Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự vùng gen matk ITS của một số mẫu cây thuộc chi dương đồng (adinandra)

Trên thế giới, một số công trình nghiên cứu về các chất hóa học và tác dụngsinh học của một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng đã thể hiện phổ hoạt tínhkháng viêm, chống độc và giảm đ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KIỀU THỊ TRÀ GIANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI

VÀ TRÌNH TỰ VÙNG GEN matK/ITS CỦA MỘT SỐ MẪU CÂY

THUỘC CHI DƯƠNG ĐỒNG (Adinandra)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KIỀU THỊ TRÀ GIANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI

VÀ TRÌNH TỰ VÙNG GEN matK/ITS CỦA MỘT SỐ MẪU CÂY

THUỘC CHI DƯƠNG ĐỒNG (Adinandra)

Ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hữu Quân

Thái Nguyên, năm 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Mọi trích dẫn trongluận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn làtrung thực và chưa được ai công bố

Thái Nguyên, tháng 6 năm 2019

Tác giả luận văn

Kiều Thị Trà Giang

T S N g u y ễ n

H ữ u Q u â n

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới

TS Nguyễn Hữu Quân, giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đạihọc Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ emtrong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Em cũng xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS Phạm Văn Khang, giảng viênKhoa Hóa học đã hướng dẫn em về tách chiết và định tính các chất hóa học

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của cô Trần Thị Hồng, kỹ thuật viênphòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, cô Cao Thị Phương Thảo, kỹ thuậtviên phòng thí nghiệm Thực vật học và các thầy cô kỹ thuật viên các phòng thínghiệm Khoa Sinh học; phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ, Khoa Hóa học, TrườngĐại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện giúp em trong suốtquá trình nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Sinh học hiện đại vàGiáo dục sinh học, bộ phận sau đại học thuộc Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sưphạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quátrình học tập và hoàn thành luận văn

Em xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, bạn bè đã động viên, khuyến khích vàgiúp đỡ em trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn

Em xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài KH&CN Quỹ NAFOSTED “Phântích thành phần hóa học và tìm kiếm các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng ung

thư và kháng viêm từ một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) ở

Việt Nam” mã số 106.02-2018.338

Thái Nguyên, tháng 6 năm 2019

Tác giả luận văn

Kiều Thị Trà Giang

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG .v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 1

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra ) 3

1.2 Tình hình nghiên cứu về chi Dương đồng (Adinandra) 5

1.2.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học Error! Bookmark not defined. 1.2.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học 8

1.3 Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật 11

1.4 Các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của các loài cây thuốc 14

1.5 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro 16

1.6 Vai trò của polyphenol, coumarin, dẫn xuất của flavon và flavonol 18

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 21

2.1.2 Hóa chất, thiết bị 21

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp phân loại hình thái 22

2.2.2 Phương pháp giải phẫu thực vật 22

2.2.3 Phương pháp sinh học phân tử 24

2.2.4 Phương pháp hóa sinh 26

2.2.5 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 28

2.2.6 Phương pháp xử lý và phân tích kết quả 29

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30

3.1 Đặc điểm hình thái ngoài và phân bố của loài Adinandra lienii 30

3.2 Cấu tạo giải phẫu của loài Adinandra lienii 31

3.2.1 Đặc điểm giải phẫu cắt ngang thân cây 31

3.2.2 Đặc điểm giải phẫu cắt ngang phiến lá cây 32

3.3 Đặc điểm của vùng gen matK phân lập từ loài Adinandra lienii 34

3.4 Khảo sát các hợp chất có trong các phân đoạn dịch chiết của cây Adinandra lienii 39

3.4.1 Định tính polyphenol 39

3.4.2 Định tính các flavonoid 40

3.4.3 Định tính các coumarin 40

3.4.4 Phân tích thành phần các hợp chất trong cao chiết của loài A lienii 41

3.5 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ loài Adinandra lienii 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

1 KẾT LUẬN 46

2 KIẾN NGHỊ 46

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết

tắt

Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng việt

APG II An update of the Angiosperm

Phylogeny Group classificationfor the ordors and families offlowering plants

Hệ thống phân loại thực vật

DMSO Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleic Axit (DNA)

EC50 Effective dose 50% Liều hiệu quả đáp ứng 50%EDTA Ethylene diamine tetraa acid cetic Etylen diamin tetraxetic AxitELISA Enzyme linked

immunosorbentassay Thử nghiệm miễn dịch gắnenzymeEtOH Ethyl acetatae

Hep G2 Hepatocellular carcinoma human Ung thư gan ở người

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% cá thểISSR Inter Simple Sequence Repea Đánh giá sự sai khác di truyền

ở thực vật

ITS Internal transcribed space Vùng gen ITS

sinh vật

MIC Minimalinhibitory concentration Nồng độ tối thiểu ức chế

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymeraseRAPD Random Amplification

of Polymorphic DNA Đa hình DNA nhân bản ngẫunhiên

TTC Triphenyl tetrazolium Chloride Chỉ thị màu

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Danh sách các loài thuộc chi Adinandra ở Việt Nam 3

Bảng 1.2 Tác dụng chống ung thư của dịch chiết các hợp chất phenolic tự do trên 2 dòng tế bào Hep-G2 và MCF-7 10

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 21

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 22

Bảng 2.3 Thông tin về cặp mồi nhân gen matK 25

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR nhân gen matK 25

Bảng 3.1 Các trình tự nucleotide của đoạn gen matK sử dụng trong phân tích 36

Bảng 3.2 Hệ số tương đồng và hệ số phân ly trình tự các nucleotide của đoạn gen matK từ loài Adinandra lienii và các loài thuộc chi Adinandra 38

Bảng 3.3 Hoạt tính sinh học của dịch chiết từ cây A lienii 42

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) 4

Hình 1.2 Các hợp chất flavonoid và triterpene saponins từ A nitida 6

Hình 1.3 Các hợp chất triterpene saponins từ A nitida 7

Hình 1.4 Các hợp chất flavonoid từ A nitida 8

Hình 1.5 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro 17

Hình 1.6 Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro sinh tự ký 18

Hình 2.1 Sơ đồ chiết phân đoạn các hợp chất từ cây A lienii 26

Hình 3.1 Hình thái ngoài của cây A.lienii (Ảnh chụp của tác giả thu tại Lào Cai, tháng 3, năm 2018) 30

Hình 3.2 Giải phẫu cắt ngang thân cây A lienii 32

Hình 3.3 Giải phẫu cắt ngang phiến lá cây A lienii 33

Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ DNA tổng số của loài A lienii 34

Hình 3.5 Kết quả giải trình tự đoạn gen matK của loài A lienii thu tại Lào Cai 35

Hình 3.6 Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự đoạn gen matK của loài A lienii so với trình tự đoạn gen matK trên GenBank bằng BLAST trong NCBI 36 Hình 3.7 Trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ loài A lienii thu tại Lào Cai, Việt Nam và trình tự đoạn gen matK công bố trên GenBank 37

Hình 3.8 Sơ đồ cây phân loại dựa trên trình tự các nucleotide của đoạn gen matK .39

Hình 3.9 Phản ứng với muối sắt (III) (a) và với dung dịch H2SO4 đặc (b) 39

Hình 3.10 Định tính các flavonoid 40

Hình 3.11 Định tính coumarin phản ứng với NaOH (a) và HCl đặc (b) 41

Hình 3.12 Sắc kí đồ cao chiết ethanol (A) và ethyl acetate (B) trong hệ dung môi n-hexan : acetone tỉ lệ 1:1 41

Hình 3.13 Sắc kí đồ cao chiết ethanol (A) và ethyl acetate (B) trong hệ dung môi dichloromethane : n-hexan tỉ lệ 3:1 41

Hình 3.14 Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn B subtilis 43

Hình 3.15 Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn L plantarum 43

Hình 3.16 Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S aureus 44

Hình 3.17 Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn E.coli 44

Hình 3.18 Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S marcescens 45

Hình 3.19 Hoạt tính kháng của cao chiết đối với vi khuẩn S lutea 45

1 Đặt vấn đề

MỞ ĐẦU

Vấn đề sức khỏe của con người ngày nay đang bị ảnh hưởng nghiêm trọngtrước các biến đổi của khí hậu, ô nhiễm môi trường và nguồn thực phẩm dẫn tớixuất hiện các bệnh hiểm nghèo như ung thư Do đó, việc tìm ra phương pháp hiệuquả để điều trị các bệnh liên quan tới ung thư là vấn đề cấp bách và đặt ra nhiềuthách thức lớn cho các nhà khoa học Trước thực trạng đó, những nghiên cứu đểphát hiện ra các chất có hoạt tính sinh học từ các loài thực vật để sử dụng làmthuốc chữa bệnh cho người là cần thiết Trong dự án sàng lọc hoạt tính sinh họccủa thực vật Việt Nam, dịch chiết của một số loài thuộc chi Dương đồng

(Adinandra), họ Chè được dự báo có hoạt tính chống ung thư.

Trên thế giới, một số công trình nghiên cứu về các chất hóa học và tác dụngsinh học của một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng đã thể hiện phổ hoạt tínhkháng viêm, chống độc và giảm đau, chống oxi hóa, diệt trừ các gốc tự do, chốngung thư cũng như chống lại một số loài vi khuẩn gây bệnh Ở Việt Nam, những

nghiên cứu về chi Adinandra mới chỉ tập trung ở việc thống kê danh sách thành

phần loài Còn về đặc tính sinh học cũng như thành phần hóa học của chúng chưađược nghiên cứu

Hiện nay, một số loài thuộc chi Dương đồng như Adinandra bockiana, Adinandra glischroloma và Adinandra lienii bước đầu được nghiên cứu về vị trí

phân bố địa lý Những nghiên cứu về đặc điểm hình thái, hoạt tính sinh học cũng

như trình tự vùng gen matK/ITS của các loài trên chưa được tác giả nào thực hiện.

Vì vậy, nghiên cứu về các đặc tính sinh học cũng như xây dựng mã vạch DNA từ

một số loài thuộc chi Adinandra, trong đó có loài A lienii là rất cần thiết Xuất

phát từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm

hình thái và trình tự vùng gen matK/ITS của một số mẫu cây thuộc chi Dương đồng (Adinandra)”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nhận diện được mẫu cây thuộc chi Dương đồng bằng phương pháp giảiphẫu, hình thái

- Xác định được trình tự đoạn gen matK của loài Adinandra lienii thuộc chi Dương đồng (Adinandra).

3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định đặc điểm hình thái, giải phẫu của loài Adinandra lienii.

- Phân lập và giải trình tự nucleotide đoạn gen matK của loài A lienii.

- Thu cao chiết, định tính thành phần các nhóm chất và xác định hoạt tính

kháng khuẩn từ cao chiết của loài A lienii.

TT Tên l ài Tên thường gọi

1 Adinandra annaenzymesis Sum đỏ

3 Adinandra donnaiensis Sum đồng nai

4 Adinandra glischochroma Sum lông

5 Adinandra hainanensis Sum Hải Nam

6 Adinandra integerrima Sum nguyên

7 Adinandra microcarpa Sum trái nhỏ

8 Adinandra millettii Sum millett

9 Adinandra petelotii Sum petelot

10 Adinandra poilanei Sum poilan

11 Adinandra rubropunctata Sum điểm đỏ

13 Adinandra hongiaoensis Sum Hòn Giao

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra )

Chi Adinandra (thuộc họ Chè Theaceae) thường là cây bụi hay cây nhỡ, có

khoảng 85 loài phân bố ở các nước Châu Phi, Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ,Srilanka, Banglades và một số nước Đông Nam Á [39] Ở Việt Nam, chi

Adinandra đã được tìm thấy có 13 loài, phân bố ở các tỉnh Lào Cai, Cao Bằng,

Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Quảng Trị, Kon Tum, Lâm Đồng và Gia Lai (Bảng 1.1)

[9] Loài Sum Liên Adinandra lienii là loài bản địa được tìm thấy năm 1986 nhưng mới được công nhận vào năm 2012 Loài Sum Hòn Giao Adinandra hongiaoensis mới được phát hiện ở Hòn Giao Lâm Đồng năm 2014 [34].

Bảng 1.1 Danh sách các loài thuộc chi Adinandra ở Việt Nam

Phân bố

Quảng trịBạch MãĐồng NaiSapaHải Ninh Miền TrungHòn BàSapa, Tam Đảo

Sa aLâm ĐồngTiên Yên, Quảng TrịLào Cai

tìm thấy trong lá của loài Adinandra nitida, có hoạt tính chống oxi hóa, diệt trừ

các gốc tự do, chống viêm, chống trầm cảm, chống ung thư cũng như chống lạimột số loài vi khuẩn gây bệnh

Ngoài ra, trong các cây thuộc họ Chè cũng chứa tinh dầu, một hợp chất có vaitrò quan trọng trong lĩnh vực y học Nhờ các hợp chất có trong cây mà từ xưa y

học cổ truyền đã sử dụng các loài thuộc chi Adinandra được làm thuốc điều trị bệnh ung thư vòm họng, đau dạ dày, rắn cắn, Cây Sum millett (A millettii) được

sử dụng điều trị đau dạ dày; cây Sum nguyên A integerrima được dùng để trị bong gân, rắn cắn Lá và thân cây Sum đỏ hay Sum Hải Nam A Hainanensis (A rubropunctata) được dùng cho các trường hợp viêm, ung thư vòm họng [5].

A B

C D

Hình 1.1 Một số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra)

A: A hongiaoensis, B: A millettii, C: A dumosa, D: A glischroloma

Chi Adinandra là cây gỗ ít khi là cây bụi, nhánh non có lông nhung Lá đơn,

mọc so le, có kích thước trung bình hay lớn Hoa mọc đơn ở nách lá, lưỡng tính,hoa mẫu 5 Lá đài có lông mềm hoặc lông ráp Cánh hoa không lông hay chỉ cólông ở mặt ngoài Nhị nhiều, có khoảng 25 nhị Bao phấn có lông ngắn hoặc dài

và có mũi nhọn Bầu trên, không lông hoặc có lông mềm; noãn nhiều Quả khôkhông tự mở; hạt nhiều, nhỏ (Hình 1.1) [40]

1.2 Tình hình nghiên cứu về chi Dương đồng (Adinandra)

Ở Việt Nam hiện nay chưa có công bố nào về các loài thuộc chi Adinandra Trên thế giới, đặc biệt là Trung Quốc các nghiên cứu về chi Adinandra thường tập trung ở loài Andinandra nitida Loài A nitida là cây thuộc vùng nam Trung Quốc,

lá cây được sử dụng lâu năm làm chè uống (Shiyacha) và thuốc dược liệu tốt cho

sức khỏe Loài A nitida có nhiều tác dụng điều trị như kháng khuẩn, giảm đau, giảm huyết áp Ở Trung Quốc, loài A nitida còn được sử dụng trong nhiều công

thức bào chế, thang thuốc để điều trị ung thư, chống oxy hóa Các nghiên cứu về

chi Adinandra tập trung vào 02 hướng: (1) Nghiên cứu về thành phần hóa học, (2)

Nghiên cứu về hoạt tính sinh học

1.2.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học

Lá của cây A nitida được sử dụng lâu năm làm chè uống và thuốc dược liệu

tốt cho sức khỏe, tuy nhiên chưa có nhiều các nghiên cứu khoa học về thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học của loài A nitida Các nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học của loài A nitida được phát hiện thuộc nhóm là flavonoid, flavonoid

glycoside và triterpene saponin [29], [30], [35], [37]

Năm 2003, Wang và cộng sự đã công bố phân lập được 6 hợp chất apigenin

(1), camellianin A (2), quercitrin (3), kajiichigoside F1 (4), nigaichigoside F2 (5), và peduncloside (6) trên tạp chí Trung Quốc (Hình 1.2) [35].

Năm 2008, Liu và cộng sự đã phân lập được flavonoid thuộc loại

camellianin A từ lá của loài A nitida Merr ex Li bằng phương pháp HPLC và

chứng minh được khả năng chống oxy hóa cao từ dịch chiết flavonoid bằngphương pháp làm sạch DPPH và các gốc tự do [28] Cùng hướng nghiên cứu này,

Liu và cộng sự (2013) đã phân lập, tối ưu hóa phương pháp tách chiết flavonoid và

thu được camellianin A từ lá của loài A nitida; đồng thời chứng minh được khả

năng chống oxy hóa của flavonoid ở nồng độ 0,02 mg/ml [27] Như vậy, một sốnghiên cứu đã chỉ ra flavonoid như epicatechin, apigenin, quercitrin, camellianin

A và camellianin B có hoạt tính sinh học và có khả năng chống oxy hóa

Apigenin (1) Camellianin A (2)

Quercitrin (3) Kajiichigoside F1 (4)

Nigaichigoside F2 (5) Peduncloside (6)

Hình 1.2 Các hợp chất flavonoid và triterpene saponins từ A nitida

Bằng một số phương pháp sắc ký cột, thành phần hóa học của loài A nitida

đã được Wang và cộng sự (2008) phân lập và xác định được cấu trúc của các hợpchất saponin gồm 6 loại lần lượt là 2alpha, 3alpha, 19alpha-trihydroxy-olean-12 en-

28-oic acid-28-O-beta-D-glucopyranoside; arjunetin (7); sericoside (8); glucosyl tormentate (9); nigaichigoside F1 (10) và arjunglucoside I (11) Trong đó chất

2alpha, 3alpha,

19alpha-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid-28-O-beta-D glucopyranoside là hợp

chất mới; các chất còn lại là chất lần đầu tiên được phát hiện trong loài A nitida

[36]

Arjunetin (7) Sericoside (8)

Nigaichigoside F1 (9) Glucosyl torenzymetate (10)

Arjunglucoside I (11)

Hình 1.3 Các hợp chất triterpene saponins từ A nitida

Bên cạnh các nghiên cứu của Wang về thành phần hóa học, một số nhómnghiên cứu ở Trung Quốc như Liu B và cộng sự (2010), Zhang J và cộng sự(2006) lại tập trung vào phân tích thành phần flavonoid, thành phần chiếm hàm

lượng lớn (> 20%) có trong lá A nitida với camellianin A là thành phần chính

[30], [37] Theo nghiên cứu của Liu B và cộng sự (2010) , hàm lượng camellianin

A, camellianin B và phần aglycon apigenin trong dịch chiết EtOH chiếm tỉ lệ41,98; 2,67 và 1,73% tương ứng [30] Hàm lượng flavonoid chiếm hơn 45% trongdịch chiết EtOH

Sử dụng sắc ký lỏng 2 chiều (2D-LC) kết hợp phổ khối để phân tích thành

phần hóa học đã có hơn 57 chất đã được phát hiện trong dịch chiết MeOH lá A.

nitida, trong đó 5 hợp chất epicatechin (12), camellianin A (2), rhoifolin (13),

camellianin B (14) và apigenin (1) được phát hiện dựa trên thời gian lưu, khối

lượng phân tử và phổ MS/MS (Hình 1.4) [37]

Hình 1.4 Các hợp chất flavonoid từ A nitida

Một nghiên cứu khác từ Liu năm 2008 về phân tích thành phần hóa học bằngphương pháp GCMS của dịch chiết siêu tới hạn CO2 lá của cây A nitida và phát

hiện được 16 hợp chất với γ-sitosterol là thành phần chính (47,56%) Một số hợpchất khác 3, 7, 11, 15-tetramethyl -2-hexadecen-1-ol, nonacosane, 9, 12-octadecadienal, vitamin E, γ-tocopherol, stigmasterol được phát hiện với hàmlượng từ 2,16-16,98% Tuy nhiên dịch chiết MeOH thì tương tự như các nghiên

cứu khác, chủ yếu chứa các flavonoid như camellianin A (2), camellianin B (14)

và aglycon apigenin (1) [29].

1.2.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Loài A nitida đã được nghiên cứu các tác dụng sinh học khác nhau như

chống oxy hóa, ức chế enzyme chuyển (ACE giảm huyết áp) và chống ung thư[24], [25], [29], [30]

Năm 2010, Liu và cộng sự đã thử tác dụng chống oxy hóa, tác dụng ức chếenzyme chuyển của dịch chiết EtOH, hợp chất chính camellianin A, camellianin B

và apigenin Trong tác dụng chống oxy, kết quả cho thấy IC50 của dịch chiếtEtOH, camellianin A, camellianin B và apigenin tương ứng là 14,74 μg/ml, 1,62mg/ml, 1,8 mg/ml, và 0,95 mg/ml Tác dụng chống oxy hóa của các hợp chấtflavonoid kém hơn nhiều so với dịch chiết EtOH trong phép thử DPPH vàRancimat (khoảng 100 lần) Kết quả cho thấy tác dụng chống oxy hóa của lá cây

A nitida có thể phụ thuộc vào các thành phần hóa học khác [30].

Về tác dụng giảm huyết áp, ức chế enzyme chuyển (angiotensin convertingenzyme ACE) các hợp chất flavonoid camellianin A, camellianin B và apigenin cótác dụng tốt hơn dịch chiết EtOH Ở nồng 500 μg/ml, tác dụng ức chế enzymechuyển của dịch chiết EtOH, hợp chất camellianin A, camellianin B và apigenintương ứng là 29,7; 30,16; 40,68 và 30,27% Hoạt tính ức chế enzyme chuyển củadịch chiết EtOH có lẽ phụ thuộc nhiều vào các hợp chất flavonoid [30]

Do lá cây A nitida được sử dụng để làm chè uống với tác dụng chống ung

thư, hợp chất chính camellianin A (hàm lượng được xác định chiếm 19,25% bằngHPLC được thử nghiệm hoạt tính chống ung thư trên dòng tế bào ung thư Hep-G2

và ung thư vú MCF-7 Ở nồng độ 200 μM, camellianin A ức chế 33,8% và 8,7% tếbào ung thư MCF-7 và Hep-G2 Có thể thấy tác dụng độc tế bào của camellianin A

là khá yếu Tuy nhiên, trong nghiên cứu chu trình tế bào, camellianin A làm tăngmật độ tế bào ở giai đoạn G0/G1 Việc tăng mật độ các tế bào HepG-2 và MCF-7trong giai đoạn đầu của quá trình chết tế bào được phát hiện Như vậy, camellianin

A không chỉ ảnh hưởng đến quá trình nhân lên của tế bào ung thư mà còn thúc đẩycác tế bào đi vào chu trình chết tế bào (apoptosis) [25]

Nghiên cứu của Chen Y và cộng sự (2015) khi so sánh thành phần phenolic

của 4 loài thuộc chi Adinandra ở Trung Quốc là A nitida, A glischroloma var jubata, A millettii và A latifolia về tác dụng chống oxy hóa và so sánh chống ung

thư của 4 loài này trên các dòng ung thư HepG-2 và MCF-7 [24]

Hàm lượng các hợp chất phenolic trong A nitida cao nhất là 140,54±1,04 mg/g, tiếp đến loài A millettii (125,96±3,19 mg/g), loài A glischroloma var.

jubata (84,14±2,97 mg/g) Loài A latifolia có hàm lượng phenolic ít nhất (71,29 ± 2,69 mg/g) Tương tự, thành phần flavonoid có trong loài A nitida là cao nhất 88,72±2,13 mg/g, tiếp đến là loài A glischroloma var jubata (44,74±1,79 mg/g)

và loài A millettii (43,54±1,48 mg/g) Loài A latifolia có hàm lượng flavonoid ít nhất (19,13 ± 0,54 mg/g) Do vậy, trong 4 loài thuộc chi Adinandra nghiên cứu, tác dụng chống oxy hóa và chống ung thư của loài A nitida và A millettii có tác dụng tốt hơn so với loài A jubata và A latifolia Điều này có thể được giải thích

là phù hợp với hàm lượng các hợp chất phenolic có trong các loài này Dịch chiết

của các loài Adinandra có các hợp chất phenolic tự do có khả năng ức chế quá trình nhân lên của tế bào ung thư Các dịch chiết có thể ức chế với EC50 từ 1,05-6,44 mg/ml trên tế bào ung thư gan Hep-G2 và EC50 từ 2,26-8,02 mg/ml trên tếbào ung thư gan MCF-7 (Bảng 1.2)

Thành phần hợp chất flavonoid của loài A nitida có chứa camellianin A,

camellianin B, apigenin, quercitrin trong khi thành phần flavonoid của loài

A milettii chưa được phát hiện [24].

Bảng 1.2 Tác dụng chống ung thư của dịch chiết các hợp chất phenolic tự do

trên 2 dòng tế bào Hep-G2 và MCF-7

Như vậy, tác dụng sinh học và thành phần hóa học của các loài thuộc chi

Adinandra còn chưa rõ ràng, chưa được nghiên cứu sâu Việc tiến hành nghiên

cứu về các loài thuộc chi này là rất cần thiết nhằm hiểu biết thêm về thành phầnhóa học cũng như hoạt tính sinh học Dựa trên phương pháp hoạt tính dẫn đường,kết hợp với phương pháp sắc kí phổ hiện đại, các hợp chất mới có tác dụng chống

ung thư trong chi Adinandra sẽ được phát hiện.

1.3 Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA trong phân loại thực vật

Theo phương pháp truyền thống, việc phân loại hay giám định sinh vật chủyếu dựa trên chỉ thị về hình thái hoặc các đặc tính sinh lý, sinh hóa bên trong nhờvào bảng hướng dẫn định danh có sẵn Phương pháp phân loại truyền thống nàytrong nhiều trường hợp còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế như là nhiều sinh vật

có hình thái rất giống nhau nhưng thực tế lại rất khác nhau trong hệ thống phânloại (hệ gen rất khác nhau) Ngược lại nhiều sinh vật có hình thái rất khác nhaunhưng lại rất gần nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất giống nhau) Mặt khác,phương pháp phân loại truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái rất khó phânbiệt được sự khác biệt giữa các biến dị dưới loài Đặc biệt, đối với những mẫu vật

có nguồn gốc sinh vật đã bị biến đổi về hình thái như là những mẫu sinh vật đãchết, bị chôn vùi dưới đất, ở các công trình xây dựng, đã qua chế biến thì khôngthể xác định được bằng chỉ thị hình thái Gần đây, nhờ vào sự phát triển của khoahọc công nghệ nói chung và các kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng đã cho phépcác nhà nghiên cứu nhanh chóng xác định được sự khác biệt về vật chất di truyềngiữa các loài sinh vật, thậm chí giữa các cá thể sinh vật trong cùng loài Từ đó cóthể định danh được sinh vật và xác định được mối quan hệ di truyền giữa các cáthể, quần thể hay xuất xứ Việc kết hợp giữa chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tửDNA sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữa sinh vật này với sinh vậtkhác một cách chính xác Vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử được xem là công

cụ hỗ trợ có hiệu quả cho việc phân tích di truyền ở các loài sinh vật Trong đó,

mã vạch DNA được xem như là một công cụ để giám định sinh vật và xác địnhmối quan hệ di truyền giữa các loài [38]

Mã vạch DNA là kỹ thuật sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong hệ gencủa sinh vật như một chuỗi kí tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau

Vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) được phát hiện đầu tiên trên

cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự vùng gen matK mã hóa cho

tRNALys (UUU) của lục lạp Nó gồm 1 đoạn ORF chứa 509 nucleotit nằm trong

intron của gen trnK và chưa rõ chức năng Các nghiên cứu sử dụng trình tự gen

matK để xây dựng cây phát sinh loài cho thấy gen matK có tính đa dạng hơn những gen khác có trong lục lạp Do vậy gen matK trở thành gen chỉ thị quan

trọng để giúp phân loại thực vật [33]

Nhận thấy vai trò, ý nghĩa và sự cần thiết của việc xây dựng ngân hàng mãvạch DNA, ở Việt Nam các nhà khoa học cũng như các nhà quản lý đã bước đầutiếp cận và quan tâm đến hướng nghiên cứu này, nhằm hướng tới xây dựng mộtngân hàng dữ liệu mã vạch DNA quốc gia cho các loài sinh vật (động vật, thựcvật, vi sinh vật, ) phục vụ phân loại, giám định, chẩn đoán bệnh, bảo tồn và quản

lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở nước ta

Năm 2003, Paul Hebert đưa ra khái niệm đầu tiên về mã vạch DNA nhằmgiúp nhận diện các mẫu vật Mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn nằmtrong hệ gen của sinh vật như một chuỗi kí tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinhvật với nhau [26]

Ở Việt Nam, nghiên cứu về mã vạch DNA được triển khai ở một số cơ sởnghiên cứu Tuy nhiên, các nghiên cứu này còn nhỏ lẻ, tập trung trên một số đốitượng sinh vật, chưa có tính hệ thống, đồng bộ nên chưa thể xây dựng được cơ sở

dữ liệu về mã vạch DNA Vũ Thị Thu Hiền và Đinh Thị Phòng (2011) đã sử dụng

kỹ thuật DNA vào việc đánh giá mối quan hệ di truyền tập đoàn cây gỗ trắc đỏ

(Dalbergia cochinchinensis) ở Việt Nam đang có nguy cơ tuyệt chủng Kết quả

nghiên cứu đã cho thấy, trong số 51 chỉ thị phân tử (28 chỉ thị RAPD và 23 chỉ thị

ISSR) phân tích cho 35 mẫu D cochinchinensis thì có 31/51 chỉ thị (12/28 RAPD

và 19/23 ISSR) cho tính đa hình Tổng số có 163 phân đoạn DNA được nhân bảnthì có 99 phân đoạn đa hình (chiếm 60,74%), số lượng các phân đoạn nhân bảndao động từ 1 đến 8 với kích thước nhân bản trong khoảng 250 bp đến 2000 bp

Mối quan hệ di truyền của 35 mẫu D cochinchinensis được thể hiện trên sơ đồ

hình cây, đã phân ra làm 02 nhánh và có hệ số sai khác di truyền dao động trongkhoảng 5,1% (1-0,949) đến 29,3% (1-0,707) Nhánh chính I duy nhất là mẫu DC9với hệ số sai khác di truyền với các mẫu còn lại khoảng 29,3% (1-0,707) Nhánhchính II bao gồm 34 mẫu còn lại và có hệ số sai khác di truyền dao động trongkhoảng từ 5,1% (1-0,949) đến 26,0% (1-0,740) [7]

Năm 2013, Trần Thu Hoa và cộng sự đã tiến hành “khảo sát đặc tính dược

liệu và bước đầu định danh bằng trình tự gen ITS và matK cho một mẫu Ngải mới

tìm thấy ở vùng núi Cấm - An Giang” nhằm hướng đến ứng dụng trong việc điềuchế các thuốc chữa bệnh, nhóm nghiên cứu đã thu thập được hơn 20 mẫu cây họGừng có tên bắt đầu bằng chữ “Ngải” tại vùng núi Cấm Đặc điểm chung của cácmẫu này là hình thái của chúng khá giống nhau Trong đó, loài “Ngải sậy củ lớn”(tên phổ thông thường gọi ở vùng núi Cấm, Tịnh Biên, An Giang) đã được chứngminh là cây thuốc có tiềm năng trị ung thư Nhóm nghiên cứu đã xây dựng câyphát sinh loài [8]

Hà Văn Huân (2014) đã lựa chọn gen matK để làm mã vạch phục vụ cho các

nghiên cứu về đa dạng di truyền, phân loại và giám định loài góp phần nâng caohiệu quả bảo tồn nguồn gen và phát triển loài Sến mật ở Việt Nam Trên cơ sở các

thông tin của gen matK đã công bố, một cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế để nhân dòng gen matK từ DNA tổng số của 3 mẫu Sến mật trồng tại Thanh Hóa (S1, S2 và S3) Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng: Trình tự nucleotit của gen matK

phân lập từ mẫu S1, S2 và S3 dài 1521 nucleotit, trong đó, trình tự nucleotit của

gen matK ở mẫu S1 và S3 giống nhau 100%, trình tự nucleotit của mẫu S2 có sai

khác với hai mẫu S1 và S3 duy nhất 1 nucleotit ở vị trí 877 (C được thay thế bằng

G) Trình tự nucleotit của gen matK phân lập từ mẫu S1, S2 và S3 (được ký hiệu

là Senthanhh) có sự tương đồng đến 98,43% so với trình tự nucleotit của gen

matK ở cây Sến lá to (Madhuca macrophyll) đã công bố trên GenBank (mã số:

DQ924091.1) “Senthanhh” có thể được sử dụng là cơ sở dữ liệu quan trọng phục

vụ cho các nghiên cứu về đa dạng di truyền, phân loại và giám định loài góp phầnnâng cao hiệu quả bảo tồn nguồn gen và phát triển loài Sến mật ở Việt Nam [10].Năm 2015, Hà Văn Huân và cộng sự đã tiến hành “ Xác định đoạn mã vạch

DNA cho Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis) loài cây đặc hữu của Việt Nam” Nghiên cứu đã nhân bản thành công đoạn gen matK từ nguồn DNA

tổng số của loài Trà hoa vàng bằng kỹ thuật PCR Đã xác định được trình tự

nucleotide của đoạn gen matK của các mẫu sản phẩm PCR có kích thước 951 bp.

So sánh cho thấy không có sự khác biệt về trình tự nucleotide của đoạn gen matK

ở các lần lặp lại và các mẫu trong cùng một loài Kết quả so sánh cho thấy trình tự

nucleotide của đoạn gen matK ở cây Trà hoa vàng Tam Đảo so với ở cây Trà vàng

lá dày chỉ sai khác 1 nucleotide (thay A bằng G) ở vị trí 508, so với ở loài Tràvàng petêlô thì có 1 nucleotide sai khác (thay C bằng A) ở vị trí 613 Trình tự

đoạn gen matK phân lập được có thể là một trong các chỉ thị dùng để phân loại các

loài Trà hoa vàng của Việt Nam [11]

Lê Thanh Hương và cộng sự (2017) đã nghiên cứu “ Ứng dụng mã vạch DNA

hỗ trợ định loại loài một số mẫu sâm thuộc chi nhân sâm (Panax L.)” Trong nghiên cứu này, 5 mã vạch phân tử tiềm năng là 18S, ITS, matK, psbA - trnH và rbcL được sử dụng để đánh giá khả năng phân biệt loài của 11 mẫu sâm nghiên

cứu Phân tích so sánh các trình tự nhận được với 41 trình tự của 9 loài thuộc chi

Nhân sâm (Panax L.) đã được công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế cho thấy vùng

18S có độ tương đồng giữa các cặp trình tự cao nhất, trình tự của các loài tươngđồng trung bình đạt

99,87 % Tiếp đến là vùng rbcL, matK và psbA - trnH với tỷ lệ tương đồng trung

bình lần lượt là 99,27 %, 98,66 % và 96,82 % Mức độ đa hình thể hiện rõ trên

vùng ITS với tỷ lệ tương đồng trung bình thấp nhất, chỉ đạt 96,50 % Các biểu

đồ hình cây về mối quan hệ phát sinh loài cho thấy có 4 trong 11 mẫu sâm là

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) và 3 mẫu là Tam thất hoang (Panax stipuleanatus) Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy 4 mẫu có hình thái của Sâm Vũ diệp (Panax bipinnatifidus) được nhận dạng phân tử là loài Tam thất hoang Ngoài ra nghiên cứu cũng cho thấy, chỉ thị ITS và psbA - trnH là hai chỉ thị

tiềm năng, hỗ trợ định danh Sâm Ngọc Linh và Tam thất hoang [12]

Các nghiên cứu trên đã tạo tiền đề quan trọng cho hướng nghiên cứu ứngdụng chỉ thị phân tử vào việc phân loại, giám định, đánh giá đa dạng di truyền,bảo tồn và quản lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở nước ta

1.4 Các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của các loài cây thuốc

Năm 1992, Nakatomi và cộng sự đã nghiên cứu về các hợp chất alkaloid cómùi hăng của cây Cúc áo Nghiên cứu nhận thấy cặn chiết từ cây Cúc áo có khả

năng ức chế được nhiều loại vi sinh vật: Staphylococcus albus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella gallinarum, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris và nấm enzyme Candida albicans [31] Năm 2006, Mai Sỹ Tuấn và cộng

sự đã nuôi cấy in vitro thành công được cây Cúc áo Bước đầu công bố khả năng

kháng tế bào ung thư

biểu mô vòm họng, tế bào ung thư vú ở người và kháng vi sinh vật kiểm định củacặn chiết thô từ chồi cây Cúc áo nuôi trên môi trường thạch [22].

Võ Thị Mai Hương và Trần Thanh Phong (2013) đã nghiên cứu dịch chiết

của quả Nhàu (Morinda citrifolia L.) đều có khả năng kháng với 4 loại vi sinh vật kiểm định gồm S aureus, Salmonella typhi, E coli và Bacillus pumilus Trong đó, loài S aureu là chủng nhạy cảm nhất với dịch chiết [13] Năm 2015, Bùi Thị Lê Minh và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của tỏi (Allium sativum L.) trên vi khuẩn E coli và ảnh hưởng của tỏi lên sự sinh trưởng của gà được bổ sung

tỏi tươi vào khẩu phần thức ăn tại Đại học Cần Thơ Kết quả nghiên cứu cho thấy

các khuẩn E.coli nhạy cảm với dịch chiết tỏi tươi với giá trị MIC 12,5-35 µg/ml;

sự tăng trọng và hệ số chuyển hóa thức ăn ở các khẩu phần ăn có bổ sung thêm tỏi

và không bổ sung thêm là khác nhau, việc bổ sung thêm tỏi tươi vào khẩu phần

thức ăn của gà phòng được bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E.coli gây ra [18].

Năm 2017, Bùi Kim Anh và cộng sự bước đầu nghiên cứu thành phần hóahọc và hoạt tính sinh học của Củ ngải đen Từ dịch chiết methanol của thân rễ ngải

đen (Kaempferia parviflora) nhóm nghiên cứu đã phân lập được 6 hợp chất tectochrysin (1), apigenin 7,4'-dimethyl ether (2) 3,5,7-trimethoxyflavon (3), 5,7-

dimethoxyflavon (4), β-sitosterol (5) và daucosterol (6) Cấu trúc của các hợp chất

được xác định bằng việc phân tích các dữ liệu phổ và so sánh với số liệu đã công

bố Cặn chiết MeOH và hợp chất 4 thể hiện hoạt tính độc tế bào ở dòng ung thưbiểu mô-KB với giá trị IC50 lần lượt là 55,21 và 14,95 μg/ml [1]

Nguyễn Thị Hồng Anh và cộng sự (2017) đã phân lập các hợp chất phenolic

từ cặn ethyl acetate của cây Tỏa dương Từ cặn ethyl acetate của cây Tỏa dương, 4

hợp chất đã được phân lập bao gồm epoxyconiferyl alcohol (1), salicifoliol (2), 5-(hydroxymethyl)-2-furaldehyd (3) và ethyl caffeat (4) Cấu trúc của các hợp chất

này được xác định bằng các phương pháp phổ như 1D - NMR, ESI - MS và sosánh với các dữ liệu đã công bố Các hợp chất này đều được phân lập lần đầu tiên

từ cây Tỏa dương Hợp chất 1, 2 và 3 được công bố lần đầu tiên từ

chi Balanophora [2].

Lê Việt Dũng và cộng sự nghiên cứu thành phần hóa học của phần trên mặtđất cây Lấu thu hái tại Việt Nam vào năm 2017 Kết quả nghiên cứu cho thấy từ

dịch chiết ethanol 96% phần trên mặt đất của cây Lấu (Psychotria asiatica L.) đã

phân lập được 5 hợp chất β-sitosterol (1), 2 - [(N - benzoylphenylalanyl) - amino]

- 3 - phenylpropyl benzoat (2), asperglaucid (3), daucosterol (4) và catechin (5).

Cấu trúc các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ NMR, MS,

kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo Trong đó, hai hợp chất (2) và (5) lần đầu

tiên được phân lập từ cây Lấu [6]

1.5 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro

Với sự phát triển của khoa học công nghệ, hiện nay trên thế giới đã phát triển

nhiều phương pháp thử các hoạt tính sinh học in vitro có thời gian thực hiện ngắn

nhưng cho kết quả chính xác cao Có thể phân loại các phương pháp này bằng kỹthuật đưa chất thử vào hệ thử [23]

Phương pháp dùng khoanh giấy trên môi trường đặc: Nguyên tắc của

phương pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được tẩm vào khoanh giấy,khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh ốngtrụ đựng chất Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh (Hình1.5A)

Phương pháp đục lỗ thạch trên môi trường đặc: Nguyên tắc của phương

pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được cho vào giếng thạch, khuếchtán vào lớp thạch ức chế sự phát triển của vi khuẩn trên bề mặt thạch Vùng ức chếcàng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh

Phương pháp dùng ống trụ trên môi trường đặc: Nguyên tắc của phương

pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được cho vào ống trụ, khuếch tánvào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh ống trụ Vùng

ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh (Hình 1.5B)

Phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng: Nguyên tắc của phương

pháp là dùng hàng loạt ống nghiệm chứa môi trường lỏng, có chất dinh dưỡngthích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn định nghiên cứu Thêm những nồng độkhác nhau của chất nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn vào các ống Xác định nồng

độ thấp nhất của chất nghiên cứu ức chế được sự phát triển của vi khuẩn Nồng độnày được gọi là nồng độ tối thiểu ức chế (MIC: minimal inhibitory concentration).Phương pháp này còn được gọi là phương pháp hòa loãng 2 lần liên tiếp hoặcphương pháp hệ nồng độ (Hình 1.5C).

A B

C D

Hình 1.5 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro

(A) Phương pháp dùng khoanh giấy trên môi trường đặc; (B) Phương phápdùng ống trụ trên môi trường đặc; (C) Phương pháp hệ nồng độ trong môi trườnglỏng; (D) Phương pháp vi định lượng trong môi trường lỏng

Phương pháp vi định lượng trong vi môi trường lỏng: Nguyên tắc của

phương pháp này chủ yếu cũng như phương pháp hòa loãng 2 lần liên tiếp, nhưngphải có dàn máy ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay: thử nghiệm miễndịch gắn enzyme), nên hiện đại hơn, nhạy hơn, nhanh hơn, tự động, tiết kiệm và

có tính định lượng cao hơn so với phương pháp hệ nồng độ thông thường ở chỗ:(1) Kỹ thuật thông thường chỉ dùng một hoặc vài ba dãy thí nghiệm, trong khi ởđây dùng 8 dãy thí nghiệm; (2) Kỹ thuật thông thường dùng 6-8 độ pha loãng khácnhau của chất thử còn ở đây có thể dùng đến 11 độ pha loãng; (3) Kỹ thuật thông

thường đọc kết quả bằng mắt thường (có thể cho thêm chỉ thị TTC(Triphenyltetrazolium Chloride)), nhưng ở đây được xác định bằng cách đo mật độ quanghọc ở bước sóng 492 nm của dàn máy ELISA (Hình 1.5D).

Phương pháp sinh tự ký (Bioautography): Phương pháp này sử dụng khi

đã xác định được dịch chiết toàn phần của một dược liệu nghiên cứu có tác dụngkháng khuẩn trên một loại vi khuẩn nào đó và muốn xác định xem thành phần nàotrong dược liệu này có tác dụng Nguyên tắc tương tự như các phương pháp sửdụng môi trường đặc, sau khi chạy sắc ký dịch chiết tổng có hoạt tính trên bảnmỏng, tiến hành láng môi trường thạch đặc có chứa vi khuẩn nghiên cứu, ủ 18-24h

để xác định vùng vết chất làm vi khuẩn không mọc được; đó là chất có tác dụngkháng khuẩn Để phát hiện vi khuẩn mọc được dễ dàng nên dùng chỉ thị màu TTC(Hình 1.6)

Hình 1.6 Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro sinh tự ký 1.6 Vai trò của polyphenol, coumarin, dẫn xuất của flavon và flavonol

Vai trò của polyphenol: (1) Các polyphenol là một chất vận chuyển điện tử

trong quá trình hô hấp (2) Là chất điều khiển, chất đặc trưng cho mỗi loài về màusắc, mùi vị (3) Polyphenol có vai trò như những kháng thể chống lại tác nhân gâybệnh (4) Nhiều polyphenol có hoạt tính của vitamin PP có tác dụng làm bền thànhmạch, hạn chế các hiện tượng chảy máu dưới da (5) Polyphenol là chất chống oxyhóa (6) Polyphenol có khả năng chống ung thư, bảo vệ hệ tim mạch, chống lão hóa[4]

Vai trò của dẫn xuất của flavon và flavonol: Flavonol đã được chứng minh

là có một số các hoạt tính sinh học và dược lý như: chống dị ứng, chống viêm,

chống oxy hóa, chống vi khuẩn (kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus), chốngưng thư, hoạt tính chống tiêu chảy, ức chế enzyme topoisomerase gây đột biếnDNA trong bạch cầu.

(1) Tác dụng chống oxy hóa: Dẫn xuất của flavon và flavonol sinh ra các gốc

tự do bền vững hơn các gốc tự do được hình thành trong quá trình bệnh lý (viêmnhiễm, ung thư, lão hóa …) Các gốc tự do tạo bởi flavon và flavonol phản ứngvới các gốc tự do hoạt động và trung hòa chúng nên không tham gia vào dâychuyền phản ứng oxy hóa tiếp theo

(2) Tác dụng đối với enzyme: (i) Làm tăng hoạt tính của proline hydroxylase

là một enzyme quan trọng trong quá trình làm lành vết thương và tạo sẹo (ii) Kìmhãm các enzyme lypoxygenase và enzyme tổng hợp prostaglandin, chất chuyểnacid béo không no về các dạng dẫn xuất chứa oxy

Nhờ các tác dụng sinh học đối với enzyme mà các dẫn xuất của flavon vàflavonol có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, mau chóng làm lànhvết thương, giảm các nguy cơ về tim mạch,…

(3) Tác dụng kháng sinh, chống viêm nhiễm: Hầu hết các flavon và flavonolđều có tác dụng chống viêm nhiễm và kháng khuẩn bằng cách kìm hãm sự hô hấphay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucose Trong các dòng tế bào người,Herpesvirus hominis bị kìm hãm bởi quercetin - một flavonol, khi thêm quercetinvào virus gây bệnh ở người, virus sẽ bị kìm hãm nếu có vỏ bọc và chết nếu không

có vỏ bọc bảo vệ

(4) Tác dụng đối với các bệnh tim mạch: Rối loạn tim mạch có thể bị ảnhhưởng bởi chế độ ăn uống thực phẩm có chức của dẫn xuất flavon và flavonol.Nghiên cứu về bệnh tim mạch đã cho thấy cơ chế tác dụng sau đây của dẫn xuấtflavon và flavonol: ức chế đông máu, giảm nguy cơ xơ vữa động mạch, giảmhuyết áp động mạch và giảm stress oxy hóa và đường dẫn hiệu có liên quan trong

tế bào mạch máu sửa đổi cơ chế viêm mạch máu

(5) Tác dụng đối với ung thư: Trong các hướng nghiên cứu nhằm tìm ra cáchoạt chất chống ung thư, flavonoid là một trong những hợp chất được quan tâm

đặc biệt là flavon và flavonol bởi chúng là những chất có hoạt tính chống oxy hóacao, tác dụng đến nhiều hệ enzyme và ít độc đối với cơ thể sống Các kết quả thựcnghiệm cho thấy một số flavon có tác dụng chống ung thư thông qua khả nănghoạt hóa các enzyme trong gan có nhiệm vụ chuyển hóa các chất gây ung thưthành những sản phẩm có tính gây ung thư thấp hơn Lượng flavon và flavonolchế độ ăn uống có liên quan với giảm nguy cơ ung thư dạ dày ở phụ nữ và giảmnguy cơ ung thư đường tiêu ở người hút thuốc.

(6) Tác dụng kháng khuẩn: Dẫn xuất flavon và flavonol đã được chứng minh

là có tác động trực tiếp kháng khuẩn, khả năng kết hợp với các thuốc kháng sinh

và có khả năng ngăn chặn các yếu tố độc tính của vi khuẩn trong nhiều thí nghiệm

in vitro [15].

Vai trò của coumarin: (1) Chống co thắt, làm giãn động mạch vành với cơ

chế tương tự như papaverin (2) Chống đông máu, làm bền và bảo vệ thành mạch.(4) Chữa bệnh lang trắng, bệnh vảy nến Tính chất này chỉ có ở những dẫn chấtfuranocoumarin như psoralen, angelicin, xanthotoxin, imperatorin (5) Nhiều dẫnchất coumarin có tác dụng kháng khuẩn, đặc biệt nhất là novobiocin một chất

kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng có trong nấm Streptomyces niveus (6) Một

số coumarin có tác dụng chống ung thư