Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm và đánh giá hiệu quả điều trị trên bệnh nhi lơxêmi cấp tiền tủy bào tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung Ương

LXMc thể tiền tủy bào Acute Promyelocytic Leukemia – APL làLXMc thể M3 theo phân loại FAB, thể duy nhất có chuyển đoạn nhiễm sắcthể NST t15;17q22;q21 tạo gen kết hợp PML/RAR với sự phát

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lơxêmi cấp (LXMc) là một nhóm bệnh ác tính hệ tạo máu với đặc trưngchủ yếu là sự tăng sinh và tích lũy các tế bào non – ác tính (blast) trong tủyxương và máu ngoại vi Tế bào ác tính nhanh chóng lấn át và ức chế quá trìnhsinh sản và biệt hóa của các tế bào tạo máu bình thường tại tủy xương, sẽ gây

ra những rối loạn trầm trọng toàn cơ thể

LXMc thể tiền tủy bào (Acute Promyelocytic Leukemia – APL) làLXMc thể M3 theo phân loại FAB, thể duy nhất có chuyển đoạn nhiễm sắcthể (NST) t(15;17)(q22;q21) tạo gen kết hợp PML/RAR với sự phát triển ưuthế của các tiền tủy bào ác tính (TTBAT) chứa rất nhiều các hạt đặc hiệu chứaenzyme tiêu protein là nguyên nhân chính dẫn đến rối loạn đông máu, chủ yếu

là đông máu nội mạch rải rác (DIC) Đặc biệt khi điều trị bằng hóa chất nhưnhững thể bệnh khác thì rối loạn đông máu ngày càng trở nên trầm trọng hơn.Thể bệnh này ít gặp (<10% các bệnh nhân LXMc dòng tủy), và càng ít hơn ởbệnh nhi (5-7%) [1]

ATRA (all trans retinoic acide), một dẫn chất của vitamin A hiện đangđược sử dụng hàng đầu để điều trị LXMc thể M3 Tại Việt Nam, năm 1999

Đỗ Trung Phấn và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng ATRA điều trị M3 Kết quảthu được rất tốt, tỷ lệ đạt lui bệnh > 80% với ATRA và 90% với As2O3 Tuynhiên tỷ lệ tái phát sau 2 năm còn cao (49%) [2]

Ngày nay với sự tiến bộ của công nghệ di truyền, việc theo dõi và đánhgiá hiệu quả điều trị bằng định lượng biểu hiện gen bệnh (RQ-PCR) là công

cụ đắc lực hỗ trợ chẩn đoán, theo dõi đáp ứng thuốc và MRD (minimalresidual disease) ở mức độ phân tử, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị

Tại Việt Nam các nghiên cứu về lơxêmi cấp tiền tủy bào đều ghi nhận tỷ

lệ mắc bệnh ngày càng tăng Tuy nhiên hiện tại vẫn còn ít nghiên cứu về thểbệnh này ở trẻ em Nhận thấy giá trị thực tiễn của việc nghiên cứu các đặcđiểm bệnh lý và biến chứng trong điều trị LXMc tiền tủy bào bằng ATRA nên

chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm và đánh giá hiệu quả điều trị trên bệnh nhi lơxêmi cấp tiền tủy bào tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung Ương” nhằm 2 mục tiêu:

1 Mô tả đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm lơxêmi cấp tiền tủy bào ởbệnh nhi tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung Ương

2 Đánh giá hiệu quả điều trị lơxêmi cấp tiền tủy bào bằng ATRA kếthợp hóa chất ở trẻ em sau mỗi đợt điều trị tấn công và củng cố

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA LXMC TIỀN TỦY BÀO

1.1.1 Khái niệm về LXMc tiền tủy bào

Lơxêmi cấp (LXMc) tiền tủy bào là một thể bệnh đặc biệt của lơxêmicấp dòng tủy, có biểu hiện hình thái học là type M3 theo phân loại FAB (French

- American – British) [3], di truyền học đặc trưng với tổn thương chuyển đoạnnhiễm sắc thể t(15;17) Các tế bào dòng tủy bị gián đoạn trưởng thành một cách

ác tính ở giai đoạn tiền tủy bào Lâm sàng thường đi kèm với rối loạn đông cầmmáu cụ thể là đông máu nội mạch rải rác (DIC) và tiêu sợi huyết

Theo phân loại của FAB (1976) thì LXMc tiền tủy bào, gồm thể M3 điểnhình giàu hạt và biến thể M3v ít hạt hơn thường gặp khó khăn trong chẩn đoán

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu

Thể bệnh này được mô tả lần đầu tiên vào năm 1949 bởi các nhà huyếthọc Pháp với các triệu chứng xuất huyết dữ dội dẫn đến tử vong nhanh chóng.Năm 1957, một chuyên gia Huyết học người Na Uy, Hillestad đã báo cáo các

ca bệnh APL, ông nhận thấy các ca bệnh đều có đặc điểm chung hình thái họctiền tủy bào ác tính và đặt tên cho bệnh là LXMc tiền tủy bào Năm 1959, mô

tả chi tiết về APL đã được đưa ra bởi J Bernard (Bệnh viện Louis, Pari), ôngbáo cáo loạt bệnh về 20 bệnh nhân chẩn đoán APL, từ đó đưa ra định nghĩađầy đủ về bệnh và sự liên quan của nó với các rối loạn đông máu nặng nề [4]

Từ những năm 60 tới thập kỷ 70 của thế kỷ XX các chuyên gia đã đi sâunghiên cứu tình trạng rối loạn đông máu của bệnh Các nghiên cứu đã nhậnthấy đông máu nội mạch rải rác (DIC) là nguyên nhân chính dẫn đến tình trạngchảy máu ồ ạt và tiêu sợi huyết thứ phát làm nặng thêm tình trạng xuất huyết

Lơxêmi cấp tiền tủy bào được coi là thể bệnh nặng, tiên lượng xấu nhấttrong các loại lơxêmi cấp Kể từ khi ATRA và As2O3 được ứng dụng đưa vàođiều trị kết hợp với hóa trị thì kết quả điều trị của các bệnh nhân trở nên khảquan hơn

1.1.3 Dịch tễ

LXMc tiền tủy bào là loại LXMc ít gặp, tỉ lệ chung khoảng 5-10%LXMc dòng tủy [5],[6] và ít hơn ở trẻ em [1] Tại Mỹ hàng năm có khoảng30.800 trường hợp bệnh bạch cầu cấp được chẩn đoán, trong đó số bệnh nhânmới mắc APL khoảng 600-800 ca [5],[7] Tại Ý tỷ lệ mắc bệnh hàng năm là0,6/1 triệu người [8] Tuổi hay gặp mắc LXMc trên 55 tuổi [9], và tuổi mắcLXMc tiền tủy bào thường trẻ hơn, từ 20-50 tuổi, ít gặp ở trẻ em và người caotuổi [5],[8],[10] Trên thế giới, mỗi năm có khoảng 21.700 bệnh nhân chết vìbệnh bạch cầu cấp nhưng chưa có số liệu rõ ràng về LXMc tiền tủy bào

Tại Việt Nam, nghiên cứu một vài năm gần đây cũng cho thấy tỷ lệLXMc tiền tủy bào trong số những bệnh nhân LXMc là 11% với tuổi mắcbệnh khá trẻ, trung bình 30-40 tuổi [11],[12]

1.2 ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG

Đặc điểm nổi bật của LXMc tiền tủy bào là tình trạng xuất huyết rấtnặng nề, dễ dẫn đến tử vong Các biểu hiện xuất huyết thường rất đa dạng vànặng nề: xuất huyết dưới da, niêm mạc, xuất huyết trong cơ, xuất huyết võngmạc, ho ra máu, đái máu, xuất huyết tiêu hóa, ở bệnh nhân nữ hay thấy kinhnguyệt kéo dài với số lượng nhiều Đặc biệt trước đây, xuất huyết não lànguyên nhân gây tử vong của 10-30% các trường hợp ngay từ những ngàyđầu tiên phát hiện bệnh hoặc trong quá trình điều trị hóa chất [13], hiện naykhi áp dụng ATRA trong điều trị, tỷ lệ này chỉ còn khoảng 5% [14] Nguyênnhân xuất huyết ngoài do giảm tiểu cầu như trong những thể LXMc khác thìchủ yếu còn do nguyên nhân rối loạn đông máu, trong đó phần lớn là DIC

[15] Tuy nhiên, ngoài triệu chứng chảy máu do bệnh lý đông máu thì người

ta còn gặp những trường hợp có biểu hiện ban đầu là huyết khối (tại mạchcảnh, mạch vành) [16], hội chứng Budd-Chiari [17] Có một tỷ lệ nhỏ (5,1%)các trường hợp biểu hiện lâm sàng là tình trạng huyết khối nhưng kết quả xétnghiệm vẫn cho thấy tình trạng đông máu nội mạch rải rác [18]

Thiếu máu khá phổ biến trong LXMc tiền tủy bào Bên cạnh tình trạng

ức chế sinh máu tại tủy của các tế bào ác tính, tình trạng xuất huyết nặng nềcũng là nguyên nhân gây nên thiếu máu

Các biểu hiện hay gặp khác của LXMc như sốt, gan lách hạch to ít gặphơn ở LXMc tiền tủy bào

Thâm nhiễm da và thần kinh trung ương khá hiếm gặp ở những bệnhnhân mới chẩn đoán lần đầu [19]

1.3 ĐẶC ĐIỂM ĐÔNG MÁU VÀ CƠ CHẾ GÂY RỐI LOẠN ĐÔNG MÁU

Lơxêmi cấp tiền tủy bào có biểu hiện nổi bật là hội chứng xuất huyếtnặng nề do rối loạn đông máu Các rối loạn đông máu là do tổ hợp các cơ chếkhác nhau bắt nguồn từ các hạt đặc hiệu chứa protease (elastase), yếu tố tổchức phát động đông máu nội mạch rải rác và yếu tố tiêu sợi huyết trongnguyên sinh chất TTBAT Đông máu nội mạch rải rác sẽ dẫn đến tăng tiêu thụcác yếu tố đông máu, tiểu cầu, fibrinogen và prothrombin dẫn tới tình trạngchảy máu Vô số các cục máu đông nhỏ trong lòng mạch sẽ làm cho các hồngcầu đi qua bị tổn thương dẫn đến có nhiều mảnh vỡ hồng cầu Hệ thống tiêusợi huyết cũng được khởi động mạnh mẽ do giải phóng các yếu tốplasminogen hoạt hóa từ các TTBAT Hệ tiêu sợi huyết hoạt động mạnh nêntrong máu xuất hiện nhiều các sản phẩm thoái giáng của fibrin (fibrinogen-fibrin degradation products: FDPs), chúng sẽ hoạt động như các antithrombin,

ức chế quá trình polymer hóa fibrin, do vậy hình thành các lưới fibrin khiếmkhuyết làm tổn thương tiểu cầu cũng như mất cân bằng chức năng của lướinội mạc Một lượng lớn FDPs có mặt trong tuần hoàn có thể xâm nhập làmtổn thương các tế bào mao mạch phổi dẫn đến suy hô hấp Tiêu sợi huyếttrong LXMc tiền tủy bào là sự kết hợp giữa tình trạng tiêu sợi huyết thứ phát

do hình thành quá nhiều cục đông trong lòng mạch và tình trạng tiêu sợi huyếttiên phát do vỡ các tế bào ung thư [20]

Cùng một lúc TTBAT đã hoạt hóa 3 cơ chế khác nhau tác động lên hệthống đông máu: hoạt hóa hệ thống đông máu, hoạt hóa quá mức hệ tiêu sợihuyết và tiêu protein không đặc hiệu Đông máu nội mạch rải rác trong LXMctiền tủy bào là kết quả của việc giải phóng các yếu tố tổ chức từ tế bàolơxêmi, thêm vào đó các enzyme của bạch cầu như elastase có thể làm thúcđẩy thêm tình trạng rối loạn đông máu do tiêu protein của các zymogen đôngmáu và fibrinogen Các tế bào TTBAT còn chứa một lượng lớn annexin II,một phospholipid gắn protein và các receptor với plasmin và plasminogen tổchức hoạt hóa Annexin II quá nhiều sẽ dẫn đến tăng sản xuất plasmin và làmtăng hoạt động tiêu sợi huyết tiên phát [21] Annexin II bộc lộ nhiều ở tế bàonội mạc vi mạch não, vì vậy mà LXMc tiền tủy bào có nguy cơ xuất huyếtnão cao hơn các thể khác [22] Các hạt của tế bào TTBAT chứa nồng độ rấtcao các yếu tố tổ chức cũng là nguyên nhân làm lan rộng DIC [13],[23].Người ta đã chứng minh được sự có mặt của các vi mảnh của tế bào ung thưtrong huyết tương của bệnh nhân LXMc tiền tủy bào, trong đó có chứa nồng

độ lớn yếu tố tổ chức, t-PA, PAI-1 và annexin II, điều này đã khẳng định cơchế bệnh sinh về rối loạn đông máu trong LXMc tiền tủy bào [22]

Hình 1.1 Cơ chế rối loạn đông máu trong APL [24]

1.4 CƠ CHẾ BỆNH SINH

Chuyển đoạn t(15;17) và gen kết hợp PML/RAR gặp >95% các bệnhnhân LXMc thể M3 được cho là đóng vai trò chính trong cơ chế bệnh sinhcủa bệnh RAR là gen mã hóa cho retinoic acid receptor  Kết quả của genkết hợp này là ức chế chức năng bình thường của RAR lên quá trình biệt hóacủa dòng bạch cầu hạt trung tính Thêm vào đó, PML/RAR làm phá vỡ thểnhân mà PML là một phần trong đó và kết quả là mất đi tác dụng ức chế quátrình phát triển sinh u của PML do sản phẩm protein PML đã biến đổi [25].Gen RAR nằm trên NST số 17 đóng vai trò quan trọng trong biệt hóa củanhiều loại tế bào và chức năng này được điều chỉnh thông qua retinoic acidreceptor (RAR) Sản phẩm protein của RAR bình thường có chức năng hoạthóa quá trình sao mã của các gen giúp tế bào có thể trưởng thành ProteinRAR có tác dụng như một chất gắn gây ra hiện tượng sao mã bằng cách gắnvới yếu tố đáp ứng đặc hiệu ở vùng promotor của gen đích (RARE) Phức hệRAR-RARE-RXR khi gắn vào ADN sẽ khởi động quá trình sao mã của gen

đó Gen kết hợp PML/RAR có thể kìm hãm sao mã một cách dai dẳng do ứcchế RAR vì vậy mà ngăn cản sự biệt hóa của tiền tủy bào [26] Gen PMLnằm trên NST 15 có vai trò mã hóa cho protein ức chế khối u, đóng vai tròchủ đạo trong một số tín hiệu apoptosis Gen PML còn hoạt động như mộtđồng yếu tố sao mã với p53, một gen ức chế khối u [27].

Sản phẩm của gen PML là protein PML thuộc họ protein nhân liên quanđến quá trình sao mã, có liên quan đến ức chế khối u và kiểm soát sự bềnvững của bộ gen Protein này liên quan đến hiện tượng cảm ứng phụ thuộcp53 của apoptosis, ức chế tăng trưởng, ức chế lão hóa tế bào trong đáp ứngvới phóng xạ ion hóa và tiến triển sinh u Ngoài ra, protein PML còn ức chếsao mã qua trung gian là các yếu tố ức chế khối u khác như Rb và Mad

Cả protein PML và PML thể nhân đều bị phá vỡ trong LXMc tiền tủybào do phức hợp gen PML/RAR Sự phá vỡ này sẽ làm mất chức năng sinh

lý bình thường của protein PML

Sự có mặt của phức hợp gen này không tự nó làm ức chế ngay quá trìnhbiệt hóa của dòng bạch cầu hạt, nó làm thay đổi cán cân trong sinh máu dòngtủy theo hướng kém trưởng thành Sản phẩm của gen kết hợp tạo ra là mộtprotein gây ức chế sao mã dẫn đến tế bào ngừng biệt hóa và phát triển ác tính

ở giai đoạn tiền tủy bào Khi tần số xuất hiện gen bệnh đạt đến khoảng 30%, lúc đó bệnh biểu hiện qua các triệu chứng rầm rộ kết thúc thời gian tiềmtàng Khoảng thời gian này dao động từ 30 ngày đến 26 tháng [13]

10-1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN

1.5.1 Phương pháp hình thái học và hóa học tế bào

1.5.1.1 Xét nghiệm tế bào máu ngoại vi

Ở các bệnh nhân LXMc tiền tủy bào thường thấy tình trạng giảm số

lượng hồng cầu, đa phần ở mức độ vừa và nặng.

Số lượng tiểu cầu cũng thường gặp <50G/l Số lượng tiểu cầu giảm cótính động học theo tình trạng đông máu nội mạch rải rác [28]

Số lượng bạch cầu của bệnh nhân từ thời điểm chẩn đoán thường khôngcao, đa số từ 3-15 G/l, trong đó phần đông các trường hợp có số lượng bạchcầu <5G/l Đây cũng chính là nguyên nhân để sót chẩn đoán nếu không quansát kỹ tiêu bản máu Trong khi đó các bệnh nhân biến thể M3v lại có số lượngbạch cầu khá cao (50-200G/l), đây là một trong các yếu tố tiên lượng mắc hộichứng retinoic trong quá trình điều trị

1.5.1.2 Xét nghiệm tế bào tủy xương

Yếu tố quan trọng trong chẩn đoán bệnh chính là hình thái học tế bào tủyxương và hóa học tế bào Đây là yếu tố quyết định điều trị ngay cả khi chưa cókết quả xét nghiệm gen bệnh vì tính chất cấp tính và tỷ lệ tử vong cao của bệnh

Tỉ lệ các tế bào blast trong tủy thường rất cao (30-90%) Về hình tháihọc, tế bào blast của LXMc tiền tủy bào thường có kích thước lớn (đườngkính khoảng 15-20m), nguyên sinh chất rộng, nhân bất thường Nhân của tếbào APL thường có dạng soi gương hoặc rất cuộn và có thể thấy hạt nhân.Nguyên sinh chất thường rất giàu hạt bắt màu hồng, đỏ hay tím khi nhuộm.Các tế bào chứa cả cụm thể Auer, gọi là tế bào ‘faggot’, là một đặc trưng củathể bệnh này, nhưng có thể không gặp ở một số trường hợp Nhuộm hóa học

tế bào trong trường hợp này cho kết quả dương tính rất mạnh vớiMyeloperoxidase và Sudan đen B, trong khi PAS và Esterase không đặc hiệuthường âm tính

Còn biến thể M3v (20-25% LXMc tiền tủy bào) có các vi hạt không thểquan sát được trên kính hiển vi quang học, nhưng kết quả hóa học tế bào quansát được như thể M3 bình thường M3v có hình thái học của các TTBAT

tương đối giống monoxit với bào tương xám mờ, khá mịn, bờ nhân khôngđều, nhân cuộn và không rõ hạt nhân nên dựa trên tiêu bản nhuộm Giemsa cóthể nhầm với thể M4, M5 Lúc này việc chẩn đoán cần dựa vào hóa học tế bào

và xét nghiệm gen Những vi hạt của thể bệnh này có kích thước rất nhỏ,

<250nm, được nhận biết trên kính hiển vi điện tử Các TTBAT này cũng cóchuyển đoạn gen đặc trưng PML/RAR nên có thể dùng các phương phápmiễn dịch và sinh học phân tử để chẩn đoán xác định

Hình 1.2 Hình ảnh TTBAT trong tủy của LXMc thể tiền tủy bào

1.5.2 Phương pháp phân loại miễn dịch

Phương pháp phân loại miễn dịch đã được nghiên cứu áp dụng trongLXMc từ những năm 1970 Từ đó đến nay, phương pháp này không ngừngđược cải tiến, từ phân loại miễn dịch trên kính hiển vi huỳnh quang đến phânloại bằng máy đếm tế bào dòng chảy tự động

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp, gián tiếp dựa trên nguyên lýphản ứng miễn dịch kháng nguyên-kháng thể để phát hiện các kháng nguyêncủa dòng tế bào khi chúng kết hợp đặc hiệu với kháng thể đơn dòng có gắnhuỳnh quang Mức độ dương tính của phản ứng sẽ tương ứng với mức độ phát

huỳnh quang được đọc trên kính hiển vi quang học Tuy nhiên phương phápnày có nhược điểm là phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật làm, người đọc, và chỉphân tích đơn lẻ từng dấu ấn Kỹ thuật này đã được áp dụng rộng rãi tại ViệtNam cũng như trên thế giới [29].

Kỹ thuật tế bào dòng chảy đã thể hiện được những ưu điểm vượt trội đểgiải quyết được các khó khăn trên Kỹ thuật này cho kết quả nhanh, dễ địnhlượng và còn có thể áp dụng để theo dõi bệnh tồn dư tối thiểu [30]

Các tế bào LXMc dòng tủy nói chung thường có kháng nguyên bề mặtCD33, CD11, CD13, HLA-DR dương tính Với LXMc tiền tủy bào lại có đặctrưng miễn dịch tương đối khác biệt đó là: HLA-DR âm tính, CD33 và CD9dương tính, CD14 âm tính CD34 thường âm tính hoặc có tỷ lệ dương tính rấtthấp tuy nhiên có một số trường hợp người ta nhận thấy CD34 dương tính ởmức cao và có sự liên quan với tăng số lượng bạch cầu, loại gen kết hợpPML/RAR hoặc biến thể M3v [31] Phương pháp miễn dịch học tế bào vẫnđược sử dụng để kiểm chứng lại kết quả tế bào học và hóa học tế bào trongchẩn đoán thể bệnh, tuy nhiên với LXMc tiền tủy bào thì đặc trưng về hìnhthái học và hóa học tế bào là rất rõ rệt nên thường tác dụng kiểm chứngthường chỉ có ích trong trường hợp chẩn đoán biến thể M3v [32]

Một số nghiên cứu cũng nhận thấy có những trường hợp các TTBATtrong biến thể M3v mang dấu ấn của lympho T (CD2+) và dương tính vớiCD79 Các trường hợp này cũng được xác nhận không phải là LXMc hỗn hợpnên cần phải thận trọng trong chẩn đoán CD2 thường có thể gặp ở nhữngtrường hợp LXMc tiền tủy bào nhóm bcr3 [31] Một số trường hợp về hìnhthái học và kết quả miễn dịch giống với M3v nhưng khi kiểm chứng bằng ditruyền tế bào thì không thấy có chuyển đoạn đặc trưng t(15;17) mà chỉ có bấtthường nhiễm sắc thể 17, những bệnh nhân này không có đáp ứng điều trị vớiATRA, điều này mang ý nghĩa về mặt tiên lượng Ferrara và cộng sự cho rằng

sự xuất hiện CD56 ở những bệnh nhân LXMc tiền tủy bào là yếu tố tiênlượng xấu có liên quan đến số lượng bạch cầu cao [33]

Trong những trường hợp khó khăn về chẩn đoán (thường là ở biến thểM3v), người ta cũng có thể áp dụng biện pháp kháng thể đơn dòng anti PML(còn gọi là PG-M3 hoặc MoAb) để giúp chẩn đoán xác định Kỹ thuật nàycho kết quả nhanh, độ đặc hiệu cao Như vậy khi sử dụng các kỹ thuật miễndịch học có thể giúp cho quá trình chẩn đoán và tiên lượng bệnh

1.5.3 Phương pháp di truyền tế bào - sinh học phân tử

Các bất thường di truyền tế bào có thể gặp trong một phần ba số bệnhnhân LXMc dòng tủy [34] Tuy nhiên, chỉ một số bất thường di truyền tế bào

có liên quan trực tiếp đến tiên lượng và đáp ứng điều trị Theo phân loại củaWHO 2008, một số bất thường di truyền có thể được sử dụng để chẩn đoánLXMc dòng tủy mà không đòi hỏi phải đủ tiêu chuẩn tỷ lệ blast 20% trongtủy xương [35]

Các biến đổi nhiễm sắc thể và gen trong LXMc tiền tủy bào:

- Chuyển đoạn t(15;17) và gen PML/RAR :

Hầu hết các bệnh nhân LXMc tiền tủy bào (>95%) đều có chuyển đoạnNST đặc trưng t(15;17) Điểm cắt cho chuyển đoạn là tại gen ở vị trí q22 trênNST 15 và tại gen ở vị trí q21 trên NST 17 Do tính phổ biến của nó màchuyển đoạn này giờ đây đã được xem như yếu tố chẩn đoán xác định bệnh.Chuyển đoạn này sẽ tạo ra gen kết hợp giữa gen RAR (retinoic acidreceptor) ở vị trí 17q21 (mã hóa cho protein RAR) với gen PML(promyelocytic leukemia) ở vị trí 15q22 (mã hóa cho protein PML) tạo nêngen PML/RAR

Chuyển đoạn NST t(15;17) đã làm mất chức năng bình thường của genRAR Sản phẩm protein của gen này bình thường có chức năng hoạt hóa quá

trình sao mã (hoạt hóa ADN duỗi xoắn và tổng hợp ARN thông tin) của cácgen có vai trò giúp tế bào trưởng thành Protein này có một phần cấu trúc gắnvào ADN và một phần tương tác với dẫn xuất của acid retinoic Khi cóchuyển đoạn PML/RAR, sản phẩm protein tạo ra sẽ không những khônghoạt hóa được sao mã mà còn ức chế chức năng của gen RAR bình thườngnên tế bào không thể trưởng thành được mà dừng lại một cách ác tính ở giaiđoạn tiền tủy bào [26].

Hình 1.3 Minh họa chuyển đoạn t(15;17) tạo gen PML/RARα

(Nguồn: http://hematologyinprogress.net )

Nếu điểm cắt của gen PML trên NST số 15 ở vị trí q22 trong vòng intron3(bcr3) sẽ tạo ra ARN thông tin dạng ngắn (short form), trong khi điểm cắt trong

vòng intron 6 sẽ cho ARN thông tin loại dài (long form) Điểm cắt ở intron 6 cóthể tìm thấy ở vị trí thứ 2 với kết quả chiều dài bản sao thay đổi hoặc có thể gặpđiểm cắt khác nhau (cắt đoạn ở bất kỳ vị trí nào từ 1-6) [36].

Hình 1.4 Vị trí cắt trên gen khác nhau tạo các ARN thông tin khác nhau

(Nguồn: bloodjournal.org)

Kết quả của nhiều nghiên cứu chưa thống nhất với nhau trong việc xácđịnh mối liên quan giữa hai dạng sản phẩm ARN thông tin dạng dài và dạngngắn với yếu tố tiên lượng bệnh mặc dù có ý kiến cho rằng dạng ngắn (shortform) có thời gian sống thêm toàn bộ và thời gian sống không bệnh ngắn hơndạng còn lại

Gen kết hợp làm mất chức năng chống ung thư bình thường của PML vàlàm mất chức năng bình thường của retinoic acid receptor Chính vì vậy màkhi sử dụng retinoic acid với liều dược lý sẽ giải phóng retinoic acid receptor,đồng thời phân hủy chất đồng ức chế histone deacetylase

- Các loại chuyển đoạn nhiễm sắc thể và sự kết hợp các gen khác:

Mặc dù chuyển đoạn t(15;17) được coi là đặc trưng của bệnh tuy nhiêncũng có thể gặp các chuyển đoạn bất thường khác kèm theo trong khoảng 30-40% các trường hợp LXMc tiền tủy bào Hay gặp nhất là trisomy 8, del(9q),ider(17)(q10)t(15;17) và isochromosome 17 [37] Khoảng 2-3% số ca bệnhcòn có những đột biến gen và sắp xếp lại gen khó xác định

Khoảng dưới 10% bệnh nhân không có chuyển đoạn t(15;17) mà có thểgặp các loại chuyển đoạn giữa NST số 17 và NST khác là:

+ Chuyển đoạn t(11;17)(q23;q11.12) và gen PLZF/RAR :

Chuyển đoạn này chiếm khoảng <1% số bệnh nhân LXMc tiền tủy bào.Trong kiểu chuyển đoạn này, vị trí 3' tận cùng của gen RAR trên NST số 17được nối vào vị trí 5' tận cùng của gen có tên là PLZF (promyelocyticleukemia zinc finger) trên NST số 11, gen này mã hóa cho một polypeptidechứa 9 zinc fingers (một motif thường thấy trong các yếu tố sao mã) Nồng độdược lý của retinoic acid không thể tạo nên hiện tượng ly giải của N-CoRtrong gen kết hợp PLZF/RAR trong chuyển đoạn t(11,17), điều này dẫn đến

tế bào bệnh lý tiếp tục sao mã theo hướng bị ức chế trưởng thành, bệnh nhânkhông đáp ứng điều trị với ATRA

+ Chuyển đoạn t(5;17)(q35;q11.12) và gen NPM/RAR:

Đây là loại chuyển đoạn hiếm chỉ chiếm dưới 1% số bệnh nhân LXMctiền tủy bào, trong đó gen nucleophosmin (NPM) được kết hợp với genRAR NPM là một phosphoprotein nhân tham gia vào quá trình kiến tạo vàvận chuyển (processing and transport) ribosomal ribonucleoprotein Bệnhnhân có loại chuyển đoạn này đáp ứng điều trị tốt với ATRA

+ Chuyển đoạn t(11;17)(q13;q11.12) và gen NuMA/RAR:

Đây cũng là chuyển đoạn tương hỗ giữa NST số 11 và 17 nhưng trongchuyển đoạn này gen NuMA (Nuclear matrix-mitotic apparatus protein) đượckết hợp với RAR Cũng giống như chuyển đoạn t(5;17)(q35;q11.12), thể nàyđáp ứng khá tốt với ATRA

+ Nhân đoạn nhiễm sắc thể 17 và gen STAT5b/RAR:

Gen kết hợp giữa STAT5b (signal transducer and activator oftranscription 5b) và RAR là loại rất hiếm gặp, được tìm thấy ở bệnh nhân bịnhân đoạn nhiễm sắc thể 17(dup 17) và đây là thể bệnh kháng lại ATRA

+ Chuyển đoạn NST t(X;17)(q11;q12) và gen BCOR/RAR:

Mới đây người ta đã phát hiện một trường hợp bệnh nhân LXMc tiền tủybào có chuyển đoạn NST t(X;17)(q11;q12) Kết quả của chuyển đoạn này làtạo ra gen kết hợp giữa gen đồng ức chế BCL6 (BCOR) và RAR Bệnh nhân

có chuyển đoạn đặc biệt này có đáp ứng với điều trị bằng ATRA phối hợp hóachất, tuy nhiên đã tái phát sau thời gian ngắn [38]

+ Kết hợp các đột biến gen khác:

* Trên 95% các ca LXMc tiền tủy bào có chuyển đoạn NST t(15 ;17)(q22 ;q21) dẫn đến gen kết hợp PML/RAR, trong số đó có khoảng 4-10%kết hợp với đột biến gen gây ung thư (oncogen) RAS Oncogen RAS có mặttrong khoảng 25-44% các bệnh nhân LXMc dòng tủy và thường phối hợp vớicác đột biến khác cũng có khả năng gây ung thư Mặc dù có thêm đột biến K-RAS (4%) hoặc N-RAS(10%) nhưng chưa thấy sự khác biệt giữa các nhóm có

và không có thêm bất thường gen này về lứa tuổi các bệnh nhân, số lượng bạchcầu thời điểm chẩn đoán, tiên lượng cũng như tỷ lệ gặp biến thể M3v [39]

* FLT3: FLT3 là đột biến gen hay gặp trong LXMc dòng tủy nói chung.Gen FLT3 thuộc họ receptor tyrosine kinase lớp III Gen FLT3 nằm trên nhánhdài NST 13 (13q12) và có biểu hiện trên tế bào gốc tạo máu, tế bào LXM ởngười và tế bào ác tính dòng lympho Đột biến của gen này có 3 loại là FLT3-

JM, FLT3-ITD và FLT3-TKD FLT3-JM là đột biến điểm dẫn đến tự ức chếtyrosin kinase, loại này rất hiếm gặp Loại FLT3-ITD là đột biến kiểu nội bộsong song trùng lặp, chiếm khoảng 28-34% bệnh nhân LXMc dòng tủy có kiểuhình NST bình thường FLT3- TKD là loại đột biếm điểm, xen đoạn hoặc mấtđoạn liên quan đến codon 835 và 836, kiểu đột biến gen này chiếm khoảng 11-14% bệnh nhân LXMc dòng tủy có bộ NST bình thường [40] Các nghiên cứu

đã cho thấy loại đột biến này được tìm thấy ở một số lượng lớn bệnh nhânLXMc tiền tủy bào, đặc biệt là ở typ short form PML-RAR FLT3 gặp trongLXMc tiền tủy bào có hai loại đột biến ở vị trí ITD (internal tandemduplication) và TKD (tyrosine kinase domain) với tần suất gặp khoảng 12-38% Loại đột biến FLT3-ITD có liên quan đến một số đặc điểm của bệnh như

số lượng bạch cầu tăng, PML/RAR loại bcr3 và biến thể M3v Loại đột biếnđiểm FLT3-D835 (ảnh hưởng đến aspartate 835) gặp trên khoảng 9% bệnhnhân LXMc tiền tủy bào, hiện nay mối liên quan giữa loại đột biến này và tiênlượng bệnh còn chưa rõ ràng [41],[42]

Tất cả các bệnh nhân LXMc tiền tủy bào đều có đặc điểm chung là độtbiến trên NST số 17 ở vị trí của gen mã hóa cho retinoic acid receptor(RAR) Những gen kết hợp này gọi là nhóm gen đối tác với RAR và đượcgọi chung là nhóm X-gen

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ

1.6.1 Mục tiêu điều trị và tiêu chuẩn đáp ứng điều trị

Mục tiêu chính trong điều trị LXMc dòng tủy là đạt được và duy trìđược lui bệnh hoàn toàn Bằng huyết tủy đồ theo tiêu chuẩn của Viện Ung thưquốc gia Mỹ, sau 4 tuần-khi kết thúc điều trị từng đợt hoặc khi xét nghiệmmáu ngoại vi thấy số lượng tiểu cầu >100G/l, số lượng bạch cầu trung tính

>1,5G/l và không còn tế bào ác tính [43]

+ Lui bệnh hoàn toàn: bệnh nhân ổn định trên lâm sàng, có số lượng bạchcầu trung tính >1,5G/l, Hct > 0,3 l/l, số lượng tiểu cầu > 100 G/l, không cònTTBAT máu ngoại vi, TTBAT tủy <5% trên nền tủy sinh máu bình thường.+ Lui bệnh không hoàn toàn: TTBAT tủy xương từ 5-25%

+ Không lui bệnh: TTBAT tủy xương >25%

1.6.2 Phác đồ điều trị tấn công và củng cố theo Ades 2006 [44]

Điều trị tấn công 1 đợt, củng cố 2 đợt hóa chất phối hợp ATRA

Nhóm số lượng bạch cầu >10G/l: Daunorubicin 45mg/m2 da/ngày, tĩnhmạch  3 ngày, Ara C 200 mg/m2 da/ngày, tĩnh mạch  7 ngày, ATRA45mg/m2 da/ngày, uống chia 2 lần cách nhau 12h đến lui bệnh hoàn toàn(hoặc tối đa 90 ngày)

Nhóm số lượng bạch cầu <10G/l: Daunorubicin 45mg/m2 da/ngày, tĩnhmạch  3 ngày, ATRA 45mg/m2 da/ngày, uống chia 2 lần cách nhau 12h đếnlui bệnh hoàn toàn (hoặc tối đa 90 ngày)

1.6.3 Phác đồ điều trị theo ASH đang áp dụng tại Khoa bệnh máu trẻ

em, Viện Huyết học-Truyền máu Trung Ương [45]

Điều trị

tấn công

DNR 60mg/m 2 /ngày (ngày 2,4,6,8)

ATRA 45 mg/m 2 /ngày (từ ngày 1 đến lui bệnh hoàn toàn)

Dexamethasone 2,5 mg/m2/12h x 15 ngày (nếu BC >5 G/L)

TC ≤40G/L)

Nguy cơ cao (BC >10G/L; TC ≤40G/L)

≥60 tuổi

ATRA 45 mg/m 2 /ngày x15

DNR 25mg/m 2 /ngày (ngày 1,2,3,4)

Ara-C 1000 mg/m 2 /ngày (ngày 1,2,3,4) ATRA 45mg/m 2 /ngày x15 MTZ 10 mg/m 2 /ngày (ngày 1,2,3)

ATRA 45 mg/m 2 /ngày x15 MTZ 10 mg/m

2 /ngày (ngày 1,2,3,4,5)

ATRA 45mg/m 2 /ngày x15 DNR 60 mg/m 2 /ngày

(ngày 1)

ATRA 45 mg/m 2 /ngày

x15

DNR 60mg/m 2 /ngày (ngày 1,2)

ATRA 45 mg/m 2 /ngày x15

DNR 60 mg/m 2 /ngày (ngày 1) Ara-C 150 mg/m 2 /8h (ngày 1,2,3,4)

ATRA 45mg/m 2 /ngày x15

Điều trị

duy trì 2 năm: ATRA 45mg/m2 /ngày x15 (mỗi 3 tháng)

Methotrexate 15mg/m 2 /ngày (hàng tuần)

6-Mercaptopurine 50mg/m 2 /ngày

Ghi chú:

- BN >70 tuổi chỉ nhận 3 liều điều trị DNR (ngày 2,4,6) trong đợt tấncông

- BN <20 tuổi, liều ATRA giảm xuống 25 mg/m2/ngày chia 2 lần

1.6.4 Phác đồ điều trị khi lui bệnh hoàn toàn và điều trị hỗ trợ

- Điều trị duy trì trong 2 năm: uống ATRA 20mg/ngày và 6MP 50mg/m2da/ngày

- Điều trị hỗ trợ:

+ Điều trị các rối loạn đông máu nếu có và tùy theo phác đồ hướng dẫnchẩn đoán và điều trị rối loạn đông máu của Viện Huyết học-Truyền máu 2005.+ Truyền các chế phẩm máu hỗ trợ (khối hồng cầu khi HST < 80 g/l,khối tiểu cầu khi SLTC < 20 G/l) hoặc xuất huyết trầm trọng.

+ Methylprednisolon tĩnh mạch 80mg/ngày (dự phòng hội chứngretinoic acid)

+ Sử dụng kháng sinh khi có nhiễm khuẩn hoặc SLBC < 1 G/l

+ Hướng dẫn bệnh nhân chế độ ăn uống và giữ vệ sinh

1.6.5 Điều trị tái phát

- Tiến hành điều trị khi bệnh nhân xuất hiện lại các triệu chứng lâm sàng,máu ngoại vi xuất hiện TTBAT hoặc tủy đồ có tỷ lệ TTBAT>5%; hay khibệnh nhân chưa có triệu chứng lâm sàng nhưng đã xuất hiện trở lại gen bệnhPML/RAR

- Phác đồ điều trị tái phát: nhóm 1: 3 đợt như điều trị tấn công, nhóm 2: 3đợt, mỗi đợt: arsenic trioxide 0,15mg/m2 da/ngày30 ngày truyền tĩnh mạch

- Điều trị hỗ trợ và theo dõi như trên

1.6.6 Cơ chế tác dụng, tác dụng phụ của các thuốc và biện pháp điều trị LXMc tiền tủy bào

Ngoài hóa chất giống như trong điều trị các thể LXMc dòng tủy khác thìthuốc điều trị LXMc tiền tủy bào có một số điểm khác biệt đặc biệt là việc sửdụng ATRA và arsenic trioxide

1.6.6.1 Cơ chế tác dụng của ATRA

+ Tác động lên biệt hóa tế bào [36],[46]

LXMc tiền tủy bào có tỷ lệ tử vong nhanh cao do rối loạn đông máu.Nguyên nhân là do TTBAT chứa rất nhiều enzyme tiêu protein và tiêu fibrintrong các hạt đặc hiệu Vì vậy mà khi điều trị hóa chất cho bệnh nhân, cácTTBAT vỡ ra sẽ giải phóng càng nhiều hạt đặc hiệu và gây rối loạn đông máunặng nề hơn dẫn đến nguy cơ tử vong nhanh ATRA có hoạt động khác với

hóa chất ở chỗ nó không tiêu diệt tế bào mà lại biệt hóa tế bào ung thư thành

tế bào dòng hạt trưởng thành Người ta giả thuyết ATRA có tác dụng ít nhấttrên 2 giai đoạn của quá trình phát triển của dòng tủy: tác dụng lên tiền tủybào ác tính và tế bào nguồn sinh u giai đoạn sớm (earlier neoplasticprogenitor cell –loại tế bào có khả năng tự non hóa và biệt hóa định hướngdòng tủy) Tác dụng biệt hóa này của ATRA là một chiều đi từ tế bào ung thưcho tới tế bào trưởng thành rồi đi vào chu trình chết theo chương trình [47].Tác dụng của ATRA lên tế bào nhạy cảm dòng NB4 được thiết lập theo 2bước tấn công biệt hóa TTBAT: bước đầu phụ thuộc RA, các tế bào sẽ trưởngthành thuần thục khi có retinoid, bước thứ hai phụ thuộc AMP vòng-khởiđộng mồi RA của tế bào để kết thúc quá trình biệt hóa

Hình 1.5 Tác động của ATRA lên TTBAT

(Nguồn: http://www.ufrgs.br )

Nồng độ ATRA từ 10-9-10-8M sẽ có thể làm kết thúc quá trình biệt hóaTTBAT với sự có mặt của AMP vòng ATRA có thể làm tăng ngay lập tứclượng AMP vòng nội bào và hoạt hóa con đường protein kinase A (PKA) saukhi dùng thuốc Tác dụng này bị hủy bỏ ngay khi có chất kháng PKA, điềunày gợi ý rằng có sự phối hợp cơ chế hoạt hóa giữa tín hiệu nhân RA và tín

hiệu phối hợp AMP vòng/PKA trên màng tế bào.

Retinoid có tác dụng lên tạo máu thông qua hai họ receptor nhân làRARs và retinoid X receptor (RXRs) RARs và RXRs có hoạt động giốngnhư yếu tố liên kết tấn công cho quá trình sao mã RAR là một protein tổhợp với RXR và phức hợp RAR/RXR này gắn lên vị trí đáp ứng với RA(RARE-RA response eleenzymet) nằm trên vùng khởi động của gen đích Khigắn retinoid, tổ hợp RAR/RXR bị phân ly về mặt hóa học với sự hoạt độngcủa histone deacetylase (HDAC) và phức hợp cũng bị phân hủy với đồng yếu

tố hoạt hóa histone acetylase [48]

PML-RAR có thể ảnh hưởng đến quá trình sao mã theo các cách khácnhau liên quan đến yếu tố sao mã APL và yếu tố đáp ứng với interferon (IFN).ATRA có thể thúc đẩy gen IRF-1(INF regulatory factor-1) tiến hành sao mã.Biểu hiện của IRF-1 phối hợp với biểu hiện của IFN và gen đích IFN sẽ làmngừng phát triển tế bào và dẫn đến apoptosis Như vậy IFN đóng vai trò trunggian điều hòa với tác dụng của ATRA lên biệt hóa tế bào

ATRA có tác dụng dị hóa PML/RAR, đây là cơ chế hoạt động chính đểbiệt hóa tế bào TTBAT Dưới nồng độ dược lý (10-7- 10-6M), sự thay đổi cấuhình của PML/RAR là do giải phóng các đồng yếu tố kìm hãm và HDAC;tăng cường các phức hợp đồng hoạt hóa dẫn đến giải phóng các kìm hãm sao

mã Các thực nghiệm cũng như các nghiên cứu lâm sàng dựa trên nhữngtrường hợp có chuyển đoạn t(11;17) và protein PLZF/RAR đã cho thấy sựtương hỗ giữa các đồng yếu tố ức chế và HDAC của phần RAR trongPLZF/RAR sẽ bị điều chỉnh bởi ATRA ở nồng độ 10-6M Tuy nhiên phầngắn của PLZF lên phức hợp đồng ức chế trên vùng POZ tại N tận cùng thì vẫntồn tại dù ở nồng độ ATRA rất cao (10-5M) Vì vậy mà ATRA không thể tạo

được biệt hóa cho những tế bào mang gen kết hợp PLZF/RAR mà mức độ

ức chế HDAC lại phụ thuộc vào khả năng biệt hóa tế bào của ATRA Vì vậy

mà nghiên cứu phá hủy histone deacetylase là một hướng điều trị cho nhữngbệnh nhân kháng ATRA [49]

ATRA thông qua AMP vòng, làm thúc đẩy mạnh mẽ quá trình sao mã,khôi phục chức năng RXR, lập lại khả năng gây biệt hóa của những tế bào bịbiến đổi gen, ức chế các tế bào đã phát triển và điều tiết sự thay đổi ở phaG1/S của quá trình phân bào ATRA cũng có thể làm tăng biểu hiện ức chếprotein p21 cyclin phụ thuộc kinase trên tế bào dòng tủy vì vậy mà dừng chutrình tế bào ở pha G1 Một số nghiên cứu gần đây đã cho thấy gen C/EBP vàsản phẩm protein của nó đóng vai trò quan trọng trong quá trình biệt hóaTTBAT dưới tác dụng của ATRA Đây được coi là gen đích của PML/RARphụ thuộc ATRA Protein C/EBP là một thành viên trong họ yếu tố sao mãC/EBP biểu hiện trên TTBAT dòng NB4, giúp cho sự biệt hóa TTBAT khi cómặt ATRA, tuy nhiên chỉ trong trường hợp bệnh nhân có đột biến genPML/RAR Người ta thấy nồng độ protein C/EBP tăng nhanh ở tế bàoHL60 khi có mặt ATRA với liều dược lý [50] Như vậy khả năng thúc đẩy biệthóa của ATRA với TTBAT dựa trên hệ thống sao mã và hệ thống protein baogồm: tấn công một dãy các yếu tố sao mã và đồng yếu tố, hoạt hóa tín hiệucanxi, thúc đẩy con đường INF, cần thiết cho thoái hóa PML/RAR và khôiphục PML thể nhân thông qua hoạt động của hệ thống ubiquitin/proteasome(UPS), ức chế chu kỳ tế bào, tấn công cyclooxygenase 1, ức chế tân tạo mạch,giảm yếu tố tổ chức, tăng khả năng chết theo chương trình Các can thiệptrong biến đổi gen và chuyển hóa kể trên sẽ đưa đến kết quả là các tiền tủybào ác tính cuối cùng sẽ có thể biệt hóa và chết theo chương trình (PCD-programmed cell death) [46]

* Vai trò của ATRA tác động lên rối loạn đông máu trong LXMc tiền

ATRA tác động vào tế bào ung thư:

ATRA tác động lên tất cả các yếu tố gây rối loạn đông máu của TTBAT

- Tác động lên các yếu tố tiền đông hoạt động:

Có ít nhất 3 loại yếu tố tiền đông của các tế bào ung thư đã được cácnghiên cứu xác định đó là:

+ Yếu tố tổ chức (TF), hoạt động tạo phức hợp với yếu tố VII (FVII) đểhoạt hóa yếu tố X và IX Yếu tố này là yếu tố tiền đông sinh lý và cũng nằmtrong các tổ chức ung thư

+ Receptor màng của yếu tố V, làm dễ dàng hình thành phức hệprothrombinase và có thể thúc đẩy quá trình này tăng tốc 100.000 lần

+ Yếu tố tiền đông ung thư (cancer procoagulant-CP), một cystein proteinasegây hoạt hóa trực tiếp yếu tố X, không cần sự có mặt của yếu tố VII [51]

Khi sử dụng ATRA trong quá trình nuôi cấy tế bào dòng NB4 người tathấy chúng mất khả năng bộc lộ CP và giảm khả năng bộc lộ TF ATRA cókhả năng ức chế các yếu tố tiền đông hoạt động của các TTBAT trên invitro

và invivo

- Tác động lên hệ thống tiêu fibrin và tiêu protein [52]:

TTBAT chứa cả u-PA (urokinase-type plasminogen activator) và t-PA

(tissue-type plasminogen activator) Các protease trong hạt đặc hiệu của tếbào là elastase và chymotripsin Các protease này có khả năng phá hủy cácyếu tố đông máu và thúc đẩy mạnh mẽ quá trình tiêu sợi huyết bằng cách thủyphân protein với hai yếu tố ức chế plasmin là 2-antiplasmin và C1 esterase.Thêm nữa, elastase có thể cắt trực tiếp các phân tử fibrinogen để tạo ra cácmẩu peptid (FDP) Ở những bệnh nhân LXMc tiền tủy bào khi sử dụng ATRAthì các dấu hiệu ban đầu của tăng tiêu fibrin như lượng D-dimer cao sẽ nhanhchóng giảm xuống khi tế bào biệt hóa phản ánh tình trạng tiêu fibrin xuất phát

từ chính các tế bào ác tính Sau đó ATRA sẽ thúc đẩy tổng hợp PAI làm giảmreceptor gắn plasminogen hoạt hóa

- Tác động lên giải phóng cytokin: Nhiều nghiên cứu đã cho thấy cáctiền tủy bào ở những bệnh nhân có DIC tiết ra nhiều IL-1 hơn những tế bào

ở bệnh nhân không có DIC Các cytokin viêm sẽ làm điều hòa ngược khảnăng bộc lộ thrombomodulin (TM) của tế bào nội mạc và làm tăng nhạy cảmcủa các receptor bề mặt với thrombin Phức hợp TM-thrombin sẽ hoạt hóa hệthống protein C để đảm nhận chức năng chống đông Điều hòa xuôi yếu tố tổchức và điều hòa ngược TM dẫn đến tạo điều kiện tạo huyết khối của thànhmạch Thêm nữa, TNF- và IL-1 có thể kích thích tế bào nội mạc sản xuấtPAI-1 ATRA có tác dụng điều hòa các tế bào lơxêmi sản xuất cytokin ATRAchống lại cả hai tác động điều hòa ngược TM và điều hòa xuôi TF của tế bàonội mạc dưới tác dụng của TNF-α Mặc dù ATRA có thể làm TTBAT tăng sảnxuất cytokin nhưng mặt khác cũng chính nó bảo vệ tế bào nội mạc chống lạicác tác động khởi phát đông máu của các cytokin này [53]

- Các TTBAT có khả năng tổng hợp và giải phóng serin proteasecathepsin G, enzyme này có thể chia cắt fibrinogen và PAI-1, trung hòa cácchất ức chế yếu tố tổ chức và còn là chất trung gian cho bạch cầu để tấn công

ngưng tập tiểu cầu ATRA có tác dụng điều hòa ngược quá trình bộc lộcathepsin G của TTBAT

- Annexin VIII là một thành viên trong họ protein gắn phospholipid phụthuộc Ca++ Cũng giống annexin V, nó ức chế quá trình hoạt hóa hệ thốngđông máu phụ thuộc phospholipid Gen annexin VIII bộc lộ quá mức trongLXMc tiền tủy bào và bị điều hòa ngược bởi ATRA

ATRA tác động lên tế bào nội mạc và tế bào mono:

Tế bào nội mạc có khả năng tổng hợp ra tất cả các chất trong hệ thốngtiêu fibrin (t-PA, u-PA, PAI-1) và các receptor với hoạt hóa plasminogen vàplasminogen Các chất giãn mạch như bradykinin, các yếu tố hoạt hóa tiểucầu và thrombin đều có thể gây giải phóng tức thì t-PA từ kho dự trữ ở thành

mạch Hoạt hóa protein kinase C có liên quan đến điều hòa hoạt động sao mã

và tổng hợp t-PA của tế bào nội mạc ATRA làm tăng tổng hợp t-PA của tế bàonội mạc ATRA can thiệp vào quá trình tiêu sợi huyết của tế bào bằng hoạtđộng theo phương thức receptor nhân để tế bào nội mạc sản xuất ra t-PA khi

có mặt của các receptor bề mặt như thrombin, histamine, phorbol myristate 13-acetate (PMA) Như vậy ATRA làm tăng khả năng chống huyếtkhối của hàng rào mạch máu Mặt khác, nó cũng khiến cho tế bào nội mạctăng sản xuất PAI-1 để tránh tiêu sợi huyết quá mức ATRA còn tác động lênquá trình dính của TTBAT vào tế bào nội mạc, đây là một trong các cơ chếchính dẫn đến một loạt các biến đổi của mạch máu ATRA cũng có thể ức chếbộc lộ các yếu tố tiền đông của hệ mono-đại thực bào, qua đó hạn chế đượchoạt hóa đông máu quá mức

12-Các nghiên cứu lâm sàng cũng cho thấy thời gian phục hồi đông máu ởnhững bệnh nhân điều trị bằng ATRA ngắn hơn so với những bệnh nhân chỉ

+ Trên hệ chuyển hóa: làm tăng glycerid và cholesterol máu.

+ Trên hệ tiêu hóa: độc gan (có thể gây tăng glutaminoxalotrasferase,phosphatase kiềm và bilirubin)

+ Trên tim mạch: gây suy tim xung huyết, quá tải tuần hoàn, phù chidưới, tràn dịch màng tim

+ Trên hô hấp: tràn dịch màng phổi, suy hô hấp, gây hình ảnh thâmnhiễm trên phim XQ

+ Trên máu và tạo máu: làm tăng bạch cầu, tiểu cầu, có thể làm giảm tiểucầu muộn, đôi khi cũng có thể thấy hội chứng rối loạn đông máu xuất hiện trởlại ở giai đoạn muộn

Kháng retinoid:

Có hai loại kháng retinoid là kháng ngay trong đợt điều trị đầu tiên(kháng retinoid tiên phát) và kháng retinoid mắc phải (thứ phát) Người ta sửdụng kỹ thuật RT-PCR để có thể xác định gen kết hợp PML/RAR và theodõi trong quá trình điều trị thì thấy phần lớn các trường hợp kháng retinoid

tiên phát không có gen kết hợp PML/RAR như trường hợp PLZF/RAR.Người ta thấy rằng cũng có thể thấy kháng retinoid ở những bệnh nhân códạng gen kết hợp PML/RAR loại short form Tuy nhiên, tỷ lệ kháng retinoidtiên phát thường rất ít gặp.

Kháng retinoid mắc phải thường gặp với tỷ lệ khá cao (>40%) ở nhữngbệnh nhân được điều trị ATRA đơn thuần Nguyên nhân được cho là do dượcđộng học lâm sàng của thuốc Sau liều ATRA uống đơn độc, thuốc sẽ đạt nồng

độ đỉnh huyết tương trong vòng 1 đến 2h, nửa đời sống tối đa là 40 phút vàthuốc nhanh chóng biến mất khỏi huyết tương

1.7 TIÊN LƯỢNG LXMC TIỀN TỦY BÀO

Đã có rất nhiều nghiên cứu tìm hiểu về các yếu tố tiên lượng đối vớiLXMc dòng tủy, gồm các thông số về lâm sàng và cận lâm sàng Di truyền tếbào là yếu tố tiên lượng độc lập quan trọng đối với khả năng lui bệnh và thờigian lui bệnh [54] Các yếu tố liên quan đến tiên lượng nặng bao gồm [55]:

- Loại chuyển đoạn nhiễm sắc thể và gen:

+ Chuyển đoạn NST t(11;17)(q23;q11.12) tạo gen PLZF/RARa

+ Nhân đoạn NST 17 tạo gen STAT5b/RARa

+ Gen kết hợp PML/RAR loại short form

- Có thêm đột biến gen FLT3-ITD

- Biến thể M3v

- Số lượng bạch cầu cao>10G/l từ thời điểm chẩn đoán Tỷ lệ TTBAT>70%

- Nồng độ LDH cao, creatinin tăng

- Xuất hiện thêm CD 56 và CD 34

- Giới: nam.

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là tất cả bệnh nhi được điều trị tại Khoa Bệnh máutrẻ em (H6) tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương đáp ứng các tiêuchuẩn sau:

Chẩn đoán xác định lơxêmi cấp tiền tủy bào lần đầu theo tiêu chuẩn FAB [3],[56], thời gian chẩn đoán từ tháng 6 năm 2014 đến hết tháng 5 năm 2018

- < 16 tuổi.

- Chưa được điều trị hóa chất trước đó.

- Không có chống chỉ định với điều trị hóa chất.

- Bệnh nhân và gia đình tự nguyện đồng ý điều trị.

Các bệnh nhân được nghiên cứu về các đặc điểm lâm sàng và xét nghiệmtại thời điểm nhập viện

Những bệnh nhân điều trị tấn công thành công, tiếp tục được điều trịcủng cố đợt 1, 2, 3, được nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm trướcđiều trị và đáp ứng điều trị sau từng đợt

Những bệnh nhân vào điều trị từ 09/2017 được định lượng gen bệnhtrước và sau mỗi đợt điều trị bằng kỹ thuật PCR định lượng (RQ – PCR) đểđánh giá hiệu quả điều trị

Bệnh nhân được theo dõi dọc kể từ khi chẩn đoán đến hết 05/2018

Tiêu chuẩn loại trừ: những bệnh nhân không đáp ứng các tiêu chuẩn trên

2.2 THỜI GIAN TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU

Từ tháng 9 năm 2017 đến hết tháng 8 năm 2018

2.3 BỆNH PHẨM NGHIÊN CỨU

- Máu ngoại vi của bệnh nhân: để làm huyết đồ, xét nghiệm tổng phân

tích tế bào máu ngoại vi, xét nghiệm sinh hóa máu, xét nghiệm đông máu thờiđiểm chẩn đoán và theo dõi hàng ngày trong quá trình điều trị

- Dịch tủy xương của bệnh nhân: 0,5ml để làm xét nghiệm huyết tủy đồ

chẩn đoán bệnh, 0,5-1ml để nuôi cấy và phân tích nhiễm sắc thể, thực hiện kỹthuật FISH xác định chuyển đoạn t(15;17), tìm các dấu ấn biệt hóa tế bàomáu, xác định biến đổi gen PML/RARα bằng kỹ thuật RT-PCR và định lượnggen bệnh trước và sau mỗi đợt điều trị bằng kỹ thuật RQ-PCR

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu

- Phương pháp nghiên cứu là hồi cứu, tiến cứu có can thiệp lâm sàng.

- Những bệnh nhân chẩn đoán trước tháng 9 năm 2017 sẽ được nghiên

cứu mô tả hồi cứu những đợt điều trị trước đó, và tiếp tục được theo dõi tiếncứu, can thiệp lâm sàng không đối chứng cùng với những bệnh nhân chẩnđoán lần đầu sau tháng 9 năm 2017

- Nhóm can thiệp: các bệnh nhân được chẩn đoán LXMc tiền tủy bào lần

đầu từ 9/2017-5/2018, điều trị bằng phác đồ ATRA phối hợp hóa chất

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

2.4.2 Mẫu nghiên cứu

Chọn mẫu thuận tiện, tất cả các bệnh án, bệnh nhân thỏa mãn tiêu chuẩnlựa chọn và loại trừ trong thời gian từ tháng 6 năm 2014 đến tháng 5 năm2018

BN chẩn đoán APL, điều trị

từ T6/2014-T8/2017

Lập hồ sơ NC đặc điểm LS, XN, đánh giá đáp

ứng sau mỗi đợt điều trị

Vào viện điều trị đợt mới

XN genPML/RARα

BN mới chẩn đoán lần đầu

TPTTBM, HTĐ, ĐM, SHM, CD, NST, FISH, định lượng gen bệnh PML/RARα

2.4.3 Các nội dung cần nghiên cứu

- Nghiên cứu các đặc điểm lâm sàng khi chẩn đoán bệnh và trong quá

trình điều trị

- Nghiên cứu các đặc điểm huyết học của bệnh nhân khi chẩn đoán bệnh

và trong quá trình điều trị: các chỉ số tế bào máu ngoại vi và tủy xương, cácchỉ số đông máu, sinh hóa, các biến đổi nhiễm sắc thể và gen PML/RARα

- Nghiên cứu đáp ứng điều trị: số ngày điều trị, tỷ lệ lui bệnh, biến chứng

trong quá trình điều trị, tỉ lệ gen bệnh PML/RARα còn lại sau mỗi đợt điều trị

2.5 CÁC TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ

2.5.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán LXMc tiền tủy bào theo FAB [3],[56]

- Lâm sàng: có các hội chứng xuất huyết nổi bật, thiếu máu, nhiễm trùng

và thâm nhiễm

- Xét nghiệm:

+ Số lượng TTBAT trong tủy xương ≥ 30%

+ Thể M3 điển hình: TTBAT có hình dạng tiền tủy bào bất thường tăngsinh các hạt đặc hiệu bắt màu ưa azua, quan sát dễ dàng bằng kính hiển viquang học Một số TTBAT chứa thể Auer trong nguyên sinh chất

+ Biến biến thể M3v: TTBAT có hình thái giống tiền mono: nhân lớn,cuộn, chia thùy, ít thấy hạt nhân, nguyên sinh chất rộng, không thấy có hạt.Một số ít TTBAT cũng có chứa thể Auer

+ Các tế bào TTBAT ở cả hai dưới nhóm đều có đặc điểm về hóa học

tế bào:

Esterase không đặc hiệu dương tính mạnh

Esterase không đặc hiệu có ức chế NaF dương tính mạnh

2.5.2 Tiêu chuẩn xếp loại nhóm nguy cơ theo Sanz score [6]

- Nhóm nguy cơ thấp: Số lượng bạch cầu ở thời điểm vào viện  10G/l

và số lượng tiểu cầu > 40G/l

- Nhóm nguy cơ trung bình: chỉ có một trong 2 tiêu chuẩn trên.

- Nhóm nguy cơ cao: số lượng bạch cầu thời điểm vào viện >10G/l 2.5.3 Tiêu chuẩn đánh giá phân loại mức độ thiếu máu [57]

- Hb từ 90 đến < 120 g/l: thiếu máu nhẹ.

- Hb từ 60 đến < 90 g/l: thiếu máu vừa.

- Hb từ 30 đến < 60 g/l: thiếu máu nặng.

- Hb < 30 g/l: thiếu máu rất nặng.

2.5.4 Tiêu chuẩn đánh giá DIC

Sử dụng tiêu chuẩn chẩn đoán đông máu nội mạch rải rác của ISTH

2001 sửa đổi [58],[59]: nếu tổng ≥ 5 điểm: DIC rõ ràng, 1-4 điểm: theo dõi,chấm điểm lại sau 2-3 ngày

D-dimer so với giới hạn

cao bình thường (dấu ấn

tăng tiêu fibrin)

2.5.5 Tiêu chuẩn chẩn đoán hội chứng retinoic acid [60]

Hội chứng retinoic acid có thể xảy ra trong 21 ngày điều trị đầu tiên.Theo Frankel và cộng sự năm 1992, chẩn đoán chắc chắn có mặt RAS trênlâm sàng khi có ít nhất ba trong số những dấu hiệu sau đây:

- Tăng cân,

- Suy hô hấp,

- Sốt không rõ nguyên nhân,

- Thâm nhiễm phổi kẽ,

Tiêu chuẩn loại trừ:

2.5.6 Tiêu chuẩn đánh giá kết quả điều trị

Bằng huyết tủy đồ theo tiêu chuẩn của Viện Ung thư quốc gia Mỹ, sau 4tuần-khi kết thúc điều trị từng đợt hoặc khi xét nghiệm máu ngoại vi thấy sốlượng tiểu cầu >100G/l, số lượng bạch cầu trung tính >1,5G/l và không còn tếbào ác tính [43]

- Lui bệnh hoàn toàn: bệnh nhân ổn định trên lâm sàng, có số lượng bạch

cầu trung tính >1,5G/l, Hct >0,3l/l, số lượng tiểu cầu >100G/l, không cònTTBAT máu ngoại vi, TTBAT tủy <5% trên nền tủy sinh máu bình thường

- Lui bệnh không hoàn toàn: TTBAT tủy xương từ 5-25%.

- Không lui bệnh: TTBAT tủy xương >25%.

2.6 CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

2.6.1 Kỹ thuật nhuộm tiêu bản tủy xương bằng Giemsa.

- Tiêu bản máu đàn để khô

- Cố định bằng cồn 96 độ

- Nhuộm Giemsa hai thì

2.6.2 Kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào: peroxydase (MPO), sudan đen, esterase đặc hiệu và không đặc hiệu, PAS.

Các kỹ thuật nhuộm theo quy trình hiện đang áp dụng tại khoa tế bào tổchức học viện Huyết học - Truyền máu trung ương

2.6.3 Kỹ thuật xét nghiệm đông máu:

- Xác định các chỉ số PT, APTT, TT, fibrinogen, D-dimer trên máy xét

nghiệm đông máu tự động ACL TOP 700 tại phòng xét nghiệm đông máuviện Huyết học-truyền máu trung ương

- Nghiệm pháp rượu (Ethnol): Chứng minh sự có mặt của các phức hệ

hòa tan trong đông máu nội mạch rải rác

- Nghiệm pháp tiêu euglobulin(Von Kaulla): Toan hóa huyết tương để

tách euglobulin, loại bỏ tất cả các thành phần ức chế tiêu cục đông sau đó choeuglobulin trở lại, theo dõi quá trình tiêu euglobulin để đánh giá hệ thống hoạthóa plasminogen

Các kỹ thuật áp dụng theo quy trình của Khoa Đông máu, Viện Huyếthọc – Truyền máu Trung Ương

2.6.4 Kỹ thuật xác định kháng nguyên màng tế bào bằng kháng thể đơn dòng dựa trên phương pháp miễn dịch huỳnh quang:

- Các kháng thể đặc hiệu kháng CD đã được gắn chất huỳnh quang sẽ kết

hợp với các CD tương ứng trên màng tế bào Tế bào có các CD bề mặt sẽ kếthợp với các kháng thể tương ứng gắn huỳnh quang và phát sáng trên kínhhiển vi huỳnh quang

- Đọc kết quả trên kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng thích hợp Tính

tỷ lệ tế bào TTBAT dương tính trên 200 tế bào có nhân

- Phân tích các CD dòng tủy: CD 13, 14, 15, 33, 34, HLA-DR, phân tích

các CD dòng lympho CD3, 7, 10, 19, 20 để chẩn đoán xác định và loại trừ

- Tiến hành kỹ thuật theo quy trình hiện đang áp dụng tại khoa miễn dịch

viện Huyết học- truyền máu

2.6.5 Các kỹ thuật Di truyền – Sinh học phân tử

2.6.5.1 Kỹ thuật phân tích nhiễm sắc thể (NST)

- Kỹ thuật nuôi cấy tế bào tủy ngắn hạn: tích lũy cụm kỳ giữa, thu thập tế

bào nuôi cấy, xử lý nhược trương, cố định, dàn tiêu bản, đánh số và nhuộmNST

- Các kỹ thuật nhuộm NST:

+ Kỹ thuật nhuộm Giemsa đánh giá sơ bộ

+ Kỹ thuật nhuộm băng G

+ Kỹ thuật nhuộm băng R

- Lam sau khi nhuộm Giemsa sẽ được quét trên hệ thống Metafer, và

phân tích bằng phần mềm Ikaros Hoặc lưu tọa độ, vẽ lại cụm NST quan sátđược bằng kính hiển vi thường Sau đó phân tích về số lượng và cấu trúcNST

- Các kỹ thuật được tiến hành theo quy trình hiện đang áp dụng tại khoa

Di truyền – Sinh học phân tử Viện Huyết học- truyền máu Trung ương

2.6.5.2 Các kỹ thuật PCR (RT-PCR, Nested-PCR và RQ-PCR)

- RT-PCR (Reverse transcriptase – PCR) và Nested-PCR xác định biến

đổi gen PML/RAR

Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu theo kỹ thuật Nested PCR xác định biếnđổi gen PML/RAR (bước 1: RT-reverse transcription; bước 2: PCR; bước 3:nested-phản ứng PCR lần 2)

Xác định kiểu biến đổi gen dựa trên kích cỡ sản phẩm bằng điện di trênagarose

Hình 2.1 Minh họa các bước phản ứng RT-PCR [61]

- Tiến hành PCR định lượng (RQ-PCR) biểu hiện gen bệnh PML/RAR:Phương pháp real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩmkhuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứnghuỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tănglên của tín hiệu huỳnh quang Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh sốlượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ

+ Trong nghiên cứu này kỹ thuật Real time PCR sử dụng các đầu dò laigắn huỳnh quang (Taqman hoặc Light Cycler) bổ sung thêm vào các đoạnmồi đặc hiệu gen PML/RARα Bình thường, dầu dò không phát huỳnh quang.Trong quá trình thực hiện PCR khi Taq polymerase kéo dài các đoạn mồitrong pha kéo dài chuỗi của PCR, hoạt tính exonuclease của nó cắt đứt liênkết giữa đầu phát sáng và hấp thu, dẫn tới việc chất huỳnh quang được giảiphóng Trong pha tuyến tính của PCR, có sự tương quan giữa lượng sản phẩmđích và lượng huỳnh quang được giải phóng.Trên cơ sở đó, có thể xác định

chính xác lượng sản phẩm đích, cho phép phát hiện và lượng hóa bệnh tồn dưtối thiểu cũng như mức độ lui bệnh về mặt phân tử.

+ RQ-PCR có ưu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phép chúng

ta định lượng số copy khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độ nhạycao trên một phạm vi động học lớn Các kết quả của RQ-PCR có thể là chấtlượng (sự có mặt hoặc không của trình tự đích) hoặc định lượng (sốbản copy của DNA) Số liệu của RQ-PCR có thể đánh giá mà không cầnđiện di gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên liệu đưavào quá trình được tăng lên Cuối cùng, do các phản ứng được chạy và sốliệu được đánh giá trong một hệ thống tube đóng kín, nên các cơ hội nhiễmbẩn được giảm thiểu và sự cần thiết của các thao tác hậu khuếch đại đượcloại bỏ

+ Kết quả định lượng của RQ-PCR được biểu hiện bằng đường congkhuếch đại mẫu Trong đó số chu kỳ PCR được trình bày trên trục x, và tínhiệu huỳnh quang từ phản ứng khuếch đại, tỷ lệ với số lượng sản phẩmđược khuếch đại trong tube, được trình bày ở trục y Đường cong khuếchđại có 2 pha, một pha hàm mũ (exponential phase) được tiếp theo bởimột pha ổn định (plateau phase) Trong suốt pha hàm mũ, số lượng sảnphẩm PCR xấp xỉ gấp đôi trong mỗi chu kỳ Tuy nhiên, khi phản ứngdiễn ra thành phần phản ứng sẽ bị tiêu hao, cuối cùng làm cho một hoặc nhiềuthành phần bị hạn chế Ở điểm này phản ứng chậm lại và đi vào pha ổn định(các chu kỳ 28-40)

+ Sản phẩm định lượng của RQ-PCR

Trong nghiên cứu này phương pháp RQ- PCR định lượng biểu hiện củagen lai PML/RARα nhằm phát hiện lượng tế bào ung thư còn sót lại sau quátrình điều trị thuốc

Đặc trưng của RQ-PCR là phát hiện sản phẩm khuếch đại trong quátrình chạy PCR khi sản phẩm khuếch đại từ DNA đích được nhân bản đủ sốlượng để làm cho ống phản ứng phát được huỳnh quang khi nhận được kíchthích.

Hình 2.2 Minh họa phản ứng RQ-PCR

(Nguồn: http://clinchem.aaccjnls.org)

Các kỹ thuật định lượng:

- Định lượng tuyệt đối: Định lượng số copies của tác nhân đích có

trong mẫu thử hay bệnh phẩm

- Định lượng tương đối:

+ Dựa trên đơn vị khối lượng

+ Dựa trên gen tham chiếu: kỹ thuật này áp dụng cho định lượng biểuhiện gen bệnh PML/RARα tại Viện Huyết học – Truyền máu TW, gen thamchiếu là ABL Kết quả thể hiện dưới dạng % (PML/RARα/ABL)

Kỹ thuật được tiến hành theo quy trình hiện đang áp dụng tại khoa Ditruyền-Sinh học phân tử Viện Huyết học- Truyền máu Trung ương