XÁC ĐỊNH các NHÓM ESCHERICHIA COLI gây TIÊU CHẢY ở TRẺ EM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH học PHÂN tử tại hà nội

---*---HOÀNG THỊ BÍCH NGỌC XÁC ĐỊNH CÁC NHÓM ESCHERICHIA COLI GÂY TIÊU CHẢY Ở TRẺ EM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ TẠI HÀ NỘI Chuyên ngành: Vi khuẩn học Mã số : 68 72 68 01 ĐỀ CƯƠNG

-* -HOÀNG THỊ BÍCH NGỌC

XÁC ĐỊNH CÁC NHÓM ESCHERICHIA COLI GÂY

TIÊU CHẢY Ở TRẺ EM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SINH HỌC PHÂN TỬ TẠI HÀ NỘI

Chuyên ngành: Vi khuẩn học

Mã số : 68 72 68 01

ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU SINH

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS Hoàng Thu Hà

2 GS TS Phùng Đắc Cam

HÀ NỘI – 2012

AA : Aggregative adherence

ADN : Acid Deoxyribo nucleic

A/E : Attaching/effacing

AAF : Aggregative adherence Fimbriae

BHI : Broth Heart Infusion

CDC : Centers for Disease Control and Prevention

CFA : Colonization factor antigen

DEC : Diarrhea Escherichia coli

EAEC : Enteroaggregative E.coli

EHEC : Enterohemorrhagic E.coli

EIEC : Enteroinvasive E.coli

EPEC : Enteropathogenic E.coli

ETEC : Enterotoxigenic E.coli

DAEC : Diffusely adherent E.coli

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay

KIA : Kliger iron agar

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tiêu chảy và E.coli 3

1.1.1 Bệnh tiêu chảy 3

1.1.2 Escherichia coli 5

1.2 Các phương pháp chẩn đoán E.coli 6

PHẦN II 14

ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 15

2.2 Vật liệu 15

2.2.1 Vật liệu cho vận chuyển, nuôi cấy và xác định vi khuẩn 15

2.2.2 Vật liệu cho PCR đa mồi chẩn đoán E.coli 16

2.3 Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.2 Kỹ thuật nghiên cứu 19

2.4 Xử lý số liệu 24

2.5 Y đức 24

PHẦN III 25

DỰ KIẾN KẾT QUẢ 25

3.1 Xác định tỷ lệ các loại E.coli ở trẻ tiêu chảy và không tiêu chảy 25

3.2 Đánh giá mối liên quan giữa các gien độc lực của E.coli ở nhóm trẻ tiêu chảy và không tiêu chảy 26

3.3 Đánh giá mối liên quan giữa các loại E.coli gây tiêu chảy và triệu chứng lâm sàng27 PHẦN IV 29

DỰ KIẾN BÀN LUẬN 29

PHẦN V 30

DỰ KIẾN KẾT LUẬN 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tiêu chảy là bệnh phổ biến trên toàn cầu đặc biệt ở các nước đangphát triển trong đó có Việt Nam Theo tổ chức y tế thế giới bệnh tiêu chảychiếm khoảng 30% các trường hợp tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi Tại Việt Namtheo một số nghiên cứu mỗi trẻ tiêu chảy trung bình 3,2 lần/năm Bệnh tiêuchảy là gánh nặng về y tế, kinh tế cho xã hội, cho gia đình bệnh nhân [1]

Escherichia coli (E.coli) là căn nguyên phổ biến của viêm dạ dày ruột,

chiếm tới 20-30% các căn nguyên xác định gây tiêu chảy [5]

E.coli có 2 loại: E.coli gây bệnh tiêu chảy (Diarrhea Escherichia coli: DEC) và E.coli không gây tiêu chảy Việc xác định các loại E.coli gây tiêu

chảy dựa vào ngưng kết với kháng huyết thanh, thử nghiệm trên động vật thínghiệm, nuôi cấy trên tế bào, các kỹ thuật này thường mất thời gian, phức tạpnhưng độ nhạy và độ đặc hiệu không cao

Phương pháp sinh học phân tử như khuếch đại gien PCR (polymerasechain reaction), điện di trong trường xung điện (pulse-field gel electrophoresis

- PFGE) hay phương pháp phân tích trình tự lặp locus đa hình multiple-locus variable-number tandem repeat analysis) trở thành kỹ thuậtphổ biến và đáng tin cậy để xác định nguồn gốc dịch, mối liên quan dịch tễhọc phân tử Hiện tại, các kỹ thuật này đã được áp dụng ở những nước pháttriển Tuy nhiên, tại Việt Nam nhóm kỹ thuật này chưa phát triển rộng rãi,đồng thời chưa có một nghiên cứu nào sử dụng phương pháp sinh học phân tử

(MLVA-để đánh giá mức độ khác nhau giữa các gen của các chủng E.coli gây bệnh và

không gây bệnh Do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này với mụcđích nghiên cứu các chủng DEC ở trẻ em Việt Nam bằng phương pháp sinhhọc phân tử để:

- Xác định tỷ lệ từng loại E.coli ở nhóm trẻ tiêu chảy và không tiêu

chảy dưới 5 tuổi tại Hà Nội

- Đánh giá mối liên quan giữa các gien độc lực của E.coli ở nhóm trẻ

tiêu chảy và không tiêu chảy dưới 5 tuổi bằng kỹ thuật PFGE và MLVA

- Đánh giá mối liên quan giữa các loại E.coli gây tiêu chảy và triệu

chứng lâm sàng

PHẦN I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tiêu chảy và E.coli

1.1.1 Bệnh tiêu chảy

Tiêu chảy là vấn đề y tế toàn cầu, là nguyên hàng đầu gây bệnh tật và

tử vong cho trẻ em các nước đang phát triển, ước tính trẻ dưới 5 tuổi tiêu chảy3,2 lần/năm và trong 5 năm đầu đời có 4,9/1000 trẻ tử vong do tiêu chảy [42]

Tiêu chảy là tình trạng trẻ đi ngoài từ 3 lần trở lên trong 24 giờ,phân lỏng, hoặc thay đổi tính chất bình thường của phân, kèm theo cáctriệu chứng như sốt, nôn, đau bụng [11] Tiêu chảy cấp là tiêu chảy dưới

14 ngày, tiêu chảy trên 14 ngày là tiêu chảy kéo dài, tiêu chảy trên 30ngày là tiêu chảy mãn [1], [27]

Căn nguyên gây tiêu chảy chủ yếu là do virus, vi khuẩn, ký sinh trùng,khoảng 60% các trường hợp tiêu chảy cấp xác định được căn nguyên gây tiêuchảy [7], [33] Các tác nhân gây tiêu chảy thường lây truyền qua thức ăn vànước uống nhiễm tác nhân gây bệnh, qua đường phân - miệng, bàn tay bẩnhoặc tiếp xúc trực tiếp với phân có chứa tác nhân gây bệnh Do vậy hạn chếtình trạng lây nhiễm bằng rửa tay trước khi ăn, sau khi đi vệ sinh, ăn chin,uống sôi giảm đáng kể tình trạng lây nhiễm này Những yếu tố làm tăng nguy

cơ tiêu chảy ở trẻ như trẻ nuôi hoàn toàn bằng sữa bột, trẻ suy dinh dưỡng…Việc thực hiện chương trình kiểm soát và khống chế tiêu chảy của tổ chức y tếthế giới (WHO) bao gồm tăng cường cho trẻ bú sữa mẹ, điều trị tiêu chảy chotrẻ bằng bù nước và điện giải, giai đoạn sớm cho trẻ uống ORESOL, truyềnthông giáo dục sức khỏe đã làm giảm tỷ lệ mắc tiêu chảy

Điều trị tiêu chảy tùy thuộc căn nguyên gây bệnh Tiêu chảy do E.coli

ngoài bồi phụ nước và điện giải (uống ORESOL, truyền dịch) còn dùngkháng sinh diệt vi khuẩn [6]

Tiêu chảy do E.coli chiếm khoảng 20%-30% các trường hợp tiêu chảy [5], [47], [3] Dựa vào tính chất gây bệnh chia E.coli gây tiêu chảy thành các nhóm chính:

Enteropathogenic E.coli (EPEC): E.coli gây bệnh đường ruột

Enterotoxigenic E.coli (ETEC): E.coli sinh độc tố ruột

Enterohemorrhagic E.coli (EHEC): E.coli gây xuất huyết ruột

Enteroinvasive E.coli (EIEC): E.coli xâm nhập ruột

Enteroaggregative E.coli (EAEC): E.coli bám dính kết tập ruột Diffusely adherent E.coli (DAEC): E.coli gây bám dính phân tán

Hình 1: Các loại E.coli gây tiêu chảy

Nguồn tài liệu http://cmr.asm.org/content/11/1/142.full

Tại Tanzania DEC là căn nguyên phổ biến nhất gây tiêu chảy chiếm22,9% ở trẻ dưới 5 tuổi [48] Tương tự, tỉ lệ này ở Iraq là 25,9% [8] Đặc biệttại Ấn Độ chiếm tới 43%, trong đó ETEC chiếm 37,21% [36] Nghiên cứu tạiThụy Sĩ cho thấy, bệnh tiêu chảy do DEC, EHEC chiếm tới 60% ở trẻ dưới

16 tuổi [59] Tại Brazil thì tiêu chảy cấp do EPEC điển hình chiếm 6%, EPECkhông điển hình 6%, EAEC 4,7%, EIEC 2% [10] Tại Tây Ban Nha nghiêncứu được tiến hành ở người đi du lịch bị tiêu chảy thì ETEC chiếm tới 15.7%,EAEC chiếm 13.4% và DAEC chiếm 9.14% [62].Theo Đỗ Thu Hương vàcộng sự, tại Việt Nam, trẻ dưới 5 tuổi tiêu chảy do DEC chiếm 24,9% [3].Tương tự, Nguyễn Vũ Trung và cộng sự chỉ ra tỉ lệ DEC chiếm 29,04%,trong đó EAEC chiếm 18,71%, EPEC 5,8%, EHEC chiếm 1,94%, và EIEC1,94%, ETEC 0,62% [5]

1.1.2 Escherichia coli

Escherichia do Escherich phát hiện vào năm 1885 Giống Escherichia gồm nhiều loài , trong đó E coli là loại điển hình và có vai trò quan trọng [2] E.coli là trực khuẩn Gram âm, di động, một số có vỏ, lên men đường Glucose,

Lactose và sinh hơi (trừ một số chủng EIEC), lên men đường Sorbitol (trừ đa sốEHEC), sinh Indol, không sinh H2S, không có enzyme Urease, không sử dụngcitrat trong môi trường simmons, khử Cacboxyl trong môi trường Lysinedecacboxylase … [30] Nuôi cấy dễ dàng trên môi trường nuôi cấy thông thường,hiếu kỵ khí tùy tiện, nhiệt độ thích hợp là 370C [1], [2]

Sau 24 giờ nuôi cấy khuẩn lạc dạng S (Smooth), có thể gặp dạng M(Mucous) hoặc R (Rough)

Tại đường tiêu hóa E.coli có 2 loại E.coli gây tiêu chảy (DEC) và E.coli thuộc hệ vi khuẩn bình thường của đường tiêu hóa E.coli có thể gây

bệnh ở nhiều nơi trong cơ thể như nhiễm khuẩn tiết niệu, viêm màng não,nhiễm khuẩn huyết…

1.2 Các phương pháp chẩn đoán E.coli

Thử nghiệm tính chất sinh vật hóa học

Dựa vào các tính chất để xác định E.coli, nhưng phương pháp này không phân biệt được E.coli gây bệnh và E.coli của hệ vi sinh vật bình thường.

Chẩn đoán DEC bằng định typ huyết thanh

Vào năm 1944 Kauffman đề xuất phân loại E.coli dựa 3 loại kháng

nguyên Kháng nguyên thân O (Somatic), kháng nguyên lông H (Flagellar),kháng nguyên vỏ K (Capsular) Có 170 kháng nguyên O, mỗi loại xác địnhmột nhóm kháng nguyên, có 60 kháng nguyên H và 80 kháng nguyên K [57],[63], [26] Sự kết hợp giữa kháng nguyên O và H tạo các typ huyết thanh đặchiệu [30] Các typ huyết thanh có mối liên hệ với DEC tuy nhiên 1 loại DEC

có thể có nhiều nhóm huyết thanh, 1 nhóm huyết thanh có thể có nhiều loạiDEC [40] EPEC là nhóm đầu tiên được chẩn đoán bằng huyết thanh học,theo tổ chức y tế thế giới (1987) đã thống nhất có 12 nhóm huyết thanh củaEPEC gây bệnh ở người: O26, O55, O86, O111, O114, O119, O124, O125, O126, O127,

O128, O142. [26], [40], [19] ETEC gồm các nhóm chủ yếu: O6, O8, O15, O25, O27,

O63, O78, O115, O148, O153, O159, o167 EIEC gồm các nhóm phổ biến O28ac,

O112ac, O124, O136, O143, O144, O152, O164 [26] Nhóm EHEC gây bệnh chủ yếu là

O157H7 [32]

Chẩn đoán DEC dựa vào kháng huyết thanh thực hiện đơn giản, tuynhiên giá thành đắt do vậy ít phòng thí nghiệm có đủ các týp huyết thanh đểchẩn đoán và độ nhạy, độ đặc hiệu không cao

Chẩn đoán DEC dựa vào các phản ứng miễn dịch

Phản ứng ELISA, latex, miễn dịch huỳnh quang để phát hiện khángnguyên O, kháng nguyên H của EHEC O157H7. Phát hiện độc tố ruột ST của

ETEC qua miễn dịch phóng xạ [24], ELISA [56].

Chẩn đoán DEC dựa đặc điểm về độc lực

ETEC được phát hiện dựa trên yếu tố độc tố ruột LT (heat-labile), ST(heat-stable) [41] và thử nghiệm trên thỏ [21] Phát hiện được độc tố LT khinuôi cấy vào chuột Hamster [15] LT gồm LT1, LT2 và 2 loại này không cóphản ứng chéo LT1 gây bệnh cả trên người và động vật, LT2 gây bệnh hầuhết trên động vật

Phát hiện EAEC bằng nuôi cấy trên tế bào HEp-2 được coi là tiêuchuẩn vàng chẩn đoán EAEC [1], [58], kỹ thuật này được mô tả lần đầu tiênvào năm 1979 bởi Cravioto và cộng sự EAEC có khả năng bám vào tế bàoHEp-2 bằng yếu tố bám dính AA(Aggregative Adherence) [49], [50]

EIEC: Phát hiện bằng thử nghiệm Sereny gây viêm kết giác mạc củachuột lang, xâm nhập vào trong tế bào biểu mô và lan tràn từ tế bào này sang

tế bào khác [50]

Phương pháp chẩn đoán DEC dựa vào độc lực đòi hỏi nhân viên phòngthí nghiệm có kinh nghiệm nhưng cũng không đặc hiệu 100%

Phát hiện bằng sinh học phân tử

Phương pháp này phân biệt được DEC và E.coli thuộc hệ vi khuẩn bình

thường DEC là một trong những vi khuẩn đầu tiên được phát hiện bằngphương pháp này

DNA đầu dò như phát hiện độc tố chịu nhiệt (ST) và không chịu nhiệt (LT)

Cơ chế bám dính được chia làm 3 giai đoạn [1]:

- Sự bám dính khu trú: Do bfp (bundl forming pilus) thực hiện, bámdính dưới dạng tua (Fimbriae), có khuynh hướng kết thành bó, yếu tố này

được mã hóa bởi gen bfpA nằm trên plasmid EAF, đặc hiệu cho EPEC và

không có ở hệ vi khuẩn bình thường [1], [25]

- Xâm nhập vào tế bào chủ: Bằng các protein tiết của EPEC secreted proteins: Esps) gồm espA, espB, espD [39], các protein này được mã

(EPEC-hóa bởi các gen espA, espB, espD nằm trên vùng chromosome kí hiệu LEE

(locus of enterocyte effacement), vùng này cũng có gen mã hóa cho hệ thống

tiết sep, esc [49], LEE không có ở hệ vi khuẩn bình thường và ETEC, có chủ

yếu của EPEC và EHEC [1]

- Sự dính mật thiết: vi khuẩn dính vào biểu mô ruột qua trung gian là một

protein màng ngoài gọi intimin, yếu tố này được mã hóa bởi gen eaeA, cùng với cụm gen LEE tạo ra tổn thương A/E [1], [31] Intimin có cả EPEC và EHEC.

Hình 2: Cơ chế gây bệnh của EPEC.

Nguồn tài liệu theo http://www.pnas.org/content/97/16/8799.figures-only

Mồi được chọn cho EPEC là eae và bfpA Nếu dùng PCR phát hiện có gen eae là EPEC điển hình và/hoặc không điển hình, nếu có bfpA xác định đó

là EPEC điển hình [10]

PCR phát hiện EHEC

EHEC còn gọi E.coli sinh độc tố Shiga Độc lực chính của EHEC là

độc tố Stx (Shiga toxin) hay độc tố gây độc với tế bào Vero (Verocytotocin) vì

vậy thuộc nhóm VTEC (Verocytotocin E.coli) EHEC gây bệnh theo 2 cơ chế

chảy máu đường ruột, shock E.coli O157H7 thường thuộc nhóm này [64].PCR sử dụng 2 cặp mồi riêng biệt để phát hiện gen mã hóa cho Stx1 và Stx2

Do các gen Stx thường mất đi trong quá trình cấy chuyển, nên trong ADN dò

và PCR thì gen eae được phát hiện kết hợp xác định Stx để xác định các

chủng EHEC [54] EHEC là phân nhóm của verocytotoxin (VT) sản phẩm

của E.coli (VTEC), có 2 typ chính của VT là VT1 và VT2 Xác định VT1 và

VT2 qua ADN dò phát hiện EHEC [66]

PCR phát hiện ETEC

ETEC là một trong những vi khuẩn đầu tiên được phát hiện bằng PCRvào năm 1982 [46] ETEC được coi là nguyên nhân chủ yếu gây tiêu chảy củakhách du lịch và trẻ em ở các nước phát triển Tiêu chảy do ETEC thường

khởi phát đột ngột, phân toàn nước, không có nhày, mủ, máu, đôi khi bệnhnhân có sốt, buồn nôn, nôn, đau bụng

Độc tố ruột là yếu tố quyết định khả năng gây tiêu chảy Có 2 loại độc tố:độc tố chịu nhiệt ST (heat stable toxin) và độc tố không chịu nhiệt LT (heatlabile toxin) Có chủng ETEC chỉ có ST hoặc LT nhưng có những chủng có cả

ST và LT [65], [55]

- Độc tố ST gồm STa (STI) và STb (STII) được sản xuất bởi ETEC và một

số vi khuẩn Gram âm khác Độc tố ST được mã hóa bởi 2 gen estA và st1.EAST lúc đầu được tìm thấy ở EAEC, sau đó được tìm thấy ở nhiều chủngEHEC Một số chủng ETEC có STa, STb và EAST [65]

- Độc tố LT là ngoại độc tố, gồm 2 loại: LT-I gây bệnh cho người và độngvật, LT-II chủ yếu ở động vật hiếm khi ở người [16] LT được mã hóa bởi 2

gen là elt hoặc etx, các gen này nằm trên plasmid và nó cũng chứa gen mã hóa

cho ST [30]

Kỹ thuật PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để phát hiện đoạn gen mãhóa cho ST và LT [55], [18] Hiện đã sử dụng một số mồi kết hợp để phát hiệncác tác nhân gây bệnh đường ruột khác [35], [61], [52]

PCR phát hiện EIEC

Vi khuẩn bám rồi xâm nhập vào niêm mạc ruột, nhân lên nhanh chóngtrong niêm mạc ruột, vi khuẩn lan từ tế bào này sang tế bào khác, khi vikhuẩn chết giải phóng độc tố làm hủy hoại niêm mạc ruột Các gen mã hóacho quá trình xâm nhập nằm trên cả plasmid và chromosome

Để xác định EIEC xác định gen ial hoặc gen IpaH [60] EIEC có thể

mất 1 phần hoặc toàn bộ plasmid pInv do vậy phản ứng cần thực hiện sớm

PCR phát hiện EAEC

EAEC là tác nhân gây tiêu chảy thường gặp ở người đi du lịch, gặpnhiều ở cả các nước đang phát triển và phát triển EAEC thường gây tiêu chảy

kéo dài hoặc mãn tính EAEC ngày càng đóng vai trò quan trọng gây tiêuchảy ở trẻ em, chiếm tới 15% ở các nước đang phát triển và khoảng 4% ở cácnước phát triển [29] Cơ chế gây bệnh của EAEC liên quan đến:

- Diềm bám dính kết tập AAF (Aggregative adherence fimbriae) là yếu

tố độc lực quan trọng nhất AAF gồm: AAF/I và AAF/II có cấu trúc bó,AAF/III có dạng sợi riêng biệt Các AAF tạo kiểu bám dính hình chồng gạchtrên tế bào Hep-2

- Yếu tố aggR điều hòa sự biểu hiện bám dính kết tập AAF

- Protein Pet được tiết qua màng ngoài vi khuẩn, gây tích tụ dịch và gâyđộc cho tế bào biểu mô đường tiêu hóa

- Độc tố EAST-1(enteroaggregative heat- stable toxin- 1) có khả năngphá hủy tế bào biểu mô ruột

- Ngoài ra EAEC còn tiết protein gây tan máu và mất thăng bằng vậnchuyển ion qua màng tế bào ruột

Các yếu tố độc lực được mã hóa bởi các gen nằm chủ yếu trên plasmid Bao

gồm các gen điều hòa chi phối yếu tố bám dính kết tập aggR, protein tiết aap, độc tố astA….EAEC Khi gây bệnh trên người gồm 3 bước [50]:

- EAEC xâm nhập lên bề mặt tế bào biểu mô ruột bằng yếu tố AAF

- EAEC tăng tiết chất nhày tạo màng nhày, dày của vi khuẩn trên bề mặt tếbào biểu mô

- EAEC tiết độc tố lên bề mặt niêm mạc ruột

EAEC làm nhung mao ruột ngắn dần do hoại tử, chảy máu do vậy bệnhnhân đi ngoài phân thường có máu [14], có đáp ứng viêm nhẹ với sự tăng sinhbạch cầu đơn nhân Quan sát dưới kính hiển vi điện tử không có sự bám dính

và xâm nhập như EPEC

Giả thiết về gen độc lực của EAEC và các yếu tố độc lực [17], [51]

Gen điều hòa

aggR Kiểm soát hoạt động của 1 nhóm gen độc lực nằm trên

plasmid: gen mã hóa yếu tố AAF (AAF/I và AAF/II),protein phân tán và 1 cụm gen lớn chèn vào locus PheU

Fimbriae

aggA

aafA

agg3

Mã hóa AAF/I và sự kết dính của hồng cầu

Mã hóa AAF/II (yếu tố bám dính vào tế bào tiết nhày)

Mã hóa AAF/III

Enterotoxins

astA

pet

Mã hóa độc tố chịu nhiệt, tương tự độc tố STa

Mã hóa enterotoxin và cytotoxin

Mã hóa protein phân tán

Mã hóa cho serine protease autotransporter protein

DAEC lần đầu được phát hiện khi xác định được các chủng E.coli bám

dính vào tế bào HEp-2 nhưng không phải EPEC Tuy nhiên, sự hiểu biết vềDAEC chưa nhiều Một số nghiên cứu chứng minh DAEC là căn nguyên gâytiêu chảy [44], [13] DAEC được phát hiện dựa trên đặc điểm bám dính

(Diffuse adherence: DA) khi nuôi cấy trên tế bào HEp-2 và tế bào HeLa Cácchủng DAEC có yếu tố bám dính vỏ (Afimbrial adhesive sheaths: Afas), yếu

tố này được mã hóa bởi gen afa bao gồm các gen: afaA, afaB, afaC, afaD, afaE [38].

Phương pháp điện di trong trường xung điện (PFGE: pulse field gel electrophoresis)

Phương pháp này được Schwartz và Cantor giới thiệu lần đầu tiên năm

1984, nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng enzym giới hạn để cắtphân tử ADN của vi khuẩn tại những vị trí đặc hiệu, tạo ra mẫu ADN đặctrưng, gồm các đoạn ADN có kích thước lớn khoảng 10 - 500 kb và đượcphân tách rời nhau sau khi điện di trên trường điện thay đổi Kết quả phân tíchthể hiện bởi các band khác nhau trên thạch điện di, những chủng có chungnguồn gốc sẽ cho các mẫu ADN giới hạn với tất cả số band giống hệt nhau,những chủng có liên quan với nhau, hay có thể liên quan với nhau sẽ khácnhau 2-3 band hay 4-6 band, những chủng hoàn toàn không có liên quan vớinhau khi khác nhau trên 6 band [20], [23]

Các bước cho phương pháp này:

- Chuẩn bị ADN cho PFGE

- Xử lý ADN với enzyme giới hạn loại có ít điểm cắt

- Tách trong trường xung điện

Dựa vào phương pháp PFGE có thể xác định được nguồn dịch, xác địnhcác yếu tố dịch tễ học trong điều tra dịch, nhanh chóng xác định nguồn dịch

Phương pháp phân tích trình tự lặp của locus đa hình (MLVA: locus variable-number tandem repeat analysis)

Multiple-Dựa trình tự các đoạn lặp của locus, xác định sự khác nhau của cáclocus đa hình Các bước phản ứng:

- Tách chiết ADN từ các mẫu thử nghiệm

- PCR để nhân đoạn có tính chất đa hình với các mồi đặc hiệu

- Điện di phân tích độ dài của các sản phẩm PCR thu được đối từnglocus đa hình

- Phân tích thống kê dựa tần số xuất hiện các trình tự lặp để tính đượcxác suất chính xác [12], [9]

PHẦN II ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đối tượng

- Trẻ dưới 60 tháng tuổi bị tiêu chảy (theo định nghĩa WHO) đến khám

và điều trị tại Bệnh viện nhi Trung ương, bệnh viện Saintpaul, bệnh viện đakhoa Ba Vì

Mỗi bệnh nhân được lấy 1 mẫu phân ngay khi bệnh nhân mới đến viện.Các yếu tố liên quan đến tình trạng bệnh của trẻ, được khai thác quabảng câu hỏi

- Trẻ dưới 60 tháng tuổi không bị tiêu chảy (thời gian trên 2 tuần tínhđến thời điểm lấy mẫu) tại một số điểm tiêm chủng, nhà trẻ, mẫu giáo trên địabàn Hà Nội

Địa điểm nghiên cứu

Bệnh viện nhi Trung ương

Bệnh viện Saintpaul

Bệnh viện đa khoa Ba Vì

Một số trạm xá, nhà trẻ, mẫu giáo của một số xã, phường trên địa bàn

Hà Nội

Thời gian nghiên cứu

Từ 2011- 2014

2.2 Vật liệu

2.2.1 Vật liệu cho vận chuyển, nuôi cấy và xác định vi khuẩn

- Môi trường sinh phẩm:

Môi trường vận chuyển Cary-Blair

Môi trường nuôi cấy: Mac-Conkey, XLD, SMAC

Test sinh vật hóa học: KIA, thạch mềm, Ure-Indol, Citrat-simmon

Môi trường giữ chủng BHI 30% (Broth Heart Infusion)

- Các chứng cho nghiên cứu [53], [37]

- Tiêu chuẩn xác định loại E.coli gây tiêu chảy [53]

EPEC có gen bfpA và eaeA

ETEC có gen eltB và/hoặc estA

EHEC có gen vt1 và/hoặc vt2

có gen eaeA chẩn đoán EHEC điển hình

EIEC có gen ial

EAEC có gen pCVD

DAEC có gen afaBC

Dung dịch đệm PBS 10X

- Hóa chất sinh phẩm cho phản ứng PCR

Taq PCR master mix (QIAamp – Đức)

100bp ADN Ladder (invitrogen)

Đệm TBE 10X (UtraPure™ 10X TBE)

Thạch điện di (MBI Fermentas- Đức)

Nước tinh sạch

Máy móc, dụng cụ

Máy khuếch đại gen (MyCycler- Bio-Rad).

Máy điện di power-pac 300 (Bio-Rad)

Máy ly tâm (Eppendorf Centrifuge 5415R– Đức).

Máy ủ nhiệt (Thermomixer comfort)

Máy votex (Fisher Brand)

Máy chụp gel (Bio-Rad)

Đầu côn các loại

2.3 Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả có phân tích

n= − × × −

Trong đó:

n: cỡ mẫu

Z: hệ số tin cậy

α: độ tin cậy (α =95% thì Z=1,96)

d: giá trị tương đối ( chọn d = 0,05)

p: tỷ lệ nghiên cứu tính từ một nghiên cứu khác

Lấy p = 0,25 [3], tính được cỡ mẫu n = 289 Làm tròn cỡ mẫu n=290.Với 290 trẻ mỗi nhóm, dự kiến chia 2 nhóm:

Từ 0 đến 24 tháng: 145 trẻ

Từ 25 đến 60 tháng: 145 trẻ

2.3.2 Kỹ thuật nghiên cứu

- Phương pháp thu thập mẫu phân từ bệnh nhân

- Phương pháp xác định E.coli từ phân của bệnh nhân tiêu chảy

+ Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn + Phương pháp xác định vi khuẩn bằng tính chất sinh vật hóa học

- Phương pháp PCR xác định từng loại E.coli gây tiêu chảy

+ Phương pháp tách chiết ADN của E.coli

+ Xác định các loại DEC bằng PCR đa mồi

- Phương pháp điện trường xung (PFGE: pulse field gelelectrophoresis) và MLVA (multiple-locus variable-number tandem repeatanalysis) để so sánh các gien độc lực của các chủng DEC giữa trẻ tiêu chảy

và không tiêu chảy

So sánh gen độc lực của DEC giữa trẻ tiêu chảy và không tiêu chảy