KẾT QUẢ NGHIÊN cứu độc TÍNH và tác DỤNG GIẢM ĐAU, CHỐNG VIÊM TRÊN THỰC NGHIỆM của cây SÓNG rắn THU HOẠCH tại THÁI NGUYÊN

Tác dụng chống viêm cấp của Sóng rắn thể hiện qua độ phù chân chuột trên mô hình gây phù chân chuột cống...42Bảng 3.19.. Tác dụng chống viêm cấp của Sóng rắn thể hiện qua độ dày chân chu

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, CHỐNG VIÊM TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA

CÂY SÓNG RẮN THU HOẠCH

TẠI THÁI NGUYÊN

Hà Nội, 9 - 2016

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về dược liệu Sóng rắn -Chi Albizia 3

1.1.1 Vị trí phân loại chi Albizia 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 3

1.1.3 Một số nghiên cứu về dược liệu sóng rắn 4

1.2 Tổng quan về các mô hình nghiên cứu tác dụng giảm đau invivo 8

1.2.1 Mô hình nghiên cứu tác dụng giảm đau ngoại biên 8

1.2.2 Mô hình nghiên cứu tác dụng giảm đau trung ương 9

1.3 Các nghiên cứu chống viêm in vivo 12

1.3.1 Mô hình gây tăng tính thấm thành mạch 13

1.3.2 Mô hình gây phù tai chuột bằng oxazolon 13

1.3.3 Mô hình gây phù tai chuột bằng dầu croton [ 13

1.3.4 Mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin 14

1.3.5 Mô hình gây viêm khớp 14

1.3.6 Mô hình gây viêm khớp bằng carrageenan 15

1.3.7 Mô hình gây viêm khớp bằng formaldehyd 15

1.3.8 Mô hình gây viêm khớp bằng collagen 15

1.3.9 Mô hình gây viêm khớp bằng chất kích thích miễn dịch 15

1.3.10 Mô hình gây u hạt 16

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.1 Thuốc và các hoá chất nghiên cứu 17

2.1.2 Động vật thực nghiệm 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn trên thỏ theo đường bôi 18

2.2.2 Phương pháp đánh giá tác dụng giảm đau và chống viêm 19

2.3 Xử lý số liệu 23

3.1.1 Tình trạng chung 24

3.1.2 Sự thay đổi thể trọng thỏ: 24

3.1.2 Đánh giá chức năng tạo máu 25

3.1.3 Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan: 32

3.1.4 Đánh giá chức năng gan 34

3.1.5 Đánh giá chức năng thận 37

3.1.6 Thay đổi về mô bệnh học 38

3.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau và chống viêm 39

3.2.1 Nghiên cứu tác dụng giảm đau của Sóng rắn bằng phương pháp mâm nóng 39

3.2.2 Nghiên cứu tác dụng giảm đau của Sóng rắn bằng phương pháp rê kim 40

3.2.3 Đánh giá tác dụng chống viêm 41

Chương 4: BÀN LUẬN 46

4.1 Bàn luận về độc tính bán trường diễn của dịch chiết Sóng rắn 46

4.1.1 Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn tươi và khô lên tình trạng chung và cân nặng của thỏ: 46

4.1.2 Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn tươi và khô lên các chỉ số huyết học của thỏ: 46

4.1.3 Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn lên chức năng gan thỏ: 47

4.1.4 Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn lên chức năng thận thỏ: 48

4.1.5 Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn lên mô bệnh học thỏ: 49

4.2 Bàn luận về tác dụng giảm đau, chống viêm 49

4.2.1 Về tác dụng giảm đau 49

4.2.2 Về tác dụng chống viêm 50

KẾT LUẬN 52

KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến thể trọng thỏ 24

cầu trong máu thỏ 28

trong máu thỏ 33Bảng 3.11 Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến nồng độ bilirubin toàn

phần trong máu thỏ 34Bảng 3.12 Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến nồng độ albumin trong

máu thỏ 35Bảng 3.13 Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến nồng độ cholesterol

toàn phần trong máu thỏ 36Bảng 3.14 Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến nồng độ creatinin trong

máu thỏ 37Bảng 3.15 Ảnh hưởng của Sóng rắn lên thời gian phản ứng với nhiệt độ

của chuột nhắt trắng 39Bảng 3.16 Tác dụng giảm đau của Sóng rắn trên chuột nhắt trắng bằng

máy rê kim 40Bảng 3.17 Cân nặng trung bình của các lô chuột 41Bảng 3.18 Tác dụng chống viêm cấp của Sóng rắn thể hiện qua độ phù

chân chuột trên mô hình gây phù chân chuột cống 42Bảng 3.19 Tác dụng chống viêm cấp của Sóng rắn thể hiện qua độ dày

chân chuột trên mô hình gây phù chân chuột cống 44

Hình 1.1: Cây sóng rắn (Albizia myriophylla Benth) 5

Hình 1.2: Sóng rắn dài (Albizia procera) 6

Hình 1.3: Sóng rắn dây (Acacia pennata) 6

Hình 1.4: Sóng rắn sừng nhỏ (Albizia corniculata) 7

Hình 1.5: Sóng rắn tại Thái Nguyên 7

Hình 1.6 Một số máy đo ngưỡng đau khác dùng trong mô hình Randall-Siletto 9

Hình 1.7 Phương pháp xác định ngưỡng đau bằng bức xạ nhiệt 11

Hình 1.8 Máy đo viêm Plethysmometer No 7250 của Ugo - Basile 14

Đ ẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm gió mùa nên cónguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Chính nguồn tàinguyên này đã cung cấp cho con người nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá trịtrong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc sống, đặc biệt là dùng làm thuốcchữa bệnh Các loại thuốc thảo mộc được dùng như tác nhân điều trị trực tiếp,làm chất dò sinh hoá để làm sáng tỏ nguyên lí dược học hoặc làm chất chuẩn

để phát triển các loại thuốc mới Chính vì vậy việc nghiên cứu hoá học cũngnhư hoạt tính sinh học của các loài cây thuốc có ý nghĩa quan trọng cho việc sửdụng một cách hợp lý và có hiệu quản nhất nguồn tài nguyên thiên nhiên này

Thái Nguyên là tỉnh miền núi thuộc vùng trung du - miền núi Bắc bộ Donằm sát chí tuyến Bắc trong vành đai Bắc bán cầu, nên khí hậu của tỉnh TháiNguyên mang đậm tính chất của khí hậu nhiệt đới gió mùa Bởi thế, đây chính làđịa phương có tiềm năng cho nhiều cây thuốc sinh trưởng và phát triển

Theo một nghiên cứu về nguồn tài nguyên cây thuốc năm 2010, huyện

Võ Nhai, tỉnh Thái Nguyên hiện có 136 loài thực vật có khả năng làm thuốcchữa bệnh thuộc 122 chi, 63 họ của 3 ngành Trong đó, cây thuốc quý hiếmcần được bảo vệ là 2 loài, chiếm 1,48% Một nghiên cứu khác năm 2011, tạihuyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên hiện có 187 loài thực vật bậc cao có mạch

và nấm lớn có công dụng làm thuốc, thuộc 156 chi, 81 họ Trong đó có 12loài cây thuốc quý hiếm, bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam, thuộc 10 chi, 9 họcủa 2 ngành thực vật bậc cao có mạch

Chi Albizia có số loài tương đối lớn phân bố rộng khắp các vùng nhiệtđới từ châu Phi, châu Á, châu Úc và Nam Mỹ Ở Việt Nam có 17 loài vớikhoảng 4 - 5 loài được dùng làm thuốc trong đó có cây sóng rắn Cây sóng

rắn (tên gọi trong dân gian) mọc hoang nhiều tại Thái Nguyên ở rìa rừng, trênđất trống, trên các bờ cát của các dòng sông, trên đất nghèo, từ vùng thấp đến

độ cao 900m Sóng rắn được nhân dân dùng để chữa các bệnh viêm ngoài danhư mụn dộp, herpes, zona và một số bệnh khác

Cho đến nay vẫn chưa có một nghiên cứu nào nghiên cứu về cây thuốcnày Để có cơ sở khoa học về an toàn và hiệu quả của dược liệu này, nâng caogiá trị sử dụng và tìm hiểu đầy đủ hơn về cây thuốc này chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu độc tính và tác dụng giảm đau, chống viêm

trên thực nghiệm của cây sóng rắn thu hái tại Thái Nguyên” với 2 mục tiêu

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về dược liệu Sóng rắn -Chi Albizia

Qua quan sát đặc điểm hình thái, cây sóng rắn được sơ bộ nhận định lấy

từ một hoặc một vài loài thuộc chi Albizia, họ đậu - Fabaceae

1.1.1 Vị trí phân loại chi Albizia

Theo các tài liệu về phân loại thực vật [1],[25, chi Albizia có vị trí phânloại như sau:

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố

Cây gỗ, cây nhỡ mọc đứng hay leo hoặc dây leo Nhánh ít khi có gainhỏ cong, có gốc ở sẹo lá Lá kèm hình dùi hay tai, thường rụng sớm Lá hailần lông chim có trục sơ cấp và thứ cấp có tuyến

Cụm hoa bông, đầu hay ngù, cuống cụm hoa ở nách các lá trên hayxếp thènh chùy ở ngọn và ở nách Hoa gồm 2 loại (ở trung tâm và ở rìa) trongcác cụm hoa đầu và ngù Đài hợp, xếp van, có 5 răng Nhị nhiều, chỉ nhị dínhthành ống ở gốc, bao phấn không có tuyến Bầu không cuống hay có cuống,

có khi có tuyến mật Quả có van mỏng hay dai, mở hay không Hạt có cán,dẹp hay lồi hai mặt, màu vàng, nâu hay đen, không có hạt

Chi Albizia có số loài tương đối lớn phân bố rộng khắp các vùng nhiệtđới từ châu Phi, châu Á, châu Úc và Nam Mỹ Ở Việt Nam có 17 loài, thường

sử dụng nhiều là:

A attopeuensis (pierre) I Nielsen - Bản xe Lao, Dây cai, Cha ke.

A chinensis (Osbeck) Merr - Sóng rắn Trung Quốc

A corniculata - Sóng rắn sừng nhỏ, cây muồng gai

A falcataria (L.) Fosb - Muồng giấy, Hợp hoan

A julibrissin Durazz - Hợp hoan

A kalkora (Roxb.) Prain - Hợp hoan núi

A lebbeck (L.) Benth - Bồ kết tây, Lim xanh

A lebbekoides (DC.) Benth - Bản xe trắng, câm trắng, muồng trúc

A lucidior (Steud.) I Nielsen - Bản xe, đĩa roi, ché

A myriophylla Benth - Sóng rắn, cam thảo cây, bản xe nhiều lá

A odoratissima (L.f.) Benth - Hợp hoan thơm

A procera (Roxb.) Benth - Muồng xanh, sóng rắn dài, cọ thon

1.1.3 Một số nghiên cứu về dược liệu sóng rắn

1.1.3.1 Albizia myriophylla Benth

- Tên khác: Sóng rắn, cam thảo cây, bản xe nhiều lá

- Mô tả cây: Cây bụi mọc cao 2 - 4m, tự hay leo, thân có vỏ màu nâu,cành non có lông màu hung Lá kép có cuống chung dài 9cm, với 9 - 16 cặp láchét, mỗi lá chét có từ 20 - 40 cặp lá lá chét thứ cấp dài 5 - 8mm, rộng 1mm,

có lông ở dưới và ở dìa Cụm hoa hình tán, mang hoa hình bán cầu dài 1mm,vành 4mm, có lông vàng, 15 tiểu nhụy Quả giáp dài 12cm, rộng 2cm chứa 4 -

9 hạt dài 6mm, màu nâu

- Phân bố: Mọc phổ biến ở phía Nam có một số người đã dựa vào vịngọt của vỏ thân và vỏ rễ đã khai thác với mục đích dùng thay cam thảo

- Bộ phận dùng: Vỏ thân, vỏ rễ, thu hái quanh năm dùng tươi hay phơisấy khô

- Thành phần hóa học: Trong rễ sóng rắn có 0,035% ancaloid, màutrắng ngà, vị rất đắng, 6% saponin thô màu vàng nâu nhạt, vị gắt cay hút ẩm ởngoài không khí Ngoài ra còn có phản ứng flavonoid và steroid

- Tính vị, công năng: Sóng rắn có vị ngọt, tính mát có tác dụng tả cannhiệt, thoái tâm hỏa, lương huyết, giải độc.

- Nghiên cứu dược lý: Cho chuột nhắt (trọng lượng 20g) bôi dung dịchnước thuốc với liều 18g/kg thể trọng đến 20g/kg thể trọng chuột chết sau 2 - 3ngày Tỷ lệ tử vong 10% (với liều 18g/kg) và 25% (với liều 20g/kg) Do đónhóm tác giả đã khuyến cáo cần nghiên cứu sâu hơn về độc tính và giá trịchữa bệnh của Sóng rắn để tiếp tục sử dụng hay dừng

- Ứng dụng điều trị trong dân gian:

+ Ở Việt nam hay một số nước khác dùng vỏ cây để chữa ho, viêm phếquản và làm các bánh men để ủ rượu gạo Lá giã nát đắp lên các vết thươngdùng cầm máu

+ Dịch hãm cây Sóng rắn dùng phối hợp với rễ cây thuốc khác đượcnhân dân Malaysia dùng làm thuốc hạ sốt Lá dùng pha nước tắm và gội đầu

Ở Thái Lan rễ sóng rắn được dùng làm giải khát và làm thuốc nhuận tràng,quả làm thuốc chữa ho

Hình 1.1: Cây sóng rắn (Albizia myriophylla Benth)

1.1.3.2 Albizia procera (Roxb.) Benth.

- Tên khác: Sóng rắn dài, Mu cua

- Mô tả: Cây gỗ lớn có thể cao 25m Lá nhẵn, kép lông chim hai lần, cócuống chung to, dài 20cm, mang 1 tuyến cách gốc 5mm; lá chét 9-10 đôi,màu nâu ở mặt trên, nhạt màu ở mặt dưới, hơi có lông, với lông nằm trên cảhai mặt, thuôn hay xoan, dài 25-35mm, rộng 15-20mm, tròn ở đầu, thon hẹp

không đều ở gốc Hoa dạng đầu gần hình cầu, xếp thành chuỳ dạng tháp đốidiện với lá ở ngọn, dài 15-20cm, có nhánh trải ra, dài 8cm ở gốc Quả độc dài15cm, rộng 2cm, thon hẹp và có mũi nhọn dài ở đầu, thon hẹp ở gốc, nhẵn,bóng, màu nâu Hạt 10 hay ít hơn, hình trái xoan rộng, dài 9mm, rộng 8mm,rất dẹp, bóng, màu nâu nhạt.

Hình 1.2: Sóng rắn dài (Albizia procera)

1.1.3.3 Acacia pennata (L.) Willd

- Tên khác: Sóng rắn dây, Keo lông chim

- Mô tả: Dây leo, có khi là cây bụi phân nhánh nhiều, mọc trườn, cónhiều gai, nhánh non có lông Lá kép lông chim hai lần; cuống chung cótuyến mang 16 cặp lá chét bậc nhất, mỗi lá chét này lại mang 17-35 cặp láchét bậc hai; dài 4-5mm, rộng 1-2mm; lá kèm 2-3mm Chuỳ hoa ở ngọn hay ởnách gồm nhiều đầu hoa trắng, to cỡ 13mm Quả thuôn, mỏng dài tới 13cm,rộng tới 3cm; hạt thuôn, không đều, dẹp, màu nâu hay đen

Hình 1.3: Sóng rắn dây (Acacia pennata)

1.1.3.4 Albizia corniculata (Lour.) Druce

- Tên khác: Sóng rắn sừng nhỏ

- Mô tả: Cây gỗ nhỏ mọc đứng, cao 5mm, hay leo, dài tới 20m Lá képvới 3-4 cặp lá bậc nhất; các lá này lại mang 4-10 cặp lá chét bậc hai thuôn, dài8-25mm, rộng 5-16mm, không lông Chuỳ hoa hình tháp mang các hoa đầuvới 6-12 hoa không cuống; hoa nhỏ có cánh hoa 5mm, có lông; nhị cỡ 17.Quả dẹp, dài 11-21cm, rộng 2,6-4,2cm; hạt 7-12

Hình 1.4: Sóng rắn sừng nhỏ (Albizia corniculata)

1.1.3.5 Sóng rắn tại Thái Nguyên

Hình 1.5: Sóng rắn tại Thái Nguyên

Hiện chưa có công trình nghiên cứu nào về định tên khoa học, mô tảhình thái thực vật, xác định thành phần hóa học và các nghiên cứu về dược lý

về cây sóng rắn tại Thái Nguyên

Kinh nghiệm sử dụng thuốc trong nhân dân dùng lá rửa sạch, nhai hoặcgiã nát vắt nước bôi đắp điều trị viêm ngoài da như mụn dộp, herpes, zona

1.2 Tổng quan về các mô hình nghiên cứu tác dụng giảm đau invivo

Đau là một triệu chứng của nhiều bệnh và cần điều trị với các thuốcgiảm đau Vị trí của receptor đau ở da, mô là những đầu tự do của dây thầnkinh Các kích thích lên receptor đau là các kích thích cơ học, nhiệt, hóa học.Hầu hết các receptor đau tiếp nhận mọi loại kích thích, tuy nhiên cũng córeceptor nhạy cảm hơn với một kích thích nhất định.Thuốc giảm đau ngoại biên

sẽ ngăn chặn sự hình thành các xung tại receptor đau Thuốc giảm đau trungương sẽ ức chế sự dẫn truyền các xung tín hiệu đau trong hệ thống thần kinhtrung ương [31] Sự phân loại thành các thuốc giảm đau ngoại biên và trungương là cơ sở xây dựng các mô hình dược lý nghiên cứu các thuốc giảm đaumới

1.2.1 Mô hình nghiên cứu tác dụng giảm đau ngoại biên

Hầu hết các thuốc có tác dụng giảm đau ngoại biên thường thể hiện thêmtác dụng chống viêm, một số thuốc có thêm tác dụng hạ sốt Một trong những

cơ chế tác dụng của thuốc được biết rõ là ức chế enzym cyclooxygenase làmgiảm sinh tổng hợp prostaglandin Vì vậy, đối với các thuốc giảm đau mới,

ngoài việc đánh giá tác dụng của thuốc đối với cyclooxygenase trên in vitro thì thuốc còn được đánh giá tác dụng giảm đau trên in vivo Các mô hình đánh

giá tác dụng giảm đau ngoại biên được thực hiện phổ biến nhất là mô hìnhgây quặn đau trên chuột nhắt và mô hình Randall-Selitto trên chuột cống

1.2.1.1 Phương pháp gây quặn đau

Đau được gây ra bằng cách tiêm các chất kích thích vào khoang màngbụng của chuột và gây nên những cơn đau quặn bụng điển hình Các chất kíchthích được sử dụng có thể là phenylquinon hoặc acid acetic, trong đó acidacetic được sử dụng phổ biến hơn

Các thuốc chứng dương có thể là indomethacin (10mg/kg) [], aspirin(200mg/kg) [], hoặc diclofenac (10mg/kg) [] Nhóm chứng sinh học có thể

bôi dung môi là nước muối sinh lý (10mg/kg) [] hoặc hỗn hợp dung môi đồngtan gồm nước, propylen glycol và tween (10mg/kg) [] Đánh giá tác dụnggiảm đau của thuốc dựa vào phần trăm ức chế cơn quặn đau, tính theo côngthức []:

% ức chế cơn quặn đau = Trong đó: C: số cơn quặn đau trung bình ở nhóm chứng sinh học

D: số cơn quặn đau trung bình ở nhóm bôi thuốc thửThuốc có phần trăm ức chế cơn quặn đau < 70% được coi là thuốc có tácdụng giảm đau tối thiểu []

1.2.1.2 Mô hình Randall-Selitto

Mô hình đánh giá tác dụng giảm đau này dựa trên nguyên lý: phản ứngviêm làm tăng mức độ nhạy cảm với đau, ngưỡng nhận cảm giác đau có thểđược tăng lên bởi các thuốc giảm đau gây nghiện và không gây nghiện Nấmmen Brewer là tác nhân thường được sử dụng để gây viêm trong mô hìnhRandall-Selitto [22, 34], ngoài ra có thể dùng một số chất gây viêm khác nhưcarrageenin [28], bradykinin [18]

Hình 1.6 Một số máy đo ngưỡng đau khác dùng trong mô hình

Randall-Siletto 1.2.2 Mô hình nghiên cứu tác dụng giảm đau trung ương

Các mô hình thực nghiệm nghiên cứu tác dụng giảm đau trung ương trên

in vivo là cần thiết để đánh giá hiệu quả giảm đau của một thuốc trước khi đưa

vào sử dụng trên con người Các loài động vật gặm nhấm, chủ yếu là chuộtcống và chuột nhắt, được sử dụng làm động vật thực nghiệm trong các môhình nghiên cứu này, trong một số trường hợp, cần thiết phải sử dụng độngvật bậc cao hơn, ví dụ như khỉ

Một số mô hình nghiên cứu tác dụng giảm đau trung ương hiện nay:

- Phương pháp kẹp đuôi Haffner trên chuột nhắt

- Phương pháp tail-flick hoặc các phương pháp bức xạ nhiệt khác

- Test ngâm đuôi

- Phương pháp mâm nóng ở chuột nhắt hoặc chuột cống

- Kích thích điện (shock lưới điện, kích thích tủy răng hoặc đuôi)

- Test formalin trên chuột cống

1.2.1.3 Phương pháp kẹp đuôi Haffner (Haffner’s tail clip method)

Phương pháp này được mô tả lần đầu tiên vào năm 1929 bởi Haffner.Ông đã quan sát thấy hiện tượng đuôi chuột cong lên (hiện tượng Straub) khichuột được dùng morphin hoặc các thuốc opioid tương tự morphin, và tìm rarằng sau khi dùng thuốc, mức độ nhạy cảm của đuôi chuột giảm đi với các tácnhân kích thích bên ngoài Theo Haffener, phương pháp này có độ nhạy caovới morphin [15]

Thuốc chứng dương có thể là morphin (10mg/kg) [29] hoặcdextropropoxyphen (65 mg/kg), codein 20mg/kg [33]

1.2.1.4 Mô hình tail-flick

Phương pháp dùng bức xạ nhiệt (radiant heat method)

Ban đầu, phương pháp này được phát triển bởi Schumacher và cộng sự(1940), Wolff và cộng sự nhằm xác định ngưỡng đau của con người với bức

xạ nhiệt và đánh giá tác dụng giảm đau của các opioat Sau đó, các nhà khoa

học đã sử dụng phương pháp này để đánh giá sự thay đổi mức độ nhạy cảmcủa đuôi chuột với các stress nhiệt sau khi cho chuột dùng thuốc thử Test nàyphù hợp để phân biệt thuốc giảm đau giống morphin tác dụng trên thần kinhtrung ương và thuốc giảm đau không opioat [].

Hình 1.7 Phương pháp xác định ngưỡng đau bằng bức xạ nhiệt

Phương pháp ngâm đuôi (tail immersion test)

Phương pháp này được sử dụng để đánh giá các hợp chất giống morphin.Nguyên lý của phương pháp này dựa trên những quan sát cho thấy các thuốcgiống morphin có khả năng kéo dài thời gian phản ứng của phản xạ rút đuôichuột đặc trưng khi nhúng phần cuối của đuôi chuột vào nước ấm 550C [], 19]

1.2.1.5 Mô hình mâm nóng (hot plate method)

Bàn chân của chuột nhắt rất nhạy cảm với nhiệt độ mà ở nhiệt độ đó vẫnchưa gây tổn thương da Đáp ứng của chuột bao gồm: động tác nhảy lên, rútbàn chân và liếm bàn chân Thuốc giảm đau trung ương có khả năng kéo dàithời gian xuất hiện những đáp ứng này, trong khi thuốc giảm đau ngoại biênnhư các acid acetylsalicylic hoặc acid phenyl-acetic thường không ảnh hưởngđến những phản ứng này []

1.2.1.6 Mô hình formalin (formalin test)

Test formalin giúp đánh giá tác dụng của các thuốc giảm đau trung ương,còn các thuốc giảm đau ngoại biên hầu như không có tác dụng trên mô hình

này Do đó, test formalin cho phép phân biệt giữa đau do viêm và đau không

do viêm, một cách phân loại của các thuốc giảm đau dựa vào vị trí tác dụng

và cơ chế tác dụng của chúng [8] Cowan (1990) đã nhấn mạnh rằng, testformalin gây ra tình trạng đau mạn tính, trong khi hầu hết các mô hình khácchỉ gây ra tình trạng đau cấp tính [9]

1.3 Các nghiên cứu chống viêm in vivo

Phản ứng viêm với các biểu hiện đặc trưng gồm sưng, nóng, đỏ, đau, cóthể được khởi động bởi nhiều yếu tố kích thích khác nhau như nhiễm khuẩn,thiếu máu cục bộ, tương tác kháng nguyên-kháng thể, tác nhân hóa học, nhiệt

độ hay các chấn thương cơ học Đáp ứng viêm được chia thành 3 pha với các

cơ chế khác nhau: viêm cấp, bán cấp và viêm mạn, từ đó có các mô hình thực

nghiệm đánh giá các pha của quá trình viêm tương ứng trên in vivo.

+ Đánh giá phản ứng viêm cấp và bán cấp

+ Gây ban đỏ trên da chuột lang bằng tia UV

+ Gây tăng tính thấm thành mạch

+ Gây phù tai chuột nhắt bằng oxazolon

+ Gây phù tai chuột nhắt và chuột cống và dầu croton

+ Gây phù chân chuột cống (với các chất kích thích gây viêm khác nhau)+ Thử nghiệm gây viêm màng phổi bằng formaldehyd

- Đánh giá quá trình viêm mạn dựa vào các thử nghiệm về sự hìnhthành u hạt

+ Gây u hạt bằng bông cotton

+ Gây u hạt bằng sợi thủy tinh

+ Gây u hạt bằng hạt nhựa PVC, amiant

- Thêm vào đó, các nghiên cứu đánh giá các yếu tố miễn dịch cũngngày càng phát triển, như:

+ Gây viêm khớp trên chuột cống bằng các hóa chất

+ Mô hình thực nghiệm gây viêm não tủy dị ứng

+ Phản ứng Schultz-Dale

+ Sốc phản vệ thụ động trên da

+ Phản ứng quá mẫn tức thì dạng Arthus

+ Phản ứng quá mẫn chậm

1.3.1 Mô hình gây tăng tính thấm thành mạch [ ]

Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục tiêu đánh giá khả năng củathuốc thử làm giảm tính thấm thành mạch gây ra do các chất gây viêm Cácchất trung gian hóa học của quá trình viêm như histamin, các prostaglandin vàcác leucotrien gây giãn các tiểu động mạch và tiểu tĩnh mạch và làm tăng tínhthấm thành mạch, dẫn đến thoát dịch và protein huyết tương và gây phù Cácthuốc kháng histamin H1, các chất ức chế chuyển hóa acid arachidonic, cácchất đối kháng receptor của leucotrien có thể làm giảm tác dụng gây giãnmạch của các chất trung gian hóa học này Các thuốc có tác dụng ổn địnhmàng tế bào cũng thể hiện tác dụng làm giảm tính thấm thành mạch Tiêm trong

da hợp chất 48/80 gây khử hạt của tế bào mast là một phương pháp làm tăng tínhthấm thành mạch Đánh giá mức độ tăng tính thấm thành mạch dựa vào mức độthâm nhiễm của thuốc nhuộm xanh Evan trên các vị trí tiêm trên da

1.3.2 Mô hình gây phù tai chuột bằng oxazolon

Mô hình gây phù tai bằng oxazolon trên chuột nhắt được mô tả lần đầutiên bởi Evan Mô hình này gây ra phản ứng quá mẫn do tiếp xúc nhằm đánhgiá tác dụng chống viêm tại chỗ và toàn thân của các thuốc thử dùng theođường tại chỗ [10]

1.3.3 Mô hình gây phù tai chuột bằng dầu croton [7, 13]

Mô hình thích hợp để đánh giá tác dụng chống viêm của các steroiddùng tại chỗ cũng như các thuốc chống viêm không steroid

Mô hình gây phù tai bằng dầu croton có thể được tiến hành trên cả chuộtnhắt và chuột cống Hỗn hợp dầu croton được sử dụng để gây kích ứng baogồm các thành phần: dầu croton, ethanol, pyridin và ethyl ether Tỷ lệ cácthành phần trong hỗn hợp dầu croton khác nhau đối với mỗi loài động vậtthực nghiệm

1.3.4 Mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin

Trong các mô hình thực nghiệm được sử dụng để sàng lọc các loại thuốcchống viêm, mô hình gây phù chân sau của chuột bằng cách tiêm một chất cókhả năng gây viêm (chất kích ứng) là một trong những mô hình được sử dụngphổ biến nhất Nhiều tác nhân gây viêm đã được sử dụng, như formaldehyd[31, 5], dextran [20], albumin trứng [12], kaolin [36], aerosil [39], cácpolysaccharid sulfat như carrageenin [20] hoặc naphthoylheparamin [22] Một

số chất chỉ gây viêm trong khoảng thời gian ngắn, một số chất khác lại có thểkéo dài tình trạng phù chân chuột hơn 24 giờ

Hình 1.8 Máy đo viêm Plethysmometer No 7250 của Ugo - Basile (Italy) 1.3.5 Mô hình gây viêm khớp

Động vật thực nghiệm được chia thành 3 nhóm: nhóm bôi thuốc thử,nhóm bôi thuốc chứng dương và nhóm chứng sinh học bôi dung môi được sửdụng để pha thuốc thử và thuốc chứng dương Mô hình viêm khớp trên chuột

cống có thể được gây ra bằng cách tiêm một số tác nhân gây viêm nhưcarrageenan [16], collagen [6] hoặc chất kích thích miễn dịch (adjuvant) [35].

1.3.6 Mô hình gây viêm khớp bằng carrageenan

Carrageenan được pha trong một số dung môi như dung dịch đệmphosphat hoặc nước muối sinh lý, và được tiêm vào khớp gối của chuột với thểtích 10¨L hoặc 50¨L Lô chứng sinh học chỉ tiêm khớp gối carrageenan và bôinước cất Lô chứng dương được tiêm khớp gối carrageenan và tiêm nội khớphoặc tiêm màng bụng dexamethason So sánh mức độ thay đổi của nồng độNGF trong dịch khớp của lô chứng sinh học và lô thuốc thử là chỉ tiêu đánh giákhả năng ức chế viêm khớp gây ra bằng carrageenan của thuốc thử

1.3.7 Mô hình gây viêm khớp bằng formaldehyd

Mô hình gây viêm khớp bằng formaldehyd được thực hiện bằng cáchtiêm formaldehyd (0,1mL dung dịch formaldehyd 4%) vào bàn chân trái củađộng vật thực nghiệm vào ngày thứ nhất và ngày thứ 3 của nghiên cứu Theodõi sự thay đổi kích thước bàn chân hàng ngày, và kích thước bàn chân ở lôthuốc thử sẽ được so sánh với lô chứng sinh học [27]

1.3.8 Mô hình gây viêm khớp bằng collagen

Mô hình gây viêm khớp bằng collagen trên chuột cũng được sử dụng kháphổ biến để đánh giá tác dụng chống viêm của một thuốc Collagen I, III (cónguồn gốc từ da và nhiều mô trong cơ thể) và collagen II (có nguồn gốc từsụn) đều có thể dùng làm tác nhân gây viêm khớp trên thực nghiệm [38].Đường kính khớp cổ chân (được đo bằng thước kẹp fowler) được sosánh giữa lô thuốc thử với lô chứng sinh học và lô mô hình

1.3.9 Mô hình gây viêm khớp bằng chất kích thích miễn dịch

Chuột cống được tiêm trong da 0,1mL (0,25mg) hỗn dịch dầu

Mycobacterium [17] hoặc 0,1mL (1mg) hỗn dịch dầu Mycobacterium [32] ở

gốc đuôi Một số nghiên cứu khác lại lựa chọn tiêm vào gốc đuôi chuột cống

0,1mL (0,5mg) hỗn dịch Mycobacterium butyricum trong parrafin lỏng [24].

Độ dày mắt cá chân ở lô bôi thuốc thử được đo và so sánh với các lô chứng

1.3.10 Mô hình gây u hạt

Mô hình này được mô tả lần đầu tiên với Meier và cộng sự [23] Khối uhạt có thể được hình thành bằng cách cấy hạt bông vào dưới da gáy chuộtcống Đánh giá tác dụng chống viêm của thuốc thử dựa vào [ ]:

- Trọng lượng trung bình của khối u hạt của nhóm bôi thuốc so với nhómchứng

- Phần trăm thay đổi trọng lượng u hạt của nhóm bôi thuốc so với nhómchứng

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Thuốc và các hoá chất nghiên cứu

2.1.1.1 Thuốc nghiên cứu: Dịch chiết Sóng rắn tươi và khô

Liều dùng lâm sàng (kinh nghiệm dân gian): 2-3 lá giã/nhai, đắp trựctiếp lên vết thương

2.1.1.2 Hoá chất và máy móc:

- Kit định lượng các enzym và chất chuyển hoá trong máu : ALT(alanin aminotransferase), AST (aspartat aminotransferase), bilirubin toànphần, albumin, cholesterol, creatinin của hãng Hospitex Diagnostics (Italy) vàhãng DIALAB GmbH (Áo), định lượng trên máy Screen master của hãngHospitex Diagnostics (Italy)

- Các dung dịch xét nghiệm máu của hãng Exigo, định lượng trên máyExigo - Boule Medical AB của Thụy Điển

- Các hoá chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học

Voltaren (diclofenac) dạng kem bôi 1 % của hãng Novartis Lidocain2% dạng kem bôi của hãng Pymepharco Các hóa chất carrageenin, natriclorid… đủ tiêu chuẩn phòng thí nghiệm - Trường Đại học Y Hà Nội.

Máy đo phản ứng đau bằng phương pháp rê kim, sản xuất bởi Ugo Basile, Italy

Máy đo viêm Plethysmometer No 7250 của hãng Ugo Basile (Italy).

- Thước đo độ dày (Độ chính xác: 0,02mm): MC 555 của hãngHangzhou tools and measuring tools Co., Ltd (China)

2.1.2 Động vật thực nghiệm

Cả hai giống, khoẻ mạnh

Thỏ chủng Newzealand White, lông trắng, trọng lượng 1,8-2,5 kg do

Trung tâm chăn nuôi Dê và Thỏ Sơn Tây cung cấp

- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 26

± 2 (g) do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp

- Chuột cống trắng chủng Wistar, cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng

180 - 200g, do Trung tâm chăn nuôi động vật Đan Phượng, Hà Tây cung cấp

Súc vật được nuôi trong phòng thí nghiệm 5-10 ngày trước khi nghiêncứu bằng thức ăn chuẩn dành riêng (do Công ty liên doanh Guyomarc’h-VCNsản xuất), nước tự do

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn trên thỏ theo đường bôi

Thỏ được chia làm 3 lô, mỗi lô 10 con, mỗi con nhốt riêng một chuồng

- Lô chứng: bôi dung môi

- Lô trị 1: bôi dịch chiết Sóng rắn tươi, liều 0,3ml/thỏ (liều gấp 3 liềulâm sàng)

- Lô trị 2: bôi dịch chiết Sóng rắn tươi, liều 0,18ml/thỏ (liều gấp 3 liềulâm sàng)

Thỏ được bôi dung môi hoặc thuốc thử trong 4 tuần liền, mỗi ngày mộtlần vào buổi sáng

Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong quá trình nghiên cứu:

- Tình trạng chung, thể trọng của thỏ

- Đánh giá chức phận tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, thể tíchtrung bình hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu,công thức bạch cầu và số lượng tiểu cầu

- Đánh giá chức năng gan thông qua định lượng một số enzym và chấtchuyển hoá trong máu: ALT, AST, bilirubin toàn phần, albumin vàcholesterol toàn phần

- Đánh giá chức năng thận thông qua định lượng nồng độ creatininhuyết thanh

Các thông số theo dõi được kiểm tra vào trước lúc bôi thuốc, sau 2 tuần

và sau 4 tuần bôi thuốc

- Mô bệnh học:

Sau 4 tuần bôi thuốc, thỏ được mổ để quan sát đại thể toàn bộ các cơ quan Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc da và dưới da vùng bôi dung môi hoặcthuốc, vi thể gan, thận của 30% số thỏ ở mỗi lô

Các xét nghiệm vi thể được thực hiện tại Trung tâm phát hiện sớm Ungthư (do PGS.TS Lê Đình Roanh đọc kết quả vi thể)

2.2.2 Phương pháp đánh giá tác dụng giảm đau và chống viêm

2.2.2.1 Nghiên cứu tác dụng giảm đau của Cây Đa bằng phương pháp mâm nóng (Hot plate)

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 con:

- Lô 1 (Chứng sinh học): Không bôi gì vào 2 chân chuột

- Lô 2 (Voltaren): Bôi Voltarel vào toàn bộ 2 gan bàn chân chuột

- Lô 3 (Lidocain): Bôi Lidocain vào toàn bộ 2 gan bàn chân chuột

- Lô 4 (Cao Sóng rắn tươi): Bôi cao liều 0,1ml/chuột vào toàn bộ 2gan bàn chân chuột

- Lô 5 (Cao Sóng rắn khô): Bôi cao liều 0,06ml/chuột vào toàn bộ 2gan bàn chân chuột

Phương pháp bôi: Bôi một lớp mỏng trên bề mặt gan bàn chân chuột,thoa nhiều lần để thuốc phân bố đều Sau thời gian 30 phút kể từ lúc được bôi,chuột được đo phản ứng đau bằng phương pháp mâm nóng

Nguyên lý của phương pháp mâm nóng: Sử dụng nhiệt độ trên mâmnóng (tiếp xúc trực tiếp) tác động lên gan bàn chân chuột Nhiệt độ được sử

hiện các phản xạ, điển hình là phản xạ liếm chân Xác định thời gian từ khitiếp xúc cho tới khi chuột xuất hiện phản xạ liếm chân để đo mức độ đau

Phương pháp đo như sau: Đặt chuột lên mâm nóng (máy Hot plate),

kích thích nhiệt được tính từ lúc đặt chuột lên mâm nóng đến khi chuột cóphản xạ liếm chân sau Loại bỏ những chuột phản ứng quá nhanh (trước 8giây) hoặc quá chậm (sau 30 giây) So sánh thời gian phản ứng với kích thíchnhiệt trước và sau khi bôi thuốc thử và so sánh giữa các lô chuột với nhau

2.2.2.2 Nghiên cứu tác dụng giảm đau tại chỗ của Sóng rắn bằng phương pháp rê kim [4]

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con

- Lô 1 (Chứng sinh học): Không bôi gì vào 2 chân chuột

- Lô 2 (Voltaren): Bôi Voltaren vào toàn bộ 2 gan bàn chân chuột

- Lô 3 (Cao Sóng rắn tươi): Bôi cao liều 0,1ml/chuột vào toàn bộ 2 ganbàn chân chuột

- Lô 4 (Cao Sóng rắn khô): Bôi cao liều 0,06ml/chuột vào toàn bộ 2 ganbàn chân chuột

Đánh giá phản ứng đau của chuột tại thời điểm 30 phút sau khi bôi Nguyên lý của phương pháp rê kim: Tác dụng một lực tăng dần bằngđầu kim lên gan bàn chân chuột Khi đến ngưỡng đau, chuột phản ứng bằngcách co chân, máy đo sẽ tự động xác định thời gian từ khi chạm vào chânchuột cho tới khi xuất hiện phản xạ co chân Lực tác động được cài đặt trướckhi thực hiện nghiên cứu, sự gia tăng của lực này theo thời gian là giống nhaucho toàn bộ chuột trong quá trình nghiên cứu Phương pháp rê kim để đongưỡng đau được thực hiện như sau:

+ Cho toàn bộ 10 chuột của một lô vào các buồng đo, đợi khoảng 5phút trước khi để chuột ổn định

+ Rê kim (cảm ứng) sao cho đầu kim chạm vào giữa gan bàn chân chuột + Bấm nút để thực hiện việc đo, máy tự động đo thời gian phản ứngvới đau của chân chuột

2.2.2.3 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp

Chuột được bôi thuốc 5 lần trong 3 ngày liên tục Ngày thứ 1, sau khibôi thuốc thử trước 1 giờ, tiến hành gây viêm bằng cách tiêm carrageenin1% (pha trong nước muối sinh lý) 0,25 ml/chuột vào gan bàn chân sau, bênphải của chuột

Đo thể tích chân chuột (đến khớp cổ chân) bằng dụng cụ chuyên biệtvào các thời điểm: trước khi gây viêm (V0); sau khi gây viêm 1 giờ (V1), 2giờ(V2), 4giờ (V3) và 6 giờ (V4), 24 giờ (V5), 30 giờ (V6) và 48giờ (V7).

Đo độ dày chân chuột (ở 1 điểm cố định trên lòng bàn chân chuột) bằngthước đo chuyên biệt vào các thời điểm giống với thời điểm đo thể tích chânchuột

Chú thích: Bôi thuốc

Gây viêm

Đo chân

Kết quả đo thể tích được tính theo công thức của Fontaine

+ Độ tăng thể tích chân của từng chuột được tính theo công thức:



V%  V t V0

Trong đó: V0 là thể tích chân chuột trước khi gây viêm

Vt là thể tích chân chuột sau khi gây viêm

+ Tác dụng chống viêm của thuốc được đánh giá bằng khả năng ức chế phảnứng phù (I%)

I% =



V c %  V t%

V0 % 100

Trong đó:  V c %: trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô đối chứng

 V t %: trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô bôi thuốc

Kết quả đo độ dày cũng được tính tương tự như kết quả đo thể tích

2.3 Xử lý số liệu

Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp t-testStudent

Sự khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả nghiên cứu độc tính bán trường diễn

3.1.1 Tình trạng chung

Trong thời gian thí nghiệm, thỏ ở cả 3 lô hoạt động bình thường, nhanhnhẹn, mắt sáng, lông mượt, ăn bôi tốt, phân khô Không thấy biểu hiện gì đặcbiệt ở cả 3 lô thỏ trong suốt thời gian nghiên cứu

Trọng lượng (kg)

% tăng trọng lượng

Trọng lượng (kg)

% tăng trọng lượng

Trọng lượng (kg)

% tăng trọng lượng

Trước bôi

thuốc

2,08 ± 0,13

2,05 ± 0,13

2,07

± 0,11

> 0,05

Sau 2 tuần

bôi thuốc

2,16 ± 0,11 3,85

2,13 ± 0,12 3,90

2,16

± 0,10

2,18 ± 0,11 6,34

2,19

± 0,10

trước khi nghiên cứu Không có sự khác biệt về mức độ gia tăng trọng lượngthỏ giữa lô chứng và các lô bôi thuốc thử (p>0,05)

3.1.2 Đánh giá chức năng tạo máu

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến số lượng hồng cầu trong

máu thỏ

Thời gian

(t- test Student)

Lô chứng Lô trị 1 Lô trị 2

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy:

- Sau 2 tuần và 4 tuần bôi thuốc thử, xét nghiệm đánh giá số lượng

hồng cầu ở cả lô trị 1 (bôi dịch chiết Sóng rắn tươi 0,3ml/thỏ) và lô trị 2 (bôidịch chiết Sóng rắn khô 0,18ml/thỏ) đều không có sự khác biệt có ý nghĩa sovới lô chứng và so sánh giữa các thời điểm trước và sau khi bôi thuốc thử(p>0,05)

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của dịch chiết Sóng rắn đến hàm lượng huyết sắc tố

trong máu thỏ

Thời gian

(t- test Student)

Lô chứng Lô trị 1 Lô trị 2

Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy: Sau 2 tuần và 4 tuần bôi thuốc thử, xét

nghiệm đánh giá hàm lượng huyết sắc tố ở cả lô trị 1 (bôi dịch chiết Sóng rắntươi 0,3ml/thỏ) và lô trị 2 (bôi dịch chiết Sóng rắn khô 0,18ml/thỏ) đều không

có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng và so sánh giữa các thời điểm trước

và sau khi bôi thuốc thử (p>0,05)