PHÂN TÍCH GIÁ TRỊ một số STR MARKER TRONG CHẨN đoán TRƯỚC SINH một số LỆCH bội NHIỄM sắc THỂ

Kỹ thuật FISH đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong nhiều lĩnh vực, một trong số đó là ứng dụng phát hiện các bất thường lệch bội trongchẩn đoán trước sinh ...12FISH sử dụng một

Trang 1

NGUYỄN MẠNH KIÊN

PHÂN TÍCH GIÁ TRỊ MỘT SỐ STR MARKER

TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH

MỘT SỐ LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ

Chuyên ngành : Y Sinh học Di truyền

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS.BS Đoàn Thị Kim Phượng PGS.TS Trần Đức Phấn

HÀ NỘI - 2018

Trang 2

Đoàn Thị Kim Phượng và PGS.TS Trần Đức Phấn, hai Người Thầy đã hết

lòng quan tâm, tận tình giảng dạy, chỉ bảo cho tôi trên con đường nghiên cứukhoa học, là người trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này

Từ những tình cảm chân thành nhất, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới cácthầy cô trong Bộ môn Y sinh học – Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội đãluôn tận tình dạy dỗ, đào tạo tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại

Bộ môn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong hội đồng thôngqua đề cương đã đưa ra những góp ý vô cùng giá trị, giúp cho tôi có nhữngđiều chỉnh để hoàn thành luận văn tốt hơn

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đạihọc, Phòng Kế hoạch tổng hợp của Trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ vàtạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu, nguồn động lực

để tôi luôn cố gắng chính là những tình cảm quý giá của gia đình và bạn bè

Vì vậy, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn ủng

hộ, giúp đỡ, động viên tôi trong học tập và trong cuộc sống

Hà Nội, ngày 22 tháng 8 năm 2018

Tác giả

Nguyễn Mạnh Kiên

Trang 3

học Y Hà Nội, chuyên ngành Y sinh học – Di truyền, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS.BS Đoàn Thị Kim Phượng và PGS.TS Trần Đức Phấn.

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã

được công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,

trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sởnghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày 22 tháng 8 năm 2018

Tác giả

Nguyễn Mạnh Kiên

Trang 4

BP : Base pair

DNA : Deoxyribonucleic Acid

FISH : Fluorescence In Situ Hybridization

FSH : Follicle-stimulating hormone

MSI : Microsatelitte instability

NST : Nhiễm sắc thể

PCR : Polymerase Chain Reaction

QF-PCR : Quantiative Fluorescence-Polymerase Chain Reaction

RNA : Ribonucleic Acid

STR : Short Tandem Repeat

TAQ : Theramus aquaticus

Trang 5

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 4

MỤC LỤC 5

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 3

TỔNG QUAN 3

1.1 Các bất thường lệch bội thường gặp 3

1.1.1 Hội chứng Down 3

1.1.2 Hội chứng Edwards 5

1.1.3 Hội chứng Patau 7

Tiến triển của bệnh thường rất xấu: 80% trẻ bị bệnh chết trong năm đầu Các xét nghiệm di truyền và sinh hoá có thể giúp ta chẩn đoán sớm ở giai đoạn phôi thai hội chứng 3 NST 13 Với những cặp vợ chồng có nguy cơ cao như trong gia đình đã có người sinh con bị bệnh này, lớn tuổi mà vẫn muốn sinh con… khi có thai cần đến các phòng khám di truyền để được chẩn đoán trước sinh cho thai nhi, phòng tránh xuất hiện các trẻ bị bệnh rối loạn NST nói chung trong đó có bệnh 3 NST 13 8

1.1.4 Một số hội chứng do lệch bội NST giới 8

1.2 Các phương pháp chẩn đoán trước sinh 11

1.2.1 Phương pháp di truyền tế bào 11

- Nuôi cấy tế bào và lập karyotyp là phương pháp truyền thống được xem như tiêu chuẩn vàng trong phân tích rối loạn NST ở người Ứng dụng kỹ thuật này vào chẩn đoán trước sinh bắt đầu được nghiên cứu và thực hiện vào năm 1966 khi Steele và Breg báo cáo về nuôi cấy tế bào ối để xác định bộ NST của thai Tế bào ối, máu cuống rốn hoặc gai nhau được đem nuôi cấy từ 3-14 ngày, sau đó sẽ dừng chu kỳ tế bào ở chu kỳ giữa dưới tạc động của colchicin Tiến hành thu hoạch tế bào và trải lên lam kính, nhuộm băng rồi phân tích bộ NST bằng phần mềm chuyên dụng 11

Trang 6

- Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này đó là thời gian trả kết quả

kéo dài từ 14-21 ngày Điều này tạo ra tâm lý bất an kéo dài đối với thai phụ và khiến việc chấm dứt thai kỳ nếu được chỉ định trở nên phức tạp và nguy hiểm hơn Bên cạnh đó, kỹ thuật này đòi hỏi tay nghề và chuyên môn cao của người thực hiện 111.2.2 Phương pháp di truyền tế bào - phân tử (kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh

quang FISH) 12Phép lai tại chỗ đầu tiên được thực hiện vào năm 1969 bởi hai nhà khoa

học là Joseph Gall và Mary Lou Pardue Hai người đã công bố một công trình chứng minh các bản sao gắn phóng xạ của DNA

ribosome có thể được sử dụng để phát hiện các trình tự DNA bổ sung trong nhân tế bào 12Ngày nay, các đầu dò huỳnh quang đã thay thế các đầu dò phóng xạ nhờ

tính an toàn, dễ phát hiện và độ ổn định cao Trên thực tế, đa số các

kỹ thuật lai tại chỗ hiện nay đều sử dụng phép lai FISH Kỹ thuật FISH đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong nhiều lĩnh vực, một trong số đó là ứng dụng phát hiện các bất thường lệch bội trongchẩn đoán trước sinh 12FISH sử dụng một trình tự ngắn của chuỗi DNA sợi đơn được đánh dấu

huỳnh quang, gọi là DNA dò DNA dò được lai với các DNA đích trên NST của tế bào gian kỳ hoặc ở kỳ giữa, sau đó phân tích kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang Kỹ thuật FISH có nhiều hạn chế như giá thành cao, đòi hỏi thiết bị và chuyên môn cao của người đọc kết quả 121.2.3 Phương pháp di truyền phân tử - Kỹ thuật QF-PCR (Quantiative 12flourescence - polymerase chain reaction) 12

Trang 7

1.3.3 Các nghiên cứu ứng dụng QF-PCR để chẩn đoán trước sinh các

lệch bội NST ở Việt Nam và trên thế giới 21

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Địa điểm nghiên cứu 25

Nghiên cứu được tiến hành tại Trung tâm tư vấn di truyền thuộc bệnh viện Đại học Y Hà Nội 25

2.3 Thời gian nghiên cứu 25

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 9/2016 đến tháng 8/2018 25

2.4 Phương pháp nghiên cứu 26

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 26

Là nghiên cứu mô tả cắt ngang 26

2.4.2 Cỡ mẫu 26

Cỡ mẫu nghiên cứu được xác định theo công thức sau: 26

2.4.3 Sơ đồ nghiên cứu 27

2.5 Hóa chất, phương tiện sử dụng trong nghiên cứu 28

Hóa chất nghiên cứu : 28

Kit tách DNA từ tế bào ối: QIAamp DNA Mini Kit 28

Bộ kit Devyser complete v2 cho phản ứng PCR và điện di mao quản 28

Phương tiện : 28

Máy PCR Bio – Rad 28

Máy đo nồng độ DNA, máy ly tâm 28

Tủ lạnh sâu, bàn ủ nhiệt 28

Pipet định mức, đầu côn các loại, ống PCR, ống Eppendorf 1,5ml, ống Falcon vô trùng 28

Máy điện di mao quản ABI 3500XL 28

Phần mềm phân tích DNA fragment: GenneMapper 28

2.6 Kỹ thuật sử dụng trong phương pháp QF-PCR 28

2.6.1 Tách chiết DNA 28

2.6.2 Xác định mức độ tinh sạch DNA 29

Trang 8

2.6.4 Điện di trên máy ABI 3500XL 32

DNA của thai (chiết xuất từ dịch ối) sau khi được PCR khuếch đại các trình tự STR sẽ được điện di trên máy ABI 3500XL 32

2.6.5 Phân tích kết quả 32

Kết quả điện di thu được phân tích bằng phần mềm Genmapper 32

Phân tích kết quả dựa theo Guideline của tổ chức Di truyền tế bào học lâm sàng (ACC) và Hội di truyền phân tử lâm sàng (CMGS) năm 2012 và Hướng dẫn thực hành của hãng Devyser 32

Phân biệt các marker đồng hợp và dị hợp: 32

2.7 Kỹ thuật sử dụng trong phương pháp di truyền tế bào 34

2.7.1 Nuôi cấy tế bào 34

Sau khi nhận mẫu, tiến hành cấy mẫu nhanh nhất có thể 34

Ly tâm ống lấy mẫu chứa dịch ối ở 1000 vòng/phút, trong 10 phút 34

Tiến hành nuôi cấy trong tủ an toàn sinh học 34

Dùng bơm kim tiêm hút hết phần dịch nổi, giữ lại tế bào ối Bổ sung thêm 3-4 ml môi trường Amnio Max và trộn đều 34

Chuyển tất cả môi trường và dịch nuôi vào lọ nuôi cấy 34

Chuyển lọ nuôi cấy vào tủ ấm 37 độ C, môi trường CO2 5% 34

Sau khoảng 7 - 10 ngày mang ra soi trên kính hiểu vi đảo ngược để đánh giá mức độ bám của tế bào Nếu tế bào bám tốt sẽ tiến hành thay môi trường Trút dung dịch sang một lọ mới để tiến hành lưu mẫu Bổ sung môi trường mới vào chai nuôi cấy ban đầu và tiếp tục theo dõi 34

2.7.2 Các bước thu hoạch tế bào 35

Sau khi xác lập thời điểm thu hoạch tế bào, tiến hành các bước như sau: 35

Nhỏ vào chai nuôi cấy dung dịch Colcemid để dừng quá trình phân bào Để tủ ấm 37 độ C trong 3 giờ 35

Đổ bỏ dung dịch trong chai, bổ sung 3ml dung dịch trypsin EDTA, để tủ ấm 10 phút 35

Kiểm tra trên kính hiển vi, nếu tế bào bong hết thì chuyển toàn bộ dịch sang ống falcon 15ml Rửa lại bằng 2ml môi trường và cũng chuyển tất cả vào ống falcon 35

Ly tâm ống falcon ở 2500v/phút trong 10 phút 35

Hút bỏ dịch nổi, bổ sung KCL và để tủ âm 30 phút 35

Ly tâm 2500 vòng/phút trong 10 phút 35

Trang 9

2.7.3 Lập tiêu bản và nhuộm tiêu bản 35

Ly tâm ống thu hoạch ở 2500 vòng/phút trong 10 phút 35

Hút bỏ phần dịch phía trên, để lại khoảng 0.5 ml cặn 35

Trộn đều và dùng pipet nhỏ lên lam kính đã xử lý 35

Để khô, chờ sấy và nhuộm 35

Mang lam đi sấy 80 độ C trong 1 giờ 36

Chuẩn bị bể nhuộm Giemsa và bể nhuộm Trypsin 36

Dừng hoạt độ Trypsin bằng dung dịch Buffer lạnh 36

Nhuộm Giemsa trong 10 phút rồi rửa sạch, để khô 36

2.7.4 Phân tích tiêu bản nhiễm sắc thể 36

Chụp hình các cụm NST dưới kính hiển vi bằng hệ thống camera có kết nối máy tính 36

Lập karyotyp và phân tích bất thường NST với phần mềm phân tích Ikaros analysis 36

Kết luận về bộ NST của mẫu dịch ối 36

2.8 Xử lý và phân tích số liệu 36

Số liệu của nghiên cứu được xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0 36

2.9 Đạo đức trong nghiên cứu 36

Chương 3 37

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37

3.1 Đặc điểm chung của đối tượng 37

3.1.1 Tỷ lệ giới tính thai 37

3.1.2 Phân bố tuổi thai 38

3.2 Tỷ lệ dị hợp tử, đồng hợp tử của các STR marker 39

3.2.1 Tỷ lệ dị hợp tử, đồng hợp tử của các marker STR đối với NST 13 39 3.2.2 Tỷ lệ dị hợp tử, đồng hợp tử của các marker đối với NST 18 39

3.2.3 Tỷ lệ dị hợp tử, đồng hợp tử của các marker đối với NST 21 40

3.2.4 Tỷ lệ dị hợp tử, đồng hợp tử của các marker đối với NST X 42

3.2.5 Tỷ lệ dị hợp tử, đồng hợp tử của các marker đối với NST Y 43

Nhận xét: 43

Trang 10

không phải là STR nên chúng tôi không phân tích tính đồng/dị hợp

tử 43

3.3 Giá trị của các STR marker sử dụng trong kỹ thuật QF-PCR để chẩn đoán lệch bội NST 43

3.3.1 Tỷ lệ phát hiện alen của NST 13 bằng các STR marker 43

Tỷ lệ phát hiện alen của NST 13 bằng các STR marker 43

Khả năng chẩn đoán của các tổ hợp marker rút gọn cho NST 13 44

3.3.4 Tỷ lệ phát hiện alen của NST giới bằng các STR marker 50

Tỷ lệ phát hiện alen của NST X bằng các STR marker 51

Tỷ lệ phát hiện alen của marker SRY là 100% 51

Tỷ lệ phát hiện alen chung cho 2 NST X và Y của các marker 52

3.4 Kết quả của 2 phương pháp chẩn đoán trước sinh (QF-PCR và di truyền tế bào) 53

3.4.1 Tỷ lệ thành công của phương pháp QF-PCR và di truyền tế bào 53

Tuần thai 53

Tỷ lệ thành công % 53

Số lượng 53

Di truyền tế bào 53

QF-PCR 53

16 đến ≤ 17 tuần 53

100 53 100 53 530 53 > 17 đến ≤ 18 tuần 53

Trang 11

4.1 Giá trị của các marker sử dụng trong kỹ thuật QF-PCR để chẩn đoán lệch bội nhiễm sắc thể

13, 18, 21 55 4.2 Giá trị của các marker sử dụng trong kỹ thuật QF-PCR để chẩn đoán lệch bội nhiễm sắc thể giới 60 4.3 Giá trị của phương pháp QF-PCR trong chẩn đoán lệch bội nhiễm sắc thể 62

Kỹ thuật phân tích nhiễm sắc thể đồ từ tế bào ối hoặc tua rau đã được sử dụng

từ những năm 1970 và trở thành tiêu chuẩn vàng cho chẩn đoán trước sinh cácbất thường của nhiễm sắc thể Kỹ thuật này đòi hòi thời gian từ 2-3 tuần để cókết quả Trong nhiều năm sau đó, một số phương pháp đã được phát triển để rút ngắn thời gian này Từ năm 1993, kỹ thuật QF-PCR đã được giới thiệu để phát hiện một số lệch bội NST thường gặp, ứng dụng từ phát hiện về những trình tự lặp lại ngắn của bộ gen (STR) 62QF-PCR là một kỹ thuật cho kết quả nhanh, kinh tế, khả năng tự động hoá cao

và phân tích cùng lúc nhiều mẫu Nhờ vậy, kỹ thuật này nhanh chóng được sửdụng tại nhiều labo trên thế giới nhằm phục vụ cho chẩn đoán trước sinh Từ tháng 1 năm 2005, tại Stockholm (Thụy Điển), thai phụ đã có thể lựa chọn giữa kỹ thuật QF-PCR độc lập hoặc phân tích NST từ tế bào ối để chẩn đoán

Trang 12

và vùng Đông Nam vương quốc Anh Kỹ thuật NST đồ chỉ được chỉ định trong trường hợp siêu âm phát hiện các bất thường cấu trúc thai, hoặc có 2 trong 3 các dấu hiệu của trisomy 21, gồm độ mờ da gáy > 3 mm trước 14 tuần

thai, > 6 mm sau 14 tuần thai và tiền sử gia đình có bất thường NST , , 63

Trong nghiên cứu của chúng tôi với 530 mẫu bệnh phẩm, kỹ thuật QF-PCR đã phát hiện được tất cả 19 trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể 13,18,21, X và Y, không có trường hợp nào âm tính giả hay dương tính giả Như vậy kỹ thuật QF-PCR trong nghiên cứu này có độ nhạy là 100% (19/19), độ đặc hiệu là 100% (511/511), giá trị chẩn đoán dương tính là 100% (19/19), giá trị chẩn đoán âm tính là 100% (511/511) 63

Trong một nghiên cứu của Nguyễn Khắc Hân Hoan và cộng sự (2013) , kỹ thuật QF-PCR có độ nhạy 94,4%, độ đặc hiệu 100%, giá trị chẩn đoán dương tính 100% và giá trị chẩn đoán âm tính 99,5% 63

KẾT LUẬN 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

PHỤ LỤC 9

Hình ảnh NST đồ và QF-PCR của một trường hợp Klinefelter 9

Karyotyp: 47,XXY (Người nam mắc hội chứng Klinefelter) 9

9

10

Chú thích: 11

11

DANH SÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU 12

Trang 14

Bảng 2.1 Các marker sử dụng 31

Bảng 2.2 Đối với marker có 2 peak 33

Bảng 2.3 Đối với marker có 3 peak 34

Bảng 3.1 Phân bố tuổi thai 38

Bảng 3.2 Tỷ lệ dị/đồng hợp tử của các marker đối với NST 13 39

Bảng 3.5 Tỷ lệ dị/đồng hợp tử của các marker đối với NST X 42

Bảng 3.6 Tỷ lệ dị/đồng hợp tử của các marker đối với NST Y 43

Bảng 3.7 Tỷ lệ phát hiện alen NST số 13 của các STR marker 43

Bảng 3.8 Khả năng chẩn đoán của các tổ hợp marker rút gọn cho NST 13 45

(n = 530) 45 Các marker có tỷ lệ dị hợp tử cao nhất 45

Tổ hợp 4 marker 45

Tất cả 7 marker 45

≤ 1 marker dị hợp tử 45

(Không có giá trị chẩn đoán) 45

6 45 3 45 1 45 0 45 ≥ 2 marker dị hợp tử 45

(Có giá trị chẩn đoán) 45

524 45 527 45 529 45 530 45 Tỷ lệ phát hiện (%) 45

98,9 45 99,4 45 99,8 45 100 45 Bảng 3.9 Tỷ lệ phát hiện alen NST số 18 của các STR marker 45

Bảng 3.10 Khả năng chẩn đoán của các tổ hợp marker rút gonj cho NST 18 47 (n = 530) 47

Trang 15

8 47 3 47 1 47 0 47 ≥ 2 marker dị hợp tử 47

522 47 527 47 529 47 530 47 Tỷ lệ phát hiện (%) 47

98,5 47 99,4 47 99,8 47 100 47 Bảng 3.11 Tỷ lệ phát hiện alen NST số 21 của các STR marker 49

Bảng 3.12 Khả năng chẩn đoán của các tổ hợp marker rút gọn cho NST 21 50

(n = 530) 50 Các marker có tỷ lệ dị hợp tử cao nhất 50

11 50 3 50 1 50 0 50 ≥ 2 marker dị hợp tử 50

519 50

527 50

529 50

Trang 16

Tỷ lệ phát hiện (%) 50

97,9 50 99,4 50 99,8 50 100 50 Bảng 3.13 Tỷ lệ phát hiện alen của NST X của các STR marker 51

Bảng 3.14 Tỷ lệ phát hiện alen của NST Y của các STR marker 52

Bảng 3.15 Tỷ lệ thành công của phương pháp QF-PCR và di truyền tế bào 53

Bảng 3.16 So sánh kết quả phương pháp QF-PCR và di truyền tế bào 54

Bảng 4.1 Tỷ lệ dị hợp tử của các marker chẩn đoán cho NST số 13 trong một số nghiên cứu 56

Bảng 4.4 Tỷ lệ dị hợp tử và tỷ lệ phát hiện đúng alen của các marker cho NST giới tính 61

Bảng 4.5 Tỷ lệ dị hợp tử của các marker chẩn đoán cho NST giới trong một số nghiên cứu 62

Trang 17

Hình 1.1 Hình ảnh bệnh nhân hội chứng Down 4

Hình 1.2 Hình thái bên ngoài và đặc điểm bàn tay, bàn chân của bệnh nhân thể ba nhiễm 18 6

Hình 1.3 Các bước khuếch đại PCR và phân tích một locus STR 13

Hình 1.4 Hai alen dị hợp tử 14

Hình 1.5 Hình ảnh 1 alen của NST X, ở người có Karyotyp 46, XY 15

Hình 1.6 Ba alen dị hợp tử với tỷ lệ đỉnh 1:1:1 15

Hình 1.7 Ba alen dị hợp tử với tỷ lệ 2:1 16

Hình 1.8 Cơ chế hình thành STR 17

Trang 18

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dị tật bẩm sinh là một trong những bất thường hay gặp ở thai nhi và trẻ

sơ sinh Tại các nước đang phát triển, ước tính có khoảng 4 triệu trẻ sinh ra có

dị tật bẩm sinh Trong đó, bất thường nhiễm sắc thể là một trong nhữngnguyên nhân quan trọng gây ra dị tật bẩm sinh Một số hội chứng bất thườngnhiễm sắc thể hay gặp như: hội chứng Down, hội chứng Edwards, hội chứngPatau và một số hội chứng bất thường nhiễm sắc thể giới như Klinefelter,Turner Các bất thường bẩm sinh này là nguyên nhân gây tử vong và bệnh tậttrong những năm đầu sau sinh, không chỉ để lại hậu quả nặng nề và thiệt thòilớn cho trẻ, mà còn là gánh nặng lớn cho gia đình và xã hội Bất thườngnhiễm sắc thể chiếm khoảng 15% các dị tật bẩm sinh được chẩn đoán trước 1tuổi ở châu Âu, và liên quan đến 25% tử vong chu sinh do dị tật bẩm sinh Hiện nay việc điều trị và khắc phục hậu quả cho những hội chứng này còn rấtnhiều khó khăn, do đó việc phòng bệnh và chẩn đoán sớm các dị tật bẩm sinhthời kỳ phôi thai là một việc hết sức quan trọng và cấp thiết để có thể giảmbớt gánh nặng tâm lý và kinh tế cho gia đình và xã hội , ,

Gần đây, người ta đã phát hiện ra các trình tự lặp lại ngắn STR (shorttandem repeat) có tính đa hình cao ở một số locus nhất định trên nhiễm sắc thể

số 13, 18, 21, X, Y Nhờ đó khi tiến hành phản ứng nhân gen những locus này,chúng ta có thể xác định được số lượng các alen trên hình ảnh điện di Do bấtthường số lượng alen tương ứng với bất thường các nhiễm sắc thể nên phươngpháp này có thể ứng dụng để chẩn đoán các hội chứng bất thường số lượngnhiễm sắc thể một cách nhanh chóng và chính xác mà không cần phải nuôi cấy

tế bào Kỹ thuật QF-PCR được gọi là phản ứng chuỗi polymer huỳnh quang địnhlượng dùng để khuếch đại các đoạn STR, mỗi một nhiễm sắc thể sẽ được khảosát trên nhiều locus STR khác nhau, nhờ đó tính chính xác của kỹ thuật rất cao

Trang 19

Một số quốc gia như Thụy Điển, Anh đã dùng kỹ thuật này độc lập để chẩn đoántrước sinh các bất thường lệch bội nhiễm sắc thể Chỉ các marker biểu hiện dịhợp tử (2 peak hoặc 3 peak) mới có giá trị chẩn đoán các bất thường lệch bộităng Các marker đồng hợp tử không có giá trị chẩn đoán này Tuy nhiên, tỷ lệđồng hợp tử, dị hợp tử của các alen rất khác nhau ở các chủng tộc khác nhau.Hiện nay, kỹ thuật chẩn đoán QF-PCR trước sinh ở Việt Nam đang thực hiệntrên các kit thương mại sử dụng các marker STR được phát triển ở các quần thểngười châu Âu, châu Mỹ Do đó, giá trị của việc sử dụng các marker này trênngười Việt Nam cần được đánh giá thực tiễn Bên cạnh đó, mỗi locus STR đượclựa chọn có những đặc điểm riêng về tính đa hình, hiện tượng dị/đồng hợp tử, từ

đó ảnh hưởng lớn đến việc phân tích kết quả và ý nghĩa chẩn đoán Vì vậy, tôi

tiến hành đề tài “Phân tích giá trị một số STR marker trong chẩn đoán trước sinh một số lệch bội nhiễm sắc thể” với 2 mục tiêu:

1 Xác định tỷ lệ đồng hợp tử, dị hợp tử của các STR marker sử dụng trong kỹ thuật QF-PCR để chẩn đoán trước sinh một số lệch bội nhiễm sắc thể.

2 Đánh giá giá trị của một số STR marker sử dụng trong kỹ thuật PCR để chẩn đoán trước sinh một số lệch bội nhiễm sắc thể.

Trang 20

QF-Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Các bất thường lệch bội thường gặp

1.1.1 Hội chứng Down

Hội chứng Down là một trong những bất thường lệch bội hay gặp nhất,tần số khoảng 1/319-1/1000 trẻ sơ sinh Tần số này không có sự khác biệtgiữa các chủng tộc và giữa các tầng lớp xã hội trên thế giới , Tỷ lệ nam/nữmắc hội chứng Down khoảng 3/2

Về di truyền tế bào học, khoảng 92,5% trường hợp là thể ba nhiễm 21thuần (47,XX,+21 hoặc 47,XY,+21) Thể ba nhiễm này xảy ra do rối loạn sựphân ly cặp NST 21 trong quá trình tạo giao tử, karotyp của bố mẹ là bìnhthường Khoảng 2-3% trường hợp là thể khảm với 2 dòng tế bào, một dòng tếbào chứa 46 NST, một dòng tế bào chứa 47 NST, thừa NST số 21 Khoảng 2-4% trường hợp là thể chuyển đoạn , trẻ mắc hội chứng Down có 46 NST với 2NST số 21 và NST 21 thứ 3 được chuyển đoạn với các NST tâm đầu khác,hay gặp là NST số 13, 14, 15 thuộc nhóm D hoặc 21, 22 thuộc nhóm G Triệuchứng lâm sàng trong những trường hợp này không khác gì so với thể banhiễm 21 thuần Tuy nhiên, bệnh có tính chất gia đình, bố hoặc mẹ của nhữngđứa trẻ mắc hội chứng Down do chuyển đoạn có thể là những người bìnhthường nhưng mang NST chuyền đoạn cân bằng giữa NST 21 với các NST số

13, 14, 15 hoặc 21, 22

Về triệu chứng lâm sàng, hội chứng Down có những biểu hiện rất dễnhận biết: đầu nhỏ, ngắn; mặt tròn, gốc mũi tẹt, khe mắt xếch, lưỡi to và dày,tai nhỏ, thấp; cổ ngắn, gáy phẳng rộng, bàn tay rộng, các ngón tay ngắn , Trẻ

Trang 21

mắc hội chứng Down chậm phát triển trí tuệ, IQ thấp trung bình 30-50.Thường gặp dị tật tim (thông liên thất, thông liên nhĩ, còn ống động mạch), dịtật tiêu hóa (hẹp tá tràng, không hậu môn và phình to đại tràng) Ngoài ra, hộichứng Down còn liên quan đến bệnh Alzheimer, bạch cầu cấp, tăng huyếtáp…, ,

Hình 1.1 Hình ảnh bệnh nhân hội chứng Down

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ con mắc hội chứng Down tăng nhanhtheo tuổi mẹ, cơ chế liên quan đến đột biến này là do sự không phân ly củaNST 21 trong quá trình giảm phân tạo giao tử Bên cạnh đó, tuổi mẹ quá trẻhoặc tuổi bố cao cũng ảnh hưởng đến tần số sinh con Down Các nguyênnhân khác có thể kể đến đó là các rối loạn nhiễm sắc thể ở bố mẹ, các đột biếnmới phát sinh và yếu tố môi trường

Trong những năm gần đây kết hợp các kỹ thuật di truyền phân tử và laitại chỗ, các nhà di truyền học đã xác định được 5 gen có liên quan đến dấuhiệu lâm sàng của Down đã được định vị trong một vùng của nhánh dài (q)của NST 21

Các gen liên quan đến Down bao gồm: gen mã hóa protein superoxide

dismutase (SOD - 1) và alpha - A - Cristallin ở vị trí 21q22.1, 21q22.3 Gen

Trang 22

Gart, ets - 2 ở vị trí trong 21q21.1 và 21q22.2 Gen mã hóa Phosphofructokinase

(PFK) ở vị trí 21q22.3.

Vùng 21q22.3 gây ra những biểu hiện kiểu hình Down điển hình như:chậm phát triển trí tuệ, đặc điểm đặc trưng của bộ mặt, những bất thường ởtay và những dị tật bẩm sinh của tim

Phân tích ở mức phân tử vùng 21q22.1 - q22.3 thấy chứa những gen liên

quan đến dị tật bẩm sinh của tim Một gen mới DSCR1 được phát hiện trên vùng

21q21.1 - q22.2 biểu hiện ở não, tim và được coi như là tác nhân gây ra những dịtật của tim và chậm phát triển trí tuệ trong hội chứng Down , ,

Việc tìm ra các gen này đã mở ra hướng chẩn đoán hội chứng Down ởmức di truyền tế bào - phân tử và mức phân tử

1.1.2 Hội chứng Edwards

Hội chứng thể ba nhiễm 18 được Edwards và cộng sự mô tả năm 1960

Tỷ lệ chung của bệnh là 1/6000-1/8000 trẻ sinh ra sống Tỷ lệ mắc bệnh pháthiện khi sinh ở nữ cao hơn nam (nữ/nam khoảng 1,5) Tuy nhiên, tỷ lệ thaichết lưu cao hơn ở thai nam so với nữ Hơn nữa, trẻ nữ sinh ra sống biểu hiệnkhả năng sống sót tốt hơn trẻ nam mắc bệnh ,

Về di truyền tế bào, 80% trường hợp là thể ba nhiễm thuần (47,XX,+18hoặc 47,XY,+18) Khoảng 10% ở thể khảm và 10% ở thể chuyển đoạn hoặcthể ba nhiễm kép

Về triệu chứng lâm sàng, giai đoạn phôi: thai bị mắc hội chứng trisomy

18 có biểu hiện già tháng (trung bình 42 tuần), thai hoạt động yếu, đa ối, rau

bé, thường có 1 động mạch rốn

Trang 23

Hình 1.2 Hình thái bên ngoài và đặc điểm bàn tay, bàn chân của bệnh

nhân thể ba nhiễm 18

Khi sinh ra, trẻ sinh ra nhẹ cân, thường đẻ non, có trán hẹp, sọ dài và to,khe mắt hẹp, tai thấp, ít quăn và nhọn, miệng bé, hàm nhỏ và lùi ra sau Bàntay rất đặc biệt, ngón cái quặp vào lòng bàn tay, bàn tay nắm lại, ngón trỏchùm lên ngón nhẫn Bàn chân vẹo Thường kèm theo dị tật ở tim, cơ quansinh dục, thoát vị rốn Tiên lượng rất xấu, thường chết ngay sau khi đẻ hoặcchỉ sống trung bình khoảng 10 tuần Tuổi mẹ có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệmắc hội chứng

Xét nghiệm di truyền có giá trị chẩn đoán và cũng góp phần tiên lượng,

dự phòng tái xuất hiện bệnh ở các trẻ tiếp theo Trẻ bị bệnh có khoảng 80% là

3 NST 18, 10% là thể khảm: bên cạnh dòng tế bào 3 NST 18 vẫn có dòng tếbào bình thường có 2 NST 18, 10% người mắc hội chứng Edwards là dochuyển đoạn của NST 18

Tiên lượng bệnh rất xấu, thường chết ngay sau khi đẻ hoặc chỉ sốngtrung bình 10 tuần

Chẩn đoán bệnh dựa vào:

Trang 24

- Kết quả xét nghiệm di truyền tế bào học.

- Các triệu chứng lâm sàng, siêu âm thai Đặc biệt là các biểu hiện trênbàn tay của trẻ bị bệnh

Các dấu hiệu lâm sàng có thể gợi ý cho việc chẩn đoán Tuy nhiên đểchẩn đoán xác định thì phải dựa vào xét nghiệm di truyền tế bào ,

1.1.3 Hội chứng Patau

Hội chứng thể ba nhiễm 13 được Patau và cộng sự miêu tả năm 1960 Tần

số chung của bệnh là 1/4000-1/10000 trẻ sinh ra sống, với tỷ lệ nữ mắc nhiềuhơn nam Theo một nghiên cứu tại Hoa Kỳ, tỷ lệ mắc hội chứng Patau là1,26/10000 trẻ sinh ra sống

Về di truyền tế bào, khoảng 75% trường hợp là thể ba nhiễm thuần; 20%trường hợp là chuyển đoạn 13/13 do bố mẹ truyền cho (25%) hoặc mới phátsinh (75%); 5% còn lại là thể khảm

Trẻ mắc hội chứng Patau có đặc điểm: đầu nhỏ, nhãn cầu nhỏ hoặckhông có nhãn cầu, tai thấp và biến dạng, thường điếc, sứt môi hai bên, nứtkhẩu cái, tâm thần vận động kém phát triển, thường kèm theo dị tật tim vàống tiêu hóa Tiên lượng bệnh rất xấu, phần lớn chết trong năm đầu, cáctrường hợp khảm biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn có thể sống lâu hơn

Chẩn đoán bệnh dựa vào:

- Kết quả xét nghiệm di truyền tế bào học

- Triệu chứng lâm sàng, triệu trứng trên siêu âm thai

Trang 25

Các dấu hiệu lâm sàng có thể gợi ý cho việc chẩn đoán hội chứngPatau Tuy nhiên để chẩn đoán xác định thì phải dựa vào xét nghiệm di truyền

tế bào ,

Tiến triển của bệnh thường rất xấu: 80% trẻ bị bệnh chết trong nămđầu Các xét nghiệm di truyền và sinh hoá có thể giúp ta chẩn đoán sớm ở giaiđoạn phôi thai hội chứng 3 NST 13 Với những cặp vợ chồng có nguy cơ caonhư trong gia đình đã có người sinh con bị bệnh này, lớn tuổi mà vẫn muốnsinh con… khi có thai cần đến các phòng khám di truyền để được chẩn đoántrước sinh cho thai nhi, phòng tránh xuất hiện các trẻ bị bệnh rối loạn NST nóichung trong đó có bệnh 3 NST 13

1.1.4 Một số hội chứng do lệch bội NST giới

Hội chứng Turner

Hội chứng Turner là một rối loạn ở nữ giới, đặc trưng bởi sự vắng mặt toàn

bộ hoặc một phần nhiễm sắc thể giới tính thứ 2, dẫn đến các biểu hiện lâm sàngthường gặp là thấp lùn, rối loạn sinh dục, phù mạch bạch huyết bẩm sinh Tần sốmắc hội chứng Turner ở trẻ gái sinh ra sống là 1/2500-1/3000

Hội chứng Turner có một tỷ lệ chết cao ngay ở giai đoạn phôi thai 99%), chỉ một số nhỏ sống đến khi sinh

(98-Về di truyền tế bào, khoảng 55% trường hợp có karyotyp là 45,X; 10%trường hợp ở dạng khảm 45,X/46,XX hoặc 45,X/47,XXX; 20% trường hợp

có NST đều ở nhánh dài hoặc nhánh ngắn 46,X,i(Xq); 5% trường hợp do mấtđoạn NST X ở nhánh dài hoặc nhánh ngắn 46,XXq hoặc 46,XXp-; 5% trườnghợp NST X vòng; 5% trường hợp có NST Y như trường hợp khảm45,X/46,XY ,

Trang 26

Về biểu hiện lâm sàng, trẻ gái có người thấp, chậm lớn, hàm nhỏ, cằmnhỏ, tai thấp, mép xệ, tóc mọc thấp xuống tận gáy, cổ ngắn và rộng Cẳng taycong ra ngoài, ngắn đốt bàn 4 và 5, da nhiểu nốt ruồi, móng tay giảm sản vàlồi Trẻ nhi tính khi đã đến tuổi dậy thì, thường kèm theo dị tật tim mạch, tiếtniệu và xương Thường thiểu năng trí tuệ nhẹ, có trường hợp bình thường.Bệnh nhân thường vô sinh, một số trường hợp thể khảm nhẹ có thể có thaisinh con ,

Hội chứng Klinefelter

Hội chứng Klinefelter lần đầu tiên được mô tả vào năm 1942, như là mộtrối loạn nội tiết, đặc trưng bởi tinh hoàn nhỏ, vú to ở nam giới, thiểu năng sinhdục, nồng độ hormon kích thích nang trứng (FSH) cao hơn bình thường

Tần số mắc bệnh trong quần thể chung là 0,1-0,2%, và lên tới 3,1% trongquần thể nam giới vô sinh Hội chứng là dạng phổ biến nhất của thiểu năngsinh dục nam và lệch bội nhiễm sắc thể

Khoảng 80% trường hợp là do bất thường số lượng NST bẩm sinh47,XXY; 20% còn lại có các lệch bội nhiễm sắc thể cấp cao hơn (48,XXXY;48,XXYY; 49,XXXXY), thể khảm 46,XY/47,XXY, hoặc bất thường cấu trúcnhiễm sắc thể X Tỷ lệ thực sự của các thể khảm có thể bị đánh giá thấp hơnbởi vì thể khảm nhiễm sắc thể có thể chỉ có ở tinh hoàn, trong khi karyotypetrong các tế bào bạch cầu ngoại vi bình thường

Triệu chứng lâm sàng ở giai đoạn sơ sinh và trẻ nhỏ khó nhận biết vìkhông có dị dạng quan trọng hoặc có những dị dạng không đặc hiệu như tinhhoàn lạc chỗ, lỗ đái lệch thấp Ở giai đoạn dạy thì, nhiều trường hợp ngườicao, chân tay dài, nhưng cũng có trường hợp có hình thái nam bình thường.Các triệu chứng thường thấy là tinh hoàn không phát triển, 35-50% có chứng

Trang 27

vú to, giới tính nam kém phát triển, không râu, ít lông mu, dương vật bé, tìnhdục giảm Trí tuệ phát triển bình thường, có trường hợp suy giảm

Một số hội chứng khác như:

Hội chứng 47,XYY; Hội chứng 47,XXX;… các hội chứng này ít nhiềuảnh hưởng đến biểu hiện giới tính và gây vô sinh Tần số của các hội chứngnày cũng cao ở các cặp vợ chồng vô sinh

Nhìn chung, các bất thường nhiễm sắc thể gây các hội chứng ảnh hưởngnặng nề đến sức khỏe người bệnh, ảnh hưởng đến phát triển thể chất và pháttriển trí tuệ của người bệnh

trisomy 18 thường có kèm theo nhiều dị tật Trong đó để trẻ bị trisomy 13 vàtrisomy 18 có sức sống tốt hơn thì việc phẫu thuật khắc phục các dị tật timcho trẻ là là một phần rất quan trọng trong chiến lược chăm sóc toàn diện

thể 21, 18, 13, X và Y bằng cách sử dụng PCR huỳnh quang định lượngtheo phân đoạn (SD-QF-PCR) cho thấy: 230 mẫu được phân tích bằng SD-QF-PCR, trong đó có trisomy 21 (n = 16); trisomy 18 (n = 4); trisomy 13 (n

= 3); 45,X (n = 3); 47,XXY (n = 2); 47,XYY (n = 2); nghi ngờ khảm 46,

XX /46, XY (n = 2); và nhóm chứng (n = 198) Kết quả phát hiện của QF-PCR phù hợp với kết quả phân tích karyotype truyền thống SD-QF-PCR dựa trên các bản sao phân đoạn vừa được phát triển cho phép pháthiện đồng thời một đơn ống đa locus về số lượng nhiễm sắc thể 13, 18, 21,

SD-X và Y Vì vậy, kỹ thuật này đưa ra một phương pháp mới để chẩn đoánnhiễm sắc thể bất thường

Trang 28

Iwarsson E và cs (2017) phân tích DNA tự do của thai trong máu mẹ

để phát hiện trisomy 21, 18 và 13 trong một quần thể có thai chung vàtrong quần thể có nguy cơ cao; Đây là nghiên cứu giá trị NIPT trong cộngđồng đầu tiên, kết quả cho thấy NIPT có giá trị sàng lọc tốt với trisomy 21cho các bà mẹ có thai chung Mặc dù tỷ lệ dương tính giả rất thấp, nhưngkhi NIPT có kết quả nguy cơ cao thì vẫn cần phải làm xét nghiệm xâm lấn

để xác định chẩn đoán trước khi quyết định chấm dứt thai kỳ

1.2 Các phương pháp chẩn đoán trước sinh

1.2.1 Phương pháp di truyền tế bào

- Nuôi cấy tế bào và lập karyotyp là phương pháp truyền thống được

xem như tiêu chuẩn vàng trong phân tích rối loạn NST ở người Ứng dụng kỹthuật này vào chẩn đoán trước sinh bắt đầu được nghiên cứu và thực hiện vàonăm 1966 khi Steele và Breg báo cáo về nuôi cấy tế bào ối để xác định bộNST của thai Tế bào ối, máu cuống rốn hoặc gai nhau được đem nuôi cấy từ3-14 ngày, sau đó sẽ dừng chu kỳ tế bào ở chu kỳ giữa dưới tạc động củacolchicin Tiến hành thu hoạch tế bào và trải lên lam kính, nhuộm băng rồiphân tích bộ NST bằng phần mềm chuyên dụng

- Kỹ thuật này có thể xác định các bất thường về số lượng và cấu trúcNST với độ chính xác rất cao, từ 99,4-99,8% và rất đáng tin cậy

- Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này đó là thời gian trả kết quảkéo dài từ 14-21 ngày Điều này tạo ra tâm lý bất an kéo dài đối với thai phụ

và khiến việc chấm dứt thai kỳ nếu được chỉ định trở nên phức tạp và nguyhiểm hơn Bên cạnh đó, kỹ thuật này đòi hỏi tay nghề và chuyên môn cao củangười thực hiện

Trang 29

1.2.2 Phương pháp di truyền tế bào - phân tử (kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang FISH)

Phép lai tại chỗ đầu tiên được thực hiện vào năm 1969 bởi hai nhà khoahọc là Joseph Gall và Mary Lou Pardue Hai người đã công bố một công trìnhchứng minh các bản sao gắn phóng xạ của DNA ribosome có thể được sửdụng để phát hiện các trình tự DNA bổ sung trong nhân tế bào

Ngày nay, các đầu dò huỳnh quang đã thay thế các đầu dò phóng xạ nhờtính an toàn, dễ phát hiện và độ ổn định cao Trên thực tế, đa số các kỹ thuậtlai tại chỗ hiện nay đều sử dụng phép lai FISH Kỹ thuật FISH đã được ứngdụng rộng rãi trên thế giới trong nhiều lĩnh vực, một trong số đó là ứng dụngphát hiện các bất thường lệch bội trong chẩn đoán trước sinh

FISH sử dụng một trình tự ngắn của chuỗi DNA sợi đơn được đánh dấuhuỳnh quang, gọi là DNA dò DNA dò được lai với các DNA đích trên NSTcủa tế bào gian kỳ hoặc ở kỳ giữa, sau đó phân tích kết quả dưới kính hiển vihuỳnh quang Kỹ thuật FISH có nhiều hạn chế như giá thành cao, đòi hỏi thiết

bị và chuyên môn cao của người đọc kết quả

1.2.3 Phương pháp di truyền phân tử - Kỹ thuật QF-PCR (Quantiative flourescence - polymerase chain reaction)

Khái niệm

QF-PCR là phản ứng chuỗi polymer hóa huỳnh quang định lượng dùng

để khuếch đại các đoạn STR (Short tandem repeat) trên DNA của bộ gen Sảnphẩm khuếch đại được đánh dấu bằng tín hiệu huỳnh quang và định lượngbằng điện di mao quản

Trang 30

 Các bước của phản ứng

Hình 1.3 Các bước khuếch đại PCR và phân tích một locus STR

Trang 31

Nguyên tắc phản ứng

Kỹ thuật QF-PCR được sử dụng để kiểm tra liều gen, ở đây là các đoạnSTR đặc trưng cho các NST cần khảo sát (13, 18, 21, X và Y) Sản phẩmkhuếch đại sau phản ứng PCR sẽ tỷ lệ trực tiếp với số lượng trình tự có trongmẫu ban đầu Hình ảnh điện di huỳnh quang trên máy cho ta biết chiều dàicũng như số lượng các trình tự STR đã được khuếch đại, từ đó khẳng địnhđược số lượng của 1 NST có trong bộ gen ở mẫu ban đầu

Mỗi STR được khuếch đại sẽ được biểu thị bởi 1 đỉnh trên hình ảnh điện dihuỳnh quang mà vị trí của đỉnh đó trên trục hoành biểu hiện cho kích thước(chiều dài đoạn gen) và vị trí trên trục tung biểu hiện cho nồng độ sản phẩm

• Trường hợp số lượng của 1 NST trong bộ gen là 2 Mỗi STR đặc trưngcho NST đó có 2 alen Nếu 2 alen này đồng hợp tử, hình ảnh điện di sẽ cho 1đỉnh duy nhất, do 2 sản phẩm khuếch đại từ 2 alen này có cùng chiều dài củađoạn gen và cùng 1 nồng độ Nếu 2 alen là dị hợp tử, 2 sản phẩm khuếch đạitương ứng có chiều dài đoạn gen khác nhau và cùng nồng độ, do đó hình ảnhđiện di cho 2 đỉnh tách biệt có cùng độ cao, gọi là tỷ lệ đỉnh 1:1

Hình 1.4 Hai alen dị hợp tử

Trang 32

• Trường hợp số lượng 1 NST trong bộ gen là 1, hình ảnh điện di tươngứng sẽ là 1 đỉnh duy nhất

Hình 1.5 Hình ảnh 1 alen của NST X, ở người có Karyotyp 46, XY

• Trường hợp số lượng 1 NST là 3 như trong các trường hợp lệch bội:hình ảnh điện di cho tỷ lệ đỉnh là 1:1:1 nếu 3 alen đó là dị hợp (Trisomytriallelic), tỷ lệ đỉnh là 1:2 hoặc 2:1 nếu 2 trong 3 alen là dị hợp (Trisomydiallenic) và cho 1 đỉnh duy nhất nếu cả 3 alen đồng hợp

Hình 1.6 Ba alen dị hợp tử với tỷ lệ đỉnh 1:1:1

Trang 33

DNA có thể được phân loại thành 2 loại cơ bản bao gồm: các trình tự

có chức năng mã hoá (coding gene) gồm gen 1 bản sao (solitary gene), genlặp (duplicated gene), gen lặp liên tiếp (tandemly repeated array) và các trình

tự không mã hoá (non-coding DNA) gồm DNA trình tự đơn giản, yếu tố DNA

di động và DNA đệm

STR (Short tandem repeat) hay còn gọi là Microsatellite hoặc trình tự lặplại đơn giản (Simple sequence repeats - SSR) STR là những trình tự lặp lạingắn có kích thước thường dưới 1000 base, tạo nên bởi các trình tự lõi khoảng2-6 base lặp lại nhiều lần (từ 10-60 lần) Ví dụ locus D8S1179 có trình tự lõi làTCTA, lặp lại 7-20 lần STR có tính đa hình cao, phân bố khắp trong bộ gen, sốlần lặp lại đặc trưng cho từng cá thể và di truyền cho thế hệ sau

Trang 34

Cơ chế hình thành STR được cho là do quá trình trượt lùi của mạch con

so với mạch khuôn trong quá trình nhân đôi DNA, quá trình này được minhhọa ở hình sau:

Hình 1.8 Cơ chế hình thành STR

- Danh pháp và phân loại:

Trang 35

Trung bình, một STR xuất hiện trên mỗi 2.000 bp trong hệ gen của conngười Các STR phổ biến nhất ở người là các đơn vị giàu A: A, AC, AAAN,AAN và AG Các locus STR được đặt tên là, ví dụ, D3S1266, trong đó D đạidiện cho DNA, 3 có nghĩa là nhiễm sắc thể 3 trên đó locus STR nằm, S là viếttắt của STR, và 1266 là định danh duy nhất.

Trên cơ sở các đơn vị lặp lại khác nhau, STR có thể được phân loại thànhcác loại khác nhau Một mặt, theo chiều dài của đơn vị lặp lại chính, các STRđược phân loại thành các lặp lại mono-, di-, tri-, tetra-, penta- vàhexanucleotide Tổng số của mỗi loại giảm khi kích thước của đơn vị lặp lạităng lên Các STR phổ biến nhất trong bộ gen của con người là lặp lạidinucleotide Mặt khác, theo cấu trúc lặp lại, STR được phân loại thành lặp lạihoàn hảo (lặp lại đơn giản), chỉ chứa một đơn vị lặp đi lặp lại, và lặp lại khônghoàn hảo (lặp lại phức hợp), bao gồm lặp lại các thành phần khác nhau

1.3.2 Ứng dụng của STR marker trong y học

Trong xác định danh tính cá thể

- Kỷ nguyên của phương pháp xác định danh tính người dựa trên DNAbắt đầu từ năm 1984 với công bố của nhà khoa học Alec Jeffreys về các locusDNA được gọi là minisatellite hay VNTRs (Variable number of tandemrepeats) VNTRs phân bố ở các vùng gen không mã hoá, đơn vị cấu tạo là cáctrình tự DNA có chiều dài 15-100 bp, mỗi đơn vị lặp lại nhiều lần và khácnhau giữa mỗi người Vì vậy mỗi VNTRs có thể có chiều dài từ 1 đến 20 kbtuỳ thuộc vào số lần lặp lại, tạo ra nhiều allen khác nhau, khoảng 30 allen, do

đó rất hữu ích cho giám định pháp y Một ví dụ, nếu sử dụng 4 locus VNTRs,với mỗi locus có khoảng 20 allen, có thể tạo ra khoảng 420 (hơn 2 tỷ) kiểu genkết hợp có thể có Mỗi cá thể trong cộng đồng sẽ có 1 hồ sơ DNA duy nhấtnếu sử dụng đủ số lượng VNTRs, thông thường là từ 5 đến 6 Kỹ thuật phân

Trang 36

tích VNTR gồm các bước: trích xuất DNA từ mô cơ thể, giáng hoá DNA bởienzym cắt giới hạn (Retriction Enzyme), điện di các mảnh cắt trên thạch vàphân tích Southern blot Hạn chế lớn nhất của phương pháp này đó là yêu cầumột lượng lớn mẫu DNA (khoảng 10000 tế bào hoặc 50 µg DNA), lớn hơnnhiều lượng mẫu thông thường có thể thu thập ở hiện trường một vụ án , ,

- Cuộc cách mạng của giám định DNA chỉ thực sự diễn ra khi có sự pháttriển của kỹ thuật PCR Sử dụng PCR để khuếch đại các mẫu DNA, các nhàkhoa học có thể xác định danh tính cá thể từ những mẫu rất ít tế bào như sợitóc, vết máu hoặc từ những mô đã thoái hoá hoặc rất lâu đời như xương Khácvới kỹ thuật xét nghiệm dựa trên VNTRs, kỹ thuật PCR dựa trên các vùng của

bộ gen với tên gọi Microsatellite hoặc SSR (Simple sequence repeats) haySTR (Short tandem repeats) Một panel gồm 14 đến 16 locus STR được sửdụng để xây dựng nên 1 hồ sơ DNA từ các mẫu tế bào (máu, tế bào chân tóc,tuỷ xương ) từ đó phục vụ cho công tác giám định pháp y khi cần so sánhvới một cá thể nghi ngờ (nghi phạm) hay có thể được dùng để xác định mốiquan hệ huyết thống với những cá thể khác ,

Trong xây dựng bản đồ liên kết gen và chẩn đoán bệnh di truyền

- Phương pháp phân tích gen liên kết là một phương pháp chủ yếu được

sự dụng trong di truyền học để xây dựng bản đồ liên kết gen (bản đồ ditruyền) Bằng việc sử dụng các đa hình DNA làm chỉ thị, nhà di truyền có thểphân tích mô hình phân ly của các chỉ thị này với gen bệnh, từ đó xác địnhđược vị trí của alen gây bệnh Một danh sách 104 các loại đa hình đã được lậpbản đồ vị trí trong gen để sử dụng cho các nghiên cứu liên kết di truyền Đahình đơn nucleotid (SNP) là loại thường xảy ra nhất có thể giúp xây dựng bản

đồ có độ phân giải cao nhất Các marker STR cũng được sử dụng rất nhiềunhờ tính đa hình cao, phân tích đơn giản và khả năng tạo ra một mô hình phân

Trang 37

ly chứa nhiều thông tin Kỹ thuật PCR và giải trình tự là những công cụ sinhhọc phân tử đắc lực phục vụ cho mục đích này , , ,

- Rất nhiều bệnh di truyền đã được chẩn đoán bằng phương pháp dựatrên các STR marker như chẩn đoán trước sinh các lệch bội NST, Hemophia A,loạn dưỡng cơ Duchenne, bệnh Huntington… Một ví dụ về việc sử dụng STRtrong chẩn đoán người lành mang gen bệnh Hemophilia A: tác giả Trần VânKhánh và cs đã sử dụng 2 marker là FXS 9897 và DXS 1108 để xác định ngườilành mang gen bệnh trên đối tượng là các thành viên nữ của 5 gia đình bệnhnhân mắc Hemophilia A, sau đó kết quả được so sánh với kết quả giải trình tựgen xác định đột biến điểm Nghiên cứu của tác giả đã phát hiện ra 6 thành viên

nữ của 3 gia đình bệnh nhân Hemophilia A (mẹ, bác họ, chị họ hoặc em gái) làngười lành mang gen bệnh dựa trên phân tích STR Kết quả này cũng hoàntoàn trùng khớp với kết quả của kỹ thuật giải trình tự gen Tuy nhiên ở phươngpháp này chỉ một STR có giá trị sử dụng là DXS 1108 (cho trạng thái dị hợptử) trong khi marker FXS 9897 đều ở trạng thái đồng hợp tử Điều này cho thấycần nghiên cứu nhiều hơn để có thể lựa chọn các STR có khả năng cao phân lycùng với bệnh cũng như sử dụng số lượng đủ các marker để hạn chế bỏ sót cáctrường hợp mang gen nhưng không được phát hiện

Ứng dụng của STR trong ung thư

- Hiện tượng bất ổn định vi vệ tinh (MSI-Microsatelitte instability): Theonguyên tắc, mọi tế bào trong cơ thể đều phải chứa cùng các dạng alen của mộtSTR cụ thể Hiện tượng MSI xảy ra khi xuất hiện các tế bào có biểu hiệnnhững alen mới của một STR, khác với những tế bào bình thường còn lại.Người ta quan sát thấy hiện tượng này xảy ra thường xuyên đối với những tếbào ung thư như ung thư đại tràng, ung thư dạ dày-ruột, ung thư nội mạc tửcung… Cơ chế giải thích cho hiện tượng này là do tổn thương quá tình sửa

Trang 38

chữa bắt cặp nucleotid với vai trò thuộc về hệ thống gen (Mismatch repairgene): MSH2, MLH1, MSH6 và PMS2 , , ,

- Phát hiện MSI trong ung thư có nhiều ý nghĩa lâm sàng, mặc dù ở ViệtNam chưa ứng dụng nhiều Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng MSI có thể là mộtdấu hiệu tốt cho liệu pháp miễn dịch nhắm trúng đích (immune-checkpoint-blockade therapy), giúp nhà lâm sàng lựa chọn các phương pháp điều trị thíchhợp hơn (hóa trị hay xạ trị) trong từng giai đoạn bệnh và đồng thời giúp tiênlượng bệnh

- Để xác định hiện tượng MSI, 2 mẫu tế bào (lành và ung thư) đượckhuếch đại các marker STR bằng PCR, phát hiện marker này bằng đánh dấuhuỳnh quang, rồi so sánh với nhau Tại hội nghị Bethesda, một panel được đềxuất để phát hiện MSI gồm có 3 marker dinucleotid (D2S123, D5S346,D17S250) và 2 marker mononucleotid (BAT26, BAT25)

Một số ứng dụng khác:

- Đánh giá mọc mảnh ghép (Chimerism)

- Đánh giá sự đa dạng dân số (Examining human population diversity)

- Xác định sinh đôi cùng trứng/khác trứng

- Phát hiện nhiễm tế bào mẹ (Detecting maternal contamination)

1.3.3 Các nghiên cứu ứng dụng QF-PCR để chẩn đoán trước sinh các lệch bội NST ở Việt Nam và trên thế giới

 Các kit thương mại dựa trên STR marker để chẩn đoán lệch bội NST

- Devyser: (mô tả ở phần Đối tượng và phương pháp nghiên cứu)

- Aneufast: Sử dụng 4 marker cho mỗi NST 13, 18, 21 và 4 marker choNST giới Bên cạnh đó bộ kit còn sử dụng một số extra marker cho nhữngtrường hợp kết quả còn nghi ngờ

Trang 39

- Chromoquant (Cybergene): sử dụng bộ kit gồm 24 marker, trong đó

có 6 marker cho chẩn đoán NST 21, 6 marker cho chẩn đoán NST 18, 5marker cho chẩn đoán NST 13 và 7 marker cho chẩn đoán NST giới

Một số nghiên cứu ở Việt Nam:

Hoàng Thu Lan (2004), “Hoàn chỉnh kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang

và bước đầu ứng dụng trong chẩn đoán trước sinh hội chứng Down”, luận vănthạc sĩ y học, Đại học Y Hà Nội

Nguyễn Hoài Nam (2011), “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật QF-PCRtrong chẩn đoán trước sinh một số hội chứng lệch bội NST”, luận văn thạc sĩ

Các nghiên cứu trên thế giới

Kỹ thuật QF-PCR lần đầu tiên được đề xuất vào năm 1993, và cácnghiên cứu tiến cứu đã được thực hiện vào giữa những năm 1990, tiếp theosau là sự phát triển của các thử nghiệm dựa trên QF-PCR đối với bất thườngnhiễm sắc thể giới Các nghiên cứu này đã chỉ ra rằng phương pháp này có ưuđiểm đáng kể so với FISH, vì nó mạnh hơn, tốn ít công sức hơn và phù hợphơn với số lượng mẫu lớn Tuy nhiên, đến năm 2001 báo cáo đầu tiên về việc

áp dụng kỹ thuật này mới xuất hiện QF-PCR được đưa vào Cơ quan Y tếQuốc gia vương quốc Anh (UK National Health Service – NHS) như một kỹthuật chẩn đoán giá trị năm 2000 và từ đó được ứng dụng tại các trung tâm ditruyền khác nhau ở vương quốc Anh, cũng như các nước châu Âu , , ,

Trang 40

Phân tích các trình tự lặp ngắn (STR) để xác định các bất thường nhiễmsắc thể được nhiều tác giả nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong lâm sàng.Các kỹ thuật này vừa cho độ chính xác cao, đồng thời có thể phân tích nhanhcác bất thường ở một số vị trí đã được xác định , ,

QF-PCR và Karyotyping trên 662 mẫu ối để chẩn đoán trước sinh [33] Trongnghiên cứu này, kỹ thuật QF-PCR đã phát hiện được 20 trong tổng số 22trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X và Y Hai trường hợp lệch bội

mà kỹ thuật QF-PCR không phát hiện được là một trường hợp Trisomy 18 vàmột trường hợp Turner khảm

Trong một nghiên cứu năm 2004 của Quaife và cộng sự [51], trong 1115mẫu ối và mẫu sinh thiết gai rau, kỹ thuật QF-PCR đã phát hiện được toàn bộ 37trường hợp lệch bội NST 13, 18, 21, X, Y và 5 trường hợp tam bội, không cótrường hợp nào mâu thuẫn kết quả giữa QF-PCR và kỹ thuật nhiễm sắc thể đồ.Cirigliano và cộng sự (2009) đã phân tích trên 37544 mẫu ối và 4687mẫu sinh thiết gai rau bằng kỹ thuật QF-PCR và lập NST đồ So với kỹ thuậtlập NST đồ, kỹ thuật QF-PCR đã phát hiện được 1287 trên tổng số 1290trường hợp lệch bội NST 13, 18, 21 và 265 trong tổng số 267 trường hợp lệchbội NST giới [27]

Trong những năm gần đây, ứng dụng lâm sàng của QF-PCR trong pháthiện các lệch bội phổ biến đã được báo cáo bởi nhiều nhà nghiên cứu Một sốtác giả đã đề xuất sử dụng QF-PCR thay thế NST đồ trong chẩn đoán trướcsinh ở phụ nữ mang thai có nguy cơ cao sinh con trisomy 18 hoặc 21 do tuổicủa bà mẹ hoặc kết quả sàng lọc trước sinh bất thường, vì QF-PCR có độ

Định dạng
Số trang	103
Dung lượng	2,75 MB