XÁC ĐỊNH đột BIẾN GEN KCNJ11 gây BỆNH đái THÁO ĐƯỜNG TRÊN TRẺ sơ SINH

Nguyên nhân của đái tháo đường sơ sinh do di truyền đột biến trội hoặclặn trên NST thường, gây ảnh hưởng lên quá trình bài tiết insulin, làm giảmtác động hoặc thiếu hụt insulin.. Từ thực

NGUYỄN THỊ THU GIANG

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN KCNJ11

GÂY BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TRÊN TRẺ SƠ SINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

KHÓA 2013 - 2017

HÀ NỘI – 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU GIANG

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN KCNJ11

GÂY BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TRÊN TRẺ SƠ SINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

KHÓA 2013 - 2017

Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Huy Thịnh

HÀ NỘI – 2017

vực nào trong cuộc sống Là một sinh viên y còn nhiều bỡ ngỡ khi lần đầutiên tiến hành làm nghiên cứu, em thật may mắn khi nhận được sự giúp đỡnhiệt tình của các thầy, cô, anh chị, bạn bè và gia đình luôn bên cạnh, giúp emhoàn thành khóa luận và chỉ bảo cho em nhiều điều.

Với tất cả lòng kính trọng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.

Nguyễn Huy Thịnh – Phó chủ nhiệm bộ môn Hóa sinh – Trường Đại học Y

Hà Nội, người thầy kính mến đã dìu dắt, cho em phương hướng thực hiệnnghiên cứu cũng như chỉ bảo tận tình giúp em hoàn thiện được khóa luận

Với niềm yêu mến và biết ơn từ tận đáy lòng, em xin gửi lời cảm ơn tới

CN Nguyễn Quý Hoài, người thầy và cũng là người chị, lúc nào cũng tận

tâm, tỉ mỉ, hết lòng vì chúng em, dù cho đó là lúc đêm khuya hay lúc sángsớm Cảm ơn chị, người đã truyền thêm ngọn lửa yêu nghề, yêu nghiên cứutrong em

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị làm việc tạiTrung tâm Gen – Protein, đã luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp em có thểhoàn thành khóa luận này

Và cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến bố mẹ, đã luôn là hậu phươngvững chắc, truyền cho con tình yêu, sức mạnh và niềm tin bước đi trên conđường mà con đã chọn

CHỮ VIẾT TẮT

ĐTĐSS: Đái tháo đường sơ sinh

DNA: Deoxyribonucleic acid

RNA: Ribonucleic acid

KCNJ11: Potassium inwardly-rectifying channel, subfamily J, member 11Kb: Kilo base

Bp: Base pair

SNP: Single nucleotid polymorphism

NCBI: National Center for Biotechnology Information

dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate

ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate

EDTA: Ethylendiamin Tetraacetic Acid

PCR: Polymerase chain reaction

PCI: Phenol Chloroform Isoamyl

A: Adenin

C: Cytosine

G: Guanin

T: Thymine

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đôi nét về bệnh đái tháo đường sơ sinh 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Triệu chứng lâm sàng 4

1.2 Gen KCNJ11 và cơ chế gây bệnh đái tháo đường sơ sinh 5

1.2.1 Sự bài tiết insulin 5

1.2.2 Kênh K-ATP 9

1.3 Gen KCNJ11 11

1.3.1 Cấu tạo, vị trí 11

1.3.2 Chức năng 11

1.3.3 Một số đột biến/snp đã được tìm thấy trên KCNJ11 và ảnh hưởng của chúng đến ĐTĐSS 12

1.3.5 Các kĩ thuật phát hiện đột biến gen KCNJ11 17

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Phương tiện nghiên cứu 23

2.2.1 Trang thiết bị nghiên cứu 23

2.2.2 Dụng cụ nghiên cứu 23

2.2.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 25

2.3.2 Quy trình lấy mẫu và bảo quản mẫu 25

2.3.3 Quy trình tách chiết DNA từ máu toàn phần 25

2.3.4 Quy trình khuếch đại gen KCNJ11 bằng phản ứng PCR 28

2.3.5 Giải trình tự gen KCNJ11 32

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1 Kết quả tách chiết DNA 35

3.1.1 Kết quả đo OD 35

3.1.2 Kết quả điện di DNA tổng số 36

3.2 Kết quả khuếch đại gen KCNJ11 bằng phản ứng PCR 37

3.2.1 Kết quả tối ưu hóa quy trình PCR 37

3.2.2 Kết quả sản phẩm PCR 39

3.3 Kết quả giải trình tự gen xác định đột biến gen KCNJ11 40

Chương 4: BÀN LUẬN 44

4.1 Kết quả tách chiết DNA 44

4.2 Kết quả khuếch đại gen KCNJ11 45

4.2.1 Kết quả tối ưu quy trình PCR 45

4.2.2 Kết quả khuếch đại gen KCNJ11 46

4.3 Kết quả giải trình tự gen phát hiện đột biến trên gen KCNJ11 47

4.4 So sánh kết quả thu được với các nghiên cứu khác 48

KẾT LUẬN 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

công bố 12

Bảng 1.2 Các đa hình phổ biến của gen KCNJ11 17

Bảng 2.1 Trình tự mồi khuếch đại gen KCNJ11 29

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 30

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 31

Bảng 2.4 Thành phần mix giải trình tự 33

Bảng 3.1 Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết từ máu ngoại vi của bệnh nhân 35

Bảng 3.2 Các kiểu đột biến và đa hình gen KCNJ11 được phát hiện trên ba bệnh nhân ĐTĐSS 42

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử insulin 5

Hình 1.2 Hình ảnh vi thể một đảo tụy và các nang tuyến xung quanh 6

Hình 1.3 Cơ chế bài tiết insulin của tế bào β tuyến tụy 8

Hình 1.4 Cấu tạo kênh K-ATP 10

Hình 1.5 Vị trí gen KCNJ11 trên nhiễm sắc thể số 11 11

Hình 1.6 Chức năng gen KCNJ11 12

Hình 1.7 Một số vị trí acid amin do gen KCNJ11 mã hóa đã tìm thấy đột biến 14 Hình 1.8 Đột biến gen KCNJ11 làm kênh K-ATP không đóng lại khiến cho insulin không được bài tiết 15

Hình 1.9 Hỗn hợp các tiểu đơn vị hoang dã và đột biến của Kir6.1 16

Hình 1.10 Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR 19

Hình 1.11 Quy trình giải trình tự gen theo phương pháp ddNTP 20

Hình 1.12 Hình ảnh giải trình tự gen trên máy giải trình tự gen tự động 21

Hình 3.1 Kết quả đo OD của mẫu SS3 bằng máy Nanodrop 1000 35

Hình 3.2 Hình ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8% 36

Hình 3.3 Kết quả tối ưu hóa nồng độ mồi 37

Hình 3.4 Kết quả điện di tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi 38

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel 1,5% 39

Hình 3.6 Hình ảnh kết quả giải trình tự đoạn gen KCNJ11 của mẫu SS2 trong nhóm nghiên cứu 41

Hình 3.7 Kết quả giải trình tự của bệnh nhân SS2 có đột biến p.G53S (c.157G>A) 43

Hình 3.8 Kết quả giải trình tự của bệnh nhân SS1 có đa hình K23E 43

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đái tháo đường là một căn bệnh đã được biết đến từ lâu với định nghĩa làmột nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa cacbonhydrat, mỡ và protein khihormone insulin của tuyến tụy sản xuất bị thiếu hụt hay giảm tác động trong

cơ thể, biểu hiện bằng mức đường máu luôn cao

Đái tháo đường xảy ra chủ yếu trên người trưởng thành, tuy nhiên cũng

có thể xảy ra ở trẻ sơ sinh với tỉ lệ mắc bệnh hiếm, mức độ nguy hiểm cao donhững triệu chứng không điển hình, khó có thể phát hiện sớm do trẻ khi đóchỉ biết khóc Chính vì thế, trẻ thường vào viện trong tình trạng nguy kịch vàđược chẩn đoán muộn

Nguyên nhân của đái tháo đường sơ sinh do di truyền đột biến trội hoặclặn trên NST thường, gây ảnh hưởng lên quá trình bài tiết insulin, làm giảmtác động hoặc thiếu hụt insulin

Gen KCNJ11 mã hóa cho protein tham gia cấu tạo nên kênh K-ATP, đóng vai trò quan trọng trong quá trình bài tiết insulin Đột biến gen KCNJ11

là một trong những nguyên nhân dẫn đến đái tháo đường sơ sinh Thôngthường, khi trẻ mắc đái tháo đường sẽ phải điều trị bằng insulin đường tiêmdưới da, có nhiều bất tiện và sự phụ thuộc Tuy nhiên, khi phát hiện trẻ có đột

biến gen KCNJ11 này, thay vì phải điều trị bằng insulin đường tiêm, trẻ có thể

được điểu trị hiệu quả bằng thuốc sulfonylureas đường uống Vì thế, việc xác

định xem trẻ mắc đái tháo đường sơ sinh có đột biến gen KCNJ11 không là

việc rất cần thiết

Từ thực tế đó, để tài nghiên cứu: “Xây dựng quy trình xác định đột

biến gen KCNJ11 gây bệnh đái tháo đường sơ sinh bằng kỹ thuật giải trình

tự gen” được thực hiện nhằm mục tiêu:

1 Hoàn thiện quy trình xác định đột biến gen KCNJ11 gây bệnh đái tháo đường ở trẻ sơ sinh.

2 Bước đầu xác định đột biến gen trên một số bệnh nhân mắc đái tháo đường sơ sinh.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đôi nét về bệnh đái tháo đường sơ sinh

1.1.1 Định nghĩa

Trong cơ thể, để làm tăng đường huyết có nhiều loại hormone, tuynhiên để hạ đường huyết thì cơ thể chúng ta chỉ có một hormon duy nhất đó làinsulin Vì thế, khi xuất hiện một nguyên nhân nào đó dẫn đến lượng insulintiết ra bị giảm hoặc không có, hay chất lượng của insulin không đạt đều dẫnđến tăng đường huyết Tình trạng này kéo dài sẽ dẫn đến bệnh đái tháođường

Theo tổ chức y tế thế giới WHO 2002: “Đái tháo đường là một bệnhmạn tính gây ra do thiếu sản xuất insulin của tụy hoặc tác dụng insulin khônghiệu quả do nguyên nhân mắc phải và/hoặc do di truyền với hậu quả tăngglucose máu Tăng glucose máu gây tổn thương nhiều hệ thống trong cơ thể,đặc biệt mạch máu và thần kinh”

Đái tháo đường sơ sinh (ĐTĐSS) là một dạng đái tháo đường xuất hiện

ở trẻ sơ sinh trước 6 tháng tuổi Đây là một bệnh hiếm gặp với tỉ lệ mắc1:300.000-400.000 trẻ sơ sinh Tỉ lệ này ở một số quốc gia châu Âu là1:89.000 [CITATION Pol \l 1033 ][CITATION Ent \l 1033 ]

Dựa vào đặc điểm lâm sàng, đái tháo đường sơ sinh được chia thànhhai nhóm chính: đái tháo đường sơ sinh tạm thời và đái tháo đường sơ sinhvĩnh viễn

ĐTĐSS tạm thời chiếm từ 50% - 60% trường hợp mắc ĐTĐSS

[ CITATION Pol \l 1033 ], là một tình trạng rối loạn sản suất insulin từ giai đoạn hậusản nên thường đi kèm với sự chậm phát triển trong tử cung Trẻ có thể bị cao

huyết áp và mất nước sau khi sinh Hầu hết các trẻ mắc bệnh có thể hồi phụctrong một năm, một số ít có thể bị mất dung nạp glucose liên tục hoặc/và cóthể bị tái phát đái tháo đường vào tuổi trưởng thành

ĐTĐSS vĩnh viễn là đái tháo đường phát triển từ giai đoạn sơ sinh vàkhông thuyên giảm Trẻ mắc ĐTĐSS vĩnh viễn sẽ phải theo dõi và điều trịsuốt cả cuộc đời

Triệu chứng của ĐTĐSS tạm thời và vĩnh viễn có sự giống nhau đáng

kể nên không thể phân biệt được chúng dựa trên các đặc điểm lâm sàng

1.1.2 Triệu chứng lâm sàng

Các triệu chứng của ĐTĐSS bao gồm đi tiểu thường xuyên và mấtnước Lượng glucose trong máu hoặc nước tiểu tăng, kèm theo nồng độinsulin và C-peptide thấp hoặc không thể phát hiện được Trong trường hợpnặng, sự thiếu hụt insulin có thể khiến cơ thể sản sinh ra một lượng acid dưthừa, dẫn đến tình trạng nguy hiểm đến tính mạng gọi là ketoacid Hầu hếtthai nhi mắc bệnh ĐTĐSS không phát triển tốt trong tử cung và trẻ sơ sinhnhỏ hơn nhiều so với những người cùng tuổi thai (tình trạng thai chậm tăngtrưởng trong tử cung) do insulin là yếu tố quan trọng trong sự phát triển củabào thai mà insulin của người mẹ lại không thể vượt qua hàng rào nhau thai,

do đó khi bào thai không sản xuất được insulin sẽ ảnh hưởng nghiêm trọngđến các thông số tăng trưởng của bào thai, bao gồm trọng lượng, chiều dài vàchu vi đầu Sau khi sinh, một số trẻ sơ sinh không tăng cân và phát triểnnhanh như những trẻ khác cùng tuổi và giới tính [ CITATION Pol \l 1033 ][ CITATION Neo \l 1033 ] Ngoài ra, một số trẻ còn có thể bị chậm phát triển, suy nhược cơ

và động kinh [ CITATION Glo04 \l 1033 ]

1.2 Gen KCNJ11 và cơ chế gây bệnh đái tháo đường sơ sinh

1.2.1 Sự bài tiết insulin

1.2.1.1 Insulin

Cấu trúc

Insulin được cấu tạo bởi 2 polipeptid được nối với nhau bằng cầu nốidisulfide, trọng lượng phân tử 5808 Dalton, có 51 acid amin, chuỗi A chứa 21acid amin và các chuỗi B chứa 30 acid amin [ CITATION Rud10 \l 1033 ]

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử insulin.

(Nguồn: http://www.diabetesincontrol.com)

Tác dụng

Insulin có tác dụng chuyển hóa glucid, gây hạ đường huyết bằng 2 cách:

- Tăng sử dụng: tăng tổng hợp glycogen ở gan, tăng dự trữ glycogen ở

cơ, tăng phân hủy glucose ở ruột, tăng chuyển glucose thành acid béo

- Giảm tạo đường: giảm tạo glucose từ glycogen, giảm tạo đường mới

từ protid

Điều hòa bài tiết:

- Tốc độ giải phóng insulin, cũng như nồng độ của nó trong huyết tương,chủ yếu được kiểm soát bởi nồng độ glucose máu, glucose máu cao, gây tăngbài tiết insulin và ngược lại

- Các hormon tiêu hóa như secretin, gastrin kích thích tiết insulin.

- Ngoài ra dây X cũng có tác dụng kích thích tế bào beta bài tiết insulin

1.2.1.2 Tổng hợp insulin:

Insulin được tổng hợp và bài tiết từ các tế bào β trong các đảoLangerhans của tuyến tụy Tụy nội tiết gồm từ 1-2 triệu đảo Langerhans, lànhững tế bào tụ thành đám, thường ở gần mạch máu, đổ vào tĩnh mạch cửa.Mỗi tiểu đảo gồm 4 loại tế bào, trong đó có tế bào β thực hiện chức năng tiếtinsulin [ CITATION Rud10 \l 1033 ]

Hình 1.2 Hình ảnh vi thể một đảo tụy và các nang tuyến xung quanh

(Nguồn: http://www.diabetesincontrol.com)

Các tế bào β đáp ứng nhiều chất dinh dưỡng trong máu, bao gồmglucose, các monosaccharide, acid amin, và acid béo, tuy nhiên, glucose làchất kích thích tiết insulin chủ yếu, sự tiết insulin do glucose tạo ra lớn hơnrất nhiều so với kích thích của protein và chất béo Transporter glucose 2(GLUT2), được gắn trên màng tế bào β, là cảm biến glucose đầu tiên tế bào β,cho phép glucose đi vào tế bào β với tốc độ nhất định tỉ lệ với mức glucose có

ở ngoài tế bào Sau khi vào tế bào β, glucose được phosphoryl hóa bởienzyme glucokinase, thành glucose-6-phosphat, qua các giai đoạn tiếp theotrở thành pyruvate và rồi được đưa vào chu trình Krebs để tạo ra ATP Trongcác loại tế bào khác, pyruvate có thể được biến đổi thành lactate bằngpyruvate dehydrogenase, tuy nhiên, các tế bào β không có enzyme này Cáckênh K-ATP gắn trên màng tế bào β bình thường cho các ion K+ đi từ trong rangoài tế bào nhằm duy trì hiệu điện thế âm của màng tế bào Khi có sự tăng tỉ

lệ ATP/ADP trong tế bào đến một mức nhất định tương ứng với nồng độglucose trong máu nhất định, sẽ làm cho ATP gắn vào kênh K-ATP dẫn đếnđóng các kênh, không cho các ion K+ đi qua gây ra sự khử cực màng, làm mởcửa các kênh canxi phụ thuộc điện áp (vốn dĩ được đóng khi màng tế bào duytrì hiệu điện thế âm) dẫn đến Ca2+ ồ ạt đi vào tế bào Sự gia tăng nồng độ Ca2+

trong tế bào gây nên sự hòa tan N-ethylmaleimide nhạy cảm với receptorprotein gắn kết (SNARE), gây ra sự giải phóng insulin và C-peptide từ các túichứa chất chiết xuất từ insulin và kích thích sự di chuyển các túi bổ sung vàomàng tế bào, giải phóng insulin ra khỏi tế bào [ CITATION Rud10 \l 1033 ] [ CITATION Pol15 \l 1033 ]

Hình 1.3 Cơ chế bài tiết insulin của tế bào β tuyến tụy

(Nguồn: https://ojrd.biomedcentral.com/articles/10.1186/1750-1172-2-12#CR18)

1.2.2 Kênh K-ATP

K-ATP là kênh kali nhạy cảm với ATP, chúng có trong nhiều mô, baogồm tế bào đảo tụy, tim, cơ xương, cơ trơn mạch máu và não, trong đó chúngkiểm soát tín hiệu điện trong các loại tế bào bằng cách kết hợp chuyển hóa tếbào với chuyển động kali qua màng tế bào, đóng vai trò quan trọng trong cácchức năng khác nhau của tế bào Trong các tế bào beta tụy, các kênh K-ATPliên kết sự thay đổi nồng độ glucose trong máu và sự bài tiết insulin Trongnão, chúng đóng góp vào việc kiểm soát glucose và giữ động mạch Trong cơtim, chúng bảo vệ chống lại chứng thiếu máu cục bộ

1.2.2.1 Cấu tạo

Kênh K-ATP là một hetero-octamer bao gồm hai loại tiểu đơn vị: tiểuđơn vị hình thành lỗ rỗng Kir6.x (Kir6.1 hoặc Kir6.2) và thụ thể sulfonylureaSUR (SUR1 hoặc SUR2) Kir6.x thuộc họ kênh chỉnh lưu nội bộ K+ Sự biểuhiện đa hình của Kir6.1 hoặc Kir6.2 và SUR1 hoặc SUR2 (SUR2A hoặcSUR2B) tái tạo ra các loại kênh K-ATP khác nhau với đặc tính điện sinh lýriêng biệt và độ nhạy cảm về dược lý và tương ứng với các kênh K-ATP khácnhau trong các mô tự nhiên [ CITATION Sei03 \l 1033 ]

Trong tế bào β của tuyến tụy, kênh K-ATP được cấu tạo từ 8 tiểu đơn vịprotein, trong đó, bốn tiểu đơn vị là Kir6.2 tạo thành một lỗ trung tâm đượcbao quanh bởi bốn tiểu đơn vị SUR1

Các tiểu đơn vị Kir6.2 xuyên qua màng tế bào và hình thành nên lỗ củakênh Các tiểu đơn vị SUR1 có 3 miền bổ sung màng tế bào và chứa 2 miềnliên kết nucleotid

Hình 1.4 Cấu tạo kênh K-ATP (Nguồn: http://circresearch.com) 1.2.2.2 Chức năng

Các vai trò sinh lý và sinh lý học của các kênh K-ATP đã được nghiêncứu chủ yếu sử dụng các bộ chặn kênh K-ATP và các bộ mở kênh K+

Khi mở, nó cho phép kali đi từ trong tế bào ra ngoài tế bào để duy trìhiệu điện thế -70 mV của màng tế bào Giữ cho kênh canxi nhạy cảm điện ápđóng Khi đóng, nó làm khử cực tế bào, làm mở cửa kênh canxi nhạy cảmđiện áp, Ca2+ ồ ạt đi vào tế bào gây bài tiết insulin

Kênh K-ATP có thể điều chỉnh hoạt động bởi nhiều yếu tố tế bào, quantrọng nhất là nồng độ ATP và MgADP ATP đóng kênh K-ATP bằng cáchgắn với Kir6.2, làm biến đổi trực tiếp vị trí gắn ATP trên bề mặt bên ngoàicủa protein, làm đóng cửa kênh Ngược lại, khi nồng độ MgADP tăng, chúnggắn vào thụ thể SUR1 làm cho kênh hoạt động Do đó, trong các điều kiệnsinh lý, hoạt động của kênh được xác định bằng sự cân bằng giữa nồng độATP và MgADP, sự thay đổi tỉ lệ nồng độ ATP và MgADP bên trong tế bào

là trung gian điều hòa chuyển hóa của kênh K-ATP [ CITATION And05 \l 1033 ]

Sulfonylurea kích thích bài tiết insulin bằng cách kết hợp với SUR1 vàđóng các kênh K-ATP bằng một cơ chế độc lập ATP [ CITATION Glo04 \l 1033 ].

1.3 Gen KCNJ11

1.3.1 Cấu tạo, vị trí

KCNJ11 có tên gọi đầy đủ là potassium voltage-gated channel subfamily

J member 11 KCNJ11 cũng được biết đến với các tên gọi khác như: BIR; HHF2; PHHI; IKATP; TNDM3; KIR6.2; MODY13 Gen này nằm trên

cánh dài nhiễm sắc thể số 11, là gen có một exon duy nhất, mã hóa choprotein Kir6.2, bắt đầu từ 17 385 237 bp và kết thúc 17 389 331 bp, kíchthước 24 508 bases

Hình 1.5 Vị trí gen KCNJ11 trên nhiễm sắc thể số 11

(Nguồn: http://www.genecards.org)

1.3.2 Chức năng

KCNJ11 mã hóa cho Kir.6, là 1 protein gồm 390 acid amin, có khối

lượng phân tử là 43 541 Da Protein này là một kênh chỉnh lưu ion kali bêntrong (Kir6.2) Protein Kir6.2, cùng với receptor có độ gắn kết sulfonylurea

cao 1 (SUR1), tạo thành kênh K-ATP SUR1 được mã hoá bởi gen ABCC8 nằm bên cạnh gen KCNJ11 Protein Kir6.2 gồm hai miền màng (M1 và M2)

và các cực N và C trong nội bào Về mặt cấu trúc, các tetramers Kir6.2 tạothành lỗ rỗng và bốn tiểu đơn vị SUR1 có độ gắn kết cao bao quanh lỗ rỗngcủa kênh K-ATP nằm ở màng huyết tương của các tế bào β tuyến tuỵ Kênh

này điều chỉnh sản xuất và bài tiết insulin thông qua chuyển hóa glucose

[ CITATION Pol15 \l 1033 ]

Hình 1.6 Chức năng gen KCNJ11 (Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov)

1.3.3 Một số đột biến/snp đã được tìm thấy trên KCNJ11 và ảnh hưởng của chúng đến ĐTĐSS

Bảng 1.1 Các đột biến gen KCNJ11 gây bệnh ĐTĐSS đã được tìm thấy

STT Đột biến Kiểu hình Tài liệu công bố

STT Đột biến Kiểu hình Tài liệu công bố

19 K170T PNDM Flanagan, et al (2006)[ CITATION Mut \l 1033 ]

20 A174G TNDM Suzuki, et al (2007)[ CITATION

Suz07 \l 1033 ]

21 E179A TNDM Flanagan, et al (2007)[ CITATION Sar07 \l 1033 ]

22 I182V TNDM Gloyn et al (2005) [ CITATION

25 R201L PNDM Codner, et al (2005)Cod05 \l 1033 ] [ CITATION

26 E227K TNDM Edghill, et al (2007)Edg07 \l 1033 ] [ CITATION

27 E229K TNDM Edghill, et al (2007)Edg07 \l 1033 ] [ CITATION

PNDM

Rica, et al (2007) [ CITATION Ric07 \l 1033 ]

29 E292G PNDM Rica, et al (2007) Ric07 \l 1033 ] [ CITATION

30 I296L Gloyn et al (2004) [CITATION

Hình 1.7 Một số vị trí acid amin do gen KCNJ11 mã hóa đã tìm thấy đột biến

(Nguồn: https://link.springer.com) Các đột biến gen KCNJ11 mã hóa Kir6.2 là một nguyên nhân phổ biến

gây đái tháo đường sơ sinh Chúng làm thay đổi cấu trúc của Kir6.1, khiếncho kênh không đóng cửa được, do đó làm cho màng tế bào không được khửcực, không làm mở kênh canxi phụ thuộc điện áp, dẫn đến insulin không đượctiết ra [ CITATION Ann05 \l 1033 ] [ CITATION Pol \l 1033 ] [ CITATION Neo \l 1033 ]

Hình 1.8 Đột biến gen KCNJ11 làm kênh K-ATP không đóng lại khiến

cho insulin không được bài tiết (Nguồn: https://ojrd.biomedcentral.com)

Điều này là do một số đột biến xảy ra tại vị trí liên kết với ATP làmgiảm sự nhạy cảm ATP của kênh Một số đột biến khác lại ổn định trạng thái

mở của kênh Lỗ kênh K-ATP bao gồm bốn tiểu đơn vị Kir6.2, đột biến gen

KCNJ11 ở trạng thái dị hợp tử thì hầu hết các kênh K-ATP sẽ chứa hỗn hợp

các tiểu đơn vị bình thường và đột biến ( Hình 1.9) Bởi vì chỉ cần ATP liênkết với một đơn vị con duy nhất của Kir6.1 cũng đủ để đóng kênh K-ATP[ CITATION EMa00 \l 1033 ], độ nhạy ATP của kênh K-ATP giảm đáng kể chỉkhi tất cả bốn đơn vị con bị đột biến (nghĩa là trong ~ 1/16 của kênh trongtrạng thái dị hợp tử, nếu số tiểu đơn vị đột biến trong tetramer được phân phốinhị phân) Phát hiện này giải thích tại sao các đột biến trong vùng liên kếtATP, như R201C, chỉ gây ra một sự thay đổi nhỏ trong ức chế tập trung ATPcủa các kênh dị hợp tử[ CITATION Pro04 \l 1033 ]

Hình 1.9 Hỗn hợp các tiểu đơn vị hoang dã và đột biến của Kir6.1

(Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov)

Ngoài ra, cũng có thể do ảnh hưởng tương tác giữa Kir6.2 và SUR, một

số đột biến làm tăng tính nhạy cảm MgADP của SUR1, làm tăng kích thíchhoạt động mở của kênh [ CITATION And05 \l 1033 ][CITATION FMA06 \l 1033 ][ CITATION McT10 \l 1033 ][ CITATION Neo \l 1033 ]

Các đột biến dị hợp tử của Kir6.2 gây ra bệnh tiểu đường xác nhậnrằng con đường phụ thuộc vào kênh K- ATP là rất quan trọng đối với sự tiếtinsulin, và các con đường độc lập khác của K-ATP không thể bù đắp được tổnthất của chúng Các đột biến có hiệu quả chức năng ít nghiêm trọng hơn hoặc

do sự biến đổi của nền di truyền có thể dẫn đến bệnh tiểu đường sơ sinh tạmthời hoặc tiểu đường trở nên rõ ràng sau giai đoạn sơ sinh [ CITATION Glo04 \l

1033 ]

Việc xác định các đột biến trong gen mã hoá tiểu đơn vị kênh ATP Kir6.2 có ý nghĩa quan trọng đối với việc điều trị các bệnh nhân bị ảnhhưởng: nếu kênh K ATP có thể được đóng bằng một cơ chế độc lập ATP (ví

K-dụ như bằng sulfonylureas), sự tiết insulin có thể được khôi phục [ CITATION Glo04 \l 1033 ]

Bên cạnh các đột biến, KCNJ11 còn có các đa hình, tuy không gây nên

bệnh ĐTĐSS, chúng làm tăng nguy cơ mắc đái tháo đường type 2, type 1 và

đái tháo đường thai kì KCNJ11 có 219 SNP, sáu trong số đó đã nhận được

nhiều sự chú ý hơn cho sự liên quan của họ với bệnh tiểu đường Trong số sáu

SNPs phổ biến, ba nằm trong các vùng mã hóa (rs5215, rs5218, rs5219 tươngứng làm thay đổi các acid amin: V250I, A103A, K23E) và ba trong các vùngkhông mã hóa (rs5210, rs886288, rs2285676) ( Bảng 1.2 ) [ CITATION Pol15 \l

4 rs5218 Exon 0.27 C>T A103A T2DM

5 rs5219 Exon 0.27 G>A K23E T1DM

T2DMGDM

1.3.5 Các kĩ thuật phát hiện đột biến gen KCNJ11

1.3.5.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

- Nguyên tắc chung:

Dựa vào hoạt tính của các DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp một

mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn loại nucleotid.Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự

bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳgồm ba bước: Biến tính, bắt cặp, kéo dài chuỗi

- Bước 1: Là giai đoạn biến tính (denaturation) Trong một dung dịchphản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNAđược biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử,thường là 94oC - 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút

- Bước 2: Là giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ được hạ thấp chophép các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tuỳthuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1 phút

- Bước 3: Là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ đượctăng lên 72oC để cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất.

Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéodài từ 30 giây đến nhiều phút Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạothành sẽ tiếp tục được dùng để làm các DNA nền để tổng hợp các DNA mớitrong chu kỳ tiếp theo Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là những đoạn DNAchuỗi đôi có chiều dài là khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tậncùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi

Số lượng chu kỳ trong PCR thường không vượt quá 40 Sau mỗi chu kỳ, sốsợi DNA tăng gấp đôi Như vậy, sau n chu kỳ số lượng sợi DNA là 2n Nhờvậy, số lượng DNA sẽ có đủ để có thể tách ra khi điện di và phát hiện đượcsau khi nhuộm, có thể tách dòng hoặc giải trình tự gen

Hình 1.10 Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR

(Nguồn: Andy Vierstraete, 1999)

1.3.5.2 Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA sequencing)

Giải trình tự gen là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của cácnucleotid trong phân tử DNA Đoạn DNA cần giải trình tự được sử dụng nhưtrình tự mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR) bắt đầu từ vị trí gắn mồi.Hỗn hợp của deoxynucleotid (dNTP) và dideoxynucleotid (dNTP) được sửdụng trong phản ứng với nồng độ sao cho các dideoxynucleotid sẽ gắn vàomỗi vị trí mà các deoxynucleotid thường gắn trên đoạn DNA đang được tổnghợp Sự gắn của các dideoxynucleotid sẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các

đoạn DNA được tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kíchthước khác nhau Nucleotid tận cùng trên mỗi sợi DNA có thể được xác địnhbằng cách chạy đồng thời bốn phản ứng riêng biệt trong đó mỗi phản ứngchứa một loại dideoxynucleotid (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) hoặc bởimột phản ứng hỗn hợp nhưng từng loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằngcác chất phát huỳnh quang đặc hiệu khác nhau

Hình 1.11 Quy trình giải trình tự gen theo phương pháp ddNTP

Kết quả là hỗn hợp các sợi DNA tổng hợp từ sợi khuôn được phân táchbằng điện di trên thạch acrylamid có độ phân giải cao, cho phép phân biệtđược các sợi đơn DNA hơn kém nhau 1 nucleotid Trình tự các nucleotidđược xác định tương ứng với trình tự của các vạch trên gel ứng với mỗi loạidideoxynucleotid

Máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn dùng 4 màu huỳnh quang khácnhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, hệ thống điện di thường là điện di mao quản.Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của

đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màusắc này và chuyển về máy tính phân tích Dựa vào màu huỳnh quang mà máynhận biết được từng loại nucleotid và trình tự của DNA đích

Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự gen trên Genebank(National Center for Biotechnology Information - NCBI)

Kỹ thuật giải trình tự của DNA đích đã được ứng dụng trong nhiềunghiên cứu để xác định các đột biến mất nucleotid, thay thế nucleotid, thêm

nucleotid trên gen Do phần lớn các đột biến gen KCNJ11 gây bệnh đái tháo đường sơ sinh là đột biến điểm nên phương pháp giải trình tự gen KCNJ11

vẫn được coi là một tiêu chuẩn vàng để phát hiện các đột biến của gen gâybệnh

Hình 1.12 Hình ảnh giải trình tự gen trên máy giải trình tự gen tự động

(Nguồn Trung tâm Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội)

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

 Thời gian và địa điểm thực hiện khóa luận:

- Thời gian: từ tháng 9/2016 – 5/2017

- Địa điểm: Trung tâm nghiên cứu Gen và Protein - Trường Đại học Y

Hà Nội

 Đối tượng khảo sát:

Nghiên cứu được thực hiện trên 3 bệnh nhân sơ sinh được chẩn đoán xácđịnh là mắc bệnh đái tháo đường sơ sinh dựa vào những đặc điểm lâm sàng vàcận lâm sang tại khoa Nội tiết Bệnh viện Nhi Trung Ương

- Tiêu chuẩn lựa chọn:

+ Trẻ sơ sinh được chẩn đoán mắc ĐTĐSS có glucose máu > 150 – 200mg/dl (> 8,3 – 11,1 mmol/l) dai dẳng, xuất hiện ở trẻ dưới 12 tháng tuổi, phảiđiều trị bằng insulin

- Tiêu chuẩn loại trừ: bệnh nhân tăng glucose máu do truyền dịch cóglucose, do nhiễm trùng hoặc không đồng ý tham gia nghiên cứu

 Đạo đức trong nghiên cứu:

- Trước khi tiến hành thu thập thông tin, mẫu bệnh phẩm được sự đồng ýcủa gia đình bệnh nhi: tham gia tự nguyện nghiên cứu

- Gia đình bệnh nhi được giải thích rõ ràng về mục tiêu nghiên cứu, được

tư vấn và trẻ được điều trị tương tự như mọi bệnh nhi khác Các thông tin củabệnh nhi được đảm bảo giữ kín bí mật