Nghiên cứu phát hiện hội chứng Klinefelter trong chẩn đoán trước sinh và sau sinh

Cho đến nay, phương pháp chính để chẩn đoán VS nam là dựa vào kết quả tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn của WHO với các chỉ số về thể tích tinh dịch, mật độ tinh trùng, tỷ lệ di động, tỷ lệ s

ĐẶT VẤN ĐỀ

Những năm gần đây, vô sinh là một trong những vấn đề sức khỏe sinhsản gây ảnh hưởng tới cuộc sống hạnh phúc của rất nhiều cặp vợ chồng vàmối quan tâm của toàn xã hội Các nghiên cứu cho thấy có khoảng 15% cặp

vợ chồng vô sinh, tỷ lệ vô sinh do nam giới là 35-40% và tỷ lệ này cũngtương đương với vô sinh do nữ giới

Vô sinh nam giới do không có tinh trùng (KCTT) hoặc ít tinh trùng(ITT) có nhiều nguyên nhân Việc chẩn đoán nguyên nhân vô sinh nam giới làyêu cầu bắt buộc trước khi điều trị và hết sức cần thiết để thực hiện tư vấn ditruyền có hiệu quả Trong các bệnh nhân vô sinh nam, bất thường về mặt ditruyền chiếm 10-15% trường hợp KCTT và 5% trường hợp ITT

Rối loạn vật chất di truyền ở mức độ tế bào gây vô sinh nam giới thườnghay gặp nhất là hội chứng Klinefelter (KF) Hội chứng KF (hay hội chứng47,XXY) là bất thường NST giới hay gặp nhất xảy ra ở nam và là nguyênnhân chủ yếu gây thiểu năng sinh dục và vô sinh ở nam giới Tỉ lệ mắc là1/500-1000 trẻ sơ sinh nam Lúc sơ sinh thường không phát hiện được vìthường không có dị tật trầm trọng, hoặc có các dị tật nhỏ không đặc hiệu nhưtinh hoàn lạc chỗ, lỗ đái lệch thấp hay dương vật kém phát triển Các trẻ traimang hội chứng KF chỉ số IQ thường thấp hơn trung bình và thường gặp khókhăn trong học tập; hầu hết các nam giới với hội chứng này đều có vấn đềđáng kể về y tế, tâm lý hoặc xã hội [1] Hơn nữa, tỷ lệ tử vong của bệnh nhân

KF tăng đáng kể do bệnh tiểu đường, hô hấp, tim mạch và các bệnh về tiêuhóa [62] Tuy nhiên, biểu hiện của hội chứng KF thường không đặc hiệu từnhỏ, nên chỉ được chẩn đoán vào thời kỳ niên thiếu hoặc tuổi trưởng thànhhoặc có khi không được chẩn đoán Các thai mang hội chứng KF khi sàng lọcbằng siêu âm hoặc sàng lọc bằng sản phẩm thai trong huyết thanh mẹ là

không có dấu hiệu đặc hiệu cho hội chứng KF và việc chẩn đoán trước sinhthường khó khăn Hậu quả là nam giới có hội chứng KF thường được chẩnđoán muộn khi đã lấy vợ và vô sinh do KCTT Trên thực tế nhiều cặp vợchồng điều trị vô sinh nhiều năm không có kết quả do không tìm được cănnguyên, mà thực chất là người chồng bị KF Tại Việt Nam, chưa có nhiềunghiên cứu về KF và chưa có nghiên cứu nào về chẩn đoán hội chứng KFtrước sinh.

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài "Nghiên cứu phát hiện hội chứng Klinefelter trong chẩn đoán trước sinh và sau sinh"

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình nghiên cứu vô sinh và vô sinh nam giới

1.1.1 Khái niệm vô sinh và vô sinh nam giới

Theo WHO, vô sinh (VS) được định nghĩa là tình trạng một cặp vợchồng trong tuổi sinh đẻ, mong muốn có con nhưng không thể có thai sau 12tháng quan hệ tình dục mà không sử dụng biện pháp tránh thai nào VS gồm 2loại: VS nguyên phát và VS thứ phát VS nguyên phát (VS I) là trường hợpcặp vợ chồng chưa có thai lần nào VS thứ phát (VS II) là trường hợp đã cóthai ít nhất 1 lần, nay không thể có thai nữa

Nguyên nhân VS có thể do vợ hoặc chồng hoặc do cả 2 phía VS namgiới là khi nguyên nhân VS hoàn toàn là do người chồng, người vợ bìnhthường VS nữ giới là VS mà nguyên nhân hoàn toàn do người vợ, ngườichồng bình thường VS không rõ nguyên nhân là các trường hợp thăm khámlâm sàng và làm các xét nghiệm ở cả 2 vợ chồng mà không phát hiện đượcnguyên nhân

Trong VS do nam giới, nguyên nhân bất thường về số lượng tinh trùng làrất hay gặp, đó là các trường hợp VS nam do KCTT (Azoospermia) và ITT(oligozoospermia) Theo WHO, VS ở nam giới do KCTT là tình trạng khôngtìm thấy tinh trùng trong tinh dịch khi xuất tinh, thường do tinh hoàn khôngsản xuất được tinh trùng ITT là tình trạng số lượng tinh trùng ít hơn 20x106tinh trùng/ml tinh dịch ITT mức độ nặng (severe oligozoospermia) là trườnghợp có số tinh trùng ít hơn 1x106/ml tinh dịch

1.1.2 Tình hình vô sinh nam giới trên thế giới

Theo WHO, nguyên nhân VS có khoảng 20% là không rõ nguyên nhân,80% là có nguyên nhân, trong đó VS nữ chiếm 40%, VS do nam chiếm 40%

và nguyên nhân do cả 2 vợ chồng là 20% Theo WHO (1991), trên thế giới cókhoảng 12-15% cặp vợ chồng VS tức khoảng 50-80 triệu người Tỷ lệ nàythay đổi tùy từng nghiên cứu ở từng quốc gia

Tại Australia, Kildea (2000) nghiên cứu trên đối tượng từ 20- 45 tuổi xácđịnh tỷ lệ VS là 26,3% [35]

Theo Ali (2005) có khoảng 10-15% cặp vợ chồng VS, nguyên nhân do nam giới chiếm 50% [12] Nghiên cứu của Krausz cho rằng nguyên nhân

VS do nam chiếm 50%, trong đó 40-50% liên quan đến bất thường về tinhtrùng [36]

Như vậy, tùy nghiên cứu của từng nước trên thế giới, tỷ lệ VS thay đổi

từ 10%- 20%, trong đó nguyên nhân VS do nam và nữ là tương đương nhau và tỷ lệ này có xu hướng ngày càng tăng

1.1.3 Tình hình vô sinh và vô sinh nam giới ở Việt nam

Tại Việt Nam, VS đã và đang là vấn đề sức khỏe sinh sản rất được quantâm Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tỷ lệ VS ngày càng có xu hướngtăng… Điều tra dân số năm 1980 tỷ lệ VS chung là 7%-10% nhưng đến năm

1982 tỷ lệ này là 13%, trong đó VS nữ chiếm 54%, VS nam chiếm 36%, VSkhông rõ nguyên nhân là 10%

Nghiên cứu của Nguyễn Khắc Liêu và cs tại Viện bảo vệ bà mẹ và trẻ sơsinh từ 1993-1997 cho thấy VS nữ giới là 54,5%, VS nam giới là 35,6%(KCTT là 7,1%), VS không rõ nguyên nhân là 10% [3 ] Theo Phan VănQuyền, tỷ lệ VS là 10-15% [9]

Theo Trần Thị Phương Mai (2001) tỷ lệ VS là 10% Nguyên nhân VS do

nữ chiếm 30-40% và do nam chiếm khoảng 30% Khoảng 20% các trườnghợp tìm thấy nguyên nhân VS ở cả 2 vợ chồng và cũng có khoảng 20% cáccặp vợ chồng không tìm thấy nguyên nhân VS [4]

Theo Trần Quán Anh, hiện nay cứ 100 cặp vợ chồng thì có khoảng 15cặp vợ chồng không thể có con, trong đó trên 50% nguyên nhân là do namgiới và tỷ lệ này đang có chiều hướng tăng mạnh [1]

Nhìn chung, theo các tác giả, tỷ lệ vô VS ở Việt Nam cũng ngang bằng trênthế giới và nguyên nhân VS do nam giới cũng gần tương đương do nữ giới

1.1.4 Chẩn đoán vô sinh nam giới bằng xét nghiệm tinh dịch đồ

Xét nghiệm tinh dịch đồ là một xét nghiệm cơ bản và rất cần thiết trongchẩn đoán và điều trị VS nam giới Hiện nay, nước ta và nhiều nước trên thếgiới sử dụng tiêu chuẩn về chẩn đoán và điều trị VS của WHO năm 1999,trong đó có tiêu chuẩn về xét nghiệm tinh dịch đồ Tinh dịch đồ được coi làbình thường nếu: thể tích tinh dịch ≥ 2ml; mật độ tinh trùng ≥ 20 triệu tinhtrùng/ml; số lượng tinh trùng di động nhanh > 25%; tỷ lệ tinh trùng sống ≥75%; tinh trùng có hình dạng bình thường ≥ 30% và số lượng bạch cầu < 1triệu/ ml tinh dịch

Theo WHO (1999) trong các nguyên nhân gây VS nam giới thì tới 90%

là do bất thường tinh trùng Cho đến nay, phương pháp chính để chẩn đoán

VS nam là dựa vào kết quả tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn của WHO với các chỉ

số về thể tích tinh dịch, mật độ tinh trùng, tỷ lệ di động, tỷ lệ sống, tỷ lệ tinhtrùng có hình dạng bình thường và bất thường… Cần phải xét nghiệm tinhdịch đồ ít nhất 1 lần với các cặp hiếm muộn và nếu tinh dịch đồ kết quả bấtthường phải xét nghiệm lại lần thứ hai cách lần thứ nhất ít nhất 6 ngày và xa

nhất là dưới 3 tháng (WHO-1999) Theo các nghiên cứu gần đây, VS nam giớigia tăng và lượng tinh trùng của nam giới trên thế giới đã giảm đi một nửa sovới 50 năm trước [14].

Trần Đức Phấn (2001) đã nghiên cứu 420 mẫu tinh dịch của nam thiểunăng sinh sản có 56% số mẫu có chất lượng dưới mức bình thường, trong đó10,24% KCTT và 16,43% ITT [5]

Các bệnh nhân VS nam khi có xét nghiệm tinh dịch đồ KCTT hoặc ITT

mà không do nguyên nhân tắc nghẽn và có kết quả xét nghiệm nội tiết bìnhthường thì phải tìm nguyên nhân do di truyền

1.1.5 Các nguyên nhân dẫn tới vô sinh nam giới

WHO đã đưa ra một bảng phân loại các nguyên nhân gây VS nam giới đểgiúp tiêu chuẩn hóa việc chẩn đoán các nguyên nhân VS nam và giúp cho việcđánh giá các nghiên cứu VS nam được dễ dàng Nhìn dưới phương diện ditruyền học thì có thể chia thành 2 nhóm nguyên nhân gây VS nam là nhóm dorối loạn vật chất di truyền và nhóm không do rối loạn di truyền

Vô sinh nam giới do rối loạn vật chất di truyền

 Mức độ NST.

Bất thường di truyền nói chung và bất thường NST nói riêng được coi làmột trong những nguyên nhân gây ITT hoặc KCTT, nhưng đôi khi được xếpvào nhóm KCTT không rõ nguyên nhân do không được chẩn đoán xác định.Theo các tài liệu đã công bố trên thế giới, bất thường NST thường cao gấp

6 lần và bất thường NST giới tính cao gấp 15 lần so với cộng đồng [9] Với tiến

bộ của di truyền tế bào, nhiều nghiên cứu đã cho thấy có khoảng 20-30%trường hợp KCTT là do bất thường di truyền [50]

Trong các nguyên nhân do bất thường NST giới gây VS nam hay gặpnhất là hội chứng Klinefelter thể thuần và thể khảm (47,XXY/46,XY) và cácbiến thể của hội chứng này Chẩn đoán hội chứng này thường trong thời kỳniên thiếu và trưởng thành: nam giới có tinh hoàn teo nhỏ, chắc, dáng ngườigiống nữ, chứng vú to, FSH tăng cao và thường VS do KCTT Tinh trùng lấy

từ tinh hoàn người nam 47,XXY có thể làm ICSI (Intracytoplasmic SpermInjection - bơm tinh trùng vào nguyên sinh chất noãn) Phôi được tạo ra bằng

kỹ thuật ICSI phải được chẩn đoán tiền làm tổ trước khi chuyển vào buồng tửcung Theo nghiên cứu của Simpson thì bệnh nhân KF thường VS doKCTTvà ITT [57] Tuy nhiên, theo Fossa (1971) Krause và Frosti (2000)nhận xét rằng một số ít bệnh nhân KF thể khảm thì tinh hoàn vẫn có thể sinhtinh được nên vẫn có khả năng sinh sản nhưng suy giảm tinh trùng mức độnặng [38], [59]

Theo hội tiết niệu và sản khoa Hoa kỳ (2001), bất thường NST chiếmkhoảng 7% ở VS nam giới Bất thường NST giới tính (hội chứng KF) chiếmkhoảng 2/3 bất thường NST quan sát được ở những bệnh nhân nam giới VS [13].Theo Laksim R (2004) nghiên cứu trong 251 nam giới VS, bất thườngNST chiếm 11,5%, hội chứng KF và các biến thể của nó là 3,18%

Theo Nguyễn Bửu Triều hội chứng KF chiếm 1% các cá thể vô sinh, 20% các trường hợp KCTT Theo Nguyễn Đức Nhự (2009) trong 125 nam vôsinh do KCTT và ITT, tỉ lệ bất thường NST là 20,8% (26/125) trong đó hộichứng KF chiếm 18 trường hợp [5]

13-Chẩn đoán VS nam giới do KF nhờ xét nghiệm di truyền tế bào (nuôicấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi, phân tích NST và lập karyotyp).Tuy nhiên có nhiều trường hợp vô sinh nam do KCTT hoặc ITT không

do tắc nghẽn mà karyotyp bình thường và không phát hiện thấy nguyên nhân

nào khác thì cần làm thêm các nghiên cứu bất thường di truyền ở mức độphân tử.

 Đột biến gen

Quá trình sinh tinh chịu sự điều khiển, phối hợp chính xác của khoảng

2000 gen Chỉ khoảng 30 gen có mặt trên NST Y nhưng là những gen quantrọng không thể thiếu trong quá trình sinh tinh, còn lại phần lớn nằm trên NSTthường Những đột biến mất các gen này gây hậu quả nghiêm trọng là vô sinh

do không sản xuất được tinh trùng hoặc ITT hoặc suy giảm chất lượng tinhtrùng [37]

Gen SRY nằm trên nhánh ngắn của NST Y đóng vai trò quan trọng trong

sự hình thành tuyến sinh dục thời kỳ phôi thai Bên cạnh đó NST Y còn chứanhững vùng có chức năng điều hòa sự sinh tinh Khi toàn bộ nhánh ngắn hayphần xa của nhánh ngắn NST Y bị mất thì cơ thể sẽ bị khiếm khuyết gen SRY,

do vậy sự biệt hóa tuyến sinh dục thời kỳ phôi thai sẽ bị rối loạn Biểu hiệnlâm sàng của trường hợp này sẽ giống hội chứng Turner nghĩa là suy sinh dụcnguyên phát

Nhánh dài NST Y là một vùng đặc biệt quan trọng trong quá trình sinhtinh Khi mất đoạn trên nhánh dài NST Y thì kiểu hình vẫn là nam giới có tinhhoàn, tuy nhiên tùy theo đoạn bị mất ngắn hay dài mà quá trình sinh tinh bịảnh hưởng ở mức độ khác nhau Nếu sự mất đoạn có liên quan tới vùng đặchiệu nam trên NST Y sẽ ảnh hưởng trầm trọng tới sự hình thành tế bào mầmsinh dục với biểu hiện lâm sàng là KCTT hoặc ITT nặng

* Mất đoạn nhỏ trên NST Y

Năm 1976, lần đầu tiên Tiepolo và Zufardi mô tả mối liên quan giữa mấtđoạn trên NST Y và vô sinh nam khi phát hiện 6 trường hợp KCTT bị mất

đoạn lớn ở phần xa nhánh dài NST Y [64] Nhuộm băng NST đã xác địnhnhững mất đoạn này tại vị trí Yq11 và đưa ra những giả thuyết quan trọng vềquá trình sinh tinh được điều hòa bởi đoạn AZF (azoospermic factor) trênNST Y Cùng với sự phát triển không ngừng của kỹ thuật di truyền phân tử,nhiều nghiên cứu đã xác định được các mất đoạn nhỏ trong vùng AZF củanhánh dài NST Y liên quan đến KCTT hay ITT mà trước đây thường cho làkhông rõ nguyên nhân Ba vùng AZF trên NST Y là AZFa, AZFb và AZFc.Gần đây vùng thứ 4 là AZFd đã dược phát hiện nằm giữa AZFb và AZFc Vịtrí của ba vùng AZF trên NST Y được minh họa trên hình 1.1.

Hình 1.1: Mô hình cấu trúc NST Y và các vùng AZFa,b,c [22].

AZFa nằm trên vùng 5 nhánh dài và gần tâm NST Y Kích thước chừng792kb [61] và chứa hai gen chức năng USP9Y và DBY Mất đoạn AZFathường có tỷ lệ thấp Khi mất đoạn AZFa toàn bộ (mất cả 2 gen USP9Y và

DBY), sự sai sót của quá trình sinh tinh thường nặng và bệnh nhân luôn làKCTT Ngược lại, khi chỉ mất một trong hai gen (ví dụ mất USP9Y) thì bệnhcảnh sẽ nhẹ hơn và vẫn có thể tìm thấy một lượng nhỏ tinh trùng trong ốngdẫn tinh Như vậy, mất đoạn của gen DBY (gen duy nhất còn lại trên AZFa)dường như làm nặng thêm hậu quả của việc mất gen USP9Y trong quá trìnhsinh tinh [58].

Vùng AZFb nằm ở giữa khoảng 5 và 6, kích thước 6,2 Mb (gồm 32 bảnsao gen và các đơn vị phiên mã) Các gen này được xác định là có vai trò trong

sự hình thành của tinh hoàn và quá trình sinh tinh trùng [56] Mất đoạn nhỏvùng AZFb thường hay xảy ra hơn so với vùng AZFa nhưng cũng chỉ chiếm tỉ

lệ nhỏ ở những người KCTT Mất đoạn nhỏ NST Y chứa vùng AZFb thì ngườinam giới KCTT trong tinh dịch và cả trong tinh hoàn khi sinh thiết [66]

Vùng AZFc nằm gần vùng dị nhiễm sắc, kích thước 3,5 Mb, chứa các genquan trọng như DAZ, CDY1, BPY2, PRY, TTY2… AZFc là đoạn mất chiếm tỷ

lệ cao nhất (2-10%) trong các mất đoạn AZF phát hiện ở nam giới KCTT hoặcITT nặng Biểu hiện ITT nặng hoặc xuất tinh KCTT nhưng tách chiết được tinhtrùng từ tinh hoàn Những người nam với các mất đoạn AZFa, AZFb, AZFbchoặc AZFabc thì KCTT và cũng không thể chiết tách được tinh trùng từ tinhhoàn [66] Những người nam giới KCTT bị mất AZFc vẫn có cơ hội để tìmthấy tinh trùng bằng kỹ thuật TESE và có thể sinh con nhờ phương pháp ICSI.Tuy nhiên, các con trai của họ sẽ bị di truyền NST Y mất đoạn AZFc từ bố và

có thể bị khiếm khuyết trong sự sinh tinh (ITT hoặc KCTT) [47]

 Tình hình nghiên cứu mất đoạn nhỏ trên NST Y

Năm 1976, Tiepolo và Zuffadi báo cáo 6 trường hợp nam giới KCTT bịmất đoạn ở nhánh dài NST Y [64]

Tỉ lệ mất đoạn nhỏ trên NST Y ở các bệnh nhân KCTT cao hơn so vớinhóm ITT Đột biến mất Yq11 chiếm 10-15% trong số nam giới KCTT vàkhoảng 5-10% ở nhóm ITT mức độ nặng, thậm chí cao hơn [27], [51].

Mất đoạn nhỏ trên NST Y ở 3 vùng AZFa, AZFb, AZFc cũng có tần sốkhác nhau tùy theo các nghiên cứu Theo Ferlin (2007) các bệnh nhân vô sinhnam giới có thể có 1,2 hoặc 3 vị trí mất đoạn nhỏ trên NST Y lần lượt với tỉ lệ62,5%, 25%,và 12,5% Trong đó mất đoạn nhỏ chủ yếu ở AZFc chiếm 65,7%,tiếp theo là AZFbc (13,1%), AZFa (11,2%) , AZFb (8,1%) và mất đoạn ở cả 3vùng AZFabc là 2% [14]

Năm 2010, Ceylan C nghiên cứu trên 14 bệnh nhân KF được phát hiệntrong nhóm bệnh nhân vô sinh nam do KCTT Mất đoạn nhỏ trên NST Y vùngAZFc có liên quan với các bệnh nhân nam KF (5/14 bệnh nhân KF có mấtđoạn AZFc, không có bệnh nhân nào mất đoạn AZFa, AZFb) [21] Năm 2010,hơn 100 ca mang thai thành công đã được công bố nhờ kỹ thuật hỗ trợ sinhsản IVF, sử dụng phẫu thuật lấy tinh trùng từ bệnh nhân KF [28] Ở các bệnhnhân KF khi có mất đoạn AZFc trên NST Y nếu được hỗ trợ sinh sản để sinhcon thì những đứa con trai nhận NST Y từ bố cũng sẽ bị mất đoạn AZFc như

Để nhân ADN sợi đơn cần có các yếu tố cơ bản là: ADN khuôn mẫu; haimồi (primer) là hai đoạn oligonucleotid bắt cặp bổ xung với hai đầu của đoạnADN cần nhân lên; enzyme ADN polymerase chịu nhiệt để tổng hợp ADN;bốn loại dNTP, dung dịch đệm với với thành phần và pH tối ưu cho phản ứng

và máy chu trình nhiệt có khả năng tăng giảm nhiệt độ nhanh chóng theochương trình định sẵn (PCR)

Mỗi chu kỳ PCR gồm 3 bước quan trọng:

+ Biến tính sợi khuôn: thực hiện ở nhiệt độ 92-95oC Trong điều kiện nàyADN sợi kép sẽ tách thành ADN sợi đơn

+ Gắn mồi: thường từ 50-52oC, nhiệt độ gắn mồi tùy thuộc vào từngoligonucleotid và đặc trưng cho từng phản ứng Hai đoạn mồi (mồi xuôi vàmồi ngược) sẽ cặp đôi với hai sợi đơn ADN theo hướng 5’-3’

+ Tổng hợp (kéo dài mồi): thực hiện ở 72oC là nhiệt độ tối ưu cho ADNpolymerase

- Kỹ thuật Multiplex PCR

Multiplex PCR (PCR đa locus, PCR đa bộ mồi) là phản ứng PCR sửdụng đồng thời nhiều cặp mồi để khuyếch đại nhiều phân đoạn ADN trêncùng 1 khuôn trong một ống PCR duy nhất

Các thành phần cơ bản của Muliplex PCR gồm có ADN khuôn mẫu, bộ

đa cặp mồi, enzyme Taq polymerase, 4 loại dNTP, dung dịch đệm

Mục đích của Multiplex PCR là cùng 1 thí nghiệm chứng minh sự cómặt của nhiều locus trên 1 khuôn ADN Multiplex PCR được ứng dụng tronghình sự, pháp y, phả hệ … Multiplex PCR tiết kiệm thời gian, hóa chất, công

sức nhưng gây một số khó khăn trong đánh giá kết quả khi hỗn hợp sản phẩmPCR nhiều sản phẩm phụ không đặc hiệu [10].

- Hướng dẫn chẩn đoán mất đoạn nhỏ trên NST Y của hội nam học châu Âu (EAA - European Academy of Androgy) và Viện nhiên cứu chất lượng di truyền học phân tử châu Âu (EMQN – European Molecular Genetics Quality Network)

Năm 1999, Hội nam học châu Âu (EAA) và Viện nghiên cứu chất lượng

di truyền học phân tử châu Âu (EMQN) đã đưa ra qui trình kỹ thuật hướngdẫn chẩn đoán mất đoạn nhỏ trên NST Y dựa trên 2 phản ứng Multiplexpolymerase để phát hiện sự có mặt của 3 vùng AZFa, b, c trên NST Y

Mỗi Multiplex PCR được thực hiện với 5 cặp mồi, 3 cặp mồi đại diệncho 3 vùng AZF trên nhánh dài Y và 2 cặp mồi cho đoạn chứng nội tại ZFY

và SRY trên nhánh ngắn NST Y Cùng một thời điểm, mỗi Multiplex đượcthực hiện trên 4 mẫu: bệnh nhân, chứng nam, chứng nữ và nước Chứng nam

là người nam sinh sản bình thường, dùng làm đối chứng dương Chứng nữ làngười nữ bình thường Chứng nam và chứng nữ đánh giá sự nhạy và sự đặchiệu của phản ứng Mẫu nước là chứng âm, đánh giá sự nhiễm chéo

Về nguyên tắc, các phân tích chỉ xác định mất một đoạn ADN trongvùng AZFa, AZFb hoặc AZFc là đủ để xác định mát đoạn nhỏ trên NST Ytrong mỗi vùng AZF Tuy nhiên khi phân tích hai đoạn ADN trên một vùngAZF củng cố tính chính xác chẩn đoán

Tại Việt nam, chẩn đoán mất đoạn nhỏ trên NST Y bước đầu được ápdụng Từ đầu 2005, Bệnh Viện Từ Dũ khảo sát 144 nam ITT mức độ nặng vàKCTT phát hiện 6 trường hợp có mất đoạn nhỏ trên NST Y [8]

Trần Văn Khoa (2010) nghiên cứu trên 16 nam vô sinh do KCTT pháthiện 1 trường hợp mất đoạn AZFbc (6,25%) [2] Theo Đỗ Thị Minh Phương(2011) nghiên cứu trên 70 bệnh nhân vô sinh do KCTT phát hiện 3 trườnghợp mất đoạn (4,29%) [7].

Từ năm 2010, Bộ Môn Y Sinh học Di Truyền - ĐHYHN đã thực hiện kỹthuật Multiplex PCR để phát hiện các mất đoạn nhỏ trên NST Y ở các bệnhnhân ITT hoặc KCTT và đã phát hiện được các dạng mất đoạn AZFabc,AZFb, AZFc…

đề sinh sản Tỉ lệ mắc của hội chứng là 1/1000 trẻ sơ sinh nam

Hội chứng KF là bất thường của NST giới tính ở nam giới, karyotyp códạng 47,XXY (theo ICD 10 ký hiệu là Q 98.0-Q 98.4) Khoảng 80% cáctrường hợp KF có karyotyp 47, XXY; còn lại 20% các trường hợp là các biếnthể của hội chứng KF với karyotyp dạng 47,XXY/ 46,XY (dạng khảm);48,XXYY… Các bệnh nhân KF dạng khảm thường có triệu chứng nhẹ hơn vàtrạng thái khảm có thể chỉ có ở mô tinh hoàn còn trong các mô khác, kể cả mômáu có karyotyp bình thường 46,XY [38]

Đặc điểm lâm sàng của hội chứng KF mơ hồ và có thể rất khác nhau.Chẩn đoán ít khi được thực hiện trong 10 năm đầu đời, có nhiều trường hợpmang hội chứng KF có thể không được phát hiện [11], [46]

Trẻ trai hội chứng KF thời kỳ sơ sinh có biểu hiện bình thường, tuynhiên có thể có các bất thường của bộ phận sinh dục như lỗ đái lệch thấp, tinhhoàn nhỏ, có thể chưa xuống bìu Hội chứng KF thường không được pháthiện sớm, chỉ tới tuổi vị thành niên có biểu hiện ảnh hưởng đến phát triển thểchất, ngôn ngữ và xã hội lúc đó mới được phát hiện Các đặc điểm này baogồm người cao, ít cơ bắp, tinh hoàn nhỏ và chắc, ít lông và tóc trên cơ thể,chứng vú to [39] Chỉ số IQ bình thường hoặc hơi thấp hơn bình thường ởngười có hội chứng KF tuy nhiên các trẻ này thường bị ảnh hưởng đến pháttriển ngôn ngữ và xã hội nên gặp khó khăn trong học tập, chậm phát triểnngôn ngữ, thụ động và kém nhanh nhậy hơn so bạn cùng lứa tuổi Nam giớivới KF thường hay gặp các vấn đề về sức khỏe như rối loạn miễn dịch, ungthư vú, loãng xương và các bệnh về mạch máu Họ thường có đời sống tìnhdục bình thường và khả năng sinh sản rất khác nhau tùy thuộc vào kiểukaryotyp và trạng thái khảm nếu có [11], [39] Tuy nhiên, hầu hết các trườnghợp KF đều cần đến hỗ trợ sinh sản [23] Các nam giới mang trạng thái khảm47,XXY/ 46,XY thường giống nam giới bình thường và có khả năng sinh sản.

Bảng 1.1: Các dạng karyotyp thường gặp trong hội chứng KF [64].

47,XXY/46,XY Khảm 2 dòng tế bào: 1 dòng thừa 1 NST X và

1 dòng NST giới tính nam bình thường

47,XXY/46,XX Khảm 2 dòng tế bào: 1 dòng thừa 1 NST X và

Tài liệu tham

47,XXY/46,XY

1.2.1 Tần suất của hội chứng Klinefelter

Tỉ lệ của hội chứng KF là 1/500-1/1000 trẻ sơ sinh nam

Thống kê trẻ sơ sinh sống có hội chứng KF ước chừng là 4,3-15,0 trong

10000 trẻ sơ sinh hay 8,4-29,0 trong 10000 trẻ trai [64]

Tỷ lệ hội chứng KF trước sinh còn cao hơn Theo nghiên cứu củaFerguson- Smith (1984), tỷ lệ KF trong chẩn đoán trước sinh là 33/10000 trẻtrai [26] Năm 2000, một nghiên cứu tại Đan mạch cho tỷ lệ hội chứng KF là153/100000 trẻ làm test chẩn đoán trước sinh (1/667 trẻ trai) [17]

1.2.2 Nguyên nhân

Hội chứng KF là kết quả từ sự không phân ly NST, thường là trong sựhình thành của trứng hoặc tinh trùng, khi một trong những giao tử có thêmNST X Sự thụ tinh 1 trứng X bởi một tinh trùng XY hoặc một trứng XX bởi

1 tinh trùng Y sẽ tạo thành một phôi XXY

Có ba cơ chế có thể dẫn đến karyotyp 47,XXY Chúng có thể là sự khôngphân ly trong quá trình tạo trứng hoặc tinh trùng, hoặc do sai sót trong việcphân chia các tế bào hợp tử sau khi thụ thai [52] Bảng 3 liệt kê nguồn gốccủa NST X thừa từ cha mẹ theo các nghiên cứu khác nhau Do sự hiện diện

của NST thêm, giai đoạn phân bào giảm nhiễm sự không phân ly xảy ra tronggiảm phân I (MI) hoặc trong giảm phân II (MII) có thể được xác định Trongkhoảng 55% các trường hợp của 47,XXY, NST X thừa có xuất xứ của người

mẹ, và trong phần lớn các trường hợp này sự không phân ly xảy ra trong MI.Trong khoảng 45% các trường hợp, NST X có nguồn gốc từ bố, và sự khôngphân ly hầu hết xảy ra trong MI

Bảng 1.3: Nguồn gốc của NST X trong hội chứng Klinefelter từ các nghiên

cứu khác nhau (%) [64]

Các nghiên cứu

Nguồn mẹ Nguồn bố Tổng

không ảnh hưởng đến các đặc điểm lâm sàng của nam giới với hội chứng KF[33], [41].

1.2.3 Sàng lọc trước sinh hội chứng KF

Hội chứng KF có thể được chẩn đoán trước sinh nhờ phân tích di truyền

tế bào từ mẫu tế bào thu được do xét nghiệm chọc dò ối hoặc tế bào tua rau,tuy nhiên những xét nghiệm này đều xâm phạm đến thai và có thể là nguyênnhân gây tai biến cho thai cũng như cho mẹ (sẩy thai, thai chết lưu, rỉ ối…)

Để giảm bớt những rủi ro trên, sàng lọc trước sinh ngày càng được sử dụngrộng rãi để loại bớt những thai không có nguy cơ bất thường, phát hiện nhữngthai có nguy cơ cao Việc sàng lọc chỉ là bước đầu để xác định thai có nguy cơcao bất thường, phải có tiến trình chẩn đoán xác định tiếp theo thì test sànglọc mới có hiệu quả Sàng lọc trước sinh hiện nay thường được tiến hành vớicác tật của ống thần kinh và các bất thường NST (đặc biệt là các trường hợpthai lệch bội như trisomi 21, trisomi 18)

Tuy nhiên, hội chứng KF hiện nay chưa được phát hiện nguy cơ cao dựavào test sàng lọc do không có dấu hiệu bệnh đặc hiệu trên siêu âm cũng nhưtrong xét nghiệm định lượng một số sản phẩm sinh học của thai trong máu mẹnên các thai được chẩn đoán trước sinh KF thường là tình cờ phát hiện được dosàng lọc có nguy cơ cao của các hội chứng khác như hội chứng Down haytrisomy 18 và được chỉ định chọc ối chẩn đoán trước sinh [11]

Do vậy, sàng lọc trước sinh của hội chứng KF ở đây là dựa vào các yếu

tố sàng lọc đang được sử dụng để phát hiện các thai có nguy cơ cao của hộichứng Down, trisomy 18

1.2.3.1 Tuổi mẹ

Tuổi mẹ cao khi mang thai liên quan nhiều đến sinh ra các con bị dị tậtđặc biệt con bị trisomy Nguy cơ thai bất thường NST tăng lên theo tuổi mẹ.

Ở những người mẹ cao tuổi thì nguy cơ không phân ly NST xảy ra ở trứngngày càng cao Tuổi trứng cũng như tuổi mẹ, càng cao càng chịu nhiều ảnhhưởng của tác động bên trong cũng như bên ngoài cơ thể Những yếu tố nàylàm tăng nguy cơ không phân ly NST trong quá trình phân bào, là nguyênnhân dẫn đến bất thường về số lượng NST của thai NST thừa có nguồn gốc

từ mẹ chiếm 80%, còn 20% có nguồn gốc từ bố Trisomy thuần tăng theo sựtăng của tuổi mẹ Nguy cơ hội chứng KF cũng tăng lên theo tuổi mẹ [19],[20], [26], [32] Có sự tăng nguy cơ của hội chứng KF khi tăng tuổi mẹ có thể

do sự không phân ly trong giảm phân của các trứng khi già hóa [38], [42],[52] Theo nghiên cứu của Bjosen D (2003), sự tăng của tuổi mẹ có tác độngquan trọng tới tỉ lệ của hội chứng KF [17]

1.2.3.2 Sàng lọc bằng định lượng 1 số sản phẩm của thai trong huyết thanh mẹ

Thường dùng phổ biến là triple test gồm:

AFP (alpha-fetoprotein)

hCG (human chorionic gonadotropin)

uE3: estriol không liên hợp (Unconjugated Estriol)

 AFP (Alpha–Fetoprotein)

AFP là một protein đặc biệt của thai, được phát hiện năm 1956 Năm

1972, người ta nhận thấy nồng độ AFP tăng ở những thai có dị tật ống thầnkinh Sau đó, người ta nhận thấy AFP giảm trong những thai bị Down

AFP của người là một glycoprotein trọng lượng phân tử 69 kdalton, chứa4% cacbonhydrat, có đặc tính sinh học giống albumin Thời gian bán hủytrong dịch ối khoảng từ 3-5 ngày AFP được sản xuất từ túi noãn hoàng và gancủa thai (từ tuần thứ 10-11 của thai, AFP chủ yếu do gan tổng hợp).

AFP được định lượng trong huyết thanh thai, trong dịch ối hoặc tronghuyết thanh mẹ Hay dùng định lượng AFP trong máu mẹ vì xét nghiệmkhông xâm phạm đến thai, tránh nguy cơ cho thai và mẹ

* AFP trong huyết thanh mẹ (MSAFP)

MSAFP hay được sử dụng nhất để xác định thai có nguy cơ bất thường

vì nó an toàn cho thai và mẹ, kỹ thuật lấy mẫu đơn giản

Nồng độ MSAFP tăng từ tuần thứ 10 tới tuần thứ 30-32 của thai kỳ rồilại giảm AFP có nguồn gốc từ thai, khuyếch tán từ dịch ối và huyết thanh củathai qua bánh rau vào vòng tuần hoàn của mẹ Nồng độ AFP tăng cao tronghuyết thanh mẹ từ tuần thứ 12-14 Tuần thai 15-18 nồng độ MSAFP thường

ổn định nên thường định lượng MSAFP trong thời gian này

Gía trị trung bình của AFP ở tuần thai 15-18:

+ Huyết thanh thai: 1.510.000 ng/ml

+ Dịch ối: 10.200ng/ml

+ Huyết thanh mẹ: 30, 6 ng/ml

Nồng độ AFP trong huyết thanh thai cao gấp khoảng 50.000 lần nồng độMSAFP và gấp 150 lần nồng độ AFP dịch ối [67]

Theo Ryall, nghiên cứu tại miền nam Australia (2001), MSAFP tăng cao

có liên quan đến thai có hội chứng KF [25] tuy nhiên mối liên quan này làkhông chặt chẽ [54]

 hCG

hCG là một glycoprotein trọng lượng phân tử 46.000 dalton, gồm 2chuỗi α và β hCG do tế bào lá nuôi bài tiết ngay sau khi trứng làm tổ Có thểthấy hCG trong nước tiểu từ ngày thứ 8 sau khi thụ thai hCG tăng nhanh vàđạt tối đa vào tuần 8-9, sau đó giảm dần đến tuần thứ 12 rồi ổn định nồng độcho tới lúc đẻ 3 tháng đầu người ta hay định lượng βhCG tự do còn hCG toànphần trong 3 tháng giữa

Ở nam giới và phụ nữ không có thai thì lượng hCG huyết thanh ≤ 5 mIU/ml

hCG huyết thanh mẹ tăng cao có liên quan với các thai hội chứng KF[15], [16]

 uE 3 (estriol không liên hợp- unconjugated estriol)

Estriol không liên hợp do hoàng thể và rau thai bài tiết qua bánh rau vàovòng tuần hoàn mẹ Từ tháng thứ 4 chỉ còn rau thai bài tiết Nồng độ uE3 tăngdần trong máu mẹ trong suốt thời kỳ mang thai Tăng cao nhất ở tháng thứ 9đến gần ngày sinh thì giảm xuống Người ta thường định lượng uE3 hai lần đểđánh giá quá trình phát triển của thai uE3 giảm chứng tỏ tình trạng suy yếucủa bánh rau và thai nhi Thời gian bán hủy của estriol trong máu mẹ khoảng30-60 phút

Mối liên quan của nồng độ uE3 với thai KF chưa thấy đề cập trong cáctài liệu nghiên cứu

1.2.3.2 Sàng lọc trước sinh qua siêu âm thai

Siêu âm được sử dụng trong chẩn đoán trước sinh ngày càng rộng rãi Siêu

âm được dùng để xác định tuổi thai, kích thước các phần thai, kiểm tra tử cung,bánh rau, màng ối, dịch ối, xem xét giải phẫu thai để kết hợp với kết quả testsàng lọc phát hiện các bất thường thai

Những hình ảnh siêu âm thai bất thường:

- Siêu âm 3 tháng đầu để đo độ mờ da gáy (dày da gáy)

Đầu những năm 1990, sự liên quan giữa tăng khoảng mờ da gáy và thaibất thường NST đã được công nhận Tỷ lệ bất thường NST trong khoảng từ19-88%, tương ứng với siêu âm có khoảng mờ da gáy từ 2-10mm

Độ dày khoảng mờ da gáy được tính là chiều dày tối đa của khoảng mờdưới da, là chiều dày từ mặt ngoài da gáy tới xương trên đốt sống cổ [45], [63].Khoảng mờ da gáy với thai hội chứng Down là ≥ 3 mm

- Hình ảnh siêu âm thai ở 3 tháng giữa

+ Đo chiều dày da gáy

Sự tích tụ quá mức bình thường dịch ở sau cổ của thai được phát hiện ở 3tháng giữa hoặc 3 tháng cuối của thai, dạng nang nước hoặc phù bạch huyếtdẫn đến tăng chiều dày da gáy Thường chọn ngưỡng ≥ 6mm làm ngưỡngsàng lọc cho chiều dày da gáy với thai hội chứng Down [18]

+ Siêu âm còn có thể phát hiện các bất thường của thai liên quan với bấtthường NST như kích thước xương mũi, chiều dài xương đùi, dị tật tim, dị tậtcủa ống tiêu hóa, thoát vị rốn, phù thai, hẹp ruột…

Các xét nghiệm sàng lọc chủ yếu thực hiện trong 3 tháng đầu và 3 thánggiữa 3 tháng đầu là PAPP-A, βhCG và đo dày da gáy + tuổi mẹ.

3 tháng giữa là AFP, hCG, Ue3, inhibin A và một số hình ảnh siêu âm +tuổi mẹ

Bất thường NST giới tính của thai (47,XXX; 47,XXY; 47,XYY) có liênquan đến tăng chiều dầy da gáy, là sự tích lũy dịch ở phía sau cổ đo khi siêu

âm tuần thai từ 11-14 Kích thước khoảng mờ sau gáy cùng với định lượngfree β HCG (Free β human chorionic gonadotropin) và PAPP-A (pregnancy-assisted plasma protein-A) huyết thanh mẹ trong 3 tháng đầu của thai kỳ giúpsàng lọc được thai nguy cơ cao bất thường NST [55], [60]

Alphafetoprotein [25] và hCG [15], [16] huyết thanh mẹ tăng cao có liênquan với các thai hội chứng KF Tuy vậy, do liên quan với bất thường tronghuyết thanh mẹ ở 3 tháng giữa là không đặc hiệu, nên KF chưa được sàng lọctrước sinh thường quy từ huyết thanh mẹ [54]

1.2.4 Các phương pháp chẩn đoán trước sinh

Để chẩn đoán chính xác các bất thường của thai sau khi sàng lọc các thai

có nguy cơ cao thì cần làm các xét nghiệm di truyền Các xét nghiệm ditruyền để chẩn đoán có nhiều mức độ: ở mức độ tế bào (phân tích NST), mức

độ phân tử (ADN) hay cả mức độ tế bào và phân tử (FISH) Có 2 phươngpháp lấy tế bào của thai là phương pháp trực tiếp và gián tiếp

1.2.4.1 Phương pháp trực tiếp lấy tế bào từ thai nhi

Tế bào thai thường được lấy từ thủ thuật chọc hút dịch ối, chọc hút tuarau hoặc qua chọc hút máu dây rốn, sinh thiết mô thai…

Chỉ định xét nghiệm di truyền cho thai:

+ Tuổi mẹ ≥ 35

+ Có tiền sử sảy thai, thai chết lưu, hoặc chết khi sinh; đã có con bị dịtật, bất thường NST, thai phụ hoặc chồng có mang NST bất thường (chuyểnđoạn, đảo đoạn)

+ Siêu âm thai có hình ảnh bất thường như tăng khoảng mờ sau gáy,nang bạch huyết, dị tật tim, dị tật tiêu hóa…

+ Test sàng lọc qua huyết thanh mẹ có nguy cơ cao sinh con lệch bội loạitrisomy 21, trisomy 18 và dị tật ống thần kinh

 Chọc ối

Năm 1882 lần đầu tiên Schatz sử dụng chọc hút dịch ối để rút bớt dịch ốicủa thai đa ối Ngày nay, chọc hút dịch ối là phương pháp phổ biến nhất vì vừa ítxảy ra tai biến cho thai phụ vừa thu được tế bào ối để làm chẩn đoán di truyền

* Chọc ối sớm trong chẩn đoán trước sinh ở 3 tháng đầu

Chọc ối sớm cho chẩn đoán trước sinh trong 3 tháng đầu hiện đang được

sử dụng nhiều hơn chọc hút tế bào tua rau [30], [31]

Chọc ối sớm có ưu điểm là phát hiện được các bất thường sớm Ở giai đoạnnày, khi thai có bất thường việc đình chỉ thai dễ thực hiện hơn khi thai to ở 3tháng giữa đồng thời ít ảnh hưởng tâm lý cho thai phụ khi đình chỉ thai nghén.Nhược điểm của chọc ối sớm là thủ thuật khó khăn hơn, tỷ lệ liền màngthấp hơn và có thể gây rỉ ối [48] Hơn nữa ở những mẫu ối chọc sớm, thể tíchdịch ối và nồng độ của tế bào ối thấp nên thời gian nuôi cấy thường kéo dàihơn Ngoài ra, theo Dunn và Golmillow [24] thì chọc ối sớm làm tăng tỷ lệ

sảy thai so với chọc hút tua rau (4,2% và 1,9%) và so với chọc ối kinh điển(chỉ là 1,1%).

* Chọc ối ở 3 tháng giữa thai kỳ

Từ năm 1970, chọc ối ở 3 tháng giữa của thai kỳ đã được thực hiện vàngày càng phổ biến trong chẩn đoán trước sinh Hiệu quả cao trong chẩn đoáncác thai có nguy cơ cao bất thường NST Dịch ối và tế bào trong dịch ối đượcdùng để phân tích NST, làm các xét nghiệm ở mức độ phân tử, kỹ thuật FISHhay các xét nghiệm sinh hóa Chọc ối ở tuần thai 15-18 là tiêu chuẩn vàng ápdụng cho chẩn đoán di truyền tế bào trước sinh với độ chính xác 99,4-99,8%

và có tỷ lệ sảy thai 0,5-1% [44] Tuy nhiên kết quả xét nghiệm di truyền tếbào chỉ có sau 2-3 tuần, nếu thai có bất thường và thai phụ quyết định bỏ thaithì thường thai đã to nên gặp khó khăn hơn so với trong 3 tháng đầu

 Chọc hút tua rau

Từ năm 1983, dưới hướng dẫn của siêu âm, chọc hút tua rau đã trở thành

1 xét nghiệm phổ biến để chẩn đoán trước sinh vào 3 tháng đầu của thai Mẫutua rau có thể làm phân tích NST, đặc biệt được sử dụng nhiều hơn tế bàodịch ối trong xét nghiệm ADN và sinh hóa vì mẫu xét nghiệm tươi, không cầnqua nuôi cấy

Chọc hút tua rau thường làm ở tuần 10-12, dưới hướng dẫn của siêu âmqua cổ tử cung, thành bụng hoặc đường âm đạo

Thời gian: với phương pháp trực tiếp hoặc nuôi cấy qua đêm thì kết quảNST từ tế bào tua rau có sau vài giờ hoặc 1 ngày Nếu nuôi cấy từ tế bào tuarau thì mất 1-2 tuần, hình ảnh nhuộm băng NST sẽ đẹp hơn làm trực tiếp

Ưu điểm của chọc hút tua rau là có kết quả di truyền sớm hơn chọc ối và

vì thế nếu bất thường có thể cho đình chỉ thai sớm hơn Lượng tua rau cần lấy

ít nhất 5 mg

1.2.4.2 Phương pháp gián tiếp lấy tế bào thai từ máu mẹ

Thu thập, phân tích các tế bào thai từ máu ngoại vi của mẹ để chẩn đoántình trạng thai, tránh nguy cơ xảy ra với thai khi sử dụng kỹ thuật có xâmphạm đến thai Có 3 loại tế bào có nhân là lympho bào, tế bào hợp bào lá nuôi

và hồng cầu có nhân (nucleated red blood cells NRBCs) được tách ra từ máu

mẹ nhờ phân biệt tính kháng nguyên giữa mẹ và thai

1.2.4.3 Một số kỹ thuật di truyền áp dụng để chẩn đoán thai bị hội chứng KF

 Phương pháp di truyền học tế bào để phát hiện thai bị hội chứng

KF (xét nghiệm NST)

Người ta sử dụng phương pháp trực tiếp tức là từ các tế bào đang phânchia mạnh (không qua nuôi cấy) như từ tế bào tua rau hoặc gián tiếp qua nuôicấy Nhìn chung có 3 cách nuôi cấy:

- Nuôi cấy tế bào dịch ối

- Nuôi cấy những tế bào mô (tua rau, da, tế bào cơ thai)

- Nuôi cấy bạch cầu lympho với những mẫu máu cuống rau

 Nuôi cấy tế bào dịch ối [53]

Nuôi cấy tế bào dịch ối để phân tích NST là phương pháp thuận tiệnnhất, tin cậy cho chẩn đoán trước sinh

Dịch ối có màu vàng nhạt, gồm một hỗn hợp tế bào bong không đồngnhất, có thể từ tế bào màng ối, từ da, từ đường tiết niệu, đường hô hấp, từđường tiêu hóa và có thể có những tế bào máu mẹ (khoảng 0,5%) hay máuthai trong dịch ối

 Nuôi cấy tế bào mô [53]

Có 2 phương pháp sử dụng nuôi cấy tế bào mô

- Dầm cơ học những mảnh mô thành những mảnh nhỏ để nuôi cấy.

- Dùng enzyme (trypsin hoặc collagenase) để tách riêng từng tế bào mô thai

Bổ sung môi trường nuôi cấy

Nuôi cấy theo phương pháp cấy hở

Nhuộm băng: băng G, băng Q, băng R, băng C… để đánh giá NST vàsắp xếp chính xác vị trí của các NST trong bộ NST

 Nuôi cấy bạch cầu lympho từ máu dây rốn

Đây là phương pháp thường quy để nghiên cứu NST ở người Chất PHA

là chất kích thích phân bào, làm cho các lympho bào trở thành các tế bào cókhả năng phân chia Thời gian nuôi cấy 48-72 giờ

Các phương pháp:

Nuôi cấy máu toàn phần

Nuôi cấy lympho bào đã tách hồng cầu (Moodhead và cs.1960)

Nuôi cấy lympho bào dài ngày

 Các phương pháp di truyền học phân tử

Các kỹ thuật phân tử có thể được sử dụng trong chẩn đoán trước sinhnhư kỹ thuật FISH, kỹ thuật QF-PCR Trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ sửdụng phương pháp phân tích NST qua tế bào ối nuôi cấy để phát hiện thai hộichứng KF

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm nghiên cứu

Tại phòng xét nghiệm tế bào và phân tử của Bộ Môn Y Sinh Học DiTruyền, Đại học Y Hà Nội

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu gồm 2 nhóm:

1 Nhóm chẩn đoán sau sinh (nhóm vô sinh nam)

Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là các bệnh nhân và hồ sơ bệnh áncủa các bệnh nhân vô sinh nam (tinh dịch đồ KCTT hoặc ITT, đã loại trừnguyên nhân do tắc nghẽn) được chẩn đoán là KF tại Bộ Môn Y Sinh Học DiTruyền, Đại Học Y Hà Nội từ năm 2010 đến tháng 6-2012

2 Nhóm chẩn đoán trước sinh

Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là hồ sơ bệnh án của các thai tuần15-20, được chẩn đoán là KF tại Bộ Môn Y Sinh Học Di Truyền, Đại Học Y

Hà Nội từ năm 2007 đến tháng 6-2012

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu mô tả

2.3.2 Cỡ mẫu nghiên cứu

- Nhóm vô sinh nam: chọn tất cả các bệnh nhân và các bệnh án của các

bệnh nhân đã được chẩn đoán là KF

Các bệnh nhân được thăm khám lâm sàng.

Làm bệnh án di truyền

Xét nghiệm TDĐ

Xét nghiệm nuôi cấy NST từ tế bào lympho máu ngoại vi

Xét nghiệm Multiplex PCR phát hiện mất đoạn nhỏ trên NST Y

- Nhóm chẩn đoán trước sinh: chọn tất cả các hồ sơ bệnh án của các

thai phụ tuần thai từ 15-20 được chẩn đoán trước sinh là thai KF

Các thai phụ được làm bệnh án di truyền

Sàng lọc trước sinh có nguy cơ cao với các yếu tố như tuổi mẹ, tripletest và siêu âm hay có chỉ định chọc ối

Chọc ối nuôi cấy tế bào dịch ối-làm xét ngiệm di truyền tế bào.

2.3.3 Các nội dung nghiên cứu

 Nhóm vô sinh nam

- Các thông tin chung: tuổi, nghề nghiệp, địa chỉ, tuổi của bố mẹ bệnhnhân tại thời điểm sinh con KF, thời gian điều trị vô sinh

- Đặc điểm lâm sàng: chiều cao, cân nặng, đặc điểm của bộ phận sinhdục: kích thước tinh hoàn, chiều dài dương vật

- Kết quả xét nghiệm tinh dịch đồ, NST, M-PCR phát hiện mất đoạn AZFtrên NST Y

 Nhóm chẩn đoán trước sinh

- Các thông tin chung: tuổi bố, mẹ, tuổi thai, địa chỉ

- Các đặc điểm trong sàng lọc nguy cơ cao: dấu hiệu siêu âm bất thường,AFP, hCG, uE3, tuổi mẹ

2.3.4 Nuôi cấy tế bào dịch ối với nhóm chẩn đoán trước sinh