Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng nọc rắn Hổ Mèo (Naja siamensis) trên thực nghiệm (FULL TEXT)

ĐẶT VẤN ĐỀ Rắn độc cắn là một bệnh lý nhiệt đới được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp vào nhóm bệnh lý nhiệt đới bị lãng quên [1], [2]. Mỗi năm thế giới có tới 5 triệu người bị rắn cắn, làm chết khoảng từ 20.000 đến 125.000 người [3]. 50% số nạn nhân này thuộc về các quốc gia Châu Á và Châu Phi [4], [5]. Một trong những nguyên nhân quan trọng nhất làm cho số lượng bệnh nhân rắn cắn tử vong tăng là thiếu hoặc không có huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR) để điều trị. Vấn đề này đang ở mức báo động toàn cầu [6], [7]. Việt Nam là nước nông nghiệp nhiệt đới, rất thuận lợi cho các loài rắn độc phát triển, gây nạn cho người. Theo Nguyễn Văn Sáng và cs. (1996), trên phương diện sinh thái học, ở nước ta có khoảng 146 loài rắn, trong đó có 31 loài rắn độc nguy hại cho người (18 loài trên cạn và 13 loài rắn biển) [8]. Trong lĩnh vực y tế cấp cứu điều trị bệnh nhân rắn cắn, nghiên cứu của Trịnh Xuân Kiếm và cs. cho thấy có 2 họ rắn độc (họ rắn hổ và họ rắn lục) có tầm quan trọng y học, với 9 loài chủ yếu, bao gồm: rắn hổ đất, hổ mang, hổ mèo, hổ chúa, cạp nia Bắc, cạp nia Nam, cạp nong, lục xanh và choàm quạp. Các chuyên gia quốc tế ước tính tại Việt Nam mỗi năm có tới 30.000 người bị rắn độc cắn [9]. Về điều trị, HTKNR là thuốc đặc trị cho bệnh nhân bị nhiễm độc nọc rắn [10], [11], [12]. Trước năm 1990, nước ta vẫn chưa sản xuất được bất cứ loại HTKNR để điều trị cho bệnh nhân nhiễm độc rắn độc. Hầu hết bệnh nhân rắn cắn phó thác sinh mạng vào kinh nghiệm chữa rắn độc của thầy lang hoặc đến các cơ sở y tế điều trị không đặc hiệu. Vì vậy, tỷ lệ tử vong của nhóm bệnh nhân rắn cắn nhiễm độc nặng khoảng 19.5% [13]. Đáp ứng yêu cầu thực tế này, từ năm 1990, Bộ Y tế đã cho phép Đơn vị nghiên cứu rắn, Bệnh viện Chợ Rẫy thực hiện loạt đề tài khoa học chế tạo HTKNR. Đến nay, có 07 loại HTKNR, bao gồm HTKNR hổ đất (Naja kaouthia), hổ mang (Naja atra), chàm quạp (Calloselasma rhodostoma), hổ chúa (Ophiophagus hannah), cạp nia Nam (Bungarus candidus), cạp nia Bắc (Bungarus multicinctus) và lục xanh (Cryptelytrops albolabris) đã được sản xuất quy mô phòng thí nghiệm, ứng dụng lâm sàng an toàn và hiệu quả, góp phần quyết định giảm tỷ lệ tử vong từ 19,5% xuống còn khoảng 3,1% [9], [13]. Tuy nhiên, bệnh nhân bị nhiễm độc nọc rắn hổ mèo (RHM) (Naja siamensis) vẫn còn là vấn đề y tế tồn tại. Thực vậy, mỗi năm hàng trăm bệnh nhân bị RHM cắn nhập viện với tỷ lệ tử vong cao vì chưa có HTKNR đặc hiệu loài rắn này. Số bệnh nhân may mắn hồi phục cũng để lại thương tật suốt đời vì hậu quả hoại tử mô, bộ phận cơ thể do nọc RHM rất nặng nề [14], đòi hỏi cần sớm có huyết thanh kháng nọc RHM để điều trị đặc hiệu cho các bệnh nhân RHM cắn góp phần giảm tỷ lệ tử vong và tàn phế do loài rắn độc này gây ra. Từ đó đề tài “Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) trên thực nghiệm” được tiến hành với các mục tiêu: 1. Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) đơn đặc hiệu dạng F(ab’)2 từ ngựa. 2. Đánh giá tính an toàn và hiệu lực của huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo trên thực nghiệm.

LÊ KHẮC QUYẾN

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HUYẾT THANH

KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO (Naja siamensis)

TRÊN THỰC NGHIỆM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2019

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt trong luận án

Danh mục các bảng

Danh mục các biểu đồ

Danh mục các sơ đồ

Danh mục các ảnh

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 RẮN ĐỘC VÀ TAI NẠN RẮN ĐỘC CẮN

1.1.1 Rắn độc và tai nạn rắn độc cắn trên thế giới

1.1.2 Rắn độc và tai nạn rắn độc cắn tại Việt Nam

Tỉ lệ tử vong do rắn độc cắn tại Trung tâm cấp cứu Sài Gòn trong năm 1979-1980 là 20% Tử vong do rắn độc cắn tại Bệnh viện Chợ Rẫy giai đoạn 1985-1990 khi chưa có HTKNR đặc hiệu là 19.5% Tỉ lệ này giảm rất đáng kể từ 19,5% xuống 3.1% khi có HTKNR điều trị đặc hiệu giai đoạn 1990 -1996 [13] Những trường hợp tử vong hiện nay là do rắn hổ mèo, rắn cạp nia Nhiều trường hợp bị RHM cắn để lại hậu quả nặng nề: cắt cụt tay, chân; di chứng co rút sau ghép da ảnh hưởng đến cuộc sống của người lao động Hiện nay, Việt Nam chưa có huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo (HTKNRHM) Trên thực tế tại Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Nhi đồng 1 và Nhi Đồng 2, điều trị bệnh nhân bị nhiễm độc nọc RHM bằng HTKNR hổ đất không cải thiện được triệu chứng nhiễm độc tại chỗ cũng như toàn thân HTKNR hổ đất (Naja kaouthia) không có khả năng trung hoà chéo được nọc RHM (Naja siamensis) trên lâm sàng [14] Do đó, cần nhanh chóng xúc tiến nghiên cứu sản xuất HTKNRHM đặc hiệu để kịp thời cứu người bị nạn

1.2.2 Nhiễm độc nọc rắn trên người

1.3 CẤP CỨU VÀ ĐIỀU TRỊ RẮN ĐỘC CẮN

1.3.1 Cấp cứu đầu tiên

1.3.2 Điều trị không đặc hiệu

1.3.3 Điều trị đặc hiệu

1.4 HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN

1.4.1 Khái niệm và phân loại huyết thanh kháng nọc rắn

1.4.2 Qui trình sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn

1.4.3 Các thử nghiệm đánh giá huyết thanh kháng nọc rắn

1.4.4 Tình hình sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn ở Việt Nam

1.5 RẮN HỔ MÈO

1.5.1 Đặc điểm nhận dạng và phân bố

1.5.2 Nọc rắn hổ mèo

1.5.3 Triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng nhiễm độc nọc rắn hổ mèo

*Nguồn: theo Lê Khắc Quyến và cs (2003)[14]

1.5.4 Điều trị nhiễm độc nọc rắn hổ mèo

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Động vật nghiên cứu

2.1.2 Hóa chất sinh phẩm

2.1.3 Dụng cụ và trang thiết bị nghiên cứu

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

2.2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.3 Các phương pháp kỹ thuật tiến hành

2.4 XỬ LÝ SỐ LIỆU

2.5 ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 CHẾ TẠO HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO

3.1.1 Kết quả chế tạo kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo

3.1.2 Kết quả gây miễn dịch ngựa bằng kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo

3.1.3 Kết quả phân tích kháng thể kháng nọc rắn hổ mèo trong huyết tương ngựa sau mỗi lần gây miễn dịch

3.1.4 Kết quả lấy máu, tách huyết tương và truyền trả khối hồng cầu

3.1.5 Kết quả tinh chế huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo dạng F(ab’)2 từ ngựa

3.1.6 Kiểm định chất lượng huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo F(ab’)2 đơn đặc hiệu tại Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin và sinh phẩm y tế

3.2 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO TRÊN ĐỘNG VẬT

3.2.1 Thử nghiệm xác định liều chết trung bình nọc rắn hổ mèo

Ảnh 3.16 Thử nghiệm xác định liều chết trung bình nọc rắn hổ mèo

3.2.2 Thử nghiệm đánh giá xác định hiệu lực huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo (median effective dose-ED50)

- Tiến hành pha nọc rắn hổ mèo 100μg/ml Nọc RHM dùng là 100

LD50 Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột 0,5ml hỗn hợp (nọc RHM và HKNRHM theo các mức 0,010 – 0,030 – 0,050ml ) đã ủ 60 phút cho bốn lô chuột, mỗi lô có 8 chuột: Lô 4 (lô chứng) ủ nọc RHM với nước muối sinh lý NaCl 0.9% Lô số 1, 2, 3: các mức

kháng nọc rắn hổ mèo 3.2.4 Thử nghiệm đánh giá tính an toàn (Safety test) huyết thanh

kháng nọc rắn hổ mèo 3.2.5 Thử nghiệm đánh giá tính vô khuẩn (Sterility test) huyết thanh

kháng nọc rắn hổ mèo

3.2.6 Thử nghiệm xác định hàm lượng Thimerosal, pH và natri clorid

trong huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo

Các tiêu chí lý hóa HTKNRHM cần xác định Kết quả 94

Tiêu chuẩn Quốc gia

3.2.8 Kết quả điện di miễn dịch huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo

dạng F(ab’)2

Chương 4 BÀN LUẬN 4.1 DỊCH TỄ RẮN HỔ MÈO CẮN, CÁCH TUYỂN CHỌN RẮN

HỔ MÈO LẤY NỌC VÀ THU NHẬN NỌC RẮN HỔ MÈO 4.1.1 Dịch tễ rắn hổ mèo và cách tuyển chọn rắn hổ mèo lấy nọc

ra tính kháng nguyên của độc tố nọc rắn Khi sử dụng khử độcbằng glutaraldehyde, protein sẽ bị phản ứng trùng hợp mức độkhó kiểm soát và không hồi phục được Việc khử độc sẽ làmgiảm đáp ứng tạo kháng thể cũng như kháng thể sẽ trung hoàkém độc tố tự nhiên có trong nọc rắn Do đó, WHO (2010)khuyến cáo không nên khử độc nọc rắn mà nên gây miễn dịchvới liều thấp nhủ tương hoá tốt với tá chất Freund hoàn chỉnh vàkhông hoàn chỉnh [12] Điều này được thực hiện như nghiêncứu của Sapsutthiapas S và cs (2015) trong sản xuất HTKNR

đa giá chống lại rắn lục xanh, rắn choàm quạp và rắn lục Russel[98] Tuy nhiên, nọc RHM có nhiều độc tố như cardiotoxin tácđộng trên hệ tuần hoàn và cytotoxin tác động trên hệ thống cơ

nghiệm Do đó, khi sử dụng nọc thô RHM làm nguyên liệu sảnxuất kháng nguyên để gây miễn dịch thì nguy cơ động vật chủchết Nếu sử dụng liều thấp nọc RHM thô khi gây miễn dịch thìkhả năng đáp ứng kháng thể kém trên động vật chủ nên nguy cơnghiên cứu thất bại Vì vậy, nghiên cứu đã mạnh dạn áp dụngviệc khử độc nọc RHM bằng glutaraldehyte và nhiệt, tạo giảiđộc tố kháng nguyên nọc RHM Kháng nguyên giải độc tố nọcRHM sẽ làm giảm độc lực nọc rắn nhưng có thể sử dụng liềucao để gây miễn dịch Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đãthành công Ngựa đã tạo kháng thể tốt sau gây miễn dịch thángthứ 3 bằng kháng nguyên giải độc tố nọc RHM Tổn thương tạichỗ và toàn thân trên ngựa đã được hạn chế ở mức thấp nhất.Kháng thể tạo ra từ kháng nguyên giải độc tố nọc RHM có hiệulực tốt trên thực nghiệm in vitro và in vivo khi sử dụng nọcRHM thô Qui trình khử độc để tạo giải độc tố trong nghiên cứucủa chúng tôi là kinh điển trong chế tạo vắc xin Nghiên cứu củachúng tôi đã thực hiện tương tự như các nghiên cứu của TrịnhXuân Kiếm và cs (2012) và (1997) [10], [13] 1014.2.2 Lựa chọn động vật gây miễn dịch 1024.2.3 Lựa chọn tá chất phù hợp và kích thích tạo kháng thể 103Hiện nay, các nhà sản xuất HTKNR thường chọn cách gây miễn dịch là

kháng nguyên nọc rắn được chế tạo từ nọc rắn độc toàn phần cólàm giảm độc lực hoặc không làm giảm độc lực trộn với tá chấtFreund hoàn chỉnh và Freund không hoàn chỉnh [61], [64], [98].Một số tác giả khác sử dụng aluminium hydroxide làm tá chấtnhưng kết quả chưa cao [12] Trong nghiên cứu này, chúng tôi

chỉnh trong 3 tháng đầu và tá chất Freund không hoàn chỉnhtrong 6 tháng tiếp theo Bằng việc chế tạo thành công khángnguyên giải độc tố nọc RHM giảm độc lực đảm bảo tiêu chuẩn

vô khuẩn theo hướng dẫn của WHO, sản phẩm này gây miễndịch trên ngựa đã sinh kháng thể tốt làm cơ sở cho việc tinh chếthành công HTKNRHM dạng F(ab’)2 đơn đặc hiệu với hiệu lực

và an toàn theo các tiêu chuẩn Quốc gia yêu cầu [12],[72] 1034.2.4 Lịch trình gây miễn dịch và liều lượng kháng nguyên giải độc tố

105Cùng với việc chế tạo kháng nguyên giải độc tố nọc RHM, việc gây

miễn dịch cho ngựa tạo huyết thanh ngựa có hiệu giá kháng thểđặc hiệu cao làm nguyên liệu cho việc sản xuất HTKNR là khâurất quan trọng Quy trình gây miễn dịch cho động vật phụ thuộcvào độc tính của loại nọc rắn, tính sinh miễn dịch của khángnguyên nọc rắn và khả năng đáp ứng sinh miễn dịch của loàiđộng vật được lựa chọn Liều kháng nguyên được sử dụng tăngdần kích thích tạo kháng thể trên động vật mà không gây chếtđộng vật thí nghiệm [10], [12], [61] Thời gian gây miễn dịch cóthể kéo dài từ 3 đến 15 tháng cho đến khi đạt được nồng độkháng thể cao nhất trong máu của động vật miễn dịch và đócũng là thời điểm để lấy toàn bộ máu của động vật miễn dịch.Nghiên cứu chúng tôi sử dụng lịch trình gây miễn dịch cách mỗitháng như khuyến cáo của WHO Thời gian gây miễn dịch là 9tháng đã cho hiệu giá kháng thể cao 1/64.000 và ổn định sautháng thứ 9 Như vậy, việc tinh chế HTKNRHM đã được tiếnhành sau khi thu hoạch đủ lượng huyết tương ngựa cần thiết 105

HỔ MÈO DẠNG F(ab’)2 109

4.3.1 Lựa chọn huyết thanh kháng nọc đặc hiệu đơn giá trên thực

nghiệm 1094.3.2 Lựa chọn qui trình tinh chế huyết thanh kháng nọc đặc hiệu đơn

giá dạng F(ab’)2 1104.3.3 Qui trình sản xuất công nghiệp 112

4.4 CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN 113

4.4.1 Lựa chọn huyết thanh kháng nọc rắn dạng F(ab’)2 113Huyết thanh kháng nọc rắn phải đạt tiêu chuẩn kiểm định Quốc gia

trước khi cho phép sử dụng trên lâm sàng [12], [72] Các tiêuchí bao gồm an toàn chung, vô khuẩn, chất gây sốt, hiệu lực,xác định nồng độ protein, độ pH, bảo quản, đóng gói và tínhchất vật lý của HTKNR Kết quả kiểm định Quốc gia cả haidạng dung dịch và đông khô của HTKNRHM dạng F(ab’)2 đơnđặc hiệu đều đạt các tiêu chuẩn Quốc gia về sinh phẩm và phùhợp với các khuyến cáo của WHO [12], [72] HTKNRHM dạngF(ab’)2 đơn đặc hiệu của nghiên cứu đạt tiêu chuẩn: an toàncao, hiệu lực mạnh, không có chất gây sốt và vô khuẩn Các tiêuchí về lý hoá đều đảm bảo theo qui định quốc gia Như vậy, quitrình sản xuất HTKNRHM dạng F(ab’)2 đã hoàn chỉnh, phùhợp điều kiện kinh tế và thực tế Việt Nam 1134.4.2 Lựa chọn dạng thành phẩm của huyết thanh kháng nọc rắn dạng

4.6 NHỮNG ĐIỂM HẠN CHẾ CỦA LUẬN ÁN 116 KẾT LUẬN 118 KIẾN NGHỊ 118 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN

CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 120 TÀI LIỆU THAM KHẢO 121 PHỤ LỤC 132

1 CÁC KẾT QUẢ KIỂM ĐỊNH HUYẾT THANH KHÁNG NỌC

RẮN HỔ MÈO TẠI VIỆN KIỂM ĐỊNH QUỐC GIA VỀ

VẮC XIN VÀ SINH PHẨM Y TẾ, BỘ Y TẾ 133 134

135

2 CÁC KẾT QUẢ CẤY TÌM VI KHUẨN VÀ VI NẤM CỦA KHÁNG

NGUYÊN GIẢI ĐỘC TỐ NỌC RẮN HỔ MÈO 136 136

137

138

3 CÁC KẾT QUẢ CẤY TÌM VI KHUẨN VÀ VI NẤM CỦA HUYẾT

THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO DẠNG DUNG DỊCH

VÀ ĐÔNG KHÔ 139 140

141

5 CÁC PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THỬ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ

VẮC XIN VÀ SINH PHẨM THEO TIÊU CHUẨN VIỆT

NAM (DƯỢC ĐIỂN VIỆT NAM 2009) 157

1 ACD Acid citric, citrat natri, dextrose -chất chống đông

ACD

5 aPTT Activated Partial Thromboplastine Time

19 ED50 Median Effective Dose – Liều hiệu lực trung bình

20 ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay – Xét

nghiệm miễn dịch gắn kết men

21 Fab A monovalent immunoglobulin fragment – một

29 HTKN Huyết thanh kháng nọc

31 HTKNRHM Huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo

33 IgY Immunoglobulin Yolk – Kháng thể lòng đỏ trứng

45 OPD O-phenilenediamine - Dung dịch cơ chất

46 PBS-Tween Phosphate Buffer Solution -Tween – Dung dịch

51 SD Standard Deviation - Độ lệch chuẩn

54 WHO World Health Organization – Tổ chức Y tế Thế

giới

Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Đặc điểm lâm sàng phân biệt về 6 loại rắn độc cắn thường

gặp Bảng 2.1 Liều lượng kháng nguyên giải độc tố nọc RHM và các loại tá

chất Freund dùng cho gây miễn dịch Bảng 2.2 Tiêu chuẩn Quốc gia về huyết thanh kháng nọc rắn cần đạt

Bảng 3.1 Kết quả tuyển chọn và lấy nọc rắn hổ mèo Bảng 3.2 Kết quả chuẩn bị kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo

theo lịch trình gây miễn dịch cho ngựa Bảng 3.3 Kết quả cấy vi trùng, vi khuẩn kỵ khí và vi nấm với kháng

nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo Bảng 3.4 Liều lượng kháng nguyên và số mũi tiêm thực tế trong quá

trình gây miễn dịch Bảng 3.5 Bảng theo dõi sức khoẻ ngựa trong quá trình gây miễn dịch

Bảng 3.6 Kết quả hiệu giá kháng thể đặc hiệu kháng nọc rắn hổ mèo

sau gây miễn dịch bằng kỹ thuật ELISA Bảng 3.7 Bảng kết quả lấy máu ngựa tách huyết tương và truyền trả

hồng cầu Bảng 3.8 Kết quả kiểm định chất lượng huyết thanh kháng nọc rắn hổ

mèo Bảng 3.9 Xác định liều gây chết trung bình (LD50) nọc rắn hổ mèo

Bảng 3.11: Kết quả thí nghiệm thăm dò Bảng 3.12: Kết quả xác định chất gây sốt huyết thanh kháng nọc rắn

hổ mèo Bảng 3.13: Kết quả thử nghiệm tính an toàn huyết thanh kháng nọc

rắn hổ mèo trên chuột lang (Lô thí nghiệm) Bảng 3.14: Kết quả thử nghiệm tính an toàn trên chuột lang (Lô

chứng) + Quan sát chuột lang sau khi tiêm HTKNRHM trong 01 tuần: Chuột

lang đều phát triển bình thường, tăng cân, không rụng lông

và không có xuất hiện bất cứ triệu chứng nào của phản ứng muộn của HTKNRHM Bảng 3.15: Kết quả thử nghiệm tính an toàn huyết thanh kháng nọc

rắn hổ mèo trên chuột nhắt trắng (Lô thí nghiệm) Bảng 3.16: Kết quả thử nghiệm tính an toàn trên chuột nhắt trắng (Lô

chứng) + Quan sát chuột nhắt trắng sau khi tiêm HTKNRHM trong 01 tuần

như sau: Bảng 3.17: Kết quả cấy vô khuẩn huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo

Bảng 3.18: Kết quả pH, hàm lượng thimerosal và natri clorid trong

huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo Bảng 3.19 Kết quả điện di miễn dịch huyết thanh kháng nọc rắn hổ

mèo

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1.1 Phân bố bệnh nhân bị các loại rắn độc cắn tại Bệnh viện

Chợ Rẫy từ năm 1990 -1998 (n=1997)

*Nguồn: theo Trịnh Xuân Kiếm và cs (2000)[29] Biểu đồ 1.2 Số lượng bệnh nhân rắn cắn và tử vong tại Trung tâm cấp

cứu Sài Gòn và Bệnh viện Chợ Rẫy từ 1979-1996

*Nguồn: theo Trịnh Xuân Kiếm và cs (1997)[13] Biểu đồ 3.1 Hiệu giá kháng thể sau gây miễn dịch lần 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,

8, 9 của ngựa số1 sau tiêm kháng nguyên giải độc tố nọc rắn

hổ mèo Biểu đồ 3.2 Kết quả định lượng protein huyết thanh kháng nọc rắn hổ

mèo 96

thanh kháng nọc rắn hổ mèo bằng phương pháp ELISA đạt 1/64.000

- HTKNRHM pha loãng thấp nhất dương tính: 0.099 (với độ pha loãng

1/64.000) so với chứng âm+3SD là 0.082 Như vậy hiệu giá kháng thể HTKNRHM tương đương 0.10 của bậc

pha loảng 1/64.000

Tên sơ đồ Trang

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Sơ đồ 2.2 Các bước thu thập nọc rắn, xử lý chế tạo kháng nguyên

2.2.3.3 Gây miễn dịch cho ngựa

Sơ đồ 2.3 Sơ đồ vị trí gây miễn dịch trên ngựa

Sơ đồ 2.4 Lịch trình gây miễn dịch, lấy máu xét nghiệm kiểm tra hiệu giá kháng thể và lấy máu thu hoạch huyết tương ngựa

Sơ đồ 2.5 Sơ đồ kỹ thuật Ouchterlony xác định tính đặc hiệu của kháng thể kháng nọc rắn hổ mèo trong huyết tương ngựa trước và sau gây miễn dịch theo lịch trình qui định đối với kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo (NS antigen) và nọc rắn hổ mèo thô (NS venom)

Sơ đồ 2.6 Sơ đồ kỹ thuật Ouchterlony tìm hiệu giá kháng thể kháng nọc rắn hổ mèo trong huyết tương ngựa chưa gây miễn dịch và đã gây miễn dịch tháng thứ 3

Sơ đồ 2.7 Sơ đồ kỹ thuật Ouchterlony xác định phản ứng chéo huyết tương ngựa chưa gây miễn dịch và huyết tương ngựa đã gây miễn dịch tháng thứ 3 bằng giải độc tố nọc rắn hổ mèo với nọc rắn hổ đất (Naja kaouthia-NK) và nọc rắn choàm quạp (Calloselasma rhodostoma-CR)

Sơ đồ 2.8 Sơ đồ tinh chế và đánh giá huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo

Tên ảnh Trang

Ảnh 1.1 Rắn hổ đất (Naja kaouthia)

Ảnh 1.2 Rắn hổ mang (Naja atra)

Ảnh 1.3 Rắn hổ chúa (Ophiophagus hannah)

Ảnh 1.4 Rắn hổ mèo (Naja siamensis)

Ảnh 1.5 Rắn cạp nia (Bungarus candidus)

Ảnh 1.6 Rắn cạp nong (Bungarus fasciatus)

Ảnh 1.7 Rắn choàm quạp (Calloselasma rhodostoma)

7 Ảnh 1.8 Rắn lục (Cryptelytrops albolabris)

Ảnh 1.9 Rắn sải cổ đỏ (Rhabdophis subminiata)

Ảnh 1.10 Hình ảnh lâm sàng bệnh nhân nhiễm độc nọc rắn hổ mèo

(Naja siamensis) tại chỗ và toàn thân

*Nguồn: Theo Lê Khắc Quyến và cs (2003) [14]

Ảnh 2.1 Ngựa sử dụng cho nghiên cứu chuẩn bị gây miễn dịch

Ảnh 3.1 Rắn hổ mèo (Naja siamensis)

Ảnh 3.3 Kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo thành phẩm

Ảnh 3.4 Kết quả cấy kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo trên môi trường thioglycolat

Ảnh 3.5 Kết quả cấy kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo trên môi trường thạch máu

Ảnh 3.7 Kết quả cấy kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo trên

môi trường Sabouraud Ảnh 3.8 Theo dõi tổn thương tại chỗ (a) và biểu hiện toàn thân (b) của

ngựa sau tiêm kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo Ảnh 3.9 Kết quả xác định kháng thể đặc hiệu sau 3 tháng gây miễn

dịch với nọc rắn hổ mèo và kháng nguyên giải độc tố nọc rắn

hổ mèo bằng kỹ thuật Ouchterlony Ảnh 3.10 Kết quả xác định kháng thể đặc hiệu sau 3 tháng gây miễn

dịch bằng kháng nguyên giải độc tố rắn hổ mèo bằng kỹ thuật Ouchterlony Ảnh 3.11 Thu tủa kháng thể Ảnh 3.12 Thẩm tích bằng màng cellulose acetat loại bỏ ammonium

sulfate Ảnh 3.13 Lọc vô trùng Ảnh 3.14 Đóng lọ sản phẩm huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo dạng

F(ab’)2 Ảnh 3.15 Thành phẩm huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo F(ab’)2 đơn

đặc hiệu Ảnh 3.18 Kết quả thử nghiệm xác định chất gây sốt trong huyết thanh

kháng nọc rắn hổ mèo Ảnh 3.19 Kết quả thử nghiệm tính an toàn huyết thanh kháng nọc rắn

hổ mèo trên chuột lang ngày 1: Lô thí nghiệm (1), Lô chứng (2)

Ảnh 3.21 Kết quả thử nghiệm tính an toàn huyết thanh kháng nọc rắn

hổ mèo trên chuột nhắt ngày thứ 1 và ngày thứ 7 trên Lô thí nghiệm (màu vàng) và Lô chứng (màu xanh) Ảnh 3.22 Kết quả định lượng protein huyết thanh kháng nọc rắn hổ

mèo Ảnh 3.23 Kỹ thuật thực hiện đánh giá hiệu giá kháng thể đặc hiệu

trong huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo bằng phương pháp ELISA

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rắn độc cắn là một bệnh lý nhiệt đới được Tổ chức Y tế Thế giới(WHO) xếp vào nhóm bệnh lý nhiệt đới bị lãng quên [1], [2] Mỗi năm thếgiới có tới 5 triệu người bị rắn cắn, làm chết khoảng từ 20.000 đến 125.000người [3] 50% số nạn nhân này thuộc về các quốc gia Châu Á và Châu Phi[4], [5] Một trong những nguyên nhân quan trọng nhất làm cho số lượngbệnh nhân rắn cắn tử vong tăng là thiếu hoặc không có huyết thanh khángnọc rắn (HTKNR) để điều trị Vấn đề này đang ở mức báo động toàn cầu [6],[7]

Việt Nam là nước nông nghiệp nhiệt đới, rất thuận lợi cho các loài rắnđộc phát triển, gây nạn cho người Theo Nguyễn Văn Sáng và cs (1996), trênphương diện sinh thái học, ở nước ta có khoảng 146 loài rắn, trong đó có 31loài rắn độc nguy hại cho người (18 loài trên cạn và 13 loài rắn biển) [8].Trong lĩnh vực y tế cấp cứu điều trị bệnh nhân rắn cắn, nghiên cứu của TrịnhXuân Kiếm và cs cho thấy có 2 họ rắn độc (họ rắn hổ và họ rắn lục) có tầmquan trọng y học, với 9 loài chủ yếu, bao gồm: rắn hổ đất, hổ mang, hổ mèo,

hổ chúa, cạp nia Bắc, cạp nia Nam, cạp nong, lục xanh và choàm quạp Cácchuyên gia quốc tế ước tính tại Việt Nam mỗi năm có tới 30.000 người bị rắnđộc cắn [9] Về điều trị, HTKNR là thuốc đặc trị cho bệnh nhân bị nhiễm độcnọc rắn [10], [11], [12] Trước năm 1990, nước ta vẫn chưa sản xuất được bất

cứ loại HTKNR để điều trị cho bệnh nhân nhiễm độc rắn độc Hầu hết bệnhnhân rắn cắn phó thác sinh mạng vào kinh nghiệm chữa rắn độc của thầy langhoặc đến các cơ sở y tế điều trị không đặc hiệu Vì vậy, tỷ lệ tử vong củanhóm bệnh nhân rắn cắn nhiễm độc nặng khoảng 19.5% [13]

Đáp ứng yêu cầu thực tế này, từ năm 1990, Bộ Y tế đã cho phép Đơn vịnghiên cứu rắn, Bệnh viện Chợ Rẫy thực hiện loạt đề tài khoa học chế tạo

HTKNR Đến nay, có 07 loại HTKNR, bao gồm HTKNR hổ đất (Naja

kaouthia), hổ mang (Naja atra), chàm quạp (Calloselasma rhodostoma), hổ chúa (Ophiophagus hannah), cạp nia Nam (Bungarus candidus), cạp nia Bắc (Bungarus multicinctus) và lục xanh (Cryptelytrops albolabris) đã được sản

xuất quy mô phòng thí nghiệm, ứng dụng lâm sàng an toàn và hiệu quả, gópphần quyết định giảm tỷ lệ tử vong từ 19,5% xuống còn khoảng 3,1% [9],[13]

Tuy nhiên, bệnh nhân bị nhiễm độc nọc rắn hổ mèo (RHM) (Naja siamensis) vẫn còn là vấn đề y tế tồn tại Thực vậy, mỗi năm hàng trăm bệnh

nhân bị RHM cắn nhập viện với tỷ lệ tử vong cao vì chưa có HTKNR đặchiệu loài rắn này Số bệnh nhân may mắn hồi phục cũng để lại thương tật suốtđời vì hậu quả hoại tử mô, bộ phận cơ thể do nọc RHM rất nặng nề [14], đòihỏi cần sớm có huyết thanh kháng nọc RHM để điều trị đặc hiệu cho cácbệnh nhân RHM cắn góp phần giảm tỷ lệ tử vong và tàn phế do loài rắn độc

này gây ra Từ đó đề tài “Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng nọc rắn

hổ mèo (Naja siamensis) trên thực nghiệm” được tiến hành với các mục

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 RẮN ĐỘC VÀ TAI NẠN RẮN ĐỘC CẮN

1.1.1 Rắn độc và tai nạn rắn độc cắn trên thế giới

Rắn là loài bò sát phân bố khắp nơi trên thế giới ngoại trừ bắc cực Theo

phân loại học, rắn thuộc ngành Dây sống (Chordata), bộ Có vảy (Squamata), lớp Bò sát (Reptile) [8], [15] Theo Halliday T., Adler K (2002) và Mehrtens,

J.M (1987) trong số trên 3.000 loài rắn có mặt trên trái đất thì khoảng 375 loài

là rắn độc và thuộc vào bốn họ: Viperidae, Elapidae, Atractaspididae và Colubridae [16], [17].

Rắn độc cắn là vấn đề y tế và xã hội lớn ở nhiều nước trong các vùngnhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt là ở các nước nghèo và đang phát triển, trong

đó có Việt Nam Theo Swaroop S., Grap B (1954) và Chippaux J.P (1998),hàng năm trên thế giới ước tính có khoảng 5 triệu trường hợp bị rắn cắn, trong

đó có hơn 20.000 -125.000 trường hợp bị chết do rắn độc cắn [3], [18] Hai khuvực có nhiều nạn nhân tử vong do bị rắn cắn nhất là Châu Á và Châu Phi [19],[20], [21] Trong khi đó, khu vực Bắc Mỹ và châu Úc có tỉ lệ tử vong thấp nhất[22], [23] Rắn độc cắn gây nhiễm độc nọc rắn được xem là một bệnh lý cấptính và tại một số nơi lượng bệnh nhân rắn độc cắn chiếm tới 10% số giườngbệnh cấp tính tại bệnh viện và là một trong số các nguyên nhân hàng đầu gây tửvong [11], [24]

1.1.2 Rắn độc và tai nạn rắn độc cắn tại Việt Nam

1.1.2.1 Rắn độc ở Việt Nam

Nước ta nằm trong vùng nhiệt đới với địa hình và khí hậu khác nhaugiữa các miền Bắc, Trung, Nam Từ đặc điểm tự nhiên đó đã tạo nên sự đadạng sinh học ở nước ta, trong đó có rắn độc Nghiên cứu sinh thái học cácloài rắn của Việt Nam đã được nhiều tác giả tiến hành và đã được tổng kết lại

một cách hệ thống Theo Nguyễn Văn Sáng và cs (1996), Việt Nam có 146loài rắn, trong đó có 31loài rắn độc phân bố cả trên cạn và dưới nước [8]

Rắn độc ở Việt Nam chủ yếu thuộc hai họ có tầm y học quan trọng là

họ rắn hổ (trong đó có phân họ rắn biển) và họ rắn lục (trong đó có phân họrắn có hố má) [9], [10]:

- Họ rắn hổ Elapidae: Rắn hổ đất (Naja kaouthia)(Ảnh 1.1), rắn hổ

mèo (Naja siamensis)(Ảnh 1.2), rắn hổ mang bành (Naja atra)(Ảnh 1.3), rắn

hổ chúa (Ophiophagus hannah) (Ảnh 1.4), rắn cạp nia Bungarus candidus (miền Nam)(Ảnh 1.5), rắn cạp nia Bungarus multicinctus (miền Bắc), rắn cạp nia Sông Hồng B Slowinski, rắn cạp nong (Bungarus fasciatus)(Ảnh 1.6) và phân họ rắn biển (Hydrophiidae).

- Họ rắn lục Viperidae: Rắn lục tre môi trắng hay rắn lục đầu vồ

(Cryptelytrops albolabris)(Ảnh 1.7), rắn lục miền Nam (Cryptelytrops popeorum) và phân họ Crotalidae: Rắn choàm quạp (Calloselasma rhodostoma)(Ảnh 1.8)

- Họ Colubridae: Rắn sải cổ đỏ (Rhabdophis subminiata) (Ảnh 1.9).

Ảnh 1.1 Rắn hổ đất (Naja kaouthia)

*Nguồn: theo Warrell A.D và cs (2000)[24]

Ảnh 1.2 Rắn hổ mang (Naja atra)

*Nguồn: theo Lê Khắc Quyến và cs (2003)[14]

Ảnh 1.3 Rắn hổ chúa (Ophiophagus hannah)

*Nguồn: theo Warrell A.D và cs (2000)[24]

Ảnh 1.4 Rắn hổ mèo (Naja siamensis)

*Nguồn: theo Lê Khắc Quyến và cs (2003)[14]

Ảnh 1.5 Rắn cạp nia (Bungarus candidus)

*Nguồn: theo Lê Khắc Quyến và cs (2003)[14]

Ảnh 1.6 Rắn cạp nong (Bungarus fasciatus)

*Nguồn: theo Lê Khắc Quyến và cs (2003)[14]

Ảnh 1.7 Rắn choàm quạp (Calloselasma rhodostoma)

*Nguồn: theo Warrell A.D và cs (2000)[24]

Ảnh 1.8 Rắn lục (Cryptelytrops albolabris)

*Nguồn: theo Lê Khắc Quyến và cs (2003)[14]

Ảnh 1.9 Rắn sải cổ đỏ (Rhabdophis subminiata)

*Nguồn: theo Lê Khắc Quyến và cs (2003)[14]

1.1.2.2 Tình hình rắn độc cắn ở Việt Nam

Tại nước ta, về mặt dịch tễ học, chưa có khảo sát ở cấp độ quốc gia nàođược thực hiện để ước tính tỉ lệ bệnh nhân bị rắn cắn thực tế Tai nạn rắn cắnxảy ra ở hầu hết các vùng trong cả nước Các chuyên gia ước tính mỗi nămnước ta có khoảng 30.000 trường hợp bị rắn cắn Tỷ lệ tử vong do rắn độc cắnchưa được thống kê đầy đủ [24] Số liệu từ các bệnh viện đa khoa khu vựccho thấy số trường hợp rắn cắn điều trị tại các bệnh viện này là các con sốđáng kể Tại Bệnh viện Bạch Mai, từ năm 1994-1997, có 79 bệnh nhân nhậpkhoa Săn sóc tăng cường A9, trong đó hầu hết là rắn hổ và rắn cạp nia [25]

Từ năm 1990-1998, Khoa Hồi sức, Bệnh viện 103 điều trị cho 22 trường hợprắn cắn nhiễm độc thần kinh, suy hô hấp [26] Từ năm 1992-1997, Trại rắnĐồng Tâm ghi nhận điều trị cho 3147 bệnh nhân, trong đó 57% do rắn lục cắn

và 8% do rắn hổ, rắn cạp nong và rắn cạp nia cắn [27] Từ năm 1993 - 1998,Bệnh viện Quân Y 175, có 137 nạn nhân rắn độc cắn trong tổng số 180 bệnhnhân rắn cắn, trong đó, 102 bệnh nhân do rắn lục cắn và 8 bệnh nhân do rắn

hổ cắn [28] Tại Bệnh viện Chợ Rẫy, hàng năm có từ 600 đến 1.000 bệnhnhân rắn cắn nhập viện [13], [29] Tuy nhiên, những số liệu trên đây cũng chỉphản ánh phần nổi của tảng băng

Theo nghiên cứu của Trịnh Xuân Kiếm và cs (2000), tỉ lệ rắn cắn thayđổi theo từng vùng miền khác nhau trên cả nước [29] Hầu hết các trường hợprắn độc cắn điều trị tại Trại rắn Đồng Tâm là do rắn lục và rắn hổ đất [27];trong khi tại Bệnh viện Chợ Rẫy, tỉ lệ rắn độc thay đổi: lục xanh 43,3%, hổđất 27,5%, choàm quạp 19,4%, hổ mèo 6,3%, hổ chúa 1,2%, cạp nia Nam2,1% và rắn biển 0,2% [29] Hiện nay, HTKNR đơn đặc hiệu đã có 7 loại: hổđất, hổ mang, hổ chúa, rắn cạp nia Nam, rắn cạp nia Bắc, rắn lục xanh và rắnchàm quạp

Biểu đồ 1.1 Phân bố bệnh nhân bị các loại rắn độc cắn tại Bệnh viện Chợ Rẫy

Biểu đồ 1.2 Số lượng bệnh nhân rắn cắn và tử vong tại Trung tâm cấp cứu

Sài Gòn và Bệnh viện Chợ Rẫy từ 1979-1996

*Nguồn: theo Trịnh Xuân Kiếm và cs (1997)[13]

Tỉ lệ tử vong do rắn độc cắn tại Trung tâm cấp cứu Sài Gòn trong năm1979-1980 là 20% Tử vong do rắn độc cắn tại Bệnh viện Chợ Rẫy giai đoạn1985-1990 khi chưa có HTKNR đặc hiệu là 19.5% Tỉ lệ này giảm rất đáng kể

từ 19,5% xuống 3.1% khi có HTKNR điều trị đặc hiệu giai đoạn 1990 -1996[13] Những trường hợp tử vong hiện nay là do rắn hổ mèo, rắn cạp nia.Nhiều trường hợp bị RHM cắn để lại hậu quả nặng nề: cắt cụt tay, chân; dichứng co rút sau ghép da ảnh hưởng đến cuộc sống của người lao động Hiệnnay, Việt Nam chưa có huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo (HTKNRHM).Trên thực tế tại Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Nhi đồng 1 và Nhi Đồng 2,điều trị bệnh nhân bị nhiễm độc nọc RHM bằng HTKNR hổ đất không cảithiện được triệu chứng nhiễm độc tại chỗ cũng như toàn thân HTKNR hổ đất

(Naja kaouthia) không có khả năng trung hoà chéo được nọc RHM (Naja siamensis) trên lâm sàng [14] Do đó, cần nhanh chóng xúc tiến nghiên cứu

sản xuất HTKNRHM đặc hiệu để kịp thời cứu người bị nạn

1.2 NỌC RẮN VÀ NHIỄM ĐỘC NỌC RẮN

1.2.1 Nọc rắn

Nọc rắn được tiết ra từ tuyến nọc nằm gần sau mắt; là hỗn hợp nhiềuđộc tố và các enzym có bản chất là proteins, peptid, các acid amin và một sốkhoáng chất [9], [11] Tổ hợp các độc tố và enzym làm cho nọc rắn trở thànhmột hỗn hợp sinh học có hoạt tính sao vừa là phương tiện tự vệ, vừa là công

cụ bắt mồi và tiêu hoá con mồi một cách rất hiệu quả

- Tự vệ là chức năng đầu tiên của nọc rắn Biện pháp tự vệ hữu hiệunhất cùa các loài rắn là các vết cắn gây đau do nọc rắn

- Nhiều loại động vật dùng nọc độc có các độc tố tác dụng nhanh vàđặc hiệu làm bất động hoặc giết con mồi Nọc rắn chứa nhiều độc tố gây tửvong cao tác động lên các chức năng sinh tồn của cơ thể: hệ thần kinh, hệtuần hoàn, trực tiếp lên tim và hệ đông cầm máu

- Tác động thường gặp của nọc rắn là giúp tiêu hoá con mồi Do đó,

thành phần nọc rắn có mặt nhiều hỗn hợp các độc tố và các men gây chết cótác động mạnh và hữu hiệu

Nọc rắn độc sau đông khô là hỗn hợp các chất vô cơ (Al, Cu, Zn, Ag )

và các chất hữu cơ phần lớn là loại protein có trọng lượng phân tử thấp, trong

đó có cả một hệ thống enzym phong phú: Protease, phospholipase,hyaluronidase, cholinesterase, phosphatase, 5-nucleotidase, ribonuclease .[9], [30] Các độc tố và men một số loài gây hoại tử cơ vân [31] Một số độc

tố và men tác động lên hệ thống đông cầm máu [32], [33] Độc tố cũng có thểtác động gây độc cho tim (cardiotoxin) [34] Markland F.S (1998) và Matsui

T và cs (2000) đã tổng hợp lại cơ chế gây rối loạn đông cầm máu và tạothành huyêt khối của nọc rắn [35], [36] Meb D và cs (1990) và Ownby C.L.(1998) chứng minh tác động của độc tố cơ từ nọc rắn [37], [38] Fletcher J.E

và cs (1986) chứng minh vai trò của độc tố phospholipase A2 (PLA2) trongviệc giải phóng acetylcholine và choline tại khớp thần kinh – cơ [39]

Nọc của các loại rắn độc đa phần có bản chất là các protein có trọnglượng phân tử lớn khoảng từ 50 – 125 kDa, trong đó có chứa rất nhiều hoạtchất khác nhau tuỳ thuộc mỗi loài rắn mà chúng có các hoạt chất đặc trưngtheo loài [9] Do có bản chất như trên nên nọc rắn độc có tính sinh miễn dịchtốt [10], [40] Hơn nữa trong thành phần nọc rắn có nhiều hoạt chất giốngnhau giữa các loại rắn khác nhau trong cùng một họ nên dễ tạo nên phản ứngchéo giữa huyết thanh kháng lại loại nọc rắn này với các quyết định khángnguyên có trong nọc độc của một số loài rắn khác cùng họ [9], [10]

1.2.2 Nhiễm độc nọc rắn trên người

Nọc rắn độc được coi là một phức hợp phát triển cao nhất trong số cácđộc tố do động vật và thực vật tạo ra Nọc rắn chứa một số lượng lớn các chất

có hoạt tính dược lý mạnh và mỗi độc tố trong số này có những phương thứchoạt động đặc hiệu Khi bị rắn độc cắn, các chất này được tiêm qua vết cắnvào cơ thể nạn nhân bắt đầu hoạt động theo các kiểu độc lập, hiệp đồng hoặc

đối kháng Nọc rắn độc có thể gây ra rất nhiều biểu hiện nhiễm độc trên lâmsàng bao gồm:

Các dấu hiệu và triệu chứng tại chỗ bao gồm: dấu răng, đau, sưng nề,vết sưng đỏ, vết bầm máu, chảy máu, viêm mạch bạch huyết, hạch bạch huyếtsưng to, bóng nước và hoại tử [42], [43] Tuy nhiên, một số loài rắn của họrắn hổ ví dụ các loài rắn Bungarus, rắn hổ Philippines và rắn biển: có triệuchứng tại chỗ rất mờ ảo nhưng triệu chứng toàn thân rất rầm rộ Vì vậy, dùvết cắn không có dấu răng cũng không được loại trừ rắn độc cắn [44], [45].Bệnh nhân phải được theo dõi trong bệnh viện cho đến khi chứng minh đượcvết cắn này do rắn không độc gây ra Ngoài ra, các triệu chứng tại chỗ có thểthay đổi do một số các biện pháp sơ cứu ban đầu gây ra như rạch, nặn máu,ga-rô [11], [46]

1.2.2.2 Nhiễm độc toàn thân

Các dấu hiệu hay triệu chứng toàn thân xuất hiện trên bệnh nhân bị rắnđộc cắn tuỳ thuộc vào loài rắn gây tai nạn [11], [24] Những triệu chứng nàythường là: đau đầu, buồn nôn, nôn ói, ớn lạnh, đau bụng, tiêu chảy, chóngmặt, yếu, lừ đừ và kiệt sức [11], [14] Ngất và co giật là những dấu hiệu đầutiên của nhiễm độc nọc rắn Hạ huyết áp, nhịp tim nhanh hoặc chậm cũng lànhững dấu hiệu thường được ghi nhận [11], [45] Tuy nhiên, một số bệnhnhân sau khi bị cắn dù không có nhiễm độc nọc rắn vẫn gặp các triệu chứng

như: hoảng sợ, chóng mặt, co quắp tay chân, sốc thần kinh, choáng váng vàngất xỉu đưa đến sự nhầm lẫn với những triệu chứng toàn thân thực sự củanhiễm độc nọc rắn Thỉnh thoảng các bác sĩ còn có thể gặp những bệnh nhân

có đau ngực, nhồi máu cơ tim, hoặc rối loạn nhịp tim do quá sợ hãi [11], [24]

-Nhiễm độc thần kinh (neurotoxicity) do độc tố thần kinh (neurotoxins)

thường gặp trên bệnh nhân bị cắn bởi các loài rắn thuộc họ rắn hổ (Elapidae)

như rắn hổ, rắn khoang và rắn biển cũng như vài loài rắn lục như rắn lục

Russell (D russellii) hay rắn chuông Nam Mỹ (Crotalus durissus terrificus)

[11], [47], [48] Tuỳ vào kích thước loài rắn, rắn đã ăn mồi hay chưa trướckhi cắn bệnh nhân, vị trí của vết cắn, tình trạng vết cắn (một dấu hay hai dấurăng hoặc nhiều vết cắn, hay chỉ vết cào xước…) mà mức độ nhiễm độc thầnkinh xuất hiện khác nhau từ nhẹ tới nặng [11], [24] Các triệu chứng này cóthể xuất hiện vài phút sau cắn hoặc chậm hơn 16 giờ sau đó Triệu chứng đầutiên là sụp mi mắt Kiểm tra triệu chứng này bằng cách khám vận động mắt.Người khám có thể yêu cầu bệnh nhân nhìn lên và quan sát mi mắt trên có colại hoàn toàn hay không Độc tố thần kinh là độc tố tiền synapse hoặc hậusynapse Nó ảnh hưởng không những trên các khớp thần kinh-cơ của thầnkinh ngoại biên mà còn tác động trên các cơ [11], [24] Ở người, độc tố tiềnsynapse thần kinh PLA2 có thể ngăn chặn việc giải phóng acetylcholine vàhậu quả là liệt hô hấp gây tử vong [11], [47], [48] Độc tố hậu synapse thầnkinh là các polypeptide, cạnh tranh với acetylcholine tại các thụ thể của khớpthần kinh-cơ Chúng chặn dẫn truyền thần kinh tại tấm động thần kinh-cơ đưađến liệt giống curare Ngoài ra, các cơ mà được điều khiển bằng các thầnkinh sọ cũng bị ảnh hưởng Vì vậy, các triệu chứng thường gặp là: mệt lả, khónuốt, khó phát âm, khó nói và liệt cơ hô hấp dẫn đến khó thở và ngừng thở[9], [11], [24] Tiếp theo, bệnh nhân sẽ tím tái, co giật và sau cùng tử vong.May mắn thay, các triệu chứng này có thể hồi phục bằng cách sử dụngHTKNR đơn đặc hiệu sớm và đủ liều Các thuốc anticholinesterase như

edrophonium, neostigmine, pyridostigmine cũng có thể đảo ngược tình trạngliệt thần kinh này nhưng không rõ rệt trên thực tế lâm sàng [49].

- Nhiễm độc cơ vân (myotoxicity): Nhiều nghiên cứu trước đây đã báocáo về tình trạng tổn thương cơ vân do độc tố cơ vân (myotoxin) dẫn đến đáihuyết sắc tố như rắn biển, nhiều loại rắn hổ ở Úc (Eastern small-eyed, mulga,

tiger and taipan snakes), rắn hổ đất (Naja kaouthia) và vài loại rắn lục có hố

má (Crotalus horridus attricaudatus and Bothrops asper) [31], [38] Nhữngdấu hiệu lâm sàng hoại tử cơ ở bệnh nhân như đau cơ, yếu cơ, tăng mencreatine phosphokinase (CPK), men gan aspartate aminotransferase (ASAT),tăng kali máu và huyết sắc tố niệu [11], [14] Huyết sắc tố niệu có thể đưađến suy thận Tuy nhiên, các triệu chứng hoại tử cơ thường không đặc hiệu vàthỉnh thoảng được quan sát thấy ở những trường hợp rắn cắn khác ví dụ đau

cơ trên bệnh nhân bị rắn cạp nia cắn [44], [45] Nói chung, tổn thương cơ vân(hoặc tác động hoá học trực tiếp hoặc gây hoại tử ở các tế bào cơ vân củađộng vật có vú) gây ra bởi độc tố cơ được tìm thấy trong nọc rắn Độc tố cơđược chia thành 4 nhóm: độc tố cơ cơ bản dạng polypeptide nhỏ, độc tố cơ tạichỗ dạng PLA2 (độc tố hoại tử cơ), độc tố cơ chung (độc tố gây huyết sắc tốniệu) và độc tố cơ hỗn hợp [31], [38]

- Nhiễm độc tế bào (cytotoxicity): Bệnh nhân bị nhiễm độc nọc rắn là

do độc tố tế bào (cytotoxin) gây ra, trước đây được biết dưới tên độc tố tim(cardiotoxin) hoặc polypeptide hoạt động màng [34] Những độc tố này gây

ra nhiều tác động như rút ngắn tâm thu, khử cực tế bào cơ, ly giải nhiều dạng

tế bào (như hồng cầu, tế bào biểu mô và tế bào phổi phôi thai) và ngăn trở kếttập tiểu cầu [34], [50] Các triệu chứng phù nề, bóng nước và hoại tử thườngquan sát được tại vết cắn của loài rắn thuộc họ rắn lục và rắn hổ do các menprotease và hyaluronidase gây ra [51] Men haemolysin gây ly giải hồng cầu[35], [36], [52] Haemorrhagin gây tổn thương nội mạc mạch máu làm tăngtính thấm và thoát mạch thường gặp trên họ rắn lục [11], [35], [36]

- Nhiễm độc trên hệ tim mạch và gây rối loạn huyết động: Nọc rắn cóthể ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp lên hệ thống tuần hoàn dẫn đến các rốiloạn như tụt huyết áp, ngừng tim Sốc hoặc tụt huyết áp là do tác động cơ timtrực tiếp hoặc dãn mạch của nọc rắn Dãn mạch có thể là do các peptide dạngbradykinin tiềm ẩn, các men giống kallikrein hoặc thrombin có trong nọc họrắn lục và rắn có hố má Những men này phóng thích những chất gây dãnmạch cực mạnh như kinin, bradykinin và/hoặc kallidin vào hệ tuần hoàn gâytăng tính thấm thành mạch và hậu quả là dẫn đến tụt huyết áp, phản ứngviêm, phù nề và đau Hơn thế nữa, các men giống thrombin cũng làm tăngxuất huyết đưa đến sốc giảm thể tích [11], [14], [50] Một dấu hiệu khác củanhiễm độc tim (cardiotoxicity) là ngừng tim do tác động trực tiếp của độc tốtim hoặc tăng kali máu nghiêm trọng Tăng kali máu là nguyên nhân thườnggặp trong ngừng tim và thường là hậu quả của ly giải cơ vân trên bệnh nhân

bị rắn biển cắn [11], [24], [34] Những nguyên nhân khác có thể là do tháoga-rô quá nhanh từ chi bị cắn dẫn đến một lượng lớn nọc rắn và độc tố về timgây ngưng tim đột ngột [11], [24], [53] Nói chung, rối loạn tuần hoàn có thể

do các tác động ban đầu của nọc rắn mà cũng có thể do nhiều tác động thứphát gây ra

- Nhiễm độc hệ máu (haemotoxicity): Độc tố gây ra chủ yếu là các chấtkháng đông, tiền đông, fibrinolysin, haemorrhagin và haemolysin có trongnọc [35], [52] Các triệu chứng chính là xuất huyết dẫn đến thiếu máu Cácchất tiền đông là các men kích thích quá trình tạo cục máu đông, làm tiêu huỷcác yếu tố đông máu Hậu quả là máu không đông được Haemorrhagin gâytổn thương lớp nội mạc thành mạch máu nên gây xuất huyết tự nhiên toànthân [32], [33] Giảm tiểu cầu là do cơ chế như có sự ngăn chặn ngưng kếttập tiểu cầu khởi đầu và làm giảm kết dính nó Tóm lại, nhiều protein và cácthành phần khác của nọc rắn thuộc 3 họ rắn hổ, lục và rắn nước tác động lên

hệ thống đông cầm máu của người [35], [36], [52]

- Nhiễm độc thận (nephrotoxicity): Tổn thương nhiễm độc thận trênlâm sàng gây ra bởi độc tố thận (nephrotoxin) của nọc rắn có thể gặp nhiềudạng khác nhau như không có triệu chứng, thay đổi màu sắc và thể tích nướctiểu, và/hoặc xuất hiện các triệu chứng của suy thận cấp Những biểu hiệnkhác của nhiễm độc này bao gồm protein niệu, tiểu máu, tiểu huyết sắc tố vàsuy thận [11], [54] Bệnh nhân thường được theo dõi sát để phát hiện dấuhiệu suy thận nếu có các dấu hiệu sau: thiểu niệu hoặc vô niệu, tăng urê hoặccreatinin máu và xuất hiện hội chứng urê huyết cao: buồn nôn, nôn ói, nấccụt, ngủ gà, lú lẫn, hôn mê, run vỗ tay, xoắn vặn cơ, co giật, tiếng cọ màngtim và dấu hiệu quá tải tuần hoàn [11], [24] Suy thận mạn tính cũng ghi nhận

ở một số bệnh nhân bị rắn lục Russell cắn với tình trạng tiểu albumin kéo dài,tăng huyết áp và tiểu đêm kéo dài 11 tháng sau đó Như vậy, tổn thương thậnsau rắn cắn cần được theo dõi bằng đo lường thể tích nước tiểu hoặc pháthiện sớm các bằng chứng của rối loạn chức năng thận [11], [24]

- Các biểu hiện dị ứng: Một số bệnh nhân có biểu hiện sốc phản vệ saukhi bị rắn độc cắn đặc biệt là rắn lục xanh [14]

1.3 CẤP CỨU VÀ ĐIỀU TRỊ RẮN ĐỘC CẮN

1.3.1 Cấp cứu đầu tiên

Cấp cứu đầu tiên hay sơ cứu nạn nhân rắn độc cắn là các biện phápđược tiến hành càng sớm càng tốt ngay tại hiện trường bằng các biện phápđơn giản nhằm tăng cơ hội sống sót cho nạn nhân và giảm bớt các biến chứng

do nhiễm độc nọc rắn gây ra [11], [55]

1.3.1.1 Các biện pháp cấp cứu đầu tiên

- Trấn an bệnh nhân Đặt bệnh nhân trên mặt bằng phẳng và hạn chế dichuyển Có thể đặt chi bị cắn ở vị trí thấp hơn vị trí tim

- Nẹp chi bị cắn tránh bị uốn cong và di chuyển làm hạn chế hấp thunọc rắn vào cơ thể

- Rửa sạch vết cắn và băng ép bằng băng thun từ vị trí bị cắn đến gốc

chi (có thể băng ép toàn bộ chi) [11], [55] Phương pháp băng ép bất động chỉ

áp dụng cho các trường hợp rắn cắn thuộc họ rắn hổ vì gây nhiễm độc thầnkinh nên tử vong nhanh, không khuyến cáo áp dụng với họ rắn lục [11], [55].Tuy nhiên khi bị cắn, bệnh nhân khó xác định rắn loại gì nên có thể ứng dụngđược cho tất cả các trường hợp bị rắn cắn để đảm bảo cứu mạng trước mắt.Không buộc ga-rô chi bị cắn (cả động mạch và tĩnh mạch) vì gây hoại tử chinếu bệnh nhân chuyển đến bệnh viện sau 4-6 giờ ga-rô Trong điều kiệnkhông có phương tiện băng ép bất động chi bị rắn cắn, ta buộc phải sử dụngphương pháp ga-rô tĩnh mạch (vẫn bắt được động mạch đoạn sau ga-rô) Mỗi

2 giờ, ga-rô phải nới dần lên về phía gốc chi để tránh tình trạng hoại tử xảy

ra Các tình huống vết cắn vào vùng đầu mặt, cổ, tim…cần nhanh chóng đặtnội khí quản tránh suy hô hấp do vết cắn sưng nề, nhiễm độc tim hoặc nãobộ,… Nhanh chóng chuyển đến nơi có HTKNR để điều trị kịp thời

Nhanh chóng chuyển bệnh nhân đến cơ sở y tế gần nhất đảm bảo hôhấp và tuần hoàn trên đường di chuyển (hồi sức được hô hấp, tim mạch)

Nếu bị nọc rắn phun vào mắt, rửa mắt bằng nước sạch trong thời gian ítnhất 15 phút Không được nhỏ nước chanh hay các dung dịch khác vào mắt vì

có thể gây mù Nhanh chóng đến cơ sở y tế để được điều trị [11], [24]

1.3.1.2 Một số khuyến cáo trong cấp cứu nạn nhân rắn độc cắn

Warrell D.A (2010) [11], Warrell D.A và Trịnh Xuân Kiếm (2000)[24] khuyến cáo trong hướng dẫn xử lý lâm sàng rắn cắn như sau:

- Không tháo nẹp và băng ép cho đến khi bệnh nhân được chuyển đếnbệnh viện có huyết thanh kháng nọc rắn đặc hiệu để điều trị Trong trườnghợp bệnh nhân được ga-rô cả động và tĩnh mạch chi bị cắn, tiến hành băng épbất động đúng cách phần trên và dưới ga-rô chi bị cắn Sau đó nới dần ga-rô

về gốc chi và băng ép phần còn lại Theo dõi sát triệu chứng lâm sàng toànthân

- Không được cắt hoặc rạch vết cắn vì gây chảy máu và nhiễm trùng