NGHIÊN cứu sản XUẤT mẫu NGOẠI KIỂM CHO ĐỊNH NHÓM máu hệ ABO RH

Ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm đã được Bộ Y tế ban hành thành quyđịnh trong quản lý chất lượng xét nghiệm, về mặt chuyên môn, đây là công cụ để đánh giá độ tin cậy của xét nghiệm và ph

TRƯƠNG THỊ LỆ

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT MẪU NGOẠI KIỂM

CHO ĐỊNH NHÓM MÁU HỆ ABO - RH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

KHÓA 2013 - 2017

HÀ NỘI - 2017

TRƯƠNG THỊ LỆ

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT MẪU NGOẠI KIỂM

CHO ĐỊNH NHÓM MÁU HỆ ABO - RH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới

PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung, cô đã luôn dành cho tôi sự quan tâm, tạo mọi

điều kiện thuận lợi và đưa ra những lời khuyên quý báu cho tôi không chỉ trongnghiên cứu mà cả trong cuộc sống Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và

sâu sắc tới CKI Đỗ Thị Hường, người trực tiếp hướng dẫn tôi, đã luôn tận tình

hướng dẫn nghiên cứu, giảng giải kiến thức và tạo điều kiện tốt nhất giúp tôihoàn thành khóa luận

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị nhân viên đang làmviệc tại phòng xét nghiệm Huyết học - Đông máu - Trung tâm Kiểm chuẩnchất lượng Xét nghiệm - trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện và nhiệttình hướng dẫn, giúp đỡ, giải đáp mọi thắc mắc để tôi có thể thực hiện tốt nhấtkhóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý đào tạo đạihọc, Bộ môn Sinh lý, Khoa Kỹ thuật y học, trường Đại Học Y Hà Nội đã tạo mọiđiều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới cha mẹ, những người đã sinhthành, nuôi dưỡng tôi, cùng người thân, bạn bè đã luôn ở bên động viên, chia

sẻ, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Hà Nội, tháng 6 năm 2017

Sinh viên

Trương Thị Lệ

Tôi xin cam đoan đây là khóa lu n do tôi tr c ti p th c hi n dậ ự ế ự ệ ưới

s hự ướng d n c a ẫ ủ PGS.TS Đ ng Th Ng c Dung ặ ị ọ và CKI Đ Th ỗ ị

H ườ Các s li u và k t qu đ a ra trong khóa lu n hoàn toàn trung ng ố ệ ế ả ư ậ

th c, khách quan và ch a đự ư ược công b trong b t kỳ tài li u nào N u sai,ố ấ ệ ếtôi xin hoàn toàn ch u trách nhi m.ị ệ

Hà N i, tháng 6 năm 2017 ộ

Sinh viên

Tr ươ ng Th L ị ệ

ISBT : International Society of Blood Transfusion

IQC : Internal Quality Control

QC : Quality Control

ISO : International Organization for Standardization

IUPAC : International Union of Pure and Applied ChemistryWHO : World Health Organization

M C L C Ụ Ụ

Đ T V N ĐẶ Ấ Ề 0

1.1.1 Khái ni mệ 3

1.1.2 N i ki mộ ể 3

1.1.3 Ngo i ki mạ ể 4

1.2 H nhóm máu h ng c uệ ồ ầ .10

1.2.1 Khái ni m v nhóm máuệ ề .10

1.2.2 H nhóm máu ABOệ .11

1.2.3 H nhóm máu Rhệ .12

1.2.4 Các h nhóm máu khácệ .13

1.2.5 Tình hình phân b nhóm máuố 14

1.2.6 Nguyên lý và các phương pháp xác đ nh nhóm máuị .14

1.3 Tình hình ngo i ki m Đ nh nhóm máuạ ể ị .15

1.3.1 Trên th gi iế ớ .15

1.3.2 Vi t NamỞ ệ 16

1.4 Quy trình chu n b m u theo hẩ ị ẫ ướng d n c a WHOẫ ủ .17

1.4.1 Quy trình chu n b m u huy t thanh ẩ ị ẫ ế 17

1.4.2 Quy trình chu n b dung d ch b o qu n h ng c u ẩ ị ị ả ả ồ ầ 18

1.5 Quy trình chu n b panel h ng c u sàng l c kháng th b t thẩ ị ồ ầ ọ ể ấ ường c a Vi n Huy t h c - Truy n máu Trung ủ ệ ế ọ ề ương 19

1.6 Các quy trình trong s n xu t m u ngo i ki mả ấ ẫ ạ ể 19

1.6.1 Quy trình đ nh nhóm máu ị 19

1.6.2 Quy trình xét nghi m Hematocrit (HCT) ệ 20

1.6.3 Quy trình xét nghi m Coombs ệ 20

1.6.4 Quy trình xét nghi m HGKT ệ 21

1.7 Ki m tra ch t lể ấ ượng m uẫ .22

1.7.1 Đ đ ng nh tộ ồ ấ .22

1.7.2 Đ n đ nhộ ổ ị 23

CHƯƠNG 2: V T LI U VÀ PHẬ Ệ ƯƠNG PHÁP NGHIÊN C UỨ .24

2.1 V t li u nghiên c uậ ệ ứ .24

2.2 Th i gian và đ a đi m nghiên c uờ ị ể ứ .25

2.3 D ng c , trang thi t b và hóa ch tụ ụ ế ị ấ .25

2.3.1 D ng cụ ụ 25

2.3.2 Trang thi t bế ị 25

2.3.3 Hóa ch tấ 27

2.4 Phương pháp nghiên c uứ .28

2.5 Thi t k nghiên c uế ế ứ .28

2.5.1.Giai đo n 1ạ 28

2.5.2.Giai đo n 2ạ 30

2.6 S đ nghiên c uơ ồ ứ .31

2.6.1 Giai đo nạ 31

2.6.2 Giai đo n 2ạ 32

2.7 Thu th p và x lý s li uậ ử ố ệ .33

2.7.1 Thu th p s li uậ ố ệ 33

2.7.2 X lý s li uử ố ệ 33

CHƯƠNG 3: K T QU NGHIÊN C UẾ Ả Ứ .37

3.1 Ch t lấ ượng m u th nghi mẫ ử ệ .37

3.2 K t qu giai đo n 1ế ả ạ .37

3.2.1 K t qu s b c a m u huy t t ng/huy t thanh và m u h ng c u banế ả ơ ộ ủ ẫ ế ươ ế ẫ ồ ầ đ uầ 37

3.2.2 Đ đ ng nh t c a m u th nghi mộ ồ ấ ủ ẫ ử ệ .38

3.2.3 Đ n đ nh c a m u th nghi m trong 4 tu nộ ổ ị ủ ẫ ử ệ ầ .42

3.3 Hoàn thi n quy trình s n xu t m u ngo i ki mệ ả ấ ẫ ạ ể .50

3.3.1 Quy trình s n xu t m u h ng c uả ấ ẫ ồ ầ .50

3.3.1 Quy trình s n xu t m u huy t thanhả ấ ẫ ế .51

3.4 K t qu giai đo n 2ế ả ạ 53

3.4.1 K t qu s b m u huy t t ng/huy t thanh và m u h ng c u ban ế ả ơ ộ ẫ ế ươ ế ẫ ồ ầ đ uầ 53

3.4.4 K t qu thu đế ả ượ ừc t các phòng xét nghi m tham gia th ệ ử

nghi mệ 58

CHƯƠNG 4: BÀN LU NẬ 61

4.1 Bàn lu n v quy trình s n xu t m u ngo i ki mậ ề ả ấ ẫ ạ ể .61

4.2 Bàn lu n v k t qu giai đo n 1ậ ề ế ả ạ .62

4.2.1 Đ đ ng nh tộ ồ ấ .62

4.2.2 Đ n đ nhộ ổ ị 64

4.3 Bàn lu n v k t qu giai đo n 2ậ ề ế ả ạ .66

4.3.1 Đ đ ng nh tộ ồ ấ .66

4.3.2 Đ n đ nhộ ổ ị 67

4.3.3 Bàn lu n v k t qu phân tích c a phòng xét nghi mậ ề ế ả ủ ệ .69

K T LU NẾ Ậ 70

KI N NGHẾ Ị 71 TÀI LI U THAM KH OỆ Ả

B ng 3.1 K t qu s b m u huy t tả ế ả ơ ộ ẫ ế ương/huy t thanh và m u h ngế ẫ ồ

c u ban đ u c a giai đo n 1ầ ầ ủ ạ 37

B ng 3.2 K t qu đánh giá đ đ ng nh t lô m u h ng c u 3-5% b oả ế ả ộ ồ ấ ẫ ồ ầ ả qu n b ng dung d ch Alseverả ằ ị .38

B ng 3.3 K t qu đánh giá đ đ ng nh t lô m u h ng c u 3-5% b oả ế ả ộ ồ ấ ẫ ồ ầ ả qu n b ng nả ằ ước mu i sinh lýố .39

B ng 3.4 K t qu đánh giá đ đ ng nh t lô m u huy t thanh có b sungả ế ả ộ ồ ấ ẫ ế ổ Natri azide 40

B ng 3.5 K t qu đánh giá đ đ ng nh t lô m u huy t thanh không bả ế ả ộ ồ ấ ẫ ế ổ sung Natri azide 41

B ng 3.6 K t qu đánh giá đ n đ nh lô m u h ng c u 3-5% b o qu nả ế ả ộ ổ ị ẫ ồ ầ ả ả trong dung d ch Alsever (Lô 01)ị .42

B ng 3.7 K t qu đánh giá đ n đ nh lô m u h ng c u 3-5% b o qu nả ế ả ộ ổ ị ẫ ồ ầ ả ả trong nước mu i sinh lý (Lô 02)ố .43

B ng 3.8 K t qu đánh giá đ n đ nh lô m u HC 8-10% b o qu n trongả ế ả ộ ổ ị ẫ ả ả dung d ch Alsever (Lô 03)ị .45

B ng 3.9 K t qu đánh giá đ n đ nh lô m u HC 8-10% b o qu n trongả ế ả ộ ổ ị ẫ ả ả nước mu i sinh lý (Lô 04)ố 47

B ng 3.11 K t qu đánh giá đ n đ nh lô m u huy t thanh không bả ế ả ộ ổ ị ẫ ế ổ sung Natri azide 49

B ng 3.12 K t qu s b m u huy t tả ế ả ơ ộ ẫ ế ương/huy t thanh và m u h ngế ẫ ồ c u ban đ u c a giai đo n 2ầ ầ ủ ạ .53

B ng 3.13 K t qu đánh giá đ đ ng nh t 2 lô m u h ng c uả ế ả ộ ồ ấ ẫ ồ ầ .54

B ng 3.14 K t qu đánh giá đ đ ng nh t 2 lô m u huy t thanhả ế ả ộ ồ ấ ẫ ế 55

B ng 3.15 K t qu đánh giá đ n đ nh m u h ng c u th nghi mả ế ả ộ ổ ị ẫ ồ ầ ử ệ .56

B ng 3.16 K t qu đánh giá đ n đ nh m u huy t thanh th nghi mả ế ả ộ ổ ị ẫ ế ử ệ 57

B ng 3.17 S lả ố ượng k t qu thu đế ả ược theo t ng phừ ương pháp 58

B ng 3.18 Giá tr gán cho k t qu xét nghi m nhóm máu h ABOả ị ế ả ệ ệ 58

B ng 3.19 Giá tr gán cho k t qu xét nghi m nhóm máu h Rhả ị ế ả ệ ệ .58

B ng 3.20 ả K t qu đánh giá các PXN tham gia cho XN nhóm máu h ABOế ả ệ 59

DANH M C BI U Đ Ụ Ể Ồ

Bi u đ 3.1 Giá tr HCT trung bình các m u đánh giá t i các th i đi m ể ồ ị ẫ ạ ờ ể

c a lô h ng c u 3-5% b o qu n b ng dung d ch Alseverủ ồ ầ ả ả ằ ị 42

Bi u đ 3.2 Giá tr HCT trung bình các m u đánh giá t i các th i đi m ể ồ ị ẫ ạ ờ ể

c a lô h ng c u 3-5% b o qu n trong nủ ồ ầ ả ả ước mu i sinh lýố 44

Bi u đ 3.3 Giá tr HCT trung bình các m u đánh giá t i các th i đi m ể ồ ị ẫ ạ ờ ể

c a lô h ng c u 8-10% b o qu n trong dung d ch Alseverủ ồ ầ ả ả ị 46

Bi u đ 3.4 Giá tr HCT trung bình các m u đánh giá t i các th i đi m ể ồ ị ẫ ạ ờ ể

c a lô h ng c u 8-10% b o qu n trong nủ ồ ầ ả ả ước mu i sinh lýố 47

Hình 2.1 Máy ly tâm l nh (trái) và máy ly tâm thạ ường (ph i)ả .25

Hình 2.2 Máy khu y tấ ừ 26

Hình 2.3 B n nhi tể ổ ệ 26

Hình 2.4 T s ch (t chu n b môi trủ ạ ủ ẩ ị ường) 26

Hình 2.5 Máy in (in nhãn) 27

Hình 2.6 T l nh thủ ạ ường (2-8°C) 27

Hình 3.1 So sánh c m quan m u HC 3-5% c a lô 01 và lô 02 t i các ả ẫ ủ ạ

th i đi m 1 tu n, 2 tu n, 3 tu n và 4 tu nờ ể ầ ầ ầ ầ .45

Hình 3.2 So sánh c m quan m u HC 8-10% c a lô 01 và lô 02 t i các th iả ẫ ủ ạ ờ đi m 1 tu n, 2 tu n, 3 tu n và 4 tu nể ầ ầ ầ ầ 48

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, xét nghiệm là một trong những yêu cầu cận lâm sàng thườngquy tại bệnh viện Các kết quả xét nghiệm chính xác, kịp thời sẽ giúp bác sĩlâm sàng chẩn đoán và điều trị kịp thời Do đó, chất lượng xét nghiệm có vaitrò quan trọng với công tác chăm sóc sức khỏe

Xét nghiệm Huyết học là một trong những xét nghiệm thường quyđược sử dụng rất nhiều trong chẩn đoán và điều trị Trong đó, xét nghiệmĐịnh nhóm máu hệ ABO - Rh đóng vai trò vô cùng quan trọng trong công táctruyền máu

Truyền máu rất cần thiết trong điều trị - phẫu thuật, tai biến sản khoa,ghép tạng, bệnh về máu Tuy nhiên truyền máu có thể gây ra nguy cơ taibiến, một trong số những tai biến là truyền nhầm nhóm máu Truyền nhầmnhóm máu trước đây thường hay gặp và là nguyên nhân chính gây ra tai biến,

để lại hậu quả nặng nề, đe dọa trực tiếp tính mạng bệnh nhân Để hạn chế tìnhtrạng này, cần thiết phải có kỹ thuật Định nhóm máu chính xác và hiệu quả

Để đạt được yêu cầu đó, đối với phòng xét nghiệm, cần phải đặt vấn đềđảm bảo chất lượng xét nghiệm lên hàng đầu Kiểm tra chất lượng xét nghiệm

là một khâu của đảm bảo chất lượng nhằm phát hiện sai số, tìm nguyên nhângây ra sai số và từ đó đề ra các biện pháp chế ngự hay khắc phục các sai số đó[1] Và hiện nay, ở nhiều nước trên thế giới, việc kiểm tra chất lượng xétnghiệm đã trở thành quy định tiến hành bắt buộc ở các phòng xét nghiệm yhọc Kiểm tra chất lượng xét nghiệm bao gồm hai hoạt động - nội kiểm vàngoại kiểm

Ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm đã được Bộ Y tế ban hành thành quyđịnh trong quản lý chất lượng xét nghiệm, về mặt chuyên môn, đây là công cụ

để đánh giá độ tin cậy của xét nghiệm và phát hiện sai số [2]

Ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm Định nhóm máu vẫn là vấn đề khámới mẻ trên thế giới nói chung, và ở Việt Nam nói riêng Vì vậy, vấn đề ngoạikiểm chất lượng xét nghiệm Định nhóm máu cần được nghiên cứu và pháttriển hơn nữa Nhằm đảm bảo sự chính xác trong xét nghiệm Định nhóm máu

hệ ABO - Rh, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất mẫu ngoại kiểm cho Định nhóm máu hệ ABO - Rh” với các mục tiêu:

1 Hoàn thiện quy trình sản xuất mẫu hồng cầu cho ngoại kiểm Định nhóm máu hệ ABO - Rh.

2 Hoàn thiện quy trình sản xuất mẫu huyết thanh cho ngoại kiểm Định nhóm máu hệ ABO - Rh.

3 Sản xuất và cung cấp thử nghiệm mẫu ngoại kiểm Định nhóm máu

hệ ABO - Rh cho 15 phòng xét nghiệm.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đảm bảo chất lượng và Kiểm tra chất lượng

1.1.1 Khái niệm

Đảm bảo chất lượng là một hệ thống bao hàm toàn bộ các chính sách,pháp qui, kế hoạch về đào tạo con người, trang bị máy móc, lựa chọn phươngpháp kỹ thuật và thuốc thử để xét nghiệm (XN) đạt được độ tin cậy, giúp bác

sỹ lâm sàng trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh Đảm bảo chất lượng hạnchế đến mức thấp nhất những sai sót có thể xảy ra trong ba giai đoạn của quátrình XN: trước, trong và sau XN [1]

Kiểm tra chất lượng là một khâu của đảm bảo chất lượng nhằm phát hiệnsai số, tìm nguyên nhân gây sai số và từ đó đề ra các biện pháp chế ngự haykhắc phục, tức là tiếp tục cải thiện điều kiện XN, tăng cường công tác đảmbảo chất lượng Kiểm tra chất lượng bao gồm ngoại kiểm và nội kiểm [1]

1.1.2 Nội kiểm

1.1.2.1 Khái niệm về nội kiểm

Nội kiểm (IQC) là công cụ kiểm tra chất lượng hằng ngày trong nội bộmột phòng xét nghiệm (PXN), được thực hiện bởi nhân viên của PXN nhằmđánh giá liên tục các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng XN, từ đó đi đến quyếtđịnh liệu kết quả XN có đủ tin cậy trước khi trả cho bác sỹ lâm sàng hoặcbệnh nhân [3]

1.1.2.2 Mục đích của nội kiểm [4]

− Đánh giá những kết quả thực hiện được ở một PXN

− Đảm bảo tính tin cậy của các kết quả XN

− Giúp cho mỗi PXN tự đánh giá được giá trị của kiểm tra chất lượng(quality control - QC) cùng sự hoạt động có hiệu quả của PXN mình

− Đánh giá tay nghề của mỗi cán bộ làm XN

− So sánh kết quả XN của mình với các labo khác áp dụng cùngloại kỹ thuật.

1.1.3 Ngoại kiểm

1.1.3.1 Khái niệm về ngoại kiểm

Ngoại kiểmlà một công cụ quan trọng của kiểm tra chất lượng được sửdụng để giám sát chất lượng XN Ngoại kiểm mang lại nhiều lợi ích choPXN, cơ sở khám bệnh, chữa bệnh, bác sĩ lâm sàng, bệnh nhân, các cơ quanquản lý giúp PXN so sánh kết quả với các PXN khác trong cùng khu vực,trong một hoặc nhiều quốc gia thông qua một đơn vị triển khai ngoại kiểmđộc lập [5]

Đơn vị triển khai ngoại kiểm là một tổ chức độc lập có trách nhiệm vàvai trò trong việc xây dựng, vận hành chương trình ngoại kiểm, không cóxung đột tiềm ẩn về mặt quyền lợi [5]

Ngoại kiểm chất lượng XN có ba phương thức triển khai là thử nghiệmthành thạo, kiểm tra lại/phân tích lại và đánh giá tại chỗ Trong đó, thửnghiệm thành thạo là phương thức sử dụng phổ biến cho mục tiêu đạt các tiêuchuẩn quốc gia, tiêu chuẩn quốc tế [5]

Thử nghiệm thành thạo đánh giá việc thực hiện của các PXN thông qua

so sánh liên phòng, nghĩa là đánh giá các XN trên cùng một mẫu thử nghiệmhay những mẫu thử nghiệm tương tự được phân tích bởi hai hay nhiều PXNtheo các điều kiện đã xác định trước [5]

Ngoại kiểm được thiết kế để kiểm tra định kỳ kết quả PXN có phù hợpvới kỳ vọng về chất lượng cần thiết cho chăm sóc bệnh nhân [6]

Trong chương trình ngoại kiểm, một nhóm các PXN thực hiện phân tíchmột hoặc nhiều chất phân tích/chỉ số XN trong các mẫu giống nhau (thường làcùng vật liệu kiểm tra, bắt buộc cùng số lô), mô phỏng các mẫu trên lâm sàng.Các PXN không được thông báo về nồng độ/kết quả của chất phân tích/chỉ số

XN và hoạt tính trong một mẫu cụ thể Kết quả của họ được nộp lại đơn vịtriển khai ngoại kiểm để đánh giá sự phù hợp với các kết quả mong đợi Đơn

vị triển khai ngoại kiểm dựa trên giá trị trung bình, SD đối với xét nghiệmđịnh lượng, giá trị mong đợi đối với xét nghiệm định tính để mô tả hiệu năngcủa nhóm PXN và đưa ra các báo cáo gồm kết quả báo cáo của mỗi PXN,phương pháp được sử dụng cho các phép đo, các giá trị đích mong đợi chomỗi chất phân tích/chỉ số XN và đánh giá liệu kết quả PXN riêng biệt có đápứng được yêu cầu về hiệu năng Các báo cáo cũng có thể bao gồm đánh giáhiệu năng của các phương pháp đo lường khác nhau mà các PXN đã sử dụng[6], [7]

1.1.3.2 Mục đích, vai trò của ngoại kiểm

Ngoại kiểm là công cụ quan trọng giúp giám sát chất lượng XN, cụ thể:

− Đánh giá và giám sát liên tục việc thực hiện XN của các PXN tham gia

− Xác định những yếu tố tiềm ẩn có thể ảnh hưởng đến chất lượng XN, từ

đó PXN có các hành động phòng ngừa nhằm cải tiến chất lượng (ví dụnhư những vấn đề liên quan đến quy trình thực hiện XN, huấn luyệnnhân sự )

− So sánh kết quả phân tích giữa các PXN tham gia và giữa các nhómphương pháp với nhau

− Chứng minh độ tin cậy của kết quả XN cho người sử dụng dịch vụ

− Thẩm định độ không đảm bảo đo của kết quả XN

− Đánh giá các đặc tính của phương pháp

− Cung cấp nguồn tài liệu để đào tạo liên tục cho nhân viên PXN nhằmđáp ứng những quy định của cơ quan quản lý, yêu cầu của cơ quan côngnhận và nhu cầu của chính PXN [5]

1.1.3.3 Ý nghĩa của ngoại kiểm

Thực hiện ngoại kiểm giúp tăng cường sự quan tâm của PXN trong việckiểm soát chất lượng XN, cung cấp cơ sở để PXN đánh giá được độ tin cậycủa kết quả XN tại một thời điểm cụ thể

Thông qua kết quả ngoại kiểm, PXN có thể biết được năng lực thực hiệncủa mình ở thời điểm hiện tại tốt hay kém hơn so với trước đó, có thể đánhgiá được thực trạng so với các PXN khác có cùng một nhóm phương pháp,thiết bị, phát hiện sai số, từ đó có cơ sở tìm được nguyên nhân gây sai số và

đề xuất hành động khắc phục đối với kết quả XN chưa đạt yêu cầu [5]

Kết quả ngoại kiểm được sử dụng để khuyến khích tiêu chuẩn hóa cácquy trình và hiệu chuẩn hóa để đạt được kết quả đồng đều giữa các PXN [6].Thực hiện ngoại kiểm còn là động lực thúc đẩy PXN sử dụng các phươngpháp chuẩn, hóa chất và thiết bị có chất lượng tốt, thực hiện thường xuyêncông tác nội kiểm để thu được chất lượng XN tốt nhất, đồng thời PXN cũngtiết kiệm được chi phí khắc phục sai sót trong XN Tham gia ngoại kiểm giúpPXN hướng đến cải tiến chất lượng XN, nâng cao nhận thức nhân viên trongcông tác đảm bảo chất lượng XN Ngoại kiểm còn cung cấp bằng chứngkhách quan về năng lực PXN và là cơ sở khoa học cho việc công nhận đạtchất lượng theo quy định và chuẩn hóa các PXN [5]

1.1.3.4 Thiết lập giá trị ấn định [5]

Giá trị ấn định được định nghĩa là giá trị quy cho một thông số cụ thể vàđược chấp nhận, đôi khi bằng sự đồng thuận, có độ không đảm bảo đo phùhợp với mục đích đã định

Có nhiều phương pháp xác định giá trị ấn định, việc lựa chọn phương phápxác định giá trị ấn định tùy thuộc vào mục đích của từng chương trình ngoại kiểm

và đặc tính của mẫu ngoại kiểm Có năm cách xác định giá trị ấn định:

+ Mẫu ngoại kiểm là vật liệu (mẫu) tham chiếu được chứng nhận (CRM):Giá trị ấn định và độ không đảm bảo đo là giá trị công bố của vật liệutham chiếu được chứng nhận.

+ Mẫu ngoại kiểm được điều chế theo công thức: Giá trị ấn định của thông

số là hàm lượng (nồng độ) của thành phần được thêm vào mẫu; độkhông đảm bảo đo được ước lượng từ độ không đảm bảo đo của nồng độthông số trong mẫu, thiết bị cân, đo thể tích cũng như các yếu tố liênquan trong quá trình pha trộn

+ Mẫu ngoại kiểm là mẫu được hiệu chuẩn theo mẫu CRM: Giá trị ấn địnhđược xác định bằng cách hiệu chuẩn mẫu ngoại kiểm với vật liệu thamchiếu được chứng nhận tại một phòng xét nghiệm; độ không đảm bảo đoước lượng từ độ không đảm bảo đo công bố của mẫu CRM và sai số lặplại trong quá trình phân tích

+ Mẫu ngoại kiểm có giá trị ấn định được xác định dựa vào sự đồng thuận

từ các PXN chuyên gia: Giá trị ấn định được xác định từ kết quả báo cáocủa các PXN chuyên gia; độ không đảm bảo đo được ước lượng dựa vào

độ không đảm bảo đo của các kết quả báo cáo bởi các PXN chuyên gia.+ Mẫu ngoại kiểm có với giá trị ấn định được xác định dựa vào sự đồngthuận của các PXN tham gia: Giá trị ấn định được xác định bằng cáchdựa vào khuynh hướng tập trung của các kết quả phân tích thu được từcác PXN tham gia; độ không đảm bảo đo được ước lượng từ sai sốchuẩn Phương pháp này là phổ biến nhất

1.1.3.5 Các chỉ số đánh giá kết quả chương trình ngoại kiểm định lượng

Có nhiều chỉ số đánh giá kết quả kiểm tra ngoại kiểm của PXN tham gia,được các đơn vị triển khai ngoại kiểm cung cấp với mục tiêu để đánh giá kếtquả thực hiện của PXN Các chỉ số thường được sử dụng là độ lệch (D), chỉ

số độ lệch chuẩn (SDI) và chỉ số CVI

− Độ lệch (bias - D)

Độ lệch thể hiện mức độ sai khác giữa kết quả ngoại kiểm của phòng XNvới giá trị ấn định.

Công thức tính độ lệch:

D = x - XTrong đó:

D: độ lệchx: Kết quả ngoại kiểm của PXNX: Giá trị ấn định

Độ lệch càng nhỏ thì giá trị đo được càng gần giá trị ấn định và có độxác thực càng cao, có thể biểu thị độ lệch theo tỷ lệ %:

D% = *100%

− Chỉ số độ lệch chuẩn (standard deviation index - SDI)

Chỉ số độ lệch chuẩn được tính cho từng XN riêng biệt giúp đánh giá

độ lệch của XN so với giá trị ấn định Khi có một nhóm các PXN có nhữngđiều kiện gần giống nhau (phương pháp, hóa chất, thiết bị…) gọi là nhómtương đương cùng tham gia ngoại kiểm, dựa vào giá trị ấn định của nhómtương đương để đánh giá kết quả ngoại kiểm của từng PXN so với nhómtương đương có cùng điều kiện

Công thức tính:

SDI =Trong đó:

SDI: Chỉ số độ lệch chuẩn

x: Kết quả ngoại kiểm của PXN

X: Giá trị ấn định của nhóm tương đương

SD: Độ lệch chuẩn của nhóm tương đương

Biện luận chỉ số SDI:

SDI = 0: giá trị trung bình của PXN bằng với giá trị trung bình của nhómtương đương

|SDI| = 2: PXN đang ở ranh giới có vấn đề về độ xác thực

|SDI| ≥ 2: Kết quả không chấp nhận được, cần tiến hành điều tra nguyênnhân và có hành động khắc phục [7]

− Chỉ số CV (Coeficient of variation Index - CVI)

CVI đề cập đến “chỉ số CV”, so sánh CV của phòng XN với CV củanhóm tương đương CVI được tính theo công thức:

CVI =

Biện luận CVI:

CVI = 1: CV phòng XN bằng CV của nhóm tương đương

CVI < 1: độ không chính xác của PXN thấp hơn của nhóm tương đương.CVI > 1: độ không chính xác của PXN cao hơn của nhóm tương đương [8]

1.1.3.6 Chỉ số đánh giá kết quả cho chương trình ngoại kiểm định tính

Đơn vị thực hiện ngoại kiểm so sánh kết quả ngoại kiểm của PXN vớigiá trị ấn định và xác định điểm số cho từng chỉ số từ đó đưa ra hiệu suất thựchiện của PXN

Mỗi đơn vị cung cấp ngoại kiểm sẽ thiết kế và đưa ra cách thức chođiểm, đánh giá hiệu suất riêng cho chương trình ngoại kiểm của đơn vị mình

Hướng dẫn của WHO về Hướng dẫn thiết lập và thực hiện chươngtrình ngoại kiểm Huyết thanh học nhóm máu, điểm số/hiệu suất thực hiện chomỗi chỉ số như sau [9]:

Sổ tay khách hàng chương trình ngoại kiểm Vi sinh của Trung tâmKiểm chuẩn - Trường Đại học Y Hà Nội, hiệu suất của từng chỉ số được đánhgiá như sau [10]:

1.2.1 Khái niệm về nhóm máu

Máu gồm huyết tương và các tế bào máu Các loại tế bào máu có cấutrúc và chức năng khác nhau nhưng đều có màng tế bào Trên màng tế bào cónhiều loại protein mang tính kháng nguyên (KN) Các KN liên quan đến nhautập hợp thành hệ thống Trong mỗi hệ thống có những người có cùng loại KNgọi là người cùng nhóm KN (cùng nhóm máu) Như vậy,có các hệ thốngnhóm hồng cầu (HC), các hệ thống nhóm bạch cầu, tiểu cầu và các hệ thốngnhóm KN huyết tương [11]

HC là loại tế bào chiếm số lượng lớn nhất trong máu Các KN HC đãđược biết sớm nhất và có nhiều ý nghĩa trong y học.Vì vậy có thể định nghĩanhóm máu là sự xếp loại riêng từng loại máu dựa trên sự có mặt hay vắng mặtcủa các KN trên bề mặt HC

Đến nay, Hội Truyền máu Quốc tế (ISBT) đã công nhận có 35 hệ thốngnhóm máu với 423 KN nhóm máu khác nhau [12] Trong các hệ thống nhóm

HC thì hệ nhóm máu ABO được phát hiện đầu tiên và được coi là quan trọngnhất, ngoài ra còn có hệ nhóm máu Rh cũng đóng vai trò quan trọng trongtruyền máu

1.2.2 Hệ nhóm máu ABO

Hệ nhóm máu ABO có bốn nhóm chính là nhóm A, nhóm B, nhóm AB

và nhóm O Bốn nhóm này được nhận biết dựa vào sự có mặt hoặc không cómặt của KN A, KN B trên bề mặt HC và kháng thể (KT) chống A, kháng thể(KT) chống B trong huyết thanh (HT) [13]

Kháng nguyên:

Hệ nhóm máu ABO được hình thành dựa trên hai KN là KN A và KN

B Tên của nhóm máu là tên của KN có mặt trên HC

Kháng thể:

Hệ nhóm máu ABO có hai KT là KT chống A và KT chống B

Trên HC không có KN nào thì trong HT có KT chống lại KN đó Sự cómặt của KT này là tự nhiên, hằng định, không cần một sự miễn dịch nào [11]

Bảng tóm tắt đặc điểm các nhóm máu hệ ABO:

KN A, B và KN H là hai hệ thống độc lập với nhau Gen quy định KN

H di truyền độc lập với gen ABO Tuy nhiên KN H lại có liên quan trongviệc thể hiện của KN A và KN B

Các KN A, B trên màng HC là glycoprotein có các nhóm chức đặctrưng Trên cơ sở một protein cơ bản, người có gen H sẽ tổng hợp được mộtenzym để gắn một nhóm fucoza vào chất cơ bản để tạo nên KN H Khi có

KN H thì gen A và gen B sẽ làm khuôn mẫu tổng hợp enzym chuyển một

nhóm chức vào chất H và tạo nên KN A, KN B Như vậy chất H là chất tiềnthân để gen A thể hiện KN A và gen B thể hiện KN B.

Người nhóm máu O Bombay có kiểu gen hh, do vậy mặc dù có kiểugen AA, AO, BB, BO, AB nhưng vẫn không có KN A, KN B

Cũng như hệ ABO, người có nhóm O Bombay không có KN H sẽ có

KT chống H Họ không có KN A, KN B nên cũng sẽ có KT chống A và KTchống B [11]

− Nhóm A1, A2, A yếu, B yếu [11], [14], [15], [16]:

Có người nhóm máu A nhưng khi XN thấy HC của họ ngưng kết yếu với

KT chống A so với người nhóm A bình thường, HT của những người này có

KT chống lại HC A bình thường Người ta gọi nhóm A bình thường là nhómA1, người có HC ngưng kết yếu này là nhóm A2

Người mang KN A2 có thể có KT tự nhiên chống A1 nhưng hiệu giáthấp Tuy nhiên, nếu những người A2 được truyền máu A1 có thể sinh KTmiễn dịch chống A1

HC của người mang nhóm B yếu có ngưng kết yếu với KT chống B, một

số người có mang KT chống B trong HT

1.2.3 Hệ nhóm máu Rh

Kháng nguyên chính:

Đến nay đã phát hiện được khoảng 54 KN của hệ Rh, tuy nhiên có 5 KNchính của hệ Rh, đó là KN D, C, c, E, e.Người có KN D trên HC gọi là người

Rh(+) hoặc Rh(D) dương Người không có KN D trên HC gọi là người Rh(-)hoặc Rh(D) âm [11], [17], [18].

KN D kích thích sinh KT mạnh nhất và phản ứng giữa KN D và KTchống D gây tan máu mạnh KT chống D thường là KT miễn dịch và thườngxuất hiện sau khi truyền máu Rh(D) dương cho người có nhóm máu Rh(D)

âm hoặc người mẹ có nhóm máu Rh(D) âm mang thai trẻ có nhóm máuRh(D) dương [11], [13], [19], [20]

1.2.4 Các hệ nhóm máu khác

Ngoài hệ nhóm máu ABO và hệ nhóm máu Rh, còn có một số hệ thốngnhóm máu hồng cầu phổ biến và có ý nghĩa trong truyền máu như: Kell,Kidd, MNS, Lewis, Duffy, P, Ii, Các hệ thống nhóm máu này đều được xácđịnh bởi KN trên bề mặt HC và KT trong huyết thanh [11]

1.2.5 Tình hình phân bố nhóm máu

Nhóm máu ABO có sự phân bố rất khác nhau tùy thuộc vào chủng tộc vàcác khu vực khác nhau trên thế giới Bảng dưới đây cho thấy sự phân bố cácnhóm máu hệ ABO của một số nước, chủng tộc qua một số nghiên cứu củacác tác giả trong và ngoài nước [21], [22], [23], [24], [25]

Tên nước, chủng tộc Tỷ lệ phân bố nhóm máu (%)

1.2.6 Nguyên lý và các phương pháp xác định nhóm máu

1.2.6.1 Nguyên lý định nhóm máu hệ ABO

Nhóm máu hệ ABO được xác định nhờ sự có mặt của KN trên bề mặt

HC và KT trong HT Khi KT gặp KN tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưngkết đặc hiệu có thể quan sát được

Dựa trên đặc điểm KN và KT, ta có 2 phương pháp để xác định nhómmáu hệ ABO, đó là phương pháp HTM và phương pháp HCM:

− Phương pháp HTM: dùng HTM đã biết trước KT để xác định KN trên HC

− Phương pháp HCM: dùng HCM đã biết trước KN để xác định KTtrong HT, từ đó biết KN trên HC [26]

1.2.6.2 Nguyên lý định nhóm máu hệ Rh

Các KN chính của hệ Rh là D, C, c, E, e, trong đó KN D được phát hiệnđầu tiên và cũng là KN quan trọng nhất vì có khả năng kích thích sinh KTmạnh nhất, nên trước khi truyền máu cần phải định nhóm máu hệ Rh (D) củangười cho và người nhận

Do không có KT tự nhiên loại IgM nên định nhóm máu Rh chỉ dựa trênphương pháp xác định KN, nghĩa là dùng HTM kháng D để phát hiện KN Dtrên bề mặt HC [26].

1.2.6.3 Các phương pháp định nhóm máu

Kỹ thuật định nhóm máu trên phiến đá: Dùng HTM và HCM đã biết đểđịnh loại KN nhóm máu và KT trong HT dựa vào phản ứng ngưng kết

Kỹ thuật định nhóm máu trong ống nghiệm: Dùng HTM và HCM đã biết

để định loại KN nhóm máu và KT trong HT dựa vào phản ứng ngưng kết.Quan sát phản ứng sau khi quay ly tâm

Kỹ thuật định nhóm máu bằng gelcard: Trong một cột gel có buồng phảnứng, có chứa HT chuẩn để định nhóm, có các viên bi thủy tinh làm màng ngănđám ngưng kết Nếu có phản ứng giữa KN và KT sẽ tạo thành các đám ngưngkết (dương tính), nếu không có phản ứng sẽ không tạo thành các đám ngưngkết (âm tính)

1.3 Tình hình ngoại kiểm Định nhóm máu

1.3.1 Trên thế giới

Từ năm 1994 đến năm 1997, Văn phòng tiêu chuẩn chất lượng PXN(BLQS), phòng Khoa học y học (DMSc), Bộ Y tế đã hợp tác với tiểu banTruyền máu Y học đã thiết lập thử nghiệm thành thạo Huyết thanh học nhómmáu cho các trung tâm truyền máu ở Thái Lan Các mẫu được gửi đi từ Trungtâm máu quốc gia và Hội chữ thập đỏ Thái Lan để kiểm tra XN định nhómmáu hệ ABO Đến năm 2002, chương trình này còn kiểm tra cho cả hệ nhóm

Rh [27]

Năm 2004, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã đưa ra hướng dẫn cho thiếtlập và triển khai chương trình ngoại kiểm Huyết thanh học nhóm máu [9].Năm 2010, Văn phòng tiêu chuẩn chất lượng PXN (BLQS), phòngKhoa học y học (DMSc) của Thái Lan phối hợp với WHO Việt Nam triểnkhai chương trình ngoại kiểm Huyết thanh học nhóm máu cho 5 PXN ở ViệtNam: Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Bệnh viện Truyền máu -

Huyết học Thành phố Hồ Chí Minh, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Trungương Huế và Trung tâm Huyết học - Truyền máu Cần Thơ Chương trìnhđược thực hiện với 4 nội dung kiểm tra: hệ nhóm máu ABO, hệ nhóm máu

Rh, sàng lọc KT bất thường, định danh KT bất thường [28]

1.3.2 Ở Việt Nam

1.3.2.1 Trung tâm kiểm chuẩn XN Thành phố Hồ Chí Minh

Triển khai chương trình:

Năm 2013, Trung tâm Kiểm chuẩn XN Thành phố Hồ Chí Minh đã triểnkhai Chương trình Ngoại kiểm tra chất lượng XN Định Nhóm máu (BS01A)

hệ ABO - Rh cho 20 bệnh viện tại TP.HCM với sự tài trợ của Tổ chức Y tếThế giới (WHO)

Tần suất thực hiện chương trình: 03 tháng/lần.

Mô tả bộ mẫu ngoại kiểm Định nhóm máu: Mỗi bộ mẫu gồm 3 cặp mẫu,

mỗi cặp mẫu bao gồm 1 mẫu HC và 1 mẫu HT được đựng trong tuýp nhựavới thể tích mẫu trong mỗi tuýp là 2ml

1.3.2.2 Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng XN trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh

Trung tâm bắt đầu triển khai chương trình ngoại kiểm Định nhóm máu

hệ ABO - Rh từ năm 2015

Tần suất thực hiện chương trình: 02 tháng/lần.

Mô tả bộ mẫu ngoại kiểm Định nhóm máu: Mỗi bộ mẫu gồm 3 cặp mẫu,

mỗi cặp mẫu bao gồm 1 mẫu HC và 1 mẫu HT được đựng trong tuýp nhựavới thể tích mẫu trong mỗi tuýp là 2ml

1.4 Quy trình chuẩn bị mẫu theo hướng dẫn của WHO

Một chương trình ngoại kiểm cần đáp ứng được nhu cầu của PXN thamgia và kiểm tra được tất cả các XN quan trọng mà phòng XN thường xuyênthực hiện Theo WHO, các mẫu ngoại kiểm tối thiểu phải bao gồm hệ nhómmáu ABO, hệ nhóm máu Rh [9]

Theo tài liệu của WHO về nguyên tắc xây dựng vật liệu ngoại kiểm,mẫu ngoại kiểm phải giống hoặc tương đồng với mẫu bệnh nhân [9] Như vậymẫu ngoại kiểm cho XN Định nhóm máu hệ ABO - Rh phải giống với mẫu

HT và mẫu HC của bệnh nhân, nhằm mục đích kiểm tra XN Định nhóm máucủa PXN tham gia bằng cả hai phương pháp: phương pháp HTM và phươngpháp HCM

1.4.1 Quy trình chuẩn bị mẫu huyết thanh [9]

Nguyên tắc:

Chuyển đổi huyết tương thành HT sử dụng calcium chloride và kaolin

Chuẩn bị dung dịch kaolin:

− Hòa tan 10 gam CaCl2.2H2O và 1 gam MgCl2.6H2O trong 400 mlnước cất khử ion

− Thêm vào 5 gam kaolin và thêm nước cho đủ thể tích tăng lên 100 ml

− Bảo quản ở 4oC cho đến khi sử dụng

Tiến hành chuyển đổi huyết tương sang huyết thanh:

− Đo thể tích huyết tương và cho vào ống nghiệm thủy tinh sạch

− Đưa ống nghiệm vào tủ ấm 37oC để làm ấm huyết tương

− Trộn đều huyết tương (dùng máy trộn nếu có), thêm 1 ml dung dịchkaolin đã trộn đều đối với mỗi 100 ml huyết tương, và thêm 0.1 gam Natriazide đối với mỗi 100 ml huyết tương

− Khi cục máu đông đã hình thành, tiếp tục trộn thêm 1 giờ

− Đậy ống nghiệm, bảo quản ở 4oC qua đêm

− Đậy miệng ống nghiệm lại bằng vải mỏng, cố định bằng dây cao su,

và lọc lấy HT vào ống nghiệm Phần cục đông có thể ép lại để lấy được tối đathể tích HT

− Lọc HT vào 1 lọ sạch khử trùng, sử dụng màng lọc có đường kính0.45µ Nếu có thể, lọc qua màng lọc có đường kính 0,2µ

HT này có thể bảo quản ở 4oC tới 1 năm

1.4.2 Quy trình chuẩn bị dung dịch bảo quản hồng cầu [9]

Chuẩn bị dung dịch Alserver:

− Hòa tan citric acid, dextrose, natri clorua và sodium citrate trong 600

ml nước cất khử ion

− Thêm chloramphenicol và neomycin sulphate Trộn đều

− Pha loãng đến 1000 ml với nước cất khử ion

− Bảo quản dung dịch thu được trong lọ sạch, vô trùng ở 4°C

Phương pháp sản xuất mẫu hồng cầu:

Khối HC đã rửa sạch, sau đó được pha loãng với dung dịch Alsever ởnồng độ 1-10% và lưu trữ ở nhiệt độ 4°C Những tế bào HC này có thể bảoquản trong 4 tuần, nhưng phải có sự kiểm soát thích hợp để đảm bảo tính KNtrên bề mặt HC vẫn khả thi

1.5 Quy trình chuẩn bị panel hồng cầu sàng lọc kháng thể bất thường của Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương [29]

− Rửa HC bằng máy ly tâm lạnh: Rửa 3 lần bằng nước muối sinh lý, rửa lầncuối bằng dung dịch Cellstab với tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C

− Pha HC 5% bằng dung dịch Cellstab Sau khi pha xong, kiểm tra nồng

độ HC bằng máy đếm tế bào và nghiệm pháp Coombs, nếu kết quả nghiệmpháp Coombs âm tính và dung dịch HC đạt nồng độ cho phép (3-5%) sẽ tiếnhành phân phối sản phẩm

− Phân phối sản phẩm vào lọ bằng lọ máy phân phối mẫu tự động

− Đóng gói sản phẩm panel HC sàng lọc Sản phẩm được lấy ngẫu nhiên

để kiểm tra chất lượng về độ tan máu, nồng độ HC và tính KN của một sốnhóm máu

− Phê duyệt của trưởng khoa để phân phối sản phẩm: Trước khi phêduyệt trưởng khoa xem lại các kết quả kiểm tra về chất lượng, thể tích, lô sảnxuất, số lượng sản xuất và sẽ phê duyệt nếu các kết quả chất lượng trên đạtyêu cầu

− Bảo quản panel HC trong tủ lạnh 2-6°C

1.6 Các quy trình trong sản xuất mẫu ngoại kiểm

− Trộn đều và ly tâm 1000 vòng/phút trong 1 phút

− Nghiêng nhẹ thành ống, đọc ngưng kết và hiện tượng tan máu bằngmắt thường và kính hiển vi

− Ghi lại kết quả

Phương pháp HCM:

− Nhỏ 1 giọt HCM A 5%, 1 giọt HCM B 5% vào 2 ống nghiệm đãchuẩn bị sẵn

− Thêm vào mỗi ống nghiệm 1 giọt huyết thanh bệnh nhân

− Trộn đều và ly tâm 1000 vòng/phút trong 1 phút

− Nghiêng nhẹ thành ống, đọc ngưng kết và hiện tượng tan máu bằngmắt thường và kính hiển vi

− Ghi lại kết quả

1.6.2 Quy trình xét nghiệm Hematocrit (HCT) [31]

− Trộn đều ống mẫu

− Đặt một đầu ống đo vi lượng vào trong ống mẫu để mẫu tự mao dẫnđến khoảng ¾ ống

− Gắn đầu ống bằng sáp mềm

− Đặt những ống vi lượng vào những rãnh của mâm ly tâm sao cho mỗi sốcủa ống ứng với số của mẫu máu Đầu gắn sáp phải để ở phía ngoài của mâm.

− Ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút Đọc kết quả thể tích khối HCbằng thước đo đặc biệt

− Tính kết quả: HCT = (chiều cao cột hồng cầu/tồng chiều cao cột dịchtrong ống vi lượng) *100%

1.6.3 Quy trình xét nghiệm Coombs [26]

− Chứng dương:

+ Trộn đều HTM Anti D và nhỏ 02 giọt vào tube chứng dương

+ Trộn đều HCM O 5% và nhỏ 01 giọt vào tube đã có anti D

− Chứng âm:

+ Nhỏ 02 giọt nước muối sinh lý vào tube chứng âm

+ Trộn đều HCM O 5% và nhỏ 01 giọt vào tube đã có nước muối sinh lý.Mẫu chứng được thực hiện cùng các bước với mẫu kiểm tra trong suốtquá trình thực hiện xét nghiệm

1.6.3.1 Coombs trực tiếp

− Pha HC 3-5% trong nước muối sinh lý

− Cho vào ống nghiệm sạch 1 giọt HC đã pha ở trên

− Rửa HC 3 lần bằng nước muối sinh lý, lần cuối cùng phải chú ý thấmthật khô

− Thêm 2 giọt huyết thanh Coombs

− Lắc nhẹ và ly tâm với tốc độ 1000 vòng/phút trong 1 phút

− Đọc kết quả bằng quan sát hiện tượng ngưng kết hoặc tan máu

1.6.3.2 Coombs gián tiếp

− Chuẩn bị HC panel hoặc HC O của người bình thường, rửa 3 lần rồipha 3-5% trong nước muối sinh lý hoặc đệm LISS

− Cho vào ống nghiệm sạch 2 giọt huyết thanh kiểm tra

− Thêm 1 giọt HC O đã pha ở trên

− Thêm 2 giọt đệm LISS (nếu HC O đã được pha bằng đệm LISS thìkhông cần thêm nữa)

− Ủ 37°C trong 15 phút

− Rửa 3 lần bằng nước muối sinh lý

− Thêm 2 giọt huyết thanh Coombs

− Lắc nhẹ và ly tâm 1000 vòng/phút trong 1 phút

− Đọc kết quả bằng quan sát hiện tượng ngưng kết hoặc tan máu.

1.6.4 Quy trình xét nghiệm HGKT [30]

Tiến hành:

− Thực hiện lần lượt cho từng mẫu kiểm tra

− Xếp tuýp thủy tinh đã được đánh dấu thành 1 hoặc 2 hàng trên giá đểmẫu (tùy theo số lượng KT cần hiệu giá) Mỗi hàng có 10 tuýp

− Nhỏ vào mỗi ống 02 giọt nước muối sinh lý

− Lấy mẫu huyết tương/HT cần kiểm tra, trộn đều và nhỏ 01 giọt vàotuýp có đánh dấu nồng độ pha loãng 1/2 ở hàng thứ nhất

− Dùng pipette trộn đều, hút 01 giọt huyết tương/HT pha loãng 1/2 vànhỏ vào tuýp được đánh dấu 1/4

− Tiếp tục làm như vậy cho đến tuýp cuối cùng Tuýp cuối sau khi trộnđều, dùng pipette hút 01 giọt bỏ vào cốc nước thải

− Trộn đều HCM A, nhỏ 01 giọt vào mỗi tuýp đã pha loãng huyếttương/HT ở hàng cần HGKT chống A Trộn đều HCM B, nhỏ 01 giọt vào mỗituýp đã pha loãng huyết tương/HT ở hàng cần HGKT chống B

− Ly tâm tất cả tuýp trên ở 1000 vòng/phút trong 1 phút

− Đọc kết quả bằng mắt thường và kính hiển vi

1.7 Kiểm tra chất lượng mẫu

Dựa trên độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu kiểm tra

1.7.1 Độ đồng nhất

Phương pháp đánh giá độ đồng nhất: vào thời điểm lô mẫu vừa đượcsản xuất, chọn từ ít nhất 10 mẫu một cách ngẫu nhiên (đảm bảo tính đại diệncho lô), phân tích lặp lại các mẫu ít nhất 2 lần Thực hiện đánh giá độ đồngnhất bằng cách xác định phương sai giữa các mẫu (the between- samplevariability) rồi so sánh với các tiêu chí đánh giá (ISO 13528), hoặc sử dụngcác kiểm định so sánh thống kê (Guide 35), hoặc sử dụng kết hợp hài hòagiữa các mục đích với tiêu chí thống kê (IUPAC) [32], [33], [34]

Phương pháp kiểm tra và đánh giá độ đồng nhất của mẫu HC và HTkiểm tra của Trung tâm Kiểm chuẩn XN Thành phố Hồ Chí Minh:

− Mẫu HC: Sau khi sản xuất, lấy 10% mẫu HC ngẫu nhiên trong toàn bộ

số lượng mẫu để kiểm tra Tiến hành thực hiện XN định nhóm máu, đo HCTrồi so sánh với kết quả mong đợi để kết luận lô mẫu đồng nhất [35]

− Mẫu HT: Sau khi sản xuất, lấy 10% mẫu HT ngẫu nhiên trong toàn bộ

số lượng mẫu để kiểm tra Pha loãng từ 1/2-1/512, đánh giá độ đồng nhấtbằng phương pháp bán định lượng KT Tiêu chí để kết luận có sự khác biệt(không đồng nhất) là các ống đánh giá có kết quả ngưng kết 1+ có sự sai biệt

từ 3 nồng độ pha loãng trở lên [36]

1.7.2 Độ ổn định

Phương pháp đánh giá độ ổn định: vào mỗi thời điểm đánh giá độ ổnđịnh, chọn ra một số mẫu của lô đang kiểm tra, phân tích lặp lại nhiều lần.Đánh giá độ ổn định bằng cách sử dụng các tiêu chí đánh giá hoặc đơn giảnbằng cách so sánh thống kê các kết quả thu được với các kết quả ban đầu (saukhi mẫu đã được đánh giá độ đồng nhất) (ISO 13528) [33]

Phương pháp kiểm tra và đánh giá độ ổn định của mẫu HC và HT kiểmtra của Trung tâm Kiểm chuẩn XN Thành phố Hồ Chí Minh :

− Mẫu HC: Tiến hành kiểm tra và phân tích độ ổn định của mẫu HCtrong 30 ngày (10 ngày/1 lần), dưới điều kiện bảo quản 2 - 8 °C Đo tỉ lệ tiêuhuyết của mẫu bằng công thức tính chỉ số HCT, Hb toàn phần (đo trên máyhuyết học tự động) và Hb dịch nổi (đo bằng phương pháp Harboe), so sánhvới tỷ lệ tiêu huyết với giới hạn của FDA (Hoa Kỳ) và tiêu chuẩn châu Âu[37] Tán huyết tăng đáng kể trong lưu trữ, theo tiêu chuẩn châu Âu, giới hạntán huyết cho phép trong suốt quá trình lưu trữ cho đến giai đoạn cuối của quátrình lưu trữ là 0.8%, còn theo FDA (Hoa Kỳ), giới hạn này là 1% [38]

− Mẫu HT: Mẫu HT chứa KT kháng A (Anti A) và KT kháng B (Anti B)được kiểm tra độ ổn định trong 30 ngày (10 ngày/1 lần) bằng phương phápbán định lượng KT Số lượng mẫu mỗi lần kiểm tra là 10% tổng số lượng mẫu

HT đã sản xuất [36]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Chế phẩm khối HC và huyết tương lấy từ Trung tâm Huyết học Truyền máu - Bệnh viện 198 - Bộ Công An

-2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

Khối hồng cầu:

+ Trong chế phẩm đã có chất bảo quản, chất chống đông

+ Không có tan máu, váng nổi hay đông dây

+ Chế phẩm đã được sàng lọc với các bệnh lây truyền qua đường máunhư HBV, HCV, HIV, giang mai, sốt rét

+ Chế phẩm khối HC mới được thu gom trong vòng 1 tuần, được bảoquản trong điều kiện 2 - 8°C

Huyết tương:

+ Không đục, không nổi váng, không lẫn các tế bào máu

+ Đã được sàng lọc với các bệnh lây truyền qua đường máu HBV, HCV,HIV, giang mai, sốt rét

+ Chế phẩm trong thời gian bảo quản và bảo quản trong điều kiện -20°Cđến -25°C

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

Bất kỳ mẫu nào có dấu hiệu bất thường, không đảm bảo các yêu cầukhi lấy mẫu cần loại bỏ ngay, như:

− Có tan máu, đông dây

− Có váng đục, đen do nhiễm trùng

− HT quá đục, lẫn các tế bào máu

− Chế phẩm đã hết hạn, không còn trong thời gian bảo quản, lưu trữ.Khối hồng cầu sau khi thu gom quá 1 tuần

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

− Thời gian: từ tháng 1 đến tháng 5, năm 2017

− Địa điểm:

Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng XN - trường Đại học Y Hà Nội.

Bộ môn Sinh lý - trường Đại học Y Hà Nội

2.3 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất

2.3.1 Dụng cụ

− Pipet : Pipet bán tự động, pipet Pasteur

− Đầu côn các loại tương ứng với pipet

− Ống Falcon 50mL

− Tuýp nhựa 3.5 mL có nắp đựng mẫu ngoại kiểm

− Ống nghiệm thủy tinh, ống nghiệm nhựa

− Bình nón, bình tam giác, cốc mỏ

− Bình nhựa, bình thủy tinh đựng hóa chất

− Găng tay, khẩu trang, giấy

2.3.2 Trang thiết bị

Hình 2.1 Máy ly tâm lạnh (trái) và máy ly tâm thường (phải)

Hình 2.2 Máy khuấy từ

Hình 2.3 Bể ổn nhiệt

Hình 2.4 Tủ sạch (tủ chuẩn bị môi trường)

− Bộ HTM: Anti A, Anti B, Anti AB, Anti D của hãng Tulip Diagnostics

− Bộ HCM: HCM A, HCM B, HCM O do viện Huyết học Truyền máuTrung ương sản xuất

− HT Coombs AHG của hãng Tulip Diagnostics

− Hóa chất pha dung dịch Alsever

− Hóa chất pha dung dịch Natri azide

− Nước muối sinh lý, cồn, nước cất

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu thực nghiệm trong PXN Sản xuất mẫu HC ngoạikiểm và mẫu HT ngoại kiểm từ chế phẩm khối HC và huyết tương đông lạnhban đầu Kiểm tra độ đồng nhất của mẫu thử nghiệm Sau đó, tiến hành lưu trữmẫu thử nghiệm ở các điều kiện và thời gian khác nhau để kiểm tra độ ổn định

2.5 Thiết kế nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu bao gồm 2 giai đoạn:

2.5.1.Giai đoạn 1: Hoàn thiện quy trình sản xuất

2.5.1.1 Tạo mẫu nghiên cứu ban đầu:

+ Định nhóm máu của 01 đơn vị 250 mL HC khối

+ Rửa khối HC 3 lần bằng nước muối sinh lý (Nhóm O, Rh(D)dương)

+ Chia 04 lô:

● Lô 01: pha HC tỷ lệ 3-5% bằng dung dịch Alsever

● Lô 02: pha HC tỷ lệ 3-5% bằng nước muối sinh lý

● Lô 03: pha HC tỷ lệ 8-10% bằng dung dịch Alsever

● Lô 04: pha HC tỷ lệ 8-10% bằng nước muối sinh lý

+ Phân phối: mỗi lô vào 50 tuyp (2mL/tuyp 3.5 mL)

2.5.1.2 Kiểm tra chất lượng mẫu nghiên cứu tại Trung tâm Kiểm chuẩn:

− Mẫu HT:

● Số lần thực hiện kiểm tra độ ổn định: 02 lần.

● Định nhóm máu và HGKT cho mỗi lọ mẫu của 2 lô

● Thời gian thực hiện: 1 tháng

Tiến hành sản xuất thử nghiệm HC có đối chiếu bảo quản bằng Alsever

và nước muối sinh lý Tương tự sản xuất thử nghiệm mẫu HT có đối chiếugiữa có sử dụng chất bảo quản (Natri azide 0.1%) và không có chất bảo quản

Từ đó để tìm ra cách bảo quản tốt và phù hợp nhất khi đi vào triển khai sảnxuất mẫu ngoại kiểm

2.5.2.Giai đoạn 2: Sản xuất mẫu ngoại kiểm và đánh giá kết quả ngoại kiểm.