Đánh giá ảnh hưởng của Retinoic Acid lên sự biểu hiện của các gen liên quan tới sự lão hóa và con đường tín hiệu Notch ở tế bào ung thư dạ dày MKN45 (Luận văn thạc sĩ)

Đánh giá ảnh hưởng của Retinoic Acid lên sự biểu hiện của các gen liên quan tới sự lão hóa và con đường tín hiệu Notch ở tế bào ung thư dạ dày MKN45Đánh giá ảnh hưởng của Retinoic Acid lên sự biểu hiện của các gen liên quan tới sự lão hóa và con đường tín hiệu Notch ở tế bào ung thư dạ dày MKN45Đánh giá ảnh hưởng của Retinoic Acid lên sự biểu hiện của các gen liên quan tới sự lão hóa và con đường tín hiệu Notch ở tế bào ung thư dạ dày MKN45Đánh giá ảnh hưởng của Retinoic Acid lên sự biểu hiện của các gen liên quan tới sự lão hóa và con đường tín hiệu Notch ở tế bào ung thư dạ dày MKN45Đánh giá ảnh hưởng của Retinoic Acid lên sự biểu hiện của các gen liên quan tới sự lão hóa và con đường tín hiệu Notch ở tế bào ung thư dạ dày MKN45Đánh giá ảnh hưởng của Retinoic Acid lên sự biểu hiện của các gen liên quan tới sự lão hóa và con đường tín hiệu Notch ở tế bào ung thư dạ dày MKN45Đánh giá ảnh hưởng của Retinoic Acid lên sự biểu hiện của các gen liên quan tới sự lão hóa và con đường tín hiệu Notch ở tế bào ung thư dạ dày MKN45Đánh giá ảnh hưởng của Retinoic Acid lên sự biểu hiện của các gen liên quan tới sự lão hóa và con đường tín hiệu Notch ở tế bào ung thư dạ dày MKN45

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

––––––––––––––––––––

DIỆP THỊ HƯƠNG GIANG

ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA RETINOIC ACID

LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN LIÊN QUAN

TỚI SỰ LÃO HÓA VÀ CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU NOTCH

Ở TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY MKN45

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2019

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

––––––––––––––––––––

DIỆP THỊ HƯƠNG GIANG

ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA RETINOIC ACID

LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN LIÊN QUAN

TỚI SỰ LÃO HÓA VÀ CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU NOTCH

Ở TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY MKN45

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 84 20 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Phú Hùng

THÁI NGUYÊN - 2019

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào Mọi kết quả thu được không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Phú Hùng đã định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình tôi tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo và truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu khoa học

Đề tài luận văn nhận được sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp bộ mã số B2017 – TNA48

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã nhiệt tình động viên cho tôi thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2019

Tác giả

Diệp Thị Hương Giang

Trang 5

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Dịch tễ học của ung thư dạ dày 3

1.2 Retionic acid 4

1.2.1 Khái niệm 4

1.2.2 Vai trò của Retinoic acid trong điều trị ung thư 6

1.2.3 Thụ thể của Retionic acid trong ung thư dạ dày 9

1.3 Sự lão hóa tế bào 10

1.3.1 Khái niệm 10

1.3.2 Các gen trong con đường tín hiệu của sự lão hóa tế bào 11

1.4 Con đường tín hiệu NOTCH 12

1.4.1 Vai trò của con đường tín hiệu NOTCH trong ung thư 12

1.4.2 Vai trò của con đường tín hiệu NOTCH trong ung thư dạ dày 13

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU 15

2.1 Vật liệu nghiên cứu 15

2.2 Địa điểm và thời gian 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

Trang 6

2.3.1 Nuôi cấy tăng sinh tế bào 2D 16

2.3.2 Nuôi cấy tế bào 3D và xử lý tế bào với ATRA 16

2.3.3 Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA 17

2.3.4 Phân tích sự biểu hiện gen bằng Realtime PCR 17

2.3.5 Phân tích sự biểu hiện của protein P21 bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang 18

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

3.1 Nuôi cấy tăng sinh tế bào và nuôi cấy tạo các tumorsphere 3D 20

3.1.1 Nuôi tăng sinh tế bào trong điều kiện 2D 20

3.1.2 Nuôi cấy tạo các tumorsphere 3D và xử lý tumorsphere với ATRA 20

3.2 Kết quả tách chiết RNA tổng số 22

3.3 ATRA làm tăng cường sự phiên mã các gen p53, p21 và GADD45 23

3.4 ATRA cảm ứng sự biển hiện tăng của protein p21 25

3.5 ATRA điều hòa sự biểu hiện các gen thuộc con đường tín hiệu phân tử Notch 26

3.5.1 ATRA ức chế sự biểu hiện của gen Notch 26

3.5.2 ATRA điều hòa giảm sự biểu hiện các gen mã hóa cho các Ligand của Notch 27

KẾT LUẬN 31

KIẾN NGHỊ 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

Trang 7

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AMP : Adenosine monophosphate

ATRA : Axit retinoic all-trans CDK : Cyclin-dependent kinases

DAPI : 4′,6-diamidino-2-phenylindole DMSO : Dimethyl sulfoxit

EGF : Epidermal Growth Factor

FGF : Fibroblast growth factor GCSPC : Tế bào gốc ung thư dạ dày JNK : Jun N-terminal kinase

NICD : Vùng Notch nội bào (intracellular domain) NRR : Vùng điều hòa âm tính

Trang 8

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Mã số các cặp mồi sử dụng cho Realtime-PCR 18 Bảng 2.2 Mã số các cặp mồi cho phản ứng Realtime PCR 18 Bảng 3.1 Nồng độ RNA tổng số thu được từ quá trình tinh sạch 23

Trang 9

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc thế hệ thứ nhất của retioids 5

Hình 1.2 Cấu trúc thế hệ thứ hai của retioids 5

Hình 1.3 Cấu trúc thế hệ thứ ba của retioids 5

Hình 1.4 Cơ chế phân chia của tế bào ung thư 7

Hình 1.5 Con đường tín hiệu Notch 13

Hình 3.1 Hình ảnh nuôi cấy tăng sinh tế bào trong 3 ngày nuôi cấy 20

Hình 3.2 Nuôi cấy tạo tumorsphere (A) trong 5 ngày và xử lý các tumorsphere trong 48h với ATRA (B), mũi tên màu đen chỉ các tế bào chết 21

Hình 3.3 Phổ hấp thụ của RNA tổng số thu được từ quá trình tách chiết 22

Hình 3.4 Mức độ biểu hiện gene P21, P53 và GADD45A giữa mẫu đối chứng và mẫu xử lý với ATRA 23

Hình 3.5 Ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện của protein p21 25

Hình 3.6 Ảnh hưởng của ATRA lên sự hiệu hiện của các gen 26

Hình 3.7 Ảnh hưởng của ATRA lên sự hiểu hiện các Ligand của Notch 27

Trang 10

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ung thư dạ dày là bệnh lý ác tính của dạ dày Ung thư dạ dày là loại ung thư phổ biến thứ tư và là loại ung thư nguy hiểm thứ hai trên toàn thế giới, với một triệu bệnh nhân mới được chẩn đoán và 600000 ca tử vong mỗi năm [38] Khoảng 70% các trường hợp ung thư dạ dày xảy ra ở Đông Á, Trung và Đông Âu, Nam Phi và Trung và Nam Mỹ [43]

Việt Nam là một trong 20 quốc gia có tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao nhất thế giới, với tỷ lệ mắc trung bình là 16 người trên 100 nghìn dân Tỷ lệ sống sót trên 5 năm của các bệnh nhân ung thư dạ dày cũng thấp dưới 20% (theo Globocan, 2014)

Bằng chứng ủng hộ sự tồn tại của tế bào gốc ung thư trong ung thư dạ dày đã xuất hiện trong những năm gần đây, các tế bào gốc ung thư thường được biến đổi từ các tế bào gốc đặc hiệu của mô [73] Tế bào gốc ung thư, lần đầu tiên được xác định trong bệnh bạch cầu tủy cấp tính và sau đó là trong các khối u rắn, đóng vai trò quan trọng trong việc bắt đầu ung thư Tế bào gốc ung thư thường là các tế bào gốc đặc hiệu mô hoặc các tế bào tiền thân khuếch đại chuyển hóa khác biệt Trong nghiên cứu, điều trị và phát hiện tế bào gốc ung thư

dạ dày, có thể sử dụng các chỉ thị ALDH, CD33 và CD44 [57]

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng Retinoic acid (RA) có khả năng

ức chế sự hình thành và sinh trưởng của khối u trong nhiều loại ung thư khác nhau như ung thư vú, ung thư tuỵ và cả ung thư dạ dày, RA có thể tác dụng bằng cách tham gia vào quá trình này thông qua hoạt hóa con đường apoptosis, ức chế phân chia tế bào, cảm ứng sự lão hoá (senescence) và sự biệt hoá (differentiation) tế bào Đặc biệt đối với ung thư dạ dày, RA có khả năng gây biệt hoá tế bào gốc ung thư dạ dày [40] Nghiên cứu gần đây đã chỉ

ra được all trans retinoic có khả năng ức chế tế bào gốc ung thư dạ dày, gây biệt hoá tế bào này Tuy nhiên vẫn còn thiếu các phân tích về ảnh hưởng của All trans retinoic acid lên các con đường tín hiệu phân tử

Trang 11

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tìm ra cơ chế phân tử của sự ức chế tế bào ung thư dạ dày dưới tác dụng của All trans retinoic acid thông qua việc phân tích những thay đổi về mức độ phiên mã của các gen trong con đường tín hiệu của sự lão hoá tế bào và con đường tín hiệu Notch

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nuôi cấy tăng sinh tế bào và nuôi cấy tạo các tumorsphere trong điều kiện nuôi cấy 3D từ các tế bào ung thư dạ dày MKN45

Nội dung 2: Phân tích sự biểu hiện của các gen trong con đường tín hiệu lão hoá tế bào bằng Realtime PCR

Nội dung 3: Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt trong con đường tín hiệu Notch bằng Realtime PCR

Trang 12

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Dịch tễ học của ung thư dạ dày

Ung thư dạ dày là nguyên nhân phổ biến gây tử vong liên quan đến ung thư trên thế giới Hiện nay ung thư dạ dày chiếm 9,7% tổng số ca tử vong liên quan đến ung thư Tỷ lệ tử vong cao cũng được ghi nhận ở cả hai giới ở Trung

và Đông Âu, Trung và Nam Mỹ Đáng chú ý là Hàn Quốc, Trung Quốc và Nhật Bản là các quốc gia có tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao nhất trên thế giới Việt Nam là một trong 20 quốc gia có tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao nhất thế giới [54]

Về mặt mô học, ung thư dạ dày được chia thành hai loại là ung thư biểu

mô tuyến thể ruột và ung thư biểu mô tuyến thể phân tán, ngoài ra là một số dạng vô định Loại ung thư biểu mô tuyến thể phân tán xảy ra ở tất cả các nhóm tuổi có sự phân bố giới tính bằng nhau, không giống như loại ung thư biểu mô tuyến thể ruột chiếm ưu thế ở nam giới và người già Loại thể phân tán có xu hướng xâm lấn vào thành dạ dày nhiều hơn và di căn tiến triển bệnh nhanh hơn và tiên lượng xấu hơn [42], [56]

Ung thư dạ dày có thể phát triển ở bất cứ phần nào của dạ dày, có thể lan

ra khắp dạ dày và đến các cơ quan khác của cơ thể; đặc biệt là thực quản, phổi, hạch bạch huyết và gan Nguyên nhân phổ biến nhất là nhiễm vi

khuẩn Helicobacter pylori (H.polyri), chiếm hơn 60% các trường hợp

Hút thuốc, chế độ ăn uống và béo phì là các yếu tố nguy cơ khác 1% đến 3% trường hợp là do di truyền từ cha mẹ bị ung thư dạ dày, Nhật Bản và Hàn Quốc là hai quốc gia có tỷ lệ mắc cao Ở các nước phát triển và đang

phát triển tỉ lệ nhiễm H.polyri lần lượt là 35% và 85% Ước tính rằng khoảng 65% - 80% bệnh ung thư dạ dày không ở tâm vị là do nhiễm H

pylori và có khả năng phòng ngừa được [61] Ở Nhật Bản và các nước

khác, sử dụng dương xỉ diều hâu và bào tử làm thức ăn cũng có liên quan đến

tỉ lệ mắc bệnh ung thư dạ dày nhưng nguyên nhân chưa được làm rõ Tỉ lệ

Trang 13

mắc bệnh ung thư dạ dày chiếm đa số ở đàn ông, có nơi tỉ lệ mắc ở đàn ông/phụ

nữ là 2/1 Hoóc môn estrogen có thể giúp bảo vệ phụ nữ khỏi căn bệnh này và một tỉ lệ nhỏ ung thư dạ dày dạng phân tán có thể do di truyền [4], [6]

đã được nghiên cứu rộng rãi: All-trans, 9-cis và 13-cis với All-trans là dạng sinh lý được quan tâm hơn cả Retinoids liên quan đến tăng trưởng tế bào, đáp ứng miễn dịch và tăng trưởng biểu mô thông qua tương tác với các thụ thể hạt nhân, thụ thể retinoic acid và thụ thể X retinoid [45], [41]

Có ba thế hệ của retinoids:

 Thế hệ đầu tiên gồm có: retinol, retinal, tretinoin (retinoic acid), isotretinoin, và alitretinoin

 Thế hệ thứ hai bao gồm: etretinate và acitretin - chất chuyển hóa của nó

 Thế hệ thứ ba gồm: adapalene, bexarotene, và tazarotene

Trang 14

Hình 1.1 Cấu trúc thế hệ thứ nhất của retioids

Hình 1.2 Cấu trúc thế hệ thứ hai của retioids

Hình 1.3 Cấu trúc thế hệ thứ ba của retioids

Trang 15

Retinoids có nhiều chức năng quan trọng đối với cơ thể như thị lực, sự tăng sinh tế bào và sự biệt hóa tế bào, sự phát triển của tế bào xương, chức năng miễn dịch và sự kích hoạt các gen ức chế khối u, sự phát triển của thai nhi bao gồm xương, mắt, tai, tim, phổi và hocmon tăng trưởng, sự sinh tinh trùng [25] Sự tăng trưởng sau sinh [11], cân bằng nội môi [17]

1.2.2 Vai trò của Retinoic acid trong điều trị ung thư

Hiện nay tại Việt Nam Retinoic acid chưa được nghiên cứu rộng rãi, tuy nhiên trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu tác dụng của Retinoic acid, đặc biệt là ảnh hưởng của nó lên các tế bào ung thư

Retinoic acid được sử dụng trong điều trị nhiều bệnh khác nhau, trong

đó có ung thư Ung thư là một trong những căn bệnh thế kỷ chiếm tỷ lệ tử vong cao Có rất nhiều tác nhân gây ung thư, tất cả đều làm biến đổi và đột biến các tế bào trong cơ thể dẫn đến sự tăng sinh mất kiểm soát của các tế bào này Cơ thể được cấu tạo bởi nhiều loại tế bào, các tế bào phát triển và phân chia một cách có kiểm soát, các tế bào được “chết” theo chương trình đã được lập sẵn (quá trình Apoptosis) và thay vào là các tế bào mới khỏe mạnh để duy trì các chức năng của cơ thể

Các tác nhân gây đột biến như hóa chất độc hại, tia phóng xạ, các virus ung thư làm cho các tế bào bình thường bị đột biến gen hoặc nhiễm sắc thể, nên tế bào mất khả năng kiểm soát sự phân chia và liên kết tế bào Vật liệu di truyền (DNA) của một tế bào bị thay đổi hoặc hư hỏng, làm tăng sinh vô tổ chức các tế bào “lỗi”- tế bào ung thư Các tế bào ung thư này không chết đi theo chương trình được lập trình sẵn (quá trình Apoptosis) như các tế bào bình thường mà tiếp tục tăng sinh và nhân lên mất kiểm soát Các tế bào này

có thể tạo thành một khối lớn gọi là khối u

Không phải khối u nào cũng là ung thư Các khối u không lây lan ra các phần khác của cơ thể là khối u lành tính-không phải ung thư Các khối u lành

Trang 16

tính được cắt bỏ, và đa số sẽ không quay trở lại Các khối u có khả năng di căn sang các phần khác gọi là u ác tính, được gọi là ung thư

Cơ chế gây bệnh ung thư do đột biến gen làm mất kiểm soát chu kì tế bào Cơ thể có 2 nhóm gen kiểm soát chu kì tế bào là: Nhóm gen quy định yếu tố sinh trưởng và nhóm gen ức chế khối u Ở các tế bào bình thường, 2 nhóm gen này hoạt động nhịp nhàng và hài hòa với nhau Tuy nhiên, khi có đột biến, cơ chế hoạt động này bị phá hủy

Hình 1.4 Cơ chế phân chia của tế bào ung thư [29]

Retinoic acid đã được nghiên cứu rộng rãi để sử dụng trong điều trị các dạng ung thư khác nhau không chỉ trong phòng ngừa mà còn trong điều trị Trường hợp bình thường trong cơ thể, retinoic acid có tác dụng phòng ngừa chống lại sự hình thành ung thư Sau khi hình thành ung thư, RA trở thành kẻ tấn công các tế bào ung thư, ngăn chặn sự phát triển và phân chia của chúng, cũng kích hoạt sự biệt hóa và chết của chúng thông qua các con đường cụ thể

RA cũng đã được chứng minh là hợp tác với các loại thuốc điều trị ung thư hiệu quả khác chống lại sự tiến triển của ung thư Các nhà khoa học đã tìm ra

Trang 17

RA có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của khối u ác tính và sự hình thành khối u ác tính ở người [47] Tác dụng của RA cũng đã được tìm thấy có liên quan đến sự kích hoạt protein kinase phụ thuộc AMP và sialyltransferase tuần hoàn [12] Mặt khác, điều biến của sự kết dính tế bào khối u ác tính với các thành phần màng đáy đã được chứng minh là bị ảnh hưởng bởi điều trị bằng

RA [58] RA cũng đã được sử dụng để ức chế các tế bào u ác tính B16F10 di căn cao bằng cách điều chỉnh các thụ thể integrin bề mặt tế bào chống lại các protein ngoại bào, đặc biệt là laminin và vitronectin [48] Sự hình thành của khối u ác tính có liên quan đến bức xạ, RA đã được tìm thấy để sửa đổi độ nhạy của sóng radio và phục hồi từ tổn thương tia X trong ống nghiệm [46] Ngoài khả năng ức chế sự tăng trưởng, RA cũng có khả năng ức chế sự xâm lấn tế bào khối u ác tính ở người [60]

Retinoic acid và ung thư gan: RA có thể trực tiếp gây ra sự gia tăng tổng hợp protein của transferrin và albumin trong các tế bào Hep3B, RA đã được chứng minh có thể điều chỉnh biểu hiện gen của kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg) trong tế bào gan Đã có những nghiên cứu về ung thư tập trung vào sự tham gia của topoisomerase trong tăng trưởng tế bào ung thư, RA có thể ức chế sự biểu hiện của topoisomerase II trong các tế bào Hep3B Như vậy RA thực sự là một hợp chất tiềm năng để ngăn chặn sự phát triển của ung thư gan hoặc kết hợp với một số loại thuốc để hỗ trợ điều trị ung thư gan [19]

RA và ung thư phổi: Tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong của ung thư phổi làm cho căn bệnh này trở thành một chủ đề quan trọng trong nghiên cứu ung thư Sự bắt giữ G1 qua trung gian RA có liên quan đến việc gây ra sự ức chế p27 và Cdk3 trong các tế bào ung thư biểu mô vảy phổi Syndecan-1 là một proteoglycan làm trung gian sự kết dính của tế bào và ngăn chặn sự xâm lấn trong các tế bào biểu mô RA có thể làm tăng biểu hiện syndecan-1 để ngăn chặn sự xâm lấn, di căn của ung thư phổi RA còn được tìm thấy để làm giảm

Trang 18

bệnh thần kinh do hóa trị liệu trong một mô hình động vật cũng như bệnh nhân ung thư phổi [2]

RA và ung thư vú: Năm 1970 lần đầu tiên ứng dụng của RA đã được đề cặp và cho đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu phát hiện tác dụng của RA đối với điều trị ung thư vú theo các hướng khác nhau Đáng chú ý, RA có thể gây

ra sự biệt hóa của các tế bào biểu mô vú biến đổi sớm [1], cho thấy RA có vai trò phòng ngừa đối với bệnh ung thư vú RA cũng làm giảm sự phát triển ung thư vú và di căn phổi [7]

RA và ung thư tuyến tiền liệt: các tế bào ung thư tuyến tiền liệt mong muốn bổ sung androgen trong giai đoạn đầu của bệnh, 5α-reductase trở nên quan trọng để cung cấp androgen mạnh RA đã được tìm thấy có khả năng ức chế 5α-reductase và do đó trở thành phương pháp điều trị ung thư tuyến tiền liệt RA có thể làm chậm sự tiến triển của ung thư tuyến tiền liệt và thúc đẩy quá trình “tự chết” của các tế bào ung thư Ngoài ra, cũng giống như ung thư

vú, RA cũng có khả năng ức chế ung thư tiền liệt tuyến theo nhiều hướng khác nhau [20]

1.2.3 Thụ thể của Retionic acid trong ung thư dạ dày

Retinoid đã được chứng minh là ức chế sự phát triển của nhiều tế bào khối u ở người Mặc dù cơ chế phân tử chính xác của ức chế tăng trưởng qua trung gian retinoid vẫn chưa được biết đến, nhưng tầm quan trọng của thụ thể acid retinoic (RARs) và thụ thể X retinoid (RXR) đã được nghiên cứu trên tế bào khối u

RA tác động đến sự tăng trưởng, biệt hóa và apoptosis của các tế bào biểu mô bình thường, tiền ung thư và ác tính trong điều kiện in vivo và in vitro [31] Tác dụng của RA chủ yếu qua trung gian hai loại thụ thể là retinoic acid (RARs) và thụ thể X retinoid (RXR) [71], thuộc về họ thụ thể steroid/tuyến giáp và được mã hóa bởi ba gen khác nhau α, β và γ Các RXR tạo thành các bộ đồng phân (RXR/RXR) và các bộ dị vòng (RAR/RXR) với

Trang 19

RAR, sau đó liên kết với các yếu tố phản ứng RA cụ thể (RARE), điều chỉnh tích cực và ngăn chặn các hoạt động phiên mã của chúng đối với các gen đích [72], [26] Các thụ thể này phát huy các chức năng cụ thể và có tác dụng chống ung thư khác nhau trong các dòng tế bào ung thư khác nhau

Nghiên cứu của Su Liu và cộng sự đánh giá vai trò của gen RARα làm thụ thể tác dụng của axit retinoic all-trans (ATRA) trong các tế bào ung thư dạ dày ATRA có thể làm cho RARα biểu hiện trong các tế bào MGC80-3, BGC-823 và SGC-7901 một cách rõ ràng, dẫn đến ức chế tăng trưởng của các dòng tế bào này Sau khi gen RARα được chuyển vào các tế bào MKN-45 biểu hiện mức RARα khá thấp và không thể được tạo ra bởi ATRA, sự tăng trưởng tế bào bị ức chế rõ rệt bởi ATRA Ngược lại, khi gen RARα antisense được chuyển vào các tế bào BGC-823, thấy có một ức chế nhỏ của ATRA, so với các tế bào BGC-82 ATRA có thể tạo ra hoạt động phiên mã của βRARE trong các dòng tế bào MGC80-3, BGC-823, SGC-7902 và MKN/RARα, nhưng không phải trong các dòng tế bào MKN45 và BGC/aRARα Như vậy, ATRA ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư dạ dày bằng cách điều chỉnh tăng mức độ RARα; RARα là chất trung gian chính trong hoạt động của ATRA trong các tế bào ung thư dạ dày Kết quả đã chỉ ra rằng RARα là cần thiết cho ATRA để gây ức chế tăng trưởng trên các tế bào ung thư dạ dày [52]

1.3 Sự lão hóa tế bào

1.3.1 Khái niệm

Lão hóa tế bào là một trạng thái mà các tế bào bình thường ngừng phân chia, do sự ngắn đi của các đoạn telomere ở đầu mút nhiễm sắc thể sau chu kỳ DNA nhân đôi Ngoài ra, một số thay đổi ở chức năng của ty thể, biến đổi của DNA và một số tác động từ bên ngoài đều có thể gây ra sự lão hóa tế bào [33] Lão hóa là một đặc tính phổ biến của các sinh vật Trong số các sinh vật

đa bào, lão hóa được đánh dấu bằng sự suy giảm dần dần chức năng của nhiều

tế bào và mô dẫn đến sự chết tế bào Đặc điểm nổi bật nhất của lão hóa là mất

Trang 20

dần chức năng và thoái hóa, xảy ra ở cấp độ phân tử, tế bào, mô và sinh vật Ở động vật có vú, thoái hóa liên quan đến tuổi làm phát sinh các bệnh lý như: xơ vữa động mạch và suy tim, loãng xương, thoái hóa điểm vàng, suy phổi, suy thận, thoái hóa thần kinh Các tế bào phát triển và phân chia một cách có kiểm soát, các tế bào được “chết” theo chương trình đã được lập sẵn và thay vào là các tế bào mới khỏe mạnh để duy trì các chức năng của cơ thể Các tác nhân gây đột biến làm cho các tế bào bình thường bị đột biến gen hoặc nhiễm sắc thể, hay một số thay đổi ở mức độ phân tử làm cho một số gen ức chế ung thư

bị bất hoạt làm cho tế bào mất khả năng kiểm soát sự phân chia và liên kết tế bào, tăng sinh vô tổ chức và nhân lên mất kiểm soát, không có hiện tượng lão hóa hình thành ung thư [3], [5]

1.3.2 Các gen trong con đường tín hiệu của sự lão hóa tế bào

Gen p53 không cho các gen bị tổn thương tự nhân lên Khi có một thay đổi lớn trong tế bào, protein p53 còn gọi là "vệ sĩ của bộ gen" sẽ phát đi một hiệu lệnh để tế bào này tự hủy Đây là một protein quan trọng nằm trong điều hòa chu kỳ tế bào - gọi là gen áp chế khối u p53 Khi có tổn thương ở DNA, p53 làm ngừng chu kỳ tế bào cho đến khi DNA bị tổn thương được sửa chữa hoặc p53 có thể làm cho tế bào chết theo lập trình nếu không còn khả năng sửa chữa DNA Các yếu tố lối sống ảnh hưởng đến cơ chế hoạt động bình thường của gen p53 Rb (retinoblastoma) là gen có chức năng ngăn cản diễn tiến chu kỳ tế bào bằng cách gắn kết với E2F1 và ngăn cản sự sao chép các gen cần thiết cho tế bào Sở dĩ p53 ngăn cản được chu trình tế bào vì nó hoạt hóa quá trình phiên mã tạo ra CKI, p21 để luân phiên ức chế sự hoạt hóa của CDK Một khi CDK bị hoạt hóa nó sẽ phosphoryl hóa Rb và làm mất tác dụng của Rb Protein p16INK4a là sản phẩm từ sự mã hóa của gen JNK4, còn được gọi là protein ức chế ung thư p16JNK4a Protein này có vai trò trong

sự điều hòa chu trình tế bào khi ở dạng liên kết Sự biểu hiện p16JNK4a liên quan đến quá trình lão hoá của tế bào và được thừa nhận là chi phối quá trình

Trang 21

lão hóa Khi càng lớn tuổi thì nồng độ p16JNK4a sẽ càng cao Kết quả nghiên cứu từ các tế bào có các nguồn gốc khác nhau như tủy xương, tuyến nội tiết ở tụy Cũng như não cho thấy là p16JNK4a đã chi phối quá trình lão hóa bằng cách giới hạn sự tự làm mới của các tế bào có khả năng nhân đôi [50] Chương trình lão hóa có vai trò quan trọng trong ức chế tế bào tự tăng sinh

1.4 Con đường tín hiệu NOTCH

1.4.1 Vai trò của con đường tín hiệu NOTCH trong ung thư

Sự thay đổi của con đường tín hiệu Notch có thể dẫn đến các khối u ác tính của con người, bao gồm cả ung thư dạ dày vì con đường này có vai trò quan trọng trong điều hòa các quá trình của tế bào như sự phân chia, biệt hóa, quá trình tự chết hay tự làm mới của tế bào Con đường này có thể trở thành một dấu hiệu tiên lượng của ung thư dạ dày và là mục tiêu mới trong điều trị ung thư dạ dày Notch có 4 thụ thể là: Notch1, 2, 3 và 4 Chúng được tổng hợp như một dạng tiền chất bao gồm các miền ngoại bào, xuyên màng và nội bào Trong bộ máy Golgi, protein Notch tiền thân bị cắt tạo ra hai tiểu đơn vị Một tiểu đơn vị chứa hầu hết các miền ngoại bào và tiểu đơn vị thứ hai bao gồm phần còn lại của miền ngoại bào và xuyên màng Họ Notch có 5 thành viên là Jagged1, Jagged2, Delta1, Delta2, và Delta3 là các protein xuyên màng loại I Miền ngoại bào của thụ thể Notch đã được chứng minh có chứa

36 lần lặp lại [27] Ligand liên kết với vùng lặp lại, mở ra vùng điều hòa âm tính (NRR) cho phép phân cắt tiếp bởi các metallprotease, giải phóng vùng Notch nội bào (NICD) vào trong nhân tế bào, tại đó nó đóng vai trò như một yếu tố đồng phiên mã [28] Trong nhân tế bào, NICD liên kết với protein gắn kết DNA RBP-J và các protein đồng hoạt hoá khác trước khi hoạt hoá sự phiên mã các gen đích có vị trí gắn kết với protein RGP-J Một số gen được điều hoà bởi con đường tín hiệu Notch đã được xác định ở cả tế bào thường

và tế bào ung thư, đặc biệt, gen Hes và Hey mã hoá cho yếu tố phiên mã kẹp tóc (Helix-loop-Helix) và gen CD25 của tế bào T [30]

Trang 22

Hình 1.5 Con đường tín hiệu Notch [36]

1.4.2 Vai trò của con đường tín hiệu NOTCH trong ung thư dạ dày

Các nghiên cứu mới nhất đã chỉ ra rằng trong niêm mạc dạ dày bình thường, tín hiệu Notch có liên quan đến quá trình biệt hóa biểu mô dạ dày Kết quả của các nghiên cứu này đã chứng minh rằng biểu hiện của Notch1, Notch3, Jagged1, Jagged2 và Hes1 đã được tìm thấy trong ung thư dạ dày ở người [23] Thụ thể Notch như Notch1, Notch2 và Notch3, Jagged1 và Jagged2 cũng đã được phát hiện trong các mẫu mô ung thư dạ dày của con người Biểu hiện của Notch1 xuất hiện ở cả mô tiền ung thư và ung thư, Notch1 có thể đóng một vai trò quan trọng trong cả việc thúc đẩy quá trình chuyển hóa của các tế bào biểu mô dạ dày và trong việc duy trì sự tăng sinh liên tục của các tế bào biểu mô đường ruột [53], [59]

Trong số các con đường tín hiệu khác liên quan đến ung thư dạ dày thì con đường tín hiệu STAT3 và con đường Twist cũng được nghiên cứu Thụ thể Notch1 trong các tế bào ung thư dạ dày được kích hoạt sẽ thúc đẩy tương tác giữa Twist và promoter STAT3, sự biểu hiện của Notch1 khởi động sự photphorin hoá STAT3, cảm ứng sự hoạt hoá promoter Twist và tăng cường sự hình thành các colony, sự di căn và xâm lấn của các tế bào ung thư dạ dày [18]

Trang 23

Các tín hiệu Notch1 và Notch2 có thể khởi động quá trình phát sinh ung thư dạ dày thông qua cảm ứng sự biểu hiện của cyclooxygenase-2 COX-

2 Murata và cộng sự đã chứng minh rằng sự biểu hiện quá mức COX-2 trong ung thư dạ dày có mối tương quan cao với sự xâm lấn của khối u vào các mạch bạch huyết trong thành dạ dày và di căn đến các hạch bạch huyết [39] COX-2 có thể có tác động đến quá trình hình thành khối u Do đó, có thể ức chế COX-2 bằng cách bất hoạt gen COX-2 bởi quá trình methyl hóa từ đó làm giảm sự phát triển của khối u [35]

Tóm lại, con đường tín hiệu Notch có liên quan đến sinh bệnh học của các khối u đường tiêu hóa như ung thư dạ dày và ruột kết Sự hiểu biết về con đường tín hiệu Notch trong các mô ở điều kiện sinh lý ở những người có biến đổi ác tính sẽ gợi ý đến một hướng điều trị ung thư mới

Trang 24

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 do phòng thí nghiệm Inserm U1053

- Viện Sức khỏe và nghiên cứu Y học Quốc gia Pháp tại Bordeaux cung cấp Dòng tế bào được bảo quản trong nitơ lỏng tại Phòng thí nghiệm Y sinh – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên

All trans retionic acid được cung cấp bởi hãng Sigma Aldrick (Pháp) Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: môi trường nuôi cấy DMEMF12 và RPMI1640 (Invitrogen cung cấp), huyết thanh bò, trypsin, kháng sinh Penicillin/Streptomycin, DMSO (Sigma cung cấp)

Các hóa chất sử dụng trong tách chiết RNA và phản ứng Realtime PCR: RNeasy Mini Kit (Qiagen), Quantitect Reverse Transcriptase (RT) Kit (Qiagen), TOPreal qPCR 2X PreMix SYBR (Enzynomics)

Các primer dùng trong phân tích mức độ biểu hiện gen do hãng Qiagen cung cấp

Các đĩa nuôi cấy tế bào, ống pipette và một số dụng cụ nhỏ khác do Thermo Fisher cung cấp

Các thí nghiệm được triển khai trên các hệ thống trang thiết bị hiện đại gồm máy Realtime PCR (Analytic gena) hệ thống nuôi cấy tế bào (Memmert), buồng thao tác sinh học an toàn sinh học cấp 2 (Thermo Fisher)

và các trang thiết bị phụ trợ hiện đại khác tại Phòng thí nghiệm Y sinh – Trường Đại học Khoa học

2.2 Địa điểm và thời gian

Nghiên cứu được thực hiện tại các Phòng thí nghiệm Y sinh – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 04/2018 đến tháng 05/2019

Định dạng
Số trang	48
Dung lượng	1,42 MB