Nghiên cứu về liên cầu nhóm b ở các phụ nữ viêm âm đạo tại bệnh viện phụ sản trung ương năm 2016

Sự lây nhiễm này là yếu tố nguy cơ quan trọng gây nhiễm trùng sơ sinh trầm trọng với tỷ lệ tử vong tới 50%.Một số nghiên cứu cho thấy con của những sản phụ bị nhiễm liên cầu nhóm B có ng

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm âm đạo là một trong những bệnh phụ khoa thường gặp nhất ở phụ

nữ Theo một số nghiên cứu của các tác giả trong nước, tỉ lệ viêm âm đạo ởphụ nữ khoảng 20% và các thai phụ khoảng 50% Viêm âm đạo nếu khôngđược điều trị đúng, kịp thời có thể gây viêm CTC, TC, viêm dính vòi trứng vàhậu quả là bệnh nhân có thể bị vô sinh, chửa ngoài tử cung [1],[2],[3]

Liên cầu nhóm B cư trú ở đường tiêu hóa và niệu dục của người phụ

nữ, thường không biểu hiện triệu chứng lâm sàng trong hầu hết các trườnghợp Ở phụ nữ có thai, liên cầu nhóm B có thể gây nhiễm trùng tiết niệu,nhiễm khuẩn ối, viêm niêm mạc tử cung Sự lây truyền dọc từ mẹ sang con cóthể xảy ra vào thời kỳ chuyển dạ hoặc vỡ ối Sự lây nhiễm này là yếu tố nguy

cơ quan trọng gây nhiễm trùng sơ sinh trầm trọng với tỷ lệ tử vong tới 50%.Một số nghiên cứu cho thấy con của những sản phụ bị nhiễm liên cầu nhóm B

có nguy cơ nhiễm khuẩn huyết sơ sinh cao gấp 25 lần so với con của nhữngsản phụ bình thường Tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B đường sinh dục ở phụ nữkhông có thai và các thai phụ không có sự khác biệt [4],[5]

Liên cầu nhóm B được chia thành 10 type huyết thanh, trong đó cáctype Ia, Ib, II, III, V chiếm tới 95% Type III là type hay gây viêm màng não

ở trẻ sơ sinh và nhiễm khuẩn sơ sinh muộn nhất [6]

Năm 1996, Trung tâm Kiểm soát dịch bệnh của Hoa Kỳ (CDC) và Tổchức Y tế Thế giới (WHO) đã ban hành Khuyến cáo về Chiến lược điều trị dựphòng nhiễm liên cầu nhóm B ở các thai phụ Kết quả cho thấy có sự giảmđáng kể của tần suất bệnh và tỷ lệ tử vong do nhiễm trùng sơ sinh [7]

Do việc lạm dụng kháng sinh dự phòng, liên cầu nhóm B đã có hiệntượng kháng lại một số thuốc kháng sinh như erythromycin, clindamycin Năm 2005, tỷ lệ kháng thuốc của liên cầu nhóm B với hai loại kháng sinhnày là 16,5%, tỷ lệ này đã tăng lên tới 69,9% trong năm 2008 [8],[9],[10].

Chẩn đoán viêm âm đạo do liên cầu nhóm B có ý nghĩa rất quan trọngtrong việc điều trị cho bệnh nhân và ngăn ngừa các nhiễm khuẩn sơ sinh trầmtrọng [11]

Ở Việt Nam, những khuyến cáo của WHO và CDC về vấn đề này chưađược thực hiện đúng mức Bệnh viện Phụ sản Trung ương là tuyến cao nhấtnhận khám và điều trị nhiều bệnh nhân nữ bị các bệnh liên quan đến nhiễmtrùng cơ quan sinh dục trong đó có viêm âm đạo Hiện tại chưa có nghiên cứunào xác định tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B dịch âm đạo cũng như đánh giámức độ nhạy cảm với kháng sinh và xác định các type huyết thanh bằng PCR

Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu về liên cầu nhóm B ở các phụ nữ viêm âm đạo tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương năm 2016”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sinh lý học âm hộ, âm đạo, cổ tử cung

1.1.1 Dịch âm đạo

- Dịch âm đạo (thường gọi là khí hư) bao gồm các tế bào âm đạo bong

ra, chất tiết từ tuyến Bartholin, tuyến Skene, dịch nhầy ở cổ tử cung, dịch tiết

ra từ buồng tử cung và dịch thấm từ thành âm đạo

- Bình thường, dịch âm đạo trong, hơi quánh, thay đổi theo chu kỳ kinhnguyệt, vào thời kỳ phóng noãn dịch âm đạo nhiều và loãng là dịch sinh lý

1.1.2 Sinh hóa học

Dịch âm đạo chứa các phân tử carbonhydrat, glucose, protein, acid amin,acid béo, các ion K+, Na+, Cl- Bình thường hàm lượng acid lactic là 0,658 ±0,118 mg/g dịch tiết âm đạo

1.1.3 Độ pH âm đạo

Bình thường môi trường âm đạo nghiêng về acid (pH từ 3,8 đến 4,6) Độ

pH âm đạo là do glycogen tích lũy trong tế bào biểu mô chuyển thành acidlactic khi có trực khuẩn Doderlin Nồng độ Glycogen dự trữ trong tế bào chịuảnh hưởng của estrogen

1.1.4 Hệ vi sinh bình thường trong âm đạo

Dịch âm đạo thường chứa 108 đến 1012 vi khuẩn/ml, gồm trực khuẩnDoderlin chiếm khoảng 50-88% Ở phụ nữ bình thường, hệ vi sinh vật cótrong âm đạo ở trong trạng thái cân bằng động Mất sự cân bằng này có thểdẫn tới tình trạng viêm nhiễm âm đạo

Các tác nhân vi khuẩn cơ hội trong đó có liên cầu nhóm B sẽ gây bệnhkhi chúng hiện diện với số lượng cao và hoặc khi có đường vào

Để tự bảo vệ, ngoài sự bền vững của biểu mô vẩy, còn có một số cơ chế khác:+ pH âm đạo toan < 4,5 là môi trường không thuận lợi cho vi khuẩn gâybệnh phát triển Để có được môi trường âm đạo toan cần phải nhờ đến sự cómặt bình thường của trực khuẩn Doderlin có sẵn trong âm đạo Các vi khuẩnnày chuyển glycogen có trong tế bào biểu mô âm đạo thành acid lactic.

+ Niêm mạc âm đạo có dịch thấm từ mạng tĩnh mạch, bạch mạch, dịchnày có enzym kháng khuẩn

+ Chất nhầy cổ tử cung cũng có các enzym kháng vi khuẩn như lysozym,peroxidase, lactoferin

Dịch sinh lý âm đạo không bao giờ gây ra các triệu chứng cơ năng nhưkích thích, ngứa hay đau khi giao hợp, không có mùi, không chứa bạch cầu đanhân và không cần điều trị [12],[13]

1.2 Liên cầu nhóm B.

1.2.1 Sự cư trú của liên cầu nhóm B trong cơ thể người

Liên cầu nhóm B có thể được tìm thấy từ nhiều vị trí trên cơ thể người.Đường tiêu hóa là nơi thường trú của tác nhân này và có vai trò như một kho

dự trữ để vi khuẩn phát tán đến các vị trí khác Đường niệu dục là vị trí cácliên cầu nhóm B hay gây nhiễm trùng Liên cầu nhóm B có mặt trong âm đạobắt đầu từ tuổi vị thành niên, sự cư trú này có thể là tạm thời hoặc mãn tínhhoặc có tính chất từng giai đoạn

Tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B ở âm đạo phụ nữ có thể khác nhau tùy theochủng tộc, vị trí địa lý, độ tuổi, tuy nhiên tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B âm đạocủa thai phụ và ở phụ nữ không có thai là như nhau [9] Khoảng 10% đến20% thai phụ có liên cầu nhóm B trong âm đạo - trực tràng (10% từ xétnghiệm bệnh phẩm âm đạo, 27% từ xét nghiệm bệnh phẩm trực tràng) [14],[15],[16]

Liên cầu nhóm B có thể không gây ra triệu chứng trên cá thể mang mầmbệnh (người lành mang vi khuẩn) Đối với các thai phụ liên cầu nhóm B cókhả năng gây bệnh lý nguy hiểm như sảy thai tự nhiên, thai chết lưu, đẻ non,nhiễm trùng ối, nhiễm trùng hậu sản [17],[18],[19].

1.2.2 Đặc điểm sinh vật hóa học

Liên cầu được Billroth mô tả lần đầu tiên vào năm 1874 từ mủ của cáctổn thương viêm quầng và các vết thương bị nhiễm trùng Năm 1880, Pasteurphân lập được liên cầu ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết Sau đó Ogston(1881), Rosenbach (1884) đã nghiên cứu kỹ về tổ chức bệnh lý

Năm 1919, Brown đã xếp loại liên cầu theo những hình thái tan máukhác nhau khi chúng phát triển trên môi trường thạch máu:

Tan máu (): Vòng tan máu trong suốt, hồng cầu bị phá hủy hoàn toàn.Hình thái tan máu này gặp chủ yếu ở liên cầu nhóm A, ngoài ra còn có thểgặp ở nhóm B, C, G, F

Tan máu (): Tan máu không hoàn toàn, xung quanh khuẩn lạc có vòngtan máu màu xanh, thường gặp liên cầu viridans

Tan máu (): Xung quanh khuẩn lạc không nhìn thấy vòng tan máu.Hồng cầu trong thạch vẫn giữ màu hồng nhạt, thường gặp đối với liên cầu

nhóm D (S faecalis).

Năm 1930, Lancefield dựa vào kháng nguyên C (Carbohydrat) của vách

tế bào vi khuẩn để xếp liên cầu thành các nhóm A, B, C, R

1.2.2.1 Đặc điểm sinh học

- Hình thể và tính chất bắt màu

Liên cầu nhóm B là những cầu khuẩn bắt màu Gram dương, xếp thànhchuỗi dài ngắn khác nhau, không di động, đôi khi có vỏ, đường kính 0,6 -1 um

Nhiệt độ thích hợp là 370 C Trên môi trường lỏng, liên cầu nhóm B pháttriển hình thành các chuỗi đến khi đủ lớn thì tạo thành những hạt nhỏ hoặcnhững hạt như bông rồi lắng xuống đáy ống Vì vậy sau 24 giờ nuôi cấy, môitrường phía trên trong suốt, đáy ống có nhiều hạt lắng cặn.

Trên môi trường đặc, vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc nhỏ,tròn, lồi, bóng, khô, màu hơi xám.

Liên cầu nhóm B phát triển trên môi trường thạch máu có thể gặp dạngtan máu β

Đây là kháng nguyên nằm ở vách tế bào vi khuẩn Dựa vào carbohydrat

C, Lancefield xếp liên cầu thành các nhóm từ A đến R

+ Kháng nguyên M đặc hiệu type

Kháng nguyên M cũng nằm ở vách tế bào vi khuẩn

Protein M nằm rải đều trên bề mặt của tế bào, gắn ở rìa của tế bào nên dễdàng kết hợp với kháng thể kháng protein M

Protein M có khả năng chống lại thực bào vì vậy nó có liên quan trựctiếp tới độc lực của liên cầu nhóm B Kháng nguyên M bị thủy phân bởi mentrypsin hoặc pepsin

Dựa vào các kháng nguyên cacbonhydrat và polysaccharid, liên cầunhóm B được chia thành 10 type huyết thanh, trong đó các type Ia, Ib, II, III,

V chiếm tới 95% Type III là type hay gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh vànhiễm khuẩn sơ sinh muộn nhất

+ Streptodornase; (Deoxyribonuclease) hoặc DNase: Tillett đã mô tả

enzym streptodornase có 4 loại A, B, C, D và 4 loại này là những khángnguyên khác nhau, có khả năng kích thích cơ thể hình thành kháng thể đặchiệu Streptodornase có khả năng thủy phân ADN, do đó làm lỏng mủ, nhưng

nó chỉ có tác dụng khi có mặt của ion Mg

+ Hyaluronidase: Thủy phân acid hyaluronic của tổ chức, tạo điều kiện

cho vi khuẩn lan tràn sâu rộng vào các mô Enzym này là một kháng nguyên

Streptolysin S: Có vai trò tan máu ở bề mặt của môi trường nuôi cấy.Độc tố này không bị mất hoạt tính bởi oxy, tính kháng nguyên kém, vì vậykhông kích thích cơ thể hình thành kháng thể.

+ CAMP factor bản chất là một protein ngoại bào có ở liên cầu nhóm B

1.2.2.2 Miễn dịch

Trong các loại kháng thể tạo thành, chỉ có kháng thể kháng protein M cókhả năng chống lại quá trình nhiễm trùng Kháng thể này mang tính chất đặchiệu typ

Kháng thể kháng streptolysin và kháng thể kháng streptokinase không cókhả năng bảo vệ cơ thể [20],[21],[22]

1.3 Các kỹ thuật xác định liên cầu nhóm B trong phòng xét nghiệm

1.3.1 Các kỹ thuật thông thường xác định liên cầu nhóm B

1.3.1.1 Kỹ thuật nhuộm soi

Nhuộm Gram để sơ bộ đánh giá mức độ viêm, hình thể, cách sắp xếp, sốlượng vi khuẩn Tiêu bản được làm từ bệnh phẩm/mẫu hoặc từ khuẩn lạc.Trên tiêu bản nhuộm Gram: Vi khuẩn có hình cầu hoặc hình bầu dục,đường kính 0,6 -1µm, bắt màu Gram Dương, xếp thành chuỗi, phân chiatrong mặt phẳng thẳng góc với trục của chuỗi

Trong bệnh phẩm liên cầu thường đứng thành chuỗi ngắn một hoặc haiđôi với nhau, trong môi trường nuôi cấy đặc biệt là trong canh thanh chuỗi sẽdài hơn [23]

1.3.1.2 Nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

Tùy loại bệnh phẩm lựa chọn môi trường thích hợp Các môi trường đểnuôi cấy liên cầu nhóm B là thạch máu, BHI, thioglycolate ủ 370C ở khítrường bình thường hoặc có 5-10% CO2

Tất cả các loại bệnh phẩm cần phải cấy ngay vào môi trường nuôi cấythích hợp, chậm nhất không quá 3 giờ Trong trường hợp cần vận chuyển đi xa,mẫu bệnh phẩm phải được bảo quản trong môi trường vận chuyển thích hợp Với bệnh phẩm máu và dịch não tủy, thường chỉ có một loại vi khuẩnnên cấy vào môi trường BHI hoặc các chai cấy máu có bán sẵn trên thịtrường, các hạt reagent sẽ hấp phụ kháng sinh tạo điều kiện cho vi khuẩn pháttriển Vi khuẩn phát triển thay đổi nồng độ CO2 trong chai cấy máu và máy sẽbáo dương tính Cấy chuyển sang môi trường thạch máu, ủ 370C / 24 giờ Với các bệnh phẩm có thể nhiễm nhiều loại vi khuẩn nên cấy tăng sinhvào môi trường chứa kháng sinh chọn lọc vi khuẩn và giàu chất dinh dưỡng(môi trường selective LIM, môi trường selective Todd-Hewitt) Các khángsinh trong môi trường cấy (gentamycin và axit nalidixic, hoặc colistin và axitnalidixic) giúp loại trừ những loại vi sinh vật không phải là liên cầu nhóm B.Chất dinh dưỡng trong môi trường cấy giúp liên cầu nhóm B sinh sản mạnh,

từ đó tăng khả năng phát hiện hơn so với cách cấy trực tiếp bệnh phẩm vàomôi trường thạch máu Sau khi ủ môi trường tăng sinh ở 370C/ 24 giờ cấychuyển sang môi trường thạch máu, ủ 370C / 24 giờ

Trên môi trường canh thang liên cầu phát triển thành các chuỗi lắngxuống đáy ống tạo lắng cặn Các chuỗi liên cầu nhuộm soi từ môi trường canhthang luôn có xu hướng dài hơn so với trên thạch đĩa

Trên thạch máu liên cầu nhóm B tạo các khuẩn lạc nhỏ đường kính0,5mm, tròn, lồi, bóng, màu hơi xám Phần lớn các chủng liên cầu nhóm Bgây tan máu hoàn toàn trên thạch máu, có một số chủng gây tan máu khônghoàn toàn, vòng tan huyết thường nhỏ hơn so với liên cầu nhóm A Khuẩn lạcnhỏ, màu xanh nhạt trên môi trường Uriselect

Liên cầu nhóm B không sinh nha bào và không di động

Khi nuôi cấy trong môi trường kỵ khí liên cầu có kích thước nhỏ hơn sovới khi nuôi cấy trên môi trường hiếu khí, đôi khi có các vi khuẩn chỉ bằngmột nửa so với bình thường

- Thử nghiệm Catalase: liên cầu và tụ cầu có hình thể và kích thước tương

tự nhau Catalase là enzym chỉ có ở tất cả các tụ cầu mà không có ở liên cầu.Đây là đặc điểm quan trọng để chẩn đoán phân biệt tụ cầu và liên cầu

Liên cầu nhóm B catalase âm tính

- Thử nghiệm CAMP dương tính

- Có thể định danh bằng các thanh định danh có bán sẵn trên thị trườnghoặc máy định danh và đều dựa trên các đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn.+ Định danh bằng Máy định danh Vitex II

Định danh trên máy định danh vi khuẩn là một trong các kỹ thuật địnhdanh tốt nhất hiện nay đang được áp dụng tại nhiều phòng xét nghiệm Tuynhiên, kỹ thuật này cần phải có máy định danh và không phải tất cả các phòngxét nghiệm đều được trang bị thiết bị này

Sử dụng các khuẩn lạc thuần cấy qua đêm để định danh Dùng que cấy lấy3-5 khuẩn lạc thuần cho vào ống nước muối NaCl 4,5% tạo độ đục 5-6,3 McF

Sử dụng thanh GP để định danh Kết quả sẽ được máy báo sau khoảng 6 giờ

Kỹ thuật nuôi cấy và định danh vi khuẩn là tiêu chuẩn vàng trong chẩnđoán xác định liên cầu nhóm B Tuy nhiên kỹ thuật này cho kết quả khá lâusau 48 đến 72 giờ

Theo các khuyến cáo của CDC, WHO cấy bệnh phẩm từ âm đạo- trựctràng là phương pháp tốt nhất để tầm soát liên cầu nhóm B ở các thai phụ Cácnghiên cứu cho thấy lấy bệnh phẩm từ cả hai vị trí này cho kết quả phát hiện liêncầu nhóm B cao hơn so với trường hợp chỉ lấy mẫu ở âm đạo hoặc trực tràng

El Aila và cộng sự đã phân lập vi khuẩn từ hai vị trí lấy bệnh phẩm riêngbiệt (âm đạo và trực tràng) cho thấy: trong số 36 kết quả nuôi cấy dịch âm đạo-

trực tràng dương tính có 19 trường hợp dương tính ở cả hai vị trí, 9 trường hợpcấy dịch âm đạo dương tính và 8 trường hợp cấy dương tính với mẫu bệnh phẩmlấy từ trực tràng [24]

Theo một nghiên cứu của Daniels J và cộng sự năm 2009, khi cấy dịch âmđạo-trực tràng làm tăng khả năng phát hiện liên cầu nhóm B lên tới 50% sovới khi cấy dịch âm đạo Có thể sử dụng 1 hoặc 2 que tăm bông cho 2 vị trílấy bệnh phẩm [25]

Các nghiên cứu đã được tiến hành để xác định độ nhạy và thời gian mọccủa liên cầu nhóm B trong từng môi trường khác nhau như thạch máu; môitrường giàu dinh dưỡng; môi trường chứa kháng sinh chọn lọc vi khuẩn vàgiàu chất dinh dưỡng (môi trường selective LIM, môi trường selective Todd-Hewitt) Chất dinh dưỡng trong môi trường giúp liên cầu nhóm B sinh sảnmạnh, từ đó tăng khả năng phát hiện của phương pháp cấy lên 50% so vớicách cấy trực tiếp bệnh phẩm vào môi trường thạch máu Do đó, đã có khuyếncáo sử dụng loại môi trường chứa kháng sinh chọn lọc vi khuẩn và giàu chấtdinh dưỡng cho mục đích tầm soát liên cầu nhóm B [26]

Theo Votava M và cộng sự khi cấy dịch âm đạo - trực tràng trên thạchmáu cừu sau khi đã tăng sinh qua đêm bằng Todd- Hewitt, tỷ lệ phân lập đượcliên cầu nhóm B lên tới 27,9% [27],[28]

Có nhiều loại kit thương mại dựa trên nguyên lý phản ứng ngưng kếtnhư: Pastorex Strep Plus, Slidex Strep- Kit, Masta Strep có độ nhạy và độđặc hiệu cao [29]

Hình 1.4 Hình ảnh ngưng kết [23]

1.3.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử

Các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng được ứng dụng nhiều trong

chẩn đoán và nghiên cứu liên cầu nhóm B Các kỹ thuật này cho các kết

quả có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, kết quả xác định sẽ nhanh hơn

1.3.2.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

tách ra làm hai chuỗi đơn, mỗi chuỗi đơn này sẽ làm khuôn mẫu cho việc tổnghợp sợi DNA mới Kỹ thuật PCR được thực hiện với một cặp mồi đặc hiệu,mồi này có khả năng bắt cặp, bổ sung vào hai đầu của hai sợi DNA khuôntheo chiều 5’ đến 3’ dưới tác dụng của enzym Taq DNA polymerase MạchDNA mới được hình thành với các nucleotide bổ sung với các nuclotide trênsợi DNA khuôn Qua mỗi chu kỳ nhiệt, số lượng đoạn DNA cần tổng hợp sẽtăng gấp đôi.

Để thực hiện được phương pháp cần có: phân tử DNA ban đầu, hai đoạnDNA mồi (primers), mỗi mồi gồm khoảng 20 base, hai mồi này gắn ở hai đầucủa phân tử DNA ban đầu: mồi ngược và mồi xuôi 4 loại Nu (dATP, dCTP,dGTP, dTTP), Taq polymerase: enzym polymerase có tính chịu nhiệt độ cao;enzym này được tách chiết từ loài vi khuẩn Thermus aquaticus

Phương pháp PCR thực hiện qua nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

- Giai đoạn biến tính: ủ DNA ban đầu ở nhiệt độ cao: 92 - 950C để táchDNA thành sợi đơn

- Giai đoạn lai ghép: DNA mồi được lai ghép với sợi đơn của DNA banđầu Thực hiện ở nhiệt độ: 50 - 520C

- Giai đoạn tổng hợp DNA: Taq polymerase điều khiển sự gắn tiếp các

Nu vào sau DNA mồi dựa DNA ban đầu làm khuôn Thực hiện ở nhiệt độ:

70 - 720C Sau mỗi chu kỳ, từ một phân tử DNA ban đầu tổng hợp nên haiphân tử DNA, đến chu kỳ sau hai phân tử này lại làm khuôn để tổng hợp nên

4 phân tử DNA

Qua các giai đoạn như đã nêu ở trên, và cứ như vậy thực hiện tiếp cácchu kỳ sau Sau n chu kỳ từ một phân tử DNA ban đầu sẽ có 2n phân tử đượctạo thành

Phương pháp PCR là một phương pháp rất nhậy, từ một lượng DNA rất

ít ban đầu, với cặp mồi tương ứng, đặc hiệu, sau khi áp dụng phương phápPCR sẽ có một lượng lớn DNA đủ dùng cho những chẩn đoán, nghiên cứu.Phương pháp PCR trong nhiều trường hợp đã thay thế cho phương phápSouthern blotting vì phương pháp này thực hiện nhanh, cần lượng DNA ít

Đây là kỹ thuật gồm 2 quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằngphản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNAđược tạo thành

Để định lượng vi khuẩn, tiến hành nhân đoạn đặc hiệu của vi khuẩn bằng

kỹ thuật PCR, đo tín hiệu phát huỳnh quang của các đoạn DNA được nhânlên, xác định chu kỳ mà nồng độ DNA mới được tổng hợp vượt qua ngưỡng(tương đương với thời gian thực mà nồng độ vi khuẩn vượt qua ngưỡng), nếuchỉ ít chu kỳ nhân lên mà nồng độ DNA đã vượt qua ngưỡng thì chứng tỏnồng độ ban đầu lớn, và ngược lại, nếu phải qua nhiều chu kỳ nhân lên nồng

độ DNA mới vượt qua ngưỡng thì chứng tỏ nồng độ ban đầu ít Để tính nồng

độ vi khuẩn người ta có các mẫu có nồng độ DNA đặc hiệu đã biết trước, sosánh thời điểm qua ngưỡng của mẫu cần xác định với mẫu chứng có thể tính

ra nồng độ trong bệnh phẩm

- Ưu điểm:

+ Kiểm soát được lượng huỳnh quang giải phóng ra do đó xác định đượclượng sản phẩm PCR tại từng thời điểm (chu kỳ) của khuếch đại Ở kỹ thuậtPCR thông thường, gel agarose có nhiều hạn chế như độ phân giải thấp dovậy định lượng thường không chính xác

+ Độ đặc hiệu cao hơn do sử dụng các mẫu dò đặc hiệu để phát hiện sảnphẩm khuếch đại

+ Tiết kiệm thời gian chỉ khoảng 1-2 giờ trong khi PCR truyền thốngphải mất từ 3-5 giờ

+ Có hệ thống kín do đó ít có nguy cơ bị tạp nhiễm

Kỹ thuật PCR lồng (PCR nested)

- Nguyên lý: Là kỹ thuật sử dụng hai cặp mồi Đoạn DNA được tổnghợp bởi cặp mồi thứ nhất được dùng làm khuôn mẫu cho PCR lần thứ 2 Điềunày đã làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng PCR Nó chỉ nhân lên đoạn đặchiệu của DNA lần 1, đồng thời nó sẽ không nhân lên với những sản phẩmkhông đặc hiệu của lần 1

- Ưu điểm: Kỹ thuật này làm tăng độ nhạy lên nhiều lần so với của phảnứng PCR thông thường Mặc dù sản phẩm PCR lần 1 không rõ song cáckhuôn đích sẽ được khuếch đại lên nhiều lần nhờ PCR lồng tiếp theo Còn cácsản phẩm phụ trong sản phẩm PCR lần 1 sẽ ít có khả năng gắn với mồi (củaPCR lồng lần 2) do vậy sẽ không được khuếch đại Dùng cặp mồi đặc hiệu cóthể xác định được gene đặc trưng cho loài, thậm chí một chủng vi sinh vật nào

đó Đây là lợi thế của kỹ thuật PCR dùng trong xác định type vi sinh vật trongnghiên cứu dịch tễ học

- Nhược điểm: Sản phẩm PCR lần 1 không đặc hiệu song lại đủ lớn và

có thể làm khuôn cho PCR lồng tiếp theo Hiện tượng này dẫn đến các sảnphẩm gen không đặc hiệu cũng sẽ được khuếch đại và làm sai lệch kết quả

Kỹ thuật Multiplex PCR

Multiplex PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử nhằm khuếch đại nhiềutrình tự DNA chỉ trong một phản ứng PCR Trong quá trình phân tích PCR đamồi, nhiều trình tự sẽ được khuếch đại cùng lúc sử dụng nhiều cặp mồi, tất cảcác thành phần được bổ sung vào cùng một ống phản ứng Như một phươngpháp cải tiến của phản ứng PCR thông thường, phương pháp này giúp rútngắn thời gian thực hiện mà lại không ảnh hưởng tới kết quả

Các kỹ thuật trên có độ nhạy và độ đặc hiệu cao và cho kết quả nhanh sẽgiúp cho công tác điều trị chính xác và kịp thời Tuy nhiên, do chi phí của thửnghiệm và các trang thiết bị rất tốn kém nên thử nghiệm này có thể sẽ là mộtphương pháp tầm soát trong tương lai [30],[31]

1.4 Các nghiên cứu về nhiễm liên cầu nhóm B âm đạo

1.4.1 Các nghiên cứu về nhiễm liên cầu nhóm B âm đạo ở Việt Nam

Liên cầu nhóm B chủ yếu cư trú ở âm đạo và trực tràng thường khônggây triệu chứng lâm sàng cho người mang mần bệnh, chúng có khả năng gâybệnh khi có mặt với số lượng cao và hoặc khi có đường vào Tỷ lệ gặp ởngười trưởng thành cao hơn ở trẻ em Tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B ở phụ nữ

có thể khác nhau tùy theo chủng tộc, vị trí địa lý, độ tuổi Tuy nhiên, tỷ lệnhiễm liên cầu nhóm B âm đạo của thai phụ và ở phụ nữ không có thai là nhưnhau Đặc biệt tỷ lệ này còn thay đổi tùy thuộc vào vị trí lấy bệnh phẩm, môitrường nuôi cấy, kỹ thuật xác định [15],[16],[17]

Vi khuẩn này gây ra các tác hại lớn trên thai kỳ như: viêm màng ối, rỉ ối,nhiễm trùng ối, đẻ non, thai chết lưu, nhiễm khuẩn huyết sơ sinh, viêm màngnão ở trẻ sơ sinh, nhiễm trùng hậu sản [4],[18]

Tại Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu về tình hình nhiễm liên cầunhóm B ở âm đạo Các nghiên cứu này khảo sát tình hình nhiễm khuẩn đườngsinh dục dưới, qua đó đánh giá tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B bằng phươngpháp nuôi cấy và định danh vi khuẩn thông thường [32],[33],[34].

Nguyễn Thị Ngọc Khanh và cộng sự (2001) đã nuôi cấy bệnh phẩm từ

âm đạo của 602 thai phụ sống tại Hà Nội đến khám thai tại Viện BVBMTSS

từ 1998-2000 Kết quả có 4,5% đối tượng nghiên cứu nhiễm liên cầu nhóm B

âm đạo- trực tràng tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B là 18,1% [14]

Bùi Thị Thu Hương (2010) tiến hành cấy dịch âm đạo- trực tràng của cácthai phụ sinh non tại Bệnh viện Từ Dũ tỷ lệ dương tính với liên cầu nhóm B là17,5% [18]

Theo Trần Quang Hiệp (2011) tại Bệnh viện Bạch Mai tỷ lệ cấy dịch âmđạo phân lập được liên cầu nhóm B là 6,5% [37]

1.4.2 Các nghiên cứu về nhiễm liên cầu nhóm B âm đạo trên thế giới

Đánh giá được mức độ nguy hiểm của liên cầu nhóm B có thể gây ra chothai phụ và sơ sinh, trên thế giới, từ những năm đầu thập niên 80 của thế kỷtrước đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm ra những mối liênquan, những yếu tố nguy cơ cũng như kháng sinh thích hợp để điều trị chocác thai phụ và sơ sinh nhiễm liên cầu nhóm B [38],[39]

El Aila và cộng sự trong nghiên cứu thực hiện vào năm 2009 đã cho thấy

tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B tại Bỉ là 24% Shore EM (2008) nghiên cứu trên

2878 thai phụ đã chỉ ra tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B là 22% [24],[39]

Lambiase A và cộng sự (2005-2008) nhận thấy liên cầu nhóm B đã cóhiện tượng kháng lại một số thuốc kháng sinh như erythromycin vàclindamycin Năm 2005 tỷ lệ kháng thuốc của liên cầu nhóm B với hai loạikháng sinh này là 16,5%, tỷ lệ này đã tăng lên tới 69,9% trong năm 2008 Tỷ

lệ kháng tetracycline tương đối cao mặc dù các nghiên cứu hàng năm trước đóchưa có thông báo Các chủng liên cầu nhóm B vẫn nhạy cảm tốt vớipenicilline (100%) và ampicillin [9]

Theo nghiên cứu của Shore EM (2008) 100% các chủng liên cầu nhóm Bphân lập được nhạy cảm với penicillin Tỷ lệ kháng đơn thuần vớierythromycin 22%, clindamycin 19%, tỷ lệ kháng với cả 2 kháng sinh này là18% [39]

Trong số các type huyết thanh được biết đến, type III hay gặp nhất và làtype có tỷ lệ kháng fluoroquinolones cao nhất, tỷ lệ đa kháng kháng sinh cao.Type V có tỷ lệ kháng erythromycin cao hơn các type khác [40]

- Liên cầu nhóm B hiện diện ở âm đạo vào bất kỳ thời điểm nào của thai

kỳ, nhưng sự lây nhiễm truyền dọc từ mẹ sang con chỉ xảy ra khi chuyển dạbắt đầu khởi phát và màng ối bị vỡ Cơ chế của sự lây nhiễm là do thai nhihoặc trẻ sơ sinh hít, nuốt phải dịch ối hoặc dịch âm đạo nhiễm liên cầu nhóm

B hoặc bị xâm nhiễm qua những vết thương sang chấn trong đẻ Tỷ lệ trẻ sơsinh bị phát hiện nhiễm liên cầu nhóm B từ những người mẹ có mang liên cầunhóm B là 50%, chỉ có 1-2% trong số này có biểu hiện lâm sàng Khoảng80% trường hợp nhiễm trùng sơ sinh sớm có triệu chứng trong 3 ngày đầu sausinh Liên cầu nhóm B có thể gây viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, viêm

phổi sơ sinh Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, con của những sản phụ bịnhiễm liên cầu nhóm B có nguy cơ nhiễm khuẩn huyết sơ sinh cao gấp 25 lần

so với con của những sản phụ bình thường [5]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Tất cả các phụ nữ đến khám tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương có đủtiêu chuẩn sẽ được chọn vào mẫu nghiên cứu

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn

Những phụ nữ đến khám tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương trong thờigian nghiên cứu có các tiêu chuẩn sau:

- Được bác sỹ khám lâm sàng, chẩn đoán viêm âm đạo và được chỉ địnhcấy dịch âm đạo

- Không sử dụng thuốc kháng sinh, đặt thuốc âm đạo trong vòng 48 giờtrước khi đến khám

- Đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

- Các trường hợp có sử dụng kháng sinh và đặt thuốc âm đạo trong vòng 48 giờ

- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành tại khoa Vi sinh Bệnh viện Phụ sản Trungương và Khoa xét nghiệm Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

2.1.5 Thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành từ năm 2016 đến khi đủ số mẫu nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Đây là nghiên cứu mô tả, cắt ngang

p 1 p Z

n: cỡ mẫu tối thiểu cần nghiên cứu

Z: trị số giới hạn của độ tin cậy

Với độ tin cậy 95%, 2

α/2) (1

Z  = 1,96Chọn d = 0,05

p: tỷ lệ nhiễm liên cầu nhóm B dịch âm đạo

Dự kiến p= 15%

Cỡ mẫu n = 196

Số đối tượng đủ tiêu chuẩn được nghiên cứu là 385 người.Chúng tôi lấy n= 385

2.2.3 Nội dung nghiên cứu, các biến số nghiên cứu

1 Tuổi bệnh nhân: Tuổi bệnh nhân được phân thành các nhóm:

- Kính hiển vi (Olympus của Nhật).

- Máy định danh vi khuẩn Vitex II (Biomerieux của Pháp)

- Máy PCR (C1000 Thermal Cycler hãng Biorad của Mỹ)

- Máy vortex (BR-2000 Vortexer hãng Biorad của Mỹ)

- Máy ủ nhiệt (Techne-Dr Blook)

- Máy điều nhiệt tự động GenAmp PCR system 9700 AB (AppliedBiosystem, Mỹ)

- Máy ly tâm (hãng Eppendorf của Đức)

- Máy ly tâm lạnh (Tomy-Seiko MX-301 của Nhật)

- Bộ điện di ngang (Horizond 58 hãng Gibco-BRL của Mỹ)

- Máy soi và chụp gel (Geldoc hãng Biorad Mỹ)

+ Dụng cụ nuôi cấy phân lập vi khuẩn

- Tăm bông cứng vô trùng đựng trong ống nghiệm vô trùng

- Lam kính sạch, ống nghiệm vô trùng, giá để mẫu

2.3.2 Hóa chất

2.3.2.1 Vật liệu hóa chất dùng cho nuôi cấy định danh liên cầu nhóm B và làm kháng sinh đồ

- Bộ thuốc nhuộm Gram

- Các môi trường nuôi cấy và làm kháng sinh đồ theo thường qui: thạchmáu, thạch Mueller Hinton, Todd-Hewitt

- Các khoanh giấy kháng sinh của hãng MAST DIAGNOSTICS:penicillin 10 units, ampicillin 10µg, cefotaxim 30µg, erythromycin 15µg,clindamycin 2µg, vancomycin 30µg, levofloxacin 5µg

- Bộ sinh phẩm định danh liên cầu

- Thanh định danh GP 67

- Chủng vi khuẩn S aureus ATCC 25923.

- Dung dịch H2O2 và các vật liệucần thiết khác.

2.3.2.2 Vật liệu hóa chất dùng cho tách chiết DNA và định type liên cầu nhóm B

+ Vật liệu dùng cho tách chiết DNA

- Kít tách chiết DNA: (QIAamp DNA Mini Kit hãng QIAGEN - Đức)

- Ethanol 100% (Merk - Đức)

+ Vật liệu PCR dùng cho xác định các type huyết thanh của các chủng liên cầu nhóm B

- PCR Master mix của hãng QIAGEN

- Dung dịch đệm TAE - Tris Acetate EDTA (Invitrogen - Mỹ)

- Cồn 96-100 % (Meck - Đức)

- PCR purification Kit (Norgen - Canada)

- Agarose dùng trong điện di phát hiện ADN (Invitrogen - Mỹ)

- GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000 x dùng để nhuộm ADN(Biotium - Canada)

- Dung dịch đệm TE - Tris EDTA (Invitrogen - Mỹ)

- PBS - Phosphate Buffer Saline (First Base - Singapore)

- Nước cất vô trùng (Invitrogen - Mỹ)

- BigDye® Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem)

- BigDye® Terminator V3.1 Purification Kit (Applied Biosystem - Mỹ)

- Capillary Array, 4 x 50cm (Applied Biosystem - Mỹ)

- POP7 Polymer (Applied Biosystem - Mỹ)

- Running buffer 10X (Applied Biosystem - Mỹ)

- Hidi formamide (Applied Biosystem - Mỹ)

2.4 Các kỹ thuật nghiên cứu

2.4.1 Các bước tiến hành thu thập số liệu và lấy mẫu

- Giải thích cho đối tượng được chọn về mục đích của nghiên cứu chỉmang tính điều tra, mọi thông tin của đối tượng sẽ được giữ bí mật Nhữngbước phỏng vấn được thực hiện sau khi đối tượng đồng ý tham gia nghiên cứu

- Phỏng vấn theo bảng câu hỏi để thu thập các dữ liệu

- Lấy mẫu bệnh phẩm:

Bệnh nhân nằm trên bàn khám với tư thế khám phụ khoa

Giải thích cho bệnh nhân nghe về cách thức lấy mẫu

Mở mỏ vịt Dùng que tăm bông vô trùng lấy bệnh phẩm ở cùng đồ sau,cùng đồ bên Đặt que tăm bông vào ống nghiệm vô trùng

- Mẫu bệnh phẩm được dán nhãn ghi các dữ kiện về tên họ, tuổi, ngàylấy mẫu Nếu bệnh nhân có tiền sử dị ứng penicillin sẽ được ghi nhận

Bệnh phẩm được chuyển về khoa Vi sinh vòng 3 giờ tính từ lúc lấy mẫu

để nuôi cấy, định danh vi khuẩn và làm KSĐ

2.4.2 Kỹ thuật nuôi cấy phân lập, định danh và làm KSĐ.

Các bước tiến hành nuôi cấy phân lập và định danh liên cầu nhóm Bđược thực hiện theo thường qui quy trình của khoa Vi sinh

Bệnh nhân được kết luận nhiễm liên cầu nhóm B khi phân lập được vi

khuẩn trên từ nuôi cấy trực tiếp trên môi trường thạch máu và/hoặc sau khităng sinh từ canh thang Todd-Hewitt

KSĐ sẽ được thực hiện với các chủng liên cầu nhóm B phân lập từ thạch máu

2.4.2.1 Kỹ thuật nuôi cấy phân lập vi khuẩn

- Que tăm bông lấy mẫu được cấy vào ống môi trường Todd-Hewitt, ủ ở

tủ ấm có nồng độ CO2 10%/370C/qua đêm

- Que tăm bông lấy mẫu tiếp tục được cấy trên đĩa thạch máu Đĩa thạchmáu được ủ ở tủ ấm có nồng độ CO2 10%/370C /18-24 giờ

- Từ ống Todd-Hewitt để qua đêm, nếu dương tính (có hiện tượng đụchoặc lắng cặn) tiến hành nhuộm soi, nếu thấy có các cầu khuẩn Gram dươngxếp chuỗi tiếp tục cấy chuyển sang thạch máu theo kỹ thuật cấy phân vùng, ủ

ở tủ ấm có nồng độ CO2 10%/370C /18-24 giờ

2.4.2.2 Kỹ thuật định danh vi khuẩn

- Trên thạch máu quan sát và lựa chọn các khuẩn lạc nghi ngờ là liên cầunhóm B Đó là các khuẩn lạc nhỏ (0,5-1mm), tròn, lồi, bóng, màu hơi xám,phần lớn các chủng liên cầu nhóm B gây tan máu hoàn toàn trên thạch máu,

có một số chủng gây tan máu không hoàn toàn, vòng tan huyết thường nhỏhơn so với liên cầu nhóm A

- Làm tiêu bản nhuộm Gram, nếu soi thấy có hình ảnh cầu khuẩn bắtmàu Gram dương xếp thành chuỗi hoặc đứng đôi thì tiếp tục làm các phảnứng sinh vật hóa học để xác định liên cầu nhóm B

Hình 2.1 Hình ảnh khuẩn lạc liên cầu nhóm B trên thạch máu

(Ảnh chụp tại khoa Vi sinh - Bệnh viện Phụ sản Trung ương)

- Kỹ thuật xác định catalase:

+ Nguyên lý:

Catalase là một enzyme có khả năng phân hủy H2O2 thành H2O và O2

Vi khuẩn có enzyme sẽ có khả năng phân hủy H2O2 thành H2O và O2

+ Phương pháp: dùng que vô trùng (không phải là kim loại) lấy một

lượng vi khuẩn từ khuẩn lạc cần xác định liên cầu nhóm B (được nuôi cấy

trên môi trường thạch máu sau 18-24 giờ) lên lam kính Nhỏ 1 giọt dung dịchH2O2 3% lên trên vi khuẩn ở lam kính và quan sát, nếu thấy hiện tượng sủi bọtkhí (tạo ra O2): catalase dương tính; không thấy hiện tượng sủi bọt khí:catalase âm tính Liên cầu nhóm B catalase âm tính

- Thử nghiệm CAMP

+ Phương pháp:

Trên mặt đĩa thạch máu, dùng que cấy lấy một ăng cấy vi khuẩn S.

aureus cấy một đường thẳng giữa mặt thạch Sau đó dùng que cấy lấy một

ăng cấy vi khuẩn nghi ngờ liên cầu nhóm B, cấy một đường cấy vuông góc

với đường cấy S aureus, dừng cách đường cấy S aureus khoảng 2-3mm Ủ

qua đêm ở nhiệt độ 370C

+ Đọc kết quả:

Vi khuẩn có CAMP dương tính khi tại đầu vạch tiếp cận với vạch cấy S

aureus có một vùng tan huyết hình mũi tên hướng về vạch cấy S aureus

Liên cầu nhóm B có CAMP dương tính

Hình 2.2 Thử nghiệm CAMP dương tính

(Ảnh chụp tại khoa Vi sinh - Bệnh viện Phụ sản Trung ương)

- Kỹ thuật ngưng kết latex

+ Nguyên lý: Phần lớn các chủng liên cầu tan huyết β có các khángnguyên (KN) đặc hiệu nhóm được xác định bằng các kháng thể (KT) đặc hiệunhóm Các KN này chính là các Polysacharid có mặt ở thành tế bào vi khuẩn.Các hạt latex có gắn KT đặc hiệu nhóm sẽ kết hợp với các KN tương ứng tạothành các hạt ngưng kết có thể nhìn thấy bằng mắt thường

MASTASTREP là thử nghiệm ngưng kết nhanh để định nhóm liên cầutheo phân loại của Lancefield dùng một loại enzym để chiết xuất khángnguyên nhóm Kháng nguyên sau khi chiết xuất sẽ được định danh bằng cách

sử dụng hạt latex có gắn kháng thể đặc hiệu nhóm Nếu có sự hiện diện củakháng nguyên trong dung dịch chiết xuất, phản ứng kết hợp KN-KT xảy ra,

hạt latex sẽ ngưng kết Nếu không có sự hiện diện của kháng nguyên, hiệntượng ngưng kết không xảy ra.

+ Lắc đều ống chứa hạt latex có gắn kháng thể đặc hiệu nhóm B

+ Nhỏ 1 giọt latex lên vòng tròn của tấm ngưng kết

+ Nhỏ 1 giọt dung dịch chiết xuất men vào vòng tròn của tấm ngưng kếtnhóm B

+ Dùng que nhựa có sẵn trộn đều các thành phần trong vòng tròn

+ Lắc đều tấm ngưng kết tối đa 1 phút và đọc dưới ánh sáng thường

* Nhận định kết quả:

+ Kết quả dương tính khi tạo các hạt ngưng kết trong vòng 2 phút Tốc

độ và kích thước các hạt ngưng kết phụ thuộc vào nồng độ của kháng nguyêntrong dung dịch chiết xuất

+ Kết quả âm tính khi không tạo hạt ngưng kết, dung dịch đồng nhấthoặc có các hạt nhưng kích thước rất nhỏ

- Định danh bằng Máy định danh Vitek II

Sử dụng các khuẩn lạc thuần cấy qua đêm để định danh Dùng que cấy lấy3-5 khuẩn lạc thuần cho vào ống nước muối NaCl 4,5% tạo độ đục 5-6,3 McF

Sử dụng thanh GP để định danh Đưa rack chứa thanh định danh vào máy theohướng dẫn của nhà sản xuất Kết quả sẽ được máy báo sau khoảng 6 giờ

- Tiêu chuẩn xác định liên cầu nhóm B âm tính: sau 48 giờ nuôi cấynếu không phân lập được liên cầu nhóm B, mẫu xét nghiệm được coi là âm

tính với liên cầu nhóm B.

Phiên giải kết quả theo tiêu chuẩn của CLSI 2016

2.4.3 Các bước tiến hành tách chiết DNA, PCR

2.4.3.1 Kỹ thuật tách chiết DNA

Sử dụng bộ kit thương mại để tách chiết DNA tổng số theo qui trình củanhà sản xuất (bộ kit QIAamp DNA Mini Kit, Cat No 51304)

Tách DNA từ khuẩn lạc gồm các bước sau:

- Bước 1: Lấy 1 ăng khuẩn lạc vi khuẩn đã cấy thuần qua đêm, hòa vào

300 ul nước muối sinh lý, lắc đều trên máy lắc, chuyển 200 µl huyền dịch nàysang một eppendorf vô trùng, loại 1,5 ml

- Bước 2: Hút 20 µl QIAGEN protease (hoặc proteinase K) vào ống chứadịch huyền ở trên (cung cấp sẵn theo bộ kit)

- Bước 3: Bổ sung thêm 200 µl Buffer AL vào ống, trộn đều bằng vortexmạnh trong 15 giây

- Bước 4: Ủ ở 560C trong 10 phút

- Bước 5: Ly tâm nhẹ ống để đẩy các dung dịch bám ở phía trên xuốngđáy ống.

- Bước 6: Cho thêm 200µl ethanol (96-100%) vào ống, trộn đều bằngvortex mạnh trong 15 giây Sau đó ly tâm nhẹ để đẩy các dung dịch ở phíatrên xuống đáy ống

- Bước 7: Chuyển toàn bộ dung dịch ở bước 6 lên cột QIAamp Mini spin(có ống hứng 2 ml ở phía dưới), tránh làm dính dung dịch ở miệng ống Ly

tâm cột ở tốc độ 6,000 x g (8,000 vòng) trong 1 phút, sau đó chuyển cột sang

một ống hứng mới và loại bỏ ống hứng phía dưới

- Bước 8: Thêm 500µl Buffer AW1, tránh làm ướt miệng ống Đóng chặt

nắp và ly tâm ở tốc độ 6,000 x g (8,000 vòng) trong 1 phút, sau đó chuyển cột

sang một ống hứng mới và loại bỏ ống hứng phía dưới

- Bước 9: Mở nắp cột QIAamp Mini spin và cho 500 µl Buffer AW2,

tránh làm ướt miệng ống, đóng chặt nắp và ly tâm ở tốc độ tối đa (20,000 x g;

Primer F (*) (10 µM)Primer R (*)(10 µM)ADN khuôn

H2O

2542112.514.5

Tổng thể tích phản ứng 50

*: cặp mồi trong bảng 2.1

Chu trình nhiệt:

Các bước nhiệt Nhiệt độ Thời gian

Biến tính giai đoạn 1 950C 5 phút

Biến tính giai đoạn 2 950C 30 giây 35

chu kỳ

Kéo dài lần cuối 720C 5 phút

- Multiplex PCR phát hiện các serotype của liên cầu nhóm B

Thành phần phản ứng:

**: cặp mồi trong bảng 2.2

Chu trình nhiệt:

Các bước nhiệt Nhiệt độ Thời gian

Biến tính giai đoạn 1 950C 5 phút

Biến tính giai đoạn 2 950C 30 giây 35

chukỳ

Kéo dài lần cuối 720C 5 phút

- Kỹ thuật điện di sản phẩm PCR

Điện di các sản phẩm sau khi thực hiện xong PCR trên gel agarose 1,2%

với dung dịch đệm TAE 1X

+ Chuẩn bị gel Agarose 1,2%: Đun sôi cho tan hoàn toàn agarose trongđệm TAE bằng lò vi sóng Đợi nhiệt độ dung dịch gel hạ xuống 56-60oC, đổ

gel vào phiến nhựa điện di (6 x 5,5 cm hoặc 6 x 11 cm tuỳ theo số lượng mẫucần điện di), phiến nhựa được đặt thăng bằng trên mặt phẳng nằm ngang trongkhay đã cài sẵn lược tạo giếng.

+ Để gel đông lại (khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng), gỡ bỏ lược bằngcách kéo theo phương thẳng đứng (tránh làm thủng giếng), đặt bản gel vàobuồng điện di ngang sao cho chìm hẳn trong dung dịch đệm TAE 1X

+ Sử dụng micropipette hút 8 -10 µl sản phẩm PCR trộn đều với 2 µlloading dye và cho hỗn hợp này vào các giếng trên bản gel, với các giếng cóthể tích lớn hơn có thể điện di 20 µl sản phẩm PCR

+ Điện di với hiệu điện thế 120V, cường độ dòng điện 100 mA trongthời gian 30 phút

+ Các mẫu thực nghiệm được điện di song song cùng với chứng âm và dương.+ Luôn có thang DNA chuẩn để đối chiếu kết quả khi đọc

Nhuộm DNA và đọc kết quả

+ Bản gel sau khi điện di được ngâm trong dung dịch Gel red 1% phatrong nước cất (trong 5 phút) (hoặc bổ sung ngay ở khâu chuẩn bị gel), sau đóvớt bản gel ra ngâm vào nước cất 10 phút để rửa thạch Sau khi nhuộm, cácvạch ADN trên bản gel sẽ phát sáng dưới ánh đèn cực tím Đọc kết quả điện

di trên hệ thống máy GelDoc (BioRad), chụp ảnh bằng thiết bị và phần mềmchuyên dụng và lưu trong máy tính

- Kỹ thuật đo nồng độ DNA của sản phẩm PCR

Sử dụng máy Bio photometer (Đức)

Tube chứng: 50l dung dịch PBS hoặc nước cất

Tube mẫu: 5 l sản phẩm PCR + 45 l dung dịch PBS hoặc nước cất

Đo ở bước sóng 260 nm: 1 đơn vị = 50 g/ml

Đọc kết quả: Lượng DNA có trong mẫu (g/ml) x10x103/103(l) =nanogam (ng)/l

(x10: Độ pha loãng 10 lần, x103/103: đổi đơn vị từ g/ml sang ng/l)

- Các genotype của liên cầu nhóm B được xác định dựa vào:

+ Kích cỡ của băng DNA

+ Số lượng các đoạn băng DNA

Bảng 2.3 Bảng phiên giải định type huyết thanh liên cầu nhóm B [40]

- Kỹ thuật giải trình tự gen

Do trong nghiên cứu này không có chứng dương và chứng âm của nhàsản xuất, vì vậy chúng tôi thực hiện thêm kỹ thuật Sequencing nhằm mục đíchxác nhận kết quả của phản ứng PCR

Thực hiện phản ứng PCR cho giải trình tự gen:

Sử dụng bộ kít BigDye® Terminator v3.1 sequencing Kit (Mỹ), pha mixtheo hướng dẫn của nhà sản xuất:

Thành phần phản ứng:

Thành phần Thể tích (µl)

Big Dye® Terminator (Ready mix)

Big Dye® Terminator (5X buffer)

Primer (sử dụng cả primer F và R)

ADN template (sản phẩm PCR đã tinh sạch)

Nước khử ion

4,02,01,02,011,0

- Chứng dương: (1 ống)

Thành phần phản ứng bao gồm:

Big Dye® Terminator (Ready mix)

Big Dye® Terminator (5X buffer)

Primer M13F

Vector pGEM-3Zf

Nước khử ion

4,02,01,01,012,0

25 chu kỳ

- Tinh sạch sản phẩm:

Sử dụng kit BigDye® X Terminator Purification Kit (Mỹ) để tinh sạch:Cho vào mỗi ống PCR sequencing có thể tích 20 l (sản phẩm PCR dùngcho bước giải trình tự nucleotide) 2 dung dịch sau:

+ SAM TM Solution: 90 l (nếu có tủa thì ủ 370C /10 phút, sau đó vortexđều trước khi dùng).

+ X TerminatorTM Solution (Big Dye X): 20 l (trước khi dùng phảivortex thật kỹ)

Sau khi cho 2 dung dịch trên vào ống, đặt trên máy, lắc đều trong 30 phút

Sử dụng bộ kít Big Dye ® Terminator v1.1/Matrix Standard Kit:

+ Pha 170-200 l Hi-DiTM Formamide vào 1 ống Matrix Standard vàvortex đều

+ Ủ ở 950C trong 2 phút, chuyển ngay vào khay đá

+ Cho vào giếng chứng 20 l

+ Kết quả sequence thu được từ máy ABI PRISM 3130 (Mỹ) sẽ đượcphân tích bằng phần mềm ATGC 7.2 và đối chiếu với các trình tự chuẩn trênngân hàng dữ liệu gen NBCI (Genbank)

Hình 2.3: Kết quả giải trình tự