang gen đột biến (71,4%), trong đó 128 thai mangđột biến α-thalassemia (44%), cao hơn 2 lần so với số thai mang đột biến β-thalassemia (59 trường hợp, tương ứng với 20,3%) Các đột biến hay gặp nhất

là - SEA; α3.7; HbE; codon 41/42-TCTT; codon 17A+ Chọc ối và chẩn đoántrước sinh bằng kỹ thuật multiplex ARMS và multiplex gap-PCR chính xác và

an toàn [8]

Bạch Khánh Hòa và Nguyễn Quốc Cường đã nghiên cứu áp dụng kỹthuật sinh học phân tử để tìm hiểu một số đột biến gây β-thalassemia ở ngườimiền Bắc Việt Nam trên 46 người bệnh β-thalassemia, dùng kỹ thuật PCRmultiplex để xác định những đột biến của chuỗi β-globin DNA được tách từmáu toàn phần theo phương pháp Perchlorat sodium Các mẫu DNA sau khitách được tiến hành phản ứng PCR multiplex với các cặp mồi để phát hiệnnhững đột biến hay gặp nhất ở khu vực Đông Nam Á và Nam Trung Quốc:

Cd 41/42 (-TCTT), Cd17 (A-T), FS 71/72 (A+), Cd29 (A-G), Cd28 (A-G),IVS II-654(C-T) Kết quả là có 52,1% đột biến ở codon 17 (A-T và 32,15% làđột biến Cd 41/42 (-TCTT) [9]

Dương Bá Trực và cộng sự nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sàng lọc thalassemia ở cộng đồng bằng xét nghiệm đo sức bền thẩm thấu hồng cầu và

β-đo thể tích trung bình hồng cầu (MCV) trên 664 người dân tộc Thái và Giấytại Lai Châu và Điện Biên Phương pháp đo sức bền thẩm thấu hồng cầu dễdàng thực hiện tại tuyến cơ sở, không cần trang bị máy móc gì; lấy 20µl máucho vào dung dịch NaCl 0,35% và nhận định kết quả sau 5 phút Đo thể tíchtrung bình hồng cầu bằng máy tự động tổng phân tích tế bào máu Kết quả là

kỹ thuật đo sức bền thẩm thấu hồng cầu có thể sàng lọc được 80% ngườimang gen β-thalassemia và 53% người mang gen HbE; kỹ thuật đo MCV cóthể sàng lọc được tới 95% người mang gen β-thalassemia và 84% người manggen HbE [10]

Qamar-ur-Nisa và cộng sự nghiên cứu tại khoa Phụ sản - Bệnh viện Đạihọc Liaquat, Pakistan từ tháng 7 năm 2004 đến tháng 6 năm 2005: nghiên cứusàng lọc thalassemia nhẹ bằng điện di hemoglobin trên 200 phụ nữ có thai đếnkhám tại bệnh viện Kết quả là 8,5% phụ nữ có thai được chẩn đoán bịthalassemia nhẹ; 59% những nàv kết hôn cận huyết với anh em ho; môt phu

nữ đâ có con bi thalassemia; 17,6% những người chồng của họ mang genbệnh thalassemia Nghiên cứu này khuyến cáo sàng lọc thalassemia ở phụ nữ

có thai để phát hiện những trường hợp cặp vợ chồng mang gen bệnh - nguy cơcao con bị bệnh [21]

Ching-Tien Peng và cộng sự nghiên cứu chẩn đoán trước sinh bệnh Ilaiassemia và bệnh thalassemia và bệnh hemoglobin ở 1240 trường hợp thainghén có nguy cơ cao bị phù thai α thalassemia và bị β-thalassemia nặngtrong thời gian từ 1998 đến 2011 Trong số 1240 trường hợp này có 87% đượcchọc ối, 10% sinh thiết gai rau và 3% lấy máu cuống rốn Kết quả chẩn đoán trướcsinh là: 21,5% thai bị thalassemia nặng (bao gồm phù thai α-thalassemia, β-thalassemia nặng và Hb E/β-thalassemia); 50,2% thalassemia nhẹ và 28,3%

không bị thalassemia Từ năm 1993, Bộ y tế Đài Loan đã cho triển khai mộtchương trình sàng lọc phụ nữ cỏ thai để kiểm soát sự lan tràn của thalassemia,kết quả là từ năm 2003 có 4 năm không có người mắc mới thalassemia là năm

2003, 2004, 2007 và 2008 [22]

Theo Fucharoen s và cộng sự: ở vùng Đông Nam Á, thalassemia là bệnhkhá phổ biến Tỷ lệ người mang gen α-thalassemia tới 30-40% ở vùng BắcThái Lan và Lào; tỷ lệ người mang gen β- thalassemia khác nhau từ 1 đến 9%tùy từng vùng [23]

Nghiên cứu mới nhất của Phạm Thanh Loan và cộng sự năm 2013 cũngnhằm phát hiện đột biến gen gây bệnh β-thalassemia bằng kỹ thuậtMultiplex ARMS-PCR trên 56 bệnh nhân, đã phát hiện được: 39/52 (75%)

có đột biến gen β-globin với 9 loại đột biến khác nhau gồm: Đột biếnCd41/42 (-TCTT) và đột biến Cd17 (A>T) gặp với tần suất cao nhất:30,4% và 21,4% Đột biến Cd 95 (+A) và đột biến IVS II-654 (C>T) có tỷ

lệ thấp nhất 1,8% Đột biến Cd26(G>A) gây thể HbE gặp với tỷ lệ 17,8%.5/39 (12,8%) trường hợp có kiểu gen đồng hợp tử, 17/39 (43,6%) trườnghợp dị hợp tử kép, 17/39 (43,6%) trường hợp dị hợp tử đơn [24]

Các nghiên cứu về căn bệnh này trên thế giới cũng như trong nước mớichỉ tập trung chủ yếu vào tỉ lệ mắc bệnh, đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng,những tác động tâm lý của bệnh đối với bệnh nhân, đã chú ý đến vấn đề tầmsoát bệnh nhưng mới chỉ dừng lại ở nhóm đối tượng là phụ nữ mang thai vàthai nhi Như vậy còn để ngỏ việc ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tửtrong việc phân tích, xác định đột biến gen β-globin ở người lành mang gen,thành viên gia đình bệnh nhân

Với các kiểu đột biến đa dạng phong phú trên gen β-globin thì việc xâydựng một quy trình phát hiện người lành mang gen bệnh, chẩn đoán trước

sinh, tư vấn di truyền sẽ giúp ngăn ngừa và giảm tỷ lệ mắc bệnh, cung cấpliệu pháp điều trị tối ưu, chế độ chăm sóc tốt hơn cho từng bệnh nhân sẽ giảmgánh nặng về kinh tế cho gia đình người bệnh cũng như toàn xã hội.

Dịch tễ học

Trên thế giới

β- thalassemia là một trong những bệnh huyết sắc tố phổ biến nhất, phân

bố khắp thế giới, sự phân bố bệnh và tần số có liên quan chặt chẽ đến nguồngốc dân tộc, sự di cư và tập quán kết hôn Bệnh phát hiện ra ở nhiều nước trênthế giới, chủ yếu ở vùng Địa Trung Hải, Trung Đông, Cận Đông, Viễn Đông,Bắc Phi, Đông Nam Á [25] Theo ước tính của WHO (1981), có tới 241 triệungười mang gen bệnh β-thalassemia trên thế giới, riêng châu Á có khoảng 60triệu người mang gen bệnh β-thalassemia, Châu Âu là 4800 người, ở Bắc Phikhoảng 2577 người [26]

Các nghiên cứu về tần suất mắc bệnh ở các nuớc châu Á cũng như ÐôngNam Á cho thấy tỷ lệ mắc bệnh Thalassemia phân bố khá phổ biến với 3-10%

số dân Ở Lào tỷ lệ người mắc bệnh β-thalassemia là 9,6% dân số, ở Thái Lan

là 6% dân số, ở Campuchia tần số cũng khá cao [27]

Cũng theo WHO (2008) hàng năm số trẻ mới đẻ bị thalassemia thể nặngước tính vào khoảng 300.000 người [28] Người ta ước tính khoảng 95% trẻ

em sinh ra bị β-thalassemia trong hai thập kỷ tới ở những vùng như châu Á,

Ấn Độ và Trung Đông, một số lượng lớn những trẻ em này có liên hợp vớiHemoglobin E [29], [30], [31]

Ở Việt Nam

Các công trình nghiên cứu cho đến nay đều thống nhất bệnh Hb pháthiện thấy là α-thalassemia, β-thalassemia và HbE Bệnh β-thalassemia pháthiện thấy ở tất cả các tỉnh trong cả nước, gặp nhiều ở người dân tộc ít người ởmiền Bắc, người Mường 25%, người Thái 16,6%, người Nùng 7,1% [14]

Một nghiên cứu gần đây nhất của Nguyễn Thanh Liêm và cộng sự (2009) khikhảo sát bệnh thalassemia ở nhóm người dân tộc Mường, huyện Kim Bôi,tỉnh Hòa Bình cho thấy bệnh β-thalassemia rất phổ biến với tần suất là10,67% [32].

Từ năm 1963 đến 1982, Bạch Quốc Tuyên và cộng sự nghiên cứu 415bệnh nhân bị bệnh hemoglobin tại bệnh viện Bạch Mai và cho thấy bệnhhemoglobin khá phổ biến tại Việt Nam, phân bố khắp các địa phương ở trong

cả nước, hai bệnh phổ biến là β- thalassemia và HbE, trong đó β-thalassemiachiếm 91,8% các trường hợp bệnh hemoglobin [33]

1.1.6 Chẩn đoán và điều trị bệnh β-thalassemia

Chẩn đoán xác định

Vì bệnh β-thalassemia được truyền từ cha mẹ cho trẻ thông qua các gen.Những nghiên cứu di truyển liên quan đến bệnh sử gia đình và các xét nghiệmmáu sẽ cho biết bất kỳ thành viên gia đình đã bị đột biến gen globin

Bệnh β-thalassemia được chẩn đoán bằng lâm sàng và xét nghiệm thôngthường mà còn được chẩn đoán bằng xét nghiệm sinh học phân tử

Các xét nghiệm này cho phép chẩn đoán chính xác người mang bệnh ởbất cứ lúc nào, ngay cả khi đang còn là bào thai cho đến khi mới sinh ra

- Trước sinh: Để tìm hiểu xem bào thai đó có bị thiếu máu và xác địnhmức độ nghiêm trọng của bệnh Các xét nghiệm được sử dụng gồm:

Lấy mẫu sinh thiết gai màng đệm: Khoảng tuần thứ 11 của thai kỳ

Chọc ối xét nghiệm: Thực hiện khoảng tuần thứ 14 của thai kỳ Lấy mẫu máu của thai nhi: thực hiện sau 18 tuần tuổi thai

- Sau sinh: Chẩn đoán ngay bằng lâm sàng và được khẳng định bằng xétnghiệm máu để xác định biến đổi cấu trúc của gen hemoglobin

Phân loại bệnh theo mức độ biểu hiện lâm sàng

Trên lâm sàng bệnh thường biểu hiện ở 3 mức độ, nặng, trung bình vànhẹ tương ứng với 3 thể bệnh

 Ở mức độ nặng hay gặp thể nặng (bệnh Cooley), là thể đồng hợp tử.

Kiểu gen: β+/β+, β0/β0

Người bệnh bị thiếu máu nặng, xanh xao, da và vùng mắt vàng, chậmphát triển thế chất, sốt tiêu chảy và các rối loạn tiêu hóa khác Trẻ thường cóbiểu hiện của biến chứng nặng như biến dạng xướng, hộp sọ to, bướu tránh,bướu đỉnh, hai gò má cao, mũi Nếu được truyền máu đầy đủ trẻ có thể pháttriển bình thường đến khoảng 10 tuổi, thường có mũi tẹt, lách to, gan to, sỏimật, dậy thì sớm

Công thức máu: Hb: 3 - 5 g/dl; MCV giảm; Hồng cầu nhỏ, hồng cầu hìnhbia; MCH giảm, nhược sắc; Fe huyết thanh, ferritin tăng X quang sọ: Tủy rộng,hình bàn chải

Điện di Hb: HbF 20 - 100%, HbA10 - 80%, HbA2 2 - 7%

Hình 1.4: Bệnh nhân β-thalassemia với biểu hiện biến dạng xương

(nguồn: vtv.vn)

 Ở mức độ trung bình hay gặp thể trung gian (intermediate): Kiểu gen

có thể là đồng hợp tử, dị hợp tử hay thể phối hợp (β0/β0, β+/β+, β0/β+, β+/β,

β0/β) Biểu hiện thiếu máu xuất hiện muộn hơn khoảng 4 – 6 tuổi trẻ mới cầntruyền máu Tuy nhiên, nếu không điều trị đầy đủ và kịp thời, người bệnh sẽgặp phải những biến chứng như lách to, gan, sỏi mật, sạm da… Đến độ tuổitrung niên sẽ có biểu hện đái tháo đường, suy tim, sơ gan

CTM: Hb 7 - 10g/dl; MCV: 50 - 70fl; MCH: 20 - 22pg; HC nhỏ, nhượcsắc Điện di Hb: HbF, HbA1 20 - 80%; HbA2 2-7%

 Mức độ nhẹ thường thấy ở thể nhẹ (minor) hay còn gọi là thể dị hợp

tử, thường người mang gen bệnh thường không có biểu hiện gì đặc biệt ở lâmsàng Chỉ vào những thời kỳ cơ thể có nhu cầu tăng về máu như phụ nữ khimang thai, kinh nguyệt nhiều lúc đó mới thấy biểu hiện mệt mỏi, da xanh, nếulàm xét nghiệm thì sẽ thấy lượng huyết sắc tố giảm (Hb 90 - 110g/l)

Tăng số lượng hồng cầu, hồng cầu nhỏ, nhược sắc, có hồng cầu hình bia,MCV thấp Điện di Hb: HbF tăng nhưng không quá 10%; HbA2 tăng (>3,5%)

Hình 1.5 Hồng cầu trong máu ngoại vi của bệnh nhân thalassemia

Hồng cầu thay đổi hình thái: hồng cầu nhược sắc, hồng cầu nhỏ,

hồng cầu hình giọt nước, hồng cầu hình bia (nguồn: vtv.vn)

* Ngoài ra còn có một thể phối hợp: Bệnh β- thalassemia /Hb E, là thể khá

nặng, trên chuỗi β-globin, acid amin thứ 26 Glutamin được thay bằng Thường gặp ở Việt Nam và các nước Đông Nam Á

lysin-Xuất hiện từ 6 tháng tuổi nhưng mức độ tán huyết và số lần nhẹ hơn thalassemia thể nặng Bệnh nhân thường nhập viện lúc đi học, thiếu máu, ganlách to, biến dạng xương sọ mặt

β-CTM: hồng cầu nhỏ, nhược sắc Điện di: Hb F, Hb E cao, HbA 5,5 - 7,7%

Điều trị bệnh β-thalassemia

β-thalassemia thể nhẹ không cần điều trị đặc hiệu β-thalassemia thểtrung gian có thể được truyền máu khi có thiếu máu nặng.β-thalassemia thểnặng có thiếu máu nặng phải truyền máu thường xuyên đảm bảo duy trì nồng

độ huyết sắc tố để trẻ phát triển bình thường, cần kết hợp với dùng thuốc thảisắt Ngoài ra cần sử dụng một số thuốc điều trị hỗ trợ như kích thích sinh tổnghợp HbF, chống oxy hóa và chống gốc tự do Ghép tủy từ người cho phù hợpHLA là biện pháp được cho là điều trị khỏi β-thalassemia thể nặng

Liệu pháp gen là một biện pháp đang được nghiên cứu, mục tiêu là gắngen HBB bình thường vào tế bào nguồn và sử dụng tế bào nguồn này để ghéptủy xương cho bệnh nhân [34]

1.2 DI TRUYỀN HỌC BỆNH β-THALASSEMIA

β- thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, tần số vàkhả năng mắc bệnh là giống nhau ở cả hai giới nam và nữ

Đặc điểm di truyền của bệnh thalassemia:

Nếu 2 người bị bệnh mức độ nhẹ có kiểu gen dị hợp tử với một đột biếnkết hôn với nhau: khi sinh con có 25% khả năng bị bệnh thalassemia mức độnặng do nhận cả 2 gen của bố và mẹ truyền cho, 50% khả năng con bị bệnh

mức độ nhẹ hoặc là người mang gen bệnh của bố hoặc của mẹ truyền cho,25% khả năng con bình thường

Hình 1.6 Sơ đồ cơ chế di truyền bệnh β-thalassemia khi bố và mẹ mang

gen dị hợp tử với một đột biến

Bảng 1.2 Kiểu gen bố mẹ và tỉ lệ bị bệnh ở thế hệ con [35]

Genotype và phenotype của

cha mẹ Tần số con với các genotype khác nhau

1.3 GEN MÃ HÓA VÀ ĐỘT BIẾN GEN Β-GLOBIN GÂY BỆNH THALASSEMIA

β-1.3.1 Vị trí và cấu trúc gen HBB

Gen mã hóa cho sự tổng hợp chuỗi β của phân tử globin là gen HBB(Hemoglobin beta) còn gọi là gen β-globin, nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể

11 (11p15.5), chứa các gen được sắp xếp theo trình tự 5’-ε-Gγ-Aγ-ψβ-δ-β-3’.

Các gen được biểu hiện theo đúng trình tự phát triển Vùng điều hòa chính,được gọi là vùng điều khiển Là vùng điều hòa sự biểu hiện của tất cả các gen.(gene ID:NC_000011.9) [36]

Hình 1.7 Mô hình cấu trúc của gen HBB [35]

E-I, EII, E-III là các exon 1, exon 2, exon 3 của gen HBB; 1-30, 31-104, 105-146 là

vị trí các axit amin tương ứng của các exon 1, exon 2, exon 3 trên gen HBB

Gen HBB có chiều dài 1606 bp mã hóa cho 146 acid amin Gồm 3 exon

và 2 intron Vùng promoter hay vùng 5 (vùng điều khiển) có trình tự đặc hiệu

để gắn với enzym RNA polymerase và các yếu tố phiên mã Promoter có chứcnăng kiểm soát hoạt động phiên mã củagen Trong cấu trúc của gen HBB,vùng promoter kéo dài từ vị trí -95 đến vị trí -26 của gen (nghĩa là nằm trước

TA TA

TA TA

vị trí của mã mở đầu mã hóa Methionin 95 và 26 nucleotid), các trình tự đặchiệu như hộp TATA (ở vị trí -28 đến vị trí -31), hộp CCAAT (vị trí -35 đến vịtrí -76) giúp các ribosom nhận biết đúng vị trí khởi đầu dịch mã trên trong quátrình dịch mã, làm tăng hiệu quả phiên mã.

Điểm khởi đầu phiên mã có trình tự amino acid ACATTTG, đây là vị trígắn của phân tử 7 methylguanosin để tạo mũ đầu 5’ phân tử mRNA Mũ làyếu tố cần thiếu cho các ribosom nhận biết sự khởi đầu dịch mã và tránh chomRNA không bị phân hủy bởi các ribonuclease

Bộ ba mở đầu là ATG (sẽ phiên mã thành AUG ở mRNA), định vị saukhi khởi đầu phiên mã 50 cặp base Đoạn 50 cặp base xen giữa điểm khởi đầuphiên mã và bộ ba mở đầu là vùng không dịch mã, gọi là vùng 5’ UTR

Exon thứ nhất gồm 90 cặp base, mã hóa cho acid amin 1-30 của β-globin.Intron thứ nhất gồm 130 cặp base Cấu trúc của intron này rất quan trọnggiúp hoàn thiện phân tử tiền mRNA thành mRNA trưởng thành và đi ra bàotương để tổng hợp protein.Exon thứ hai gồm 222 cặp base, mã hóa cho acidamin 31-104.Intron thứ hai gồm 850 cặp base Exon thứ ba gồm 126 cặp base,

mã hóa cho acid amin 105-146 của HBB Bộ ba kết thúc là TAA, bộ ba này đượcphiên mã thành UAA ở phân tử mRNA Ribosom sẽ tách ra tại vị trí này, phân tửprotein được giải phóng Vùng không dịch mã 3’ (3’ UTR) mặc dù được phiên

mã nhưng không được dịch mã trong cấu trức của protein Có trình tựnucleotid là AATAAA, là vị trí gắn đuôi poly A (gồm khoảng 200 đến 300phân tử adenyl) để hoàn thiện phân tử mRNA Quá trình này giúp mRNA dichuyển ra bào tương tham gia quá trình sinh tổng hợp protein

Hình 1.8 Quá trình tổng hợp phân tử β-globin của gen HBB [37] 1.3.2 Các đột biến gây bệnh

Hầu hết các trường hợp thalassemia là do đột biến điểm trên gen globin, làm ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp mạch globin [35] Mất hoặc thêmmột hay vài nucleotid vào một điểm nào đó hoặc thay thế một nucleotid nàybằng một nucleotid khác Các đột biến được chia thành 2 nhóm: Nhóm gây β0-thalassemia và nhóm gây β+-thalassemia Nếu gen β-globin tổn thương mấthoàn toàn khả năng chỉ đạo tổng hợp chuỗi β sẽ gây β0-thalassemia Nếu gen β-globin tổn thương làm giảm tốc độ tổng hợp chuỗi β gọi là β+-thalassemia Tổnthương ở những vị trí khác nhau sẽ đưa đến những thể bệnh khác nhau

β-Bảng 1.3 Một số kiểu đột biến gây β 0 , β + -thalassemia

và các biến thể hemoglobin [38]

Đột biến gây β 0 -thalassemia

Codon 5(-CT) Codon 26(G>T) Codon 51(-C) IVSI-1(G>A) Codon 6(-A) Codon 27/28(+C) Codon 67(-TG) IVSI-1G>T)

Codon 8(-AA) Codon30 (G>C) Codon 71/72(+A) IVSI-2(T>A) Codon 8/9(+G) Codon 36/37(-T) Codon 95(+A) IVSI-2(T>C) Codon 14/15(+G) Codon 37(G>A) Codon 106/107(+G) IVSII-1(G>A) Codon15(G>A)

GG0GgGAGA

Codon 39 (C>T) (0) Codon 121(G>T) IVSII-849(A>G)Codon15(G>A) Codon 41/42(-TCTT) Codon 11 (-T) IVSII-850(G>T) Codon 16(-C) Codon 43(G>T) Codon 15(-T)

Codon 17(A>T) Codon 44(-C)

Đột biến gây β + -thalassemia

-90(C>T) -28(A>C) IVSI-5(G>C) IVSII-654(C>T)

-88(C>T) -28(A>G) IVSI-5(G>A) IVSII-745(C>G) -87(C>G) Codon 24(T>A) IVSI-6(T>C) Poly A(T>C) -30(T>A) Codon 27(G>T) IVSI-110(G>A) PolyA(A>G) -29(A>G) Codon 29(C>T) IVSII-848(C>A)

Codon: Bộ ba mã hóa; IVS: đột biến ở vùng intron (vùng không mã hóa gen); -28A>C: trước

vị trí bắt đầu phiên mã 28 nucleotid A>C; codon 5(-CT): Đột biến mất nucleotid CT tại

codon 5; codon 8/9 (+G) đột biến thêm nucleotid G ở giữa codon 8 và 9;

Chữ màu đỏ là các đột biến phổ biến tại Việt Nam.

Các đột biến ở vùng khởi động do thay thế nucleotid tại vị trí hộp TATAhoặc CCAAT dẫn đến làm giảm tổng hợp chuỗi β-globin, chỉ còn 10% so vớibình thường gây β+-thalassemia Ở Việt nam và các nước Đông Nam Á, đột biếnđiểm tại vị trí -28 A> G chiếm một tỷ lệ cao (khoảng 7.3%) [27], [39]

Đột biến thay thế ở một số bộ ba mã hóa làm thành mã kết thúc UAA,UAG, hay UGA, không tạo mRNA đầy đủ nên không tổng hợp được chuỗiglobin β, gây β0-thalassemia Ở Việt Nam, thường gặp nhất đột biến codon 17của exon 1 gây acid amin lysine chuyển thành thymine.Khi đó, codon 17 là5’AAG 3(bình thường mã hóa acid amin lysine) bị chuyển thành TAG, đượcphiên mã thành UAG ở mRNA là bộ ba kết thúc.Việc dịch mã kết thúc xuất

hiện sớm hơn bình thường là tạo ra sản phẩm β-globin không hoàn thiện, bịphá hủy ngay trong tế bào [40].

Đột biến thêm hoặc mất một hay vài nucleotid làm lệch khung dịch mãdẫn đến thay đổi toàn bộ mã di truyền từ vị trí đột biến, tạo chuỗi polipeptidehoàn toàn khác gây thể β0- thalassemia Ở nước ta đột biến mất 4 nucleotid (-TCTT) tại vị trí codon 41/42 chiếm tỷ lệ cao nhất (35 - 45%) trong tất cả cácđột biến gây bệnh β-thalassemia Bất thường thêm Adenin ở codon 95 hoặc tạicodon 71/72 cũng được phát hiện [41]

Kiểu thalassemia này rất hay gặp ở Trung Quốc và đã được phát hiện ởkhắp Châu Á, nó chiếm khoảng 8,5% các trường hợp thalassemia [30] Cácđột biến ở đoạn đầu hay đoạn cuối sao chép làm rối loạn quá trình sao chépmRNA, gây giảm tốc độ tổng hợp chuỗi β gây β+-thalassemia

Các đột biến vùng intron: đột biến tại những đoạn tín hiệu cắt nối(splicing site) khá phổ biến Quá trình cắt các intron và nối các exon để hoànthiện phân tử mRNA đòi hỏi các trình tự đặc hiệu ở hai đầu của các intron: Vịtrí cho nối GT (donor site) ở đầu 5’ và vị trí nhận nối AG (acceptor site) ở đầu3’ Đột biến ở hai vị trí này sẽ gây cản trở nối các exon và không tạo mRNA,kết quả là không tạo được chuỗi β-globin và thể bệnh β-thalassemia Ở miềnNam nước ta, đột biến tại nucleotid thứ nhất của intron 1: G>T chiếm khoảng4-6% [42] Các đột biến tại vị trí khác của intron dẫn đến giảm khả năng nốiRNA chính xác làm chậm quá trình chín của mRNA nhưng còn tổng hợpđược chuỗi β-globin sẽ gây β+-thalassemia Ví dụ: đột biến IVSII-654(C>T)

dẫn đến việc sản xuất ra một mRNA bất thường có chiếu dài khoảng 80 base.Kiểu đột biến này được xếp vào nhóm β+-thalassemia nhưng các cá thể có độtbiến thường thể hiện các triệu chứng giống β0-thalassemia [32]

Đột biến tại vị trí gắn đuôi poly A: Bất thường tại vị trí gắn đuôi sẽlàm giảm tổng hợp chuỗi β và gây β+-thalassemia Ở Việt Nam, đột biếntrình tự gắn đuôi AATAAA thành AACAAA được phát hiện bằng kỹ thuật

giải trình tự gen Đến nay có khoảng trên 200 loại đột biến trên gen β-globingây bệnh β-thalassemia đã được xác định trên thế giới, trong đó phổ biến nhất

là 5 loại đột biến: Cd 41/42(-TCTT), Cd 17(A>T), nt-28(A>G), IVS II-654 (C>T), và IVS I-5 (G>C), chiếm trên 80% trong tổng số các loại đột biến

được phát hiện [18] Ở Việt Nam, theo Trần Minh Hiếu, M.L Saovaros Svasticho thấy có 8 đột biến thường gặp trên gen β-globin, gặp ở khoảng trên 95%

các trường hợp β-thalassemia, gồm:Cd17 (AAG>TAG), Cd41/42 (-TCTT), -28

(A>G), Cd71/72 (+A), IVS1-1 (G>T), IVS1-5 (G>C), IVS2-654 (C>T), Cd26 (GAG>AAG) gây bệnh (HbE), là một thể β-thalassemia đặc biệt [2].

1.4 MỘT SỐ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN

Ngày nay, có nhiều phương pháp giúp xác định các loại đột biến gâybệnh β-thalassemia: Phương pháp sequencing (giải trình tự gen), ASO (Allele– specific oligonucleotid hybridization: Lai các đoạn nucleotid đặc hiệu alen),ARMS (Amplification refractory mutation system: Hệ thống khuếch đại độtbiến bền với nhiệt), ASP (Allele- specific PCR: phản ứng khuếch dại chuỗiđặc hiệu alen), RFLP (Restriction fragment length polymorphism: Kỹ thuật

đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn), SSCP (Single-strand conformationpolymorphism: Kỹ thuật đa hình thái các đoạn đơn), DGGE (Denaturinggradient gel electrophoresis: Kỹ thuật điện di trên gel theo gradient biến tính),TTG (Temporal temperature gel electrophoresis: Kỹ thuật điện di trên gel phụthuộc nhiệt độ và thời gian) [43] Trong đó, ARMS là phương pháp có độnhạy cao, kỹ thuật đơn giản và giá thành rẻ [37] Kỹ thuật ARMS cũng đãđược nghiên cứu ứng dụng vào chẩn đoán đột biến gen gây β-thalassemia tạiViệt Nam, tuy nhiên vẫn đang trong giai đoạn nghiên cứu và chưa được triểnkhai rộng rãi Mặc dù chi phí cho từng phản ứng ARMS-PCR thấp, nhưng nếukhảo sát lần lượt từng alen đột biến cho các trường hợp thì có thể phải sử dụngđến 8 phản ứng PCR cho mỗi bệnh nhân Quy trình này tiêu hao nhiều nguyên

vật liệu, rất mất thời gian và công lao động Do vậy, sử dụng quy trình sàng lọcalen đột biến bằng phương pháp multiplex ARMS-PCR và chẩn đoán xác địnhlại các alen dương tính bằng ARMS-PCR sẽ khắc phục được các nhược điểmnêu trên Về cơ bản, các phương pháp trên đều dựa trên cơ sở khuếch đại đoạngen nghi ngờ mang gen đột biến bằng kỹ thuật PCR Năm 2013, Phạm ThanhLoan và cộng sự đã sử dung phương pháp Multiplex ARMS-PCR để xác địnhmột số đột biến phổ biến trên gen β-globin và kiểu gen ở bệnh nhân bị bệnh β-thalassemia [24].

1.4.1 Kỹ thuật PCR

Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tínhcủa DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNApolymerase.Với nguyên liệu là bốn loại nucleotid, enzym DNA polymerasexúc tác sự tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn Phản ứng đòihỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầucủa trình tự DNA khuôn Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếpnhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước:

- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation) Trong một dung dịch

phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNAđược biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử,thường là 94oC - 95oC trong vòng 30-60 giây

- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ được hạ thấp cho

phép các mồi cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC - 70oC tuỳ thuộc

Tm của các mồi sử dụng và kéo dài 30 - 60 giây

- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ được

tăng lên 72oC để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất.

Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéodài từ 30 giây đến nhiều phút

Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng

để làm các DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo.Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằngkhoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xácđịnh bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi

Hình 1.9 Minh họa chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR [43]

Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn DNAban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ Sau mỗi chu kỳ sẽ làm tăng gấpđôi lượng mẫu của lần trước Như vậy sau n chu kỳ, từ một DNA đích đãnhân bản được thành 2n bản sao Nhờ vậy đủ số lượng DNA để có thể tách rakhi điện di và có thể phát hiện được sau khi nhuộm và để có thể tạo dònghoặc giải trình tự

Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, ở những chu kỳ sau lượngkhuôn tăng nhưng lượng mồi và dNTP (deoxyribonucleoside triphosphate)

tự do giảm, enzym DNA polymerase hoạt động yếu dần Do đó, cần tínhtoán hàm lượng mồi, dNTP và enzym để đảm bảo phản ứng PCR cho kếtquả tốt nhất [24]

1.4.2 Kỹ thuật ARMS (Amplification Refractoy Mutation System - Hệ thống khuếch đại các đột biến bền với nhiệt)

Hình 1.10 Minh họa kỹ thuật ARMS-PCR [43]

ĐHT: Đồng hợp tử; DHT: Dị hợp tử; ĐB: Đột biến; BT: bình thường; Mồi đột biến và mồi thường chỉ khác nhau tại một vị trí ở đầu 3’, khi đó sẽ chỉ khuếch đại alen tương ứng(mồi thường khuếch đại alen thường; mồi đột biến khuếch đại alen đột biến) giếng 1,2: Ở người bình thường không có alen đột biến, do vậy sẽ chỉ có sản phẩm khuếch đại của mồi thường (giếng 1), mồi đột biến không có sản phẩm (giếng 2); giếng 3,4: Ở cơ thể dị hợp tử mang cả alen thường và alen đột biến sẽ có sản phẩm khuếch đại của cả 2 loại mồi, khi điện di sẽ thấy xuất hiện

cả 2 băng tương ứng; giếng 5,6: Ở cơ thể đồng hợp tử alen đột biến, sẽ chỉ có sản phẩm khuếch đại của mồi đột biến (giếng 6), mồi bình thường không có sản phẩm (giếng 5).

Nguyên tắc của ARMS dựa trên sự khác biệt về các nucleotid của mồi ởđầu 3’ thiết kế cho các alen khác nhau Chính vì vậy, ARMS còn có một số tên

gọi khác nhau căn cứ vào bản chất của kỹ thuật như: PCR đặc hiệu alen (allelespecific PCR-ASP), khuếch đại PCR của các alen đặc hiệu (PCR amplification

of specific alleles-PASA) hay khuếch đại alen đặc hiệu (allele specificamplification-ASA) Kỹ thuật này được sử dụng trong trường hợp có nhiềucấu trúc đa hình thái, dòng tế bào mầm, các đột biến ở tế bào soma, xác địnhtình trạng mang gen, chẩn đoán trước sinh bệnh lý di truyền và phát hiện cácbiểu hiện bệnh trong và sau quá trình điều trị ung thư [18]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nhóm đối chứng: Chọn 5 đối tượng khỏe mạnh, không mắc bệnh gì

về máu

Tiêu chuẩn lựa chọn: Đối tượng không có biểu hiện triệu chứng thiếumáu trên lâm sàng cũng như cận lâm sàng

2.1.2 Nhóm nghiên cứu: 27 gia đình bệnh nhân đã được xác định đột biến

gen β globin gây bệnh β-thalassemia tại khoa huyết học truyền máu, bệnhviện Bạch Mai Dự kiến mỗi gia đình gồm các thành viên như bố, mẹ, anh, chị,

em ruột của bệnh nhân đã được xác định có đột biến điểm gen β-globin

Tiêu chuẩn loại trừ:

 Đối tượng mắc thiếu máu tán huyết do nguyên nhân khác

 Đối tượng có mắc thêm bệnh cấp tính khác

 Đối tượng không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.2 DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 2.2.1 Dụng cụ và máy móc

 Máy luân nhiệt PCR Vapo Protect-hãng Eppendorf

 Máy đo OD Nano Drop

 Máy điện di ngang Thermo scientific

 Máy soi gel và chụp ảnh tự động UVP- EC3 Imaging system

 Máy li tâm lạnh: Centrifuge 5424R

 Máy spindown: E-centrifuge

 Thạch điện di (electrophoresis agarose).

 Dung dịch đệm điện di TAE

 Ethidium bromide

 Marker

 Nitơ lỏng hoặc đá khô

 Dung dịch đệm giải trình tự 10x

2.3 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 02/2014 đến tháng 8/2014

 Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đạihọc Y Hà Nội

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Mô hình nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu phát hiện người lành mang

gen bệnh β-thalassemia 2.4.2 Nội dung nghiên cứu

Lựa chọn bệnh nhân β-thalassemia đã xác định đột biến gen β-globin.

- Xây dựng bệnh án và lập phả hệ gia đình.

- Thu thập mẫu máu của nhóm người nhà bệnh nhân β-thalassemia

Phát hiện người lành mang gen bệnh trên các thành viên gia đình người bệnh và các đối tượng liên quan.

- Tách chiết DNA từ mẫu máu người nhà bệnh nhân β-thalassemia

- Đo mật độ quang (OD) xác định độ tinh sạch và nồng độ

- Đột biến được xác định kiểu gen bằng kỹ thuật ARMS-PCR

- Giải trình tự một số trường hợp để kiểm tra

2.4.3 Kỹ thuật nghiên cứu

mà có sự khác biệt về trình tự nucleotid giữa các alen Như vậy, trong trườnghợp để phát hiện đột biến điểm, phản ứng ARMS-PCR sẽ sử dụng 2 loại mồiđặc hiệu là mồi đột biến (khuếch đại đoạn gen đột biến), và mồi bình thường(khuếch đại đoạn gen bình thường) cùng với một mồi chung ngược chiều vớicặp mồi trên 2 mồi này chỉ khác nhau tại điểm đột biến ở đầu 3’ của mồi.Cácsản phẩm tạo thành sẽ được phân tích bằng điện di trên gel agarose

2.4.3.2 Các cặp mồi sử dụng trong ARMS-PCR

Mồi sử dụng trong nghiên cứu là các mồi thường (kí hiệu: BT) và mồiđột biến (kí hiệu: ĐB) tương ứng với 9 loại đột biến đã xác định được trênbệnh nhân Đây là 9 loại đột biến gây bệnh β-thalassemia và đột biến gâybệnh HbE phổ biến ở Việt Nam đã được công bố bao gồm Codon 41/42(-TCTT), Codon 17 (A>T), Codon 71/72 (+A), IVS I-1(G>T), nt-28(A>G),IVSII-654 (C>T), IVS I-5 (G>C), Codon 95 (+A) và Codon 26(A>G) Thànhphần và trình tự các mồi được trình bày ở bảng 2.1

Hình 2.2: Minh họa các mồi và vị trí gắn trên gen β-globin sử dụng trong

ARMS-PCR

Mồi chung B được sử dụng cùng mồi đặc hiệu đột biến IVS II-654; mồi chung H được sử dụng cùng mồi đặc hiệu đột biến Cd26 Các mồi đặc hiệu còn lại có cùng mồi chung E

Bảng 2.1: Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu

Tên mồi Trình tự mồi (từ 5’3’) chung Mồi

Kích thước sp (bp) Mồi chung E 5’ TGAAGTCCAACTCCTAAGCCAGTG 3’

Cd 71/72 (+A)

ĐB: 5’GGTTGTCCAGGTGAGCCAGGCCATCAGTT 3’

E

596 BT: 5’GGTTGTCCAGGTGAGCCAGGCCATCAGTC3’

Cd17(A>T)-ngược

ĐB: 5’CTCACCACCAACTTCATCCACGTTCAGCTA 3’

303 BT: 5’CTCACCACCAACTTCATCCACGTTCAGCTT 3’

Chu trình nhiệt của phản ứng:

Sản phẩm của phản ứng PCR với mồi bình thường và mồi đột biếnđược điện di song song để xác định kiểu gen của các alen đột biến là đồnghợp tử hay dị hợp tử

2.5 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ

- Kết quả ARMS cho biết kiểu gen của các alen đột biến là đồng hợp tửhay dị hợp tử

- Kết quả được kiểm tra lại bằng giải trình tự gen

- Phân loại các mẫu kết quả đột biến theo nhóm

- Kết quả được trình bày dạng tỷ lệ phần trăm