Nồng độ fructose trong tinhdịch bình thường khẳng định chức năng của đường dẫn tinh, túi tinh bìnhthường, không gặp trường hợp tắc nghẽn [3].. Chính vì lý do này, phươngpháp định lượng f
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
BÙI BÍCH MAI
NGHIÊN CỨU BỘ XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG
FRUCTOSE VÀ KẼM TRONG TINH DỊCH
ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN VÔ SINH NAM TẠI BỆNH VIỆN ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI TỪ NĂM 2017- 2018
ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
HÀ NỘI - 2017
Trang 3BÙI BÍCH MAI
NGHIÊN CỨU BỘ XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG
FRUCTOSE VÀ KẼM TRONG TINH DỊCH
ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN VÔ SINH NAM TẠI BỆNH VIỆN ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI TỪ NĂM 2017- 2018
Chuyên ngành : Y sinh học- Di truyền
ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
TS Nguyễn Thị Trang PGS.TS Hoàng Thị Ngọc Lan
HÀ NỘI - 2017
Trang 4MỤC LỤC
Trang 5DANH MỤC BẢNG
Trang 6DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Trang 7DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Sơ đồ quá trình chuyển hóa của fructose
Hình 1.2 Sơ đồ tóm tắt vai trò của kẽm đối với các quá trình sống trong
cơ thể
Trang 8ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển của xã hội và nhận thức của người dân về bệnh tậtngày càng được nâng cao thì việc chăm sóc sức khỏe sinh sản đang dần đượcquan tâm nhiều hơn khi tỉ lệ vô sinh và hiếm muộn của các cặp vợ chồngngày càng tăng Theo tổ chức Y tế Thế giới, 10 - 15% các cặp vợ chồng trong
độ tuổi sinh sản bị vô sinh, trong đó 40% do nữ giới, 30 - 40% do nam giới,10% do cả nam và nữ, còn lại 10% không rõ nguyên nhân [1] Trong khi vôsinh nữ đã được biết đến và nghiên cứu từ lâu thì gần đây, vô sinh nam mơíđược chú trọng nhiều Đã có nhiều phương pháp ra đời đề phục vụ cho việcchẩn đoán và điều trị vô nam như siêu âm tinh hoàn, mổ thăm dò tinh hoàn, các xét nghiệm về gen, nhiễm sắc thể, và gần đây các xét nghiệm hóa sinhtinh dịch đã được áp dụng để đánh giá chức năng sinh sản nam giới Fructose
và kẽm là hai chất có vai trò quan trọng đối với sức khỏe nam giới và có thểđịnh lượng bằng phương pháp hóa sinh Theo WHO năm 2010, nồng độfructose trong tinh dịch thấp là đặc trưng cho tình trạng tắc nghẽn ống dẫntinh (bất sản ống dẫn tinh, bất sản túi tinh,…) [2] Nồng độ fructose trong tinhdịch bình thường khẳng định chức năng của đường dẫn tinh, túi tinh bìnhthường, không gặp trường hợp tắc nghẽn [3] Chính vì lý do này, phươngpháp định lượng fructose trong tinh dịch được khuyến cáo cho các bác sĩ lâmsàng xác định bệnh nhân có tinh trùng hay không mà không cần sử dụng đếnbiện pháp xâm lấn
Bên cạnh chỉ số của fructose thì kẽm cũng đóng vai trò quan trọng đốivới tinh trùng Nồng độ của kẽm có liên quan đến số lượng, độ di động vàhình thái của tinh trùng; cải thiện nồng độ testosterone trong máu và cải thiệnkhả năng tình dục [4] Vì vậy định lượng nồng độ kẽm trong tinh dịch cũngcần thiết trong xét nghiệm thường quy để bổ sung cho xét nghiệm tinh dịch đồ
Trang 9thông thường, giúp bác sĩ lâm sàng đưa ra những lời khuyên trong chế độ ănuống để có thể làm tăng số lượng và chất lượng tinh trùng và tăng khả năngthụ thai.
Ở Việt Nam, xét nghiệm định lượng fructose và kẽm trong tinh dịch cònchưa được phổ biến và hóa chất xét nghiệm phải nhập từ nước ngoài với giáthành cao Xuất phát từ những vấn đề thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu bộ xét nghiệm định lượng fructose và kẽm trong tinh dịch ứng dụng trong chẩn đoán vô sinh nam tại Bệnh viện Đại học Y Hà Nội từ năm 2017- 2018”, với 3 mục tiêu sau:
1 Xây dựng quy trình xét nghiệm định lượng fructose và kẽm trong tinh dịch.
2 So sánh kết quả định lượng fructose và kẽm trong tinh dịch bằng bộ xét nghiệm tự pha với bộ kit thương mại.
3 Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ xét nghiệm.
Trang 10CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Khái niệm, phân loại và nguyên nhân vô sinh nam
1.1.1 Khái niệm vô sinh, vô sinh nam và phân loại vô sinh nam
Theo WHO, vô sinh là tình trạng một cặp vợ chồng có quan hệ tìnhdục đều đặn mà không sử dụng biện pháp tránh thai nào mà sau ít nhất 12tháng không thể có thai (loại trừ các trường hợp đang cho con bú hoặc mấtkinh hậu sản) [2]
Vô sinh nam giới là trường hợp nguyên nhân vô sinh từ nam giới, dongười nam giới có chức năng sinh sản không được đảm bảo được như ngườibình thường, cần có sự can thiệp của y tế
Dựa vào kết quả tinh dịch đồ, vô sinh nam được chia thành 2 nhóm như sau:
- Nhóm không có tinh trùng gồm: vô tinh và thiểu tinh nặng
Khái niệm: Vô tinh hay Azoospermia hay là tình trạng không phát hiện
được tinh trùng nào trên tiêu bản với kính hiển vi độ phóng đại cao cũng nhưsau ly tâm tinh dịch ở ít nhất hai lần xét nghiệm (lần thứ hai cách lần thứ nhất
ít nhất 6 ngày và xa nhất dưới 3 tháng) [2]
Trang 11Phân loại: Nhóm vô tinh (Azoospermia) thường được chia thành 3 nhóm:
- Nhóm vô tinh do rối loạn nội tiết (nguyên nhân trước tinh hoàn)
- Nhóm vô tinh do rối loạn quá trình sinh tinh (tổn thương tại tinh hoàn- suysinh dục tiên phát)
- Nhóm vô tinh do rối loạn vận chuyển tinh trùng ra ngoài (nguyên nhân sautinh hoàn)
Thực tế trên lâm sàng thường phân biệt vô tinh do tắc hoặc vô tinhkhông do tắc
• Thiểu tinh hay oligospermia theo WHO (2010) là tình trạng tinh dịch có mật
độ tinh trùng ít hơn 15 triệu tinh trùng/ml [5]
Mật độ tinh trùng luôn biến động, thiểu tinh có thể là tạm thời hoặc vĩnhviễn Theo mức độ, thiểu tinh được chia thành 3 nhóm:
- Nhẹ: Mật độ 10 triệu - 20 triệu tinh trùng/ml
- Vừa: Mật độ 5 triệu - 10 triệu tinh trùng/ml
- Nặng: Mật độ < 5 triệu tinh trùng/ml [6]
Nghiên cứu của Nguyễn Xuân Quý ở những bệnh nhân nam vô sinh theotiêu chuẩn WHO (1999) về tinh dịch đồ cho thấy tỉ lệ vô tinh là 10,10% [7].Nghiên cứu của Trần Đức Phấn trên 420 mẫu tinh dịch của người chồng ở cáccặp bệnh nhân vô sinh thì tỉ lệ vô tinh là 10,24% và TT là 16,43% [8] Theo
Lê Hoàng Anh (2012) khảo sát tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn WHO 2010 chothấy tỉ lệ những người bệnh nhân nam vô sinh vô tinh là 6% [9]
Có rất nhiều nguyên nhân gây ra vô sinh nam như các nguyên nhân từtinh trùng, (số lượng, chất lượng), các nguyên nhân khác như bệnh tật baogồm các nguyên nhân di truyền và không do di truyền
Trang 121.1.2 Nguyên nhân vô sinh nam
1.1.2.1 Nguyên nhân không do di truyền
Các yếu tố gây rối loạn nội tiết hay ảnh hưởng đến quá trình sinh tinh,cương dương, phóng tinh đều ảnh hưởng đến quá trình sinh tinh
• Bệnh tật:
Các bệnh ảnh hưởng vùng dưới đồi, vùng tuyến yên như phẫu thuậtvùng tuyến yên, tia xạ, nhồi máu (hội chứng Sheehan, đột quỵ tuyến yên),bệnh tự miễn, chấn thương sọ não, dị dạng như hội chứng hố yên rỗng, thiểusản tuyến yên, và các nhiễm khuẩn hệ thần kinh: apxe, viêm màng não, viêmnão, lao
Giãn tĩnh mạch thừng tinh (Variocele): Là hiện tượng dòng máu tĩnhmạch thừng tinh bị nghẽn tắc làm tăng nhiệt độ gây giảm số lượng và giảmchất lượng tinh trùng
Lỗ đái lệch thấp (Hypospadias) là một rối loạn trong đó niệu đạo sẽ mở
ra trên mặt dưới của dương vật chứ không phải đầu dương vật, khiến tinhtrùng xuất ra khó đi vào lỗ cổ tử cung
Nhiễm trùng: một số bệnh nhiễm trùng như quai bị có thể gây viêm teotinh hoàn, sốt trên 38,5o C có thể ức chế quá trình sinh tinh trong thời gian 6tháng (WHO, 1987) [10] Viêm tuyến tiền liệt, viêm ống dẫn tinh, viêm niệuđạo, viêm bao quy đầu, viêm mào tinh hoàn, phẫu thuật, chấn thương có thểgây ra sẹo ngăn chặn quá trình xuất tinh
• Sử dụng một số thuốc điều trị bệnh nội khoa như: nội tiết tố (corticoid,androgens), cimetidin, sulphasalazine, spironolactone, nitrofurantoin,niridazone, colchichine… đều trực tiếp hoặc gián tiếp ảnh hưởng đếnquá trình sinh tinh
• Các nguyên nhân khác: một số bệnh toàn thân ảnh hưởng đến nội tiếtnhư bệnh ác tính, tim mạch, đái tháo đường, suy gan, suy thận… tiếp xúcvới hoá chất hay bức xạ, hút thuốc lá, nghiện các chất như: ma tuý,rượu…, kháng thể kháng tinh trùng, chấn thương tinh hoàn, thoát vị bẹn,tinh hoàn lạc chỗ…
Trang 131.1.2.2 Các nguyên nhân do di truyền
• Rối loạn vật chất di truyền ở mức độ tế bào
Một số bất thường di truyền nói chung và bất thường NST nói riêng gâysuy giảm quá trình sinh tinh, hậu quả là làm suy giảm khả năng sinh sản củanam giới Theo các tài liệu công bố trên thế giới, ở các bệnh nhân nam vôsinh, tỉ lệ bất thường NST thường cao gấp 6 lần và bất thường NST giới tínhcao gấp 15 lần so với cộng đồng [11]
- Bất thường NST giới tính
Hội chứng Klinefelter: Hầu hết các nghiên cứu chỉ ra rằng các trườnghợp bất thường NST giới tính như hội chứng Klinefelter (47,XXY, 48,XXXY)hay rối loạn cấu trúc NST giới tính có thể gây tình trạng vô tinh [12], [13].Theo Trần Quán Anh (2002), hội chứng Klinefelter (47,XXY) chiếm 1% cácthể vô sinh, 13 - 20% các trường hợp vô tinh [13]
Hội chứng nam 47,XYY có tỉ lệ 1/1000 trẻ sơ sinh nam Ở những ngườimắc hội chứng này, cơ thể không có biểu hiện hình thái gì đặc biệt, thườngcao lớn, nội tiết không thay đổi khác thường, nhiều trường hợp tính tình hunghăng, thiếu tự chủ Tuy nhiên, những người nam 47,XYY có thể biểu hiệnsinh dục kém phát triển, tinh hoàn lạc chỗ, lỗ đái lệch thấp
Hội chứng nam 46,XX (Male 46,XX): Hội chứng nam 46,XX là kết quảcủa sự trao đổi chéo không cân giữa nhánh ngắn của NST X và NST Y, dẫnđến sự chuyển vị vật liệu di truyền của NST Y sang NST X, trong đó có genxác định giới tính nam (SRY) Do gen SRY vẫn tồn tại nên kiểu hình vẫn lànam, tuy nhiên không có sự hiện diện của toàn bộ vùng đặc hiệu nam trênNST Y (MSY: Male specific region Y) Do đó, nam 46,XX chắc chắn không
có sự sinh tinh nên một khi làm karyotyp xác định là nam 46,XX thì việcphẫu thuật tìm tinh trùng trong tinh hoàn để hỗ trợ sinh sản là vô ích [14]
Trang 14- Bất thường NST thường
Bên cạnh những bất thường về NST giới tính, những bất thường củaNST thường cũng có thể gây nên tình trạng vô sinh Bất thường NST thườngchiếm tỉ lệ 1 - 2% các trường hợp vô sinh nam Cơ chế do sự mất cân bằngtrong bộ NST gây trở ngại cho việc bắt cặp NST trong quá trình giảm phân,
do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh tinh Thường gặp các dạng đột biến sốlượng NST như hội chứng Down và các loại đột biến cấu trúc NST như mấtđoạn, chuyển đoạn tương hỗ, đảo đoạn quanh tâm và ngoài tâm [15]
Hội chứng Prader Willi: là một rối loạn di truyền hiếm gặp do đột biếnmất đoạn nhánh dài gần tâm NST số 15 vùng băng q12 với biểu hiện béo phì,thiểu năng trí tuệ và suy sinh dục, những người này thường vô sinh
Các rối loạn di truyền khác gây thiếu GnRH hoặc gonadotropin: Những rốiloạn nguyên phát của sự chế tiết và điều hòa của hai hormon sinh dục LH vàFSH từ tuyến yên do đột biến các gen thụ thể LH nằm trên nhánh dài của nhiễmsắc thể số 9 (9q) và FSH nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 2 (2p21)
• Rối loạn vật chất di truyền ở mức độ phân tử
- Mất đoạn nhỏ trên NST Y: Với sự phát triển không ngừng của các kỹ thuật ditruyền, một số tác giả đã chỉ rõ được một số gen liên quan đến quá trình sinhsản, các gen này nằm ở đoạn xa nhánh dài NST Y (Yq11.23), nhóm gen nàyđược gọi là DAZ (Deletion In Azoospermia) Khi phân tích DNA của nhữngngười nam vô sinh thấy có 8% trường hợp có mất đoạn ở nơi có các genDAZ, những người bình thường về tinh dịch không có các bất thường này[16] Các nhà khoa học đã phát hiện mối liên quan chặt chẽ giữa không cótinh trùng hoặc thiểu tinh với sự mất đoạn nhỏ xảy ra trên nhánh dài NST Y(Yq) là vùng AZF (azoospermic factor) Bốn vùng AZF lần lượt là AZFa,AZFb, AZFc, AZFd [17] Cụ thể:
Trang 15+ Đoạn AZFa: mất hoàn toàn đoạn AZFa dẫn đến hội chứng chỉ có tế bàosertoli (SCOs) và không có tinh trùng [18] do đó, mất hoàn toàn đoạn AZFakhông thể lấy được tinh trùng từ tinh hoàn để làm kỹ thuật ICSI [19];
+ Đoạn AZFb: chứa nhiều gen mã hóa cho các protein tham gia vào quá trìnhtạo tinh [20] Mất hoàn toàn đoạn AZFb làm ngừng trưởng thành của tinhtrùng ở giai đoạn tinh bào I, do đó không thấy tinh trùng trong tinh dịch vàkhông thể lấy được tinh trùng từ tinh hoàn để làm kỹ thuật ICSI [18], [21].+ Đoạn AZFc: có chứa nhiều họ gen ảnh hưởng tới sinh tinh, mất đoạn AZFc
có thể tìm thấy ở những nam giới không có tinh trùng hoặc ít tinh trùng Ởnhững nam giới không có tinh trùng do mất đoạn AZFc thì khoảng 70% vẫn
có cơ hội để tìm thấy tinh trùng bằng kỹ thuật TESE và có thể sinh con bằngphương pháp ICSI [22], [23]
+ Đoạn AZFd: Mất đoạn AZFd có thể gây ra thiểu tinh vừa hoặc nặng vàthường có bất thường về hình thái tinh trùng [24]
- Xơ nang (Cystic Fibrosis) là một bệnh do đột biến gen CFTR trên nhánh dài
NST số 7 gây nên Đây là bệnh di truyền lặn, phổ biến nhất ở người da trắngvới tỷ lệ 1/25 [25] Gen CFTR mã hóa cho protein ở màng tế bào thực hiệnchức năng như những kênh dẫn truyền ion qua màng tế bào và có ảnh hưởngđến sự hình thành ống phóng tính, túi tinh, ống dẫn tinh và 2/3 ngoài mào tinh.Ngoài ra, protein CFTR cũng tham gia vào vận chuyển điện tử và nước quabiểu mô mào tinh hoàn để giúp tạo môi trường cho tinh trùng trưởng thành Do
đó, đột biến gen CFTR có thể gây vô sinh nam không chỉ do tắc nghẽn đườngxuất tinh mà còn do sự thiếu trưởng thành của tinh trùng [25]
- Hội chứng Kallmann: gen LAL - 1 nằm trên nhánh ngắn NST X bị đột biến
dẫn đến sự thiếu hụt LH, FSH, gây giảm sản xuất tinh trùng, suy chức năngtuyến sinh dục, giảm sự sinh tinh tại tinh hoàn Những bệnh nhân này biểuhiện mất khứu giác và suy sinh dục do suy hạ đồi
- Hội chứng kháng Androgen:gen AR (gen thụ thể của androgen)
nằm trên nhánh dài của NST X bị đột biến dẫn đến mất một
Trang 16phần hoặc hoàn toàn thụ thể androgen Người đột biến khángandrogen hoàn toàn có kiểu hình nữ, bộ NST 46,XY, tinh hoànnằm trong ổ bụng hay trong ống bẹn sâu, không có tử cung,buồng trứng, âm đạo, hoặc âm đạo cụt, vô sinh.
1.1.2.3 Nguyên nhân vô sinh nam có số lượng tinh trùng bình thường
Bên cạnh số lượng, chất lượng tinh trùng cũng như tinh dịch ảnh hưởngđáng kể đến khả năng sinh sản ở nam giới Một tỉ lệ không nhỏ nam giới cómật độ tinh trùng bình thường, vẫn gặp khó khăn trong việc có con
* Nguyên nhân từ plasma tinh
Plasma tinh có thành phần rất phức tạp, gồm nhiều hợp chất hữu cơ và
vô cơ như: nước, muối, fructose, kẽm, acid citric và một số chất khác [26]
Sự mất cân bằng hay thiếu hụt các thành phần trong plasma tinh cũng ảnhhưởng đến chất lượng tinh trùngvà độdi động của tinh trùng mặc dù số lượngtinh trùng vẫn bình thường
* Nguyên nhân từ tinh trùng
Hình thái tinh trùng: Nguyễn Xuân Bái (2002) tiến hành nghiên cứu tinhdịch của 1000 cặp vợ chồng vô sinhtại bộ môn Mô Phôi, trường Đại học Y
Hà Nội Kết quả cho thấy tỉ lệ có tinh dịch đồ bất thường chiếm 60% Bấtthường về độ di động tinh trùng chiếm tỉ lệ cao nhất 28,7%, tiếp đến là mật
độ tinh trùng 25,4%, hình thái tinh trùng 19,6% [27]
DNA của tinh trùng: sự đứt gãy DNA trong đầu của tinh trùng gây ramột tỉ lệ không nhỏ các trường hợp vô sinh Người ta ước tính rằng khoảng25% bệnh nhân nam vô sinh có mức độ đứt gãy DNA tinh trùng cao Khoảng10% số bệnh nhân điều trị vô sinh có tinh dịch đồ bình thường, nhưng cómức độ đứt gãy DNA cao Chỉ số đánh giá mức độ đứt gãy của DNA tinhtrùng - DNA Fragmentation Index (DFI) càng lớn thì mức độ đứt gãy DNAcàng cao
Trang 171.2 Các phương pháp chẩn đoán vô sinh nam hiện nay tại Việt Nam và trên thế giới [8],[10],[27]
1.2.1 Thăm khám lâm sàng
Đã từ lâu, phương pháp thăm khám lâm sàng đã được áp dụng để tìmnhững nguyên nhân thực thể có thể dẫn đến vô sinh nam Khi thăm khám lâmsàng, cần:
- Chú ý đặc biệt đến các biểu hiện của nhược năng sinh dục: Các đặc tính sinhdục phụ thứ phát không phát triển, sự phân bố lông kiểu nam giảm (nách, cơthể, mặt và mu), các tỷ lệ xương dạng của người bị hoạn (sải tay lớn hơnchiều cao 5cm, tỷ lệ thân trên và thân dưới < 1), chứng vú to nam giới
- Nên đánh giá cẩn thận các thành phần của bìu: chú ý tới kích thước tinh hoàn(kích thước tinh hoàn bình thường khoảng 4,5 x 2,5cm, thể tích 18ml), tìnhtrạng tinh hoàn có viêm không, ứ nước mào tinh hoàn không tìm kiếm giãntĩnh mạch thừng tinh trong tư thế đứng và đánh giá bằng nghiệm phápValsalva, sờ ống tinh, mào tinh hoàn và tuyến tiền liệt
1.2.2 Các kĩ thuật chẩn đoán nguyên nhân vô sinh nam
- Xét nghiệm nội tiết (FSH, LH, E2, testosterone, prolactin): chẩn đoáncác rối loạn về nội tiết
- Xét nghiệm miễn dịch: tìm kháng thể kháng tinh trùng trong huyếtthanh hay tinh dịch chồng; tìm kháng thể kháng tinh trùng trong huyết thanhhay chất nhầy cổ tử cung của vợ
- Siêu âm bẹn bìu: chú ý cấu trúc tinh hoàn, mào tinh, giãn tĩnh mạchthừng tinh, ống dẫn tinh…
- Siêu âm đầu dò trực tràng: chẩn đoán tắc đường dẫn tinh, bất thường cấutrúc hệ thống ống dẫn tinh, túi tinh, ống phóng tinh, cấu trúc tuyến tiền liệt…
- Chọc hút mào tinh hoàn qua da (PESA) hoặc chọc hút tinh hoàn qua da(TESA)
- Sinh thiết tinh hoàn: khảo sát quá trình sinh tinh tại tinh hoàn và cácbệnh lý tại tinh hoàn
Trang 18- Mổ thám sát bìu: khảo sát đường dẫn tinh và cấu trúc của tinh hoàn,mào tinh…
- Xét nghiệm di truyền học: Nhiễm sắc thể đồ, xét nghiệm phân tử nhưxét nghiệm các gen trên NST Y (gen AZF a,b,c,d), đột biến gen CF, xétnghiệm để phát hiện đứt gãy DNA của đầu tinh trùng bằng kit Halosperm,phát hiện các bệnh lý di truyền có liên quan đến vô sinh
- Các xét nghiệm đánh giá chức năng tinh trùng và tương tác giữa tinhtrùng với chất nhầy cổ tử cung
Ngoài những xét nghiệm về gen và nhiễm sắc thể tiến hành với quy trìnhphức tạp và giá thành cao thì bên cạnh đó, ở một số cơ sở như Trung tâm Tưvấn Di truyền- Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, Bệnh viện Việt Đức đã tiến hànhphương pháp định lượng fructose và kẽm trong tinh dịch bằng phương pháphóa sinh (dễ thực hiện và chi phí thấp) góp phần chẩn đoán nguyên nhân vôsinh ở nam giới
1.3 Phương pháp định lượng fructose và kẽm trong tinh dịch bằng phương pháp so màu
1.3.1 Vai trò của frutose và kẽm trong tinh dịch
• Vai trò của nồng độ fructose trong tinh dịch đối với tỉ lệ sống và độ di độngcủa tinh trùng rất quan trọng Năng lượng từ fructose là cơ sở dinh dưỡng chủ
Trang 19yếu cho tinh trùng, đảm bảo sự sản sinh, phát triển từ đó ảnh hưởng đến tỉ lệsống và khả năng di động của tinh trùng Hoạt lực của tinh trùng liên quanchặt chẽ đến nồng độ fructose trong tinh dịch [31] Độ di động của tinh trùng
đã được chứng minh có mối tương quan tỉ lệ nghịch với nồng độ fructose[32]
Hình 1.1 Sơ đồ quá trình chuyển hóa của fructose
• Được hình thành trong túi tinh và bài tiết qua các ống dẫn tinh nên fructoseđược coi là chất sinh hóa phản ánh trung thực chức năng của các thành phần này.Fructose trong tinh dịch cũng phản ánh tình trạng của tuyến tiền liệt nhưng vaitrò không rõ nét như kẽm, acid citric và photphatase acid [33]
Nồng độ fructose trong tinh dịch bình thường khẳng định vai trò của cáctestosterone và chức năng của túi tinh, ống dẫn tinh bình thường, không gặphiện tượng tắc nghẽn [34]
Theo WHO 2010, fructose trong tinh dịch thấp là đặc trưng của tìnhtrạng tắc nghẽn hệ thống ống dẫn tinh gặp trong bất sản ống dẫn tinh, bất sảntúi tinh, thiếu hụt androgen hay xuất tinh ngược dòng [35], [36]
• Do sự bài tiết của fructose trong túi tinh chịu sự ảnh hưởng của testosteronenên nồng độ fructose trong tinh dịch còn phản ánh hoạt động của testosterone
Trang 20trong huyết thanh [35] 71% bệnh nhân có nồng độ testosterone trong huyếtthanh thấp, có kèm theo nồng độ fructose hiệu chỉnh (true corrected seminalfructose = log (mật độ tinh trùng) x nồng độ fructose) trong tinh dịch thấp[37].
• Ngoài ra, tương quan giữa fructose trong tinh dịch với hình thái tinh trùngcũng được nhiều nghiên cứu quan tâm Schoenfeld và cộng sự (1979) nghiêncứu về mối tương quan nghịch giữa nồng độ fructose và bất thường ở đuôitinh trùng tiếp tục chứng minh sự cần thiết của fructose như một nguồn nănglượng cho sự vận động có hiệu quả của tinh trùng [38] Fructose cũng có mốitương quan nghịch với bất thường đầu tinh trùng, điều này cho thấy rằngfructose trong tinh dịch còn có chức năng duy trì hoạt động của acrosome vàchromatin nhân [40]
Kẽm:
- Đối với nam giới, việc cơ thể thiếu kẽm sẽ làm giảm ham muốn, đồng thờigiảm số lượng tinh trùng Kẽm đóng vai trò rất quan trọng để xác định chấtlượng tinh trùng ở nam giới Một nghiên cứu được công bố trên tạp chí sinhsản và vô sinh cho thấy nồng độ kẽm thấp gây ảnh hưởng chất lượng tinhtrùng, điều này không tốt cho những cặp vợ chồng hiếm muộn [40] Mộtnghiên cứu khác cho thấy người đàn ông sử dụng thuốc bổ sung kẽm sẽ cónhững cải tiến cả trong số lượng và chất lượng tinh trùng, các yếu tố này cóthể đóng một vai trò đáng kể trong khả năng sinh sản [41]
- Kẽm đóng một vai trò quan trọng đối với sức khỏe của tuyến tiền liệt Hàmlượng kẽm trong cơ thể nam giới nếu ở mức thấp sẽ làm tăng nguy cơ mắcbệnh ung thư tuyến tiền liệt Phần lớn những căn bệnh về tuyến tiền liệt ởmức ác tính đều có nguyên nhân do hàm lượng kẽm thấp [38], [39] Ngoài ra,kẽm là một trong những nguyên tố cơ bản, nó chịu trách nhiệm trong hoạtđộng của gen chứa thông tin ở các tế bào Kẽm có khả năng làm tăng sự sản
Trang 21xuất hormone testosterone, giúp nâng cao khả năng ham muốn của nam giới[40], [41].
Hình 1.2 Sơ đồ tóm tắt vai trò của kẽm đối với các quá trình sống trong cơ
thể
1.3.2 Các phương pháp định lượng fructose và kẽm hiện nay[27] [33]
Fructose:
Phương pháp enzym
Nguyên lí hoạt động: Gồm sorbitol dehydrogenase và sự oxi hóa đồng
thời của NADH Quá trình oxi hóa NADH tỉ lệ thuận với nồng độ fructosetrong tinh dịch Nghiên cứu này khảo sát mật độ quang ở mức sóng là 340 nmtại 2 thời điểm 3 phút và 23 phút thì xác định được nồng độ fructose thôngqua mức chênh lệch mật độ quang
Trang 22Ưu điểm: Khi so sánh với phương pháp Resorcinol thì phương pháp
enzyme có hệ số tương quan lên đến 0,96 với độ tin cậy 95%
Nhược điểm: Phương pháp khá phức tạp và giá thành cao.
Phương pháp so màu
Nguyên lí hoạt động: tinh dịch có chứa fructose trong môi trường acid
mạnh (thường dùng HCL) và được đun nóng sẽ chuyển đổi sang fufurol Chấtnày phản ứng với các chất chỉ thị màu như resorcinol hay indole Sau đó sửdụng phương pháp so màu và đo mật độ quang (OD) để xác định nồng độfructose trong tinh dịch
Một số chất màu khác có thể được sử dụng là tryptamine,aniline, tuynhiên không phổ biến trong phòng thí nghiệm
• Phương pháp so màu bằng indole
Nguyên lí hoạt động:Phương pháp này được Karvonen và Malm mô tả
năm 1955 Fructose trong môi trường acid mạnh và ở nhiệt độ 37°C, phảnứng với indole và làm đổi màu dung dịch thành màu vàng cam Phức chất nàyđược hấp thụ ở bước sóng từ 470-492 nm
Ưu điểm: Quy trình thực hiện đơn giản, cho kết quả nhanh chóng.
Nhược điểm: Không thể đo chính xác khi nồng độ fructose trong tinh
dịch nhỏ hơn 0,5g/l
Giá thành đắt gây khó khăn trong phổ biến xét nghiệm một cách rộng rãi
• Phương pháp resorcinol
Nguyên lí hoạt động: Từ những năm 1934, Roe và cộng sự đã đưa ra
phương pháp đo màu dùng chất chỉ thị là resorcinol để định lượng fructose
trong huyết thanh, vì vậy phương pháp này còn gọi là phương pháp ROE Phương pháp này cũng được Mann mô tả lại trong nghiên cứu năm 1964.
Theo đó, fructose phản ứng trong môi trường acid mạnh tạo ra 5 - hydroxylmethyl furfural, chất này khi gặp chất chỉ thị màu là resorcin tạo thành phức
có màu đỏ tươi Đậm độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ fructose trong tinh dịch
Trang 23Nồng độ fructose trong tinh dịch định lượng theo phương pháp ROE, kết hợptiêu chuẩn WHO và nhiều nghiên cứu trên thế giới đã đưa ra kết luận nồng độfructose được coi là bình thường khi trong khoảng 1,3 - 4,0 g/l.
Ưu điểm: Kĩ thuật, quy trình thực hiện đơn giản, không cần hóa chất,
dụng cụ hay thiết bị gì đặc biệt, phù hợp trong việc dễ dàng phổ biến đại trà,
dễ thực hiện trên số lượng mẫu lớn, độ đặc hiệu của phương pháp cao
Một nghiên cứu năm 2001 sử dụng phương pháp ROE chứng minh đượcnồng độ fructose ảnh hưởng đến chức năng của túi tinh, đồng thời, sự tăngnồng độ fructose trong tinh dịch ảnh hưởng rõ nét đến độ di động của tinhtrùng Do đó, fructose là giá trị hữu dụng trong đánh giá chức năng sinh sảnnam giới
Lu và CS (2007) tiến hành nghiên cứu sự ổn định của nồng độ fructosetrong tinh dịch bằng phương pháp ROE và đo mật độ quang tại bước sóng 490
nm Kết quả cho thấy nồng độ fructose trong tinh dịch duy trì ổn định, không
có sự chênh lệch mang ý nghĩa thống kê tại thời điểm 0, 2, 4, 6 giờ sau li tâmtinh dịch
Nồng độ fructose tinh dịch phản ánh sự khác biệt rõ ràng về tổng số cũngnhư mật độ tinh trùng ở những bệnh nhân vô sinh nam so với những ngườibình thường là kết luận đã được chỉ ra trong một nghiên cứu gần đây
Đây là một phương pháp phổ biến được sử dụng trong nhiều nghiên cứu
về định lượng nồng độ fructose trong tinh dịch do có nhiều ưu điểm: hóa chất,quy trình tiến hành đơn giản, cho kết quả nhanh chóng, dễ thực hiện trên sốlượng mẫu lớn, độ đặc hiệu của phương pháp cao
Kẽm:
Trang 24Hiện tại trên thế giới có 2 phương pháp thường được sử dụng để địnhlượng kẽm trong tinh dịch Đó là định lượng kẽm bằng phương pháp quangphổ hấp thụ và phương pháp so màu 5 - Br - PAPS.
• Phương pháp quang phổ hấp thụ
Mẫu tinh dịch để làm xét nghiệm sẽ được lấy bằng cách thủ dâm vàomột lọ polystyrene sau kiêng quan hệ tình dục trong 3 - 5 ngày Các mẫu này
sẽ được bảo quản ở 37°C trong 30 phút để hoàn tất quá trình hóa lỏng
Tinh dịch sẽ được li tâm với tốc độ 2000 vòng/phút trong 20 phút để thulấy dịch nổi, và được bảo quản ở -20°C cho đến khi được làm xét nghiệm.Kẽm được định lượng bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử sau khi đãđược pha loãng với nước cất Việc đo được tiến hành ở bước sóng 231,8 nm;chiều rộng khe là 0,7 nm Các đường cong chuẩn dao động trong khoảng 10-
40 µg/dl với dung dịch kẽm standard, trong đó tương ứng với nồng độ kẽmtrong huyết tương là 50-200 µg/dl [42], [43]
• Phương pháp so màu
Hàm lượng kẽm trong tinh dịch có thể được định lượng bằng phươngpháp so màu 5-Br-PAPS, dựa vào nguyên lí kẽm phản ứng với phức hợp 5-Br-PAPS tại pH thích hợp sẽ tạo ra phức chất chelate có màu sắc ổn định Độđậm màu của hỗn hợp tỉ lệ thuận với nồng độ kẽm trong tinh dịch Sau đóchúng ta sẽ tiến hành đo mật độ quang học hỗn hợp này, từ đó xác định đượcnồng độ kẽm trong tinh dịch [44], [45]
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Tiêu chuẩn lựa chọn: