Các phương pháp xử lý ô nhiễm môi trường nước gây ra bởi VKL độc đã được nghiên cứu và áp dụng từ những phương pháp cơ học đơn giản như hớt váng, che sáng hay pha loãng nước hồ đến các p
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
**********************
PHẠM THANH NGA
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ CỦA CAO CHIẾT
CÂY MẦN TƯỚI (EUPATORIUM FORTUNEI TURCZ.) LÊN
SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN
LAM ĐỘC MICROCYSTIS AERUGINOSA KUTZING
TRONG CÁC THỦY VỰC NƯỚC NGỌT
Chuyên ngành: Kỹ thuật môi trường
Mã số: 9.52.03.20
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Hà Nội - 2019
Trang 2CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
Học viện khoa học và công nghệ
Hướng dẫn khoa học:
Hướng dẫn 1 GS.TS Đặng Đình Kim Hướng dẫn 2 TS Lê Thị Phương Quỳnh
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Luận án đã được bảo vệ trước Hội đồng cấp cơ sở
tại Viện Công nghệ Môi trường
vào hồi giờ ngày tháng năm
Có thể tìm hiểu Luận án tại:
Trang 31
MỞ ĐẦU
1 Lý do chọn đề tài
Ô nhiễm nguồn nước mặt là đặc biệt nghiêm trọng khi nhiều nơi trên thế giới người dân không
có nước sạch để sử dụng cho ăn uống và sinh hoạt kéo theo tỉ lệ tử vong và bệnh tật gia tăng vì sử dụng nguồn nước không đạt yêu cầu Nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến ô nhiễm nguồn nước mặt như xả trực tiếp các nguồn nước thải công nghiệp, nước thải sinh hoạt mà không qua xử lý hoặc lạm dụng quá mức phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật trong sản xuất nông nghiệp để nâng cao sản lượng lương thực đáp ứng sự gia tăng dân số thế giới trong những thập kỉ gần đây Hậu quả dẫn đến gia tăng nguồn dinh dưỡng (chủ yếu là nitơ và photpho) trong các thủy vực gây nên hiện tượng phú dưỡng mà kéo theo là “tảo nở hoa” hoặc “nở hoa của nước” Sự nở hoa của nước bản chất là sự phát triển ồ ạt của Vi khuẩn lam (VKL) và vi tảo, có khả năng sản sinh ra độc
tố tại các thủy vực, kéo theo sự nhiễm độc và cái chết của thủy hải sản, động vật nuôi, động vật hoang dã và con người Sự nở hoa của nước thường gây ra những tác động xấu lên môi trường như làm đục nước, tăng giá trị pH, giảm hàm lượng oxy hòa tan, tăng độc tố đặc biệt là độc tố microcystin do VKL tiết ra Kết quả điều tra ở các thủy vực nước ngọt cho thấy trong các loài VKL
độc gây hiện tượng nở hoa nước thì Microcystis aeruginosa chiếm đến 90% và sản sinh ba loại độc
tố nguy hiểm là độc tố gan (hepatotoxins), độc tố thần kinh (neurotoxins) và gây dị ứng da Điều nghiêm trọng là tần suất xuất hiện các loài VKL độc ngày càng tăng liên quan đến sức khỏe con người và động vật nuôi, động vật hoang dã do sử dụng nguồn nước có VKL độc Do đó ngăn ngừa
và giảm thiểu sự phát triển bùng nổ của VKL độc là vấn đề quan trọng cần phải được quan tâm Các phương pháp xử lý ô nhiễm môi trường nước gây ra bởi VKL độc đã được nghiên cứu và áp dụng từ những phương pháp cơ học đơn giản như hớt váng, che sáng hay pha loãng nước hồ đến các phương pháp lý - hóa như dùng sóng siêu âm, sử dụng ánh sáng cực tím, hoặc sử dụng các hợp chất hóa học diệt tảo, các hợp chất có tính oxi hóa cao, các kim loại và nano kim loại Những phương pháp này bên cạnh những ưu điểm dễ thấy như hiệu quả tác động nhanh, rõ rệt trong thời gian ngắn nhưng còn tồn tại những hạn chế như tốn kém kinh phí triển khai hoặc gây ra sự ô nhiễm môi trường thứ cấp, tác động không chọn lọc lên các loài sinh vật do đó gây suy giảm đa dạng sinh học đặc biệt sử dụng hóa chất sau một thời gian quan sát thấy hiện tượng nhờn thuốc và vì thế chúng bị hạn chế triển khai ở quy mô thực tế Do đó phương pháp sinh học, đặc biệt dùng các cao chiết có nguồn gốc thực vật để ức chế sinh trưởng VKL đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu vì tính hiệu quả và thân thiện với môi trường
Cây Mần tưới Eupatorium fortunei Turcz, thuộc họ Cúc (Asteraceae) là loài cây cỏ lâu năm, được sử
dụng trong dân gian như một loại thuốc chữa bệnh và được chứng minh hoạt tính kháng khuẩn trong nhiều nghiên cứu khác nhau Năm 2013, Nguyễn Tiến Đạt và cộng sự đã tiến hành khảo sát và so sánh hoạt tính
diệt VKL độc M aeruginosa của nhiều loại cao chiết từ các loài thực vật khác nhau tại Việt Nam cho thấy
cao chiết cây Mần tưới có hiệu quả nhất để kiểm soát bùng nổ Vi khuẩn lam độc Kết luận này được khẳng định bởi các công bố của Phạm Thanh Nga trong những năm tiếp theo Tuy nhiên đây mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu khảo sát hoạt tính diệt VKL độc của cao chiết cây Mần tưới
Từ những lý do trên đề tài luận án tiến sỹ: “Nghiên cứu tác dụng ức chế của cao chiết cây Mần
tưới (Eupatorium fortunei Turcz.) lên sinh trưởng của Vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa
Kützing trong các thủy vực nước ngọt” đã được lựa chọn để thực hiện Luận án có tính chất kế thừa
kết quả của những nghiên cứu trước, tuy nhiên sẽ giải quyết nhiều vấn đề còn tồn tại
2 Mục tiêu của luận á n
Tạo được cao chiết thực vật ức chế hiệu quả sinh trưởng của Vi khuẩn lam độc Microcystis
aeruginosa
3 Nhiệm vụ của luận á n
- Xây dựng quy trình tạo cao chiết tổng, cao chiết phân đoạn, các chất sạch phân lập từ cây Mần tưới
Trang 42
Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng ức chế của cao chiết tổng Mần tưới lên sinh trưởng của M
aeruginosa và đánh giá an toàn sinh thái
- Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng ức chế của cao chiết phân đoạn etyl axetat và cao chiết phân
đoạn nước Mần tưới lên sinh trưởng của M aeruginosa và đánh giá an toàn sinh thái
- Nghiên cứu phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học của 07 hợp chất hóa học được phân lập
từ cây Mần tưới
- Nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng cao chiết để kiểm soát bùng nổ Vi khuẩn lam trong các mẫu nước hồ tự nhiên
4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
- Ô nhiễm môi trường nước, đặc biệt hiện tượng phú dưỡng kéo theo sự bùng phát sinh khối VKL với việc giải phóng độc tố microcystin đã nhận được nhiều sự quan tâm, nghiên cứu trong thời gian gần đây Sử dụng cao chiết từ thực vật để kiểm soát bùng nổ sinh khối VKL thể hiện nhiều ưu điểm vượt trội so với các phương pháp truyền thống được áp dụng trước đây Kết quả của luận án cung cấp cơ sở khoa học, chứng minh tính khả thi khi áp dụng cao chiết thực vật như một hoạt chất ức chế và diệt chọn lọc VKL độc để kiểm soát bùng phát sinh khối VKL độc
5 Đóng góp mới của luận án
- Phân lập được 02 chất mới (7,8,9 - trihydroxythymol và 8,10-didehydro-7,9-trihydroxythymol)
và đánh giá tác động của 02 chất này lên M aeruginosa trong dải nồng độ từ 1,0 µg/mL đến 50 µg/mL
với hiệu quả ức chế sinh trưởng ghi nhận từ 39,1÷41,2 % và 20,0 – 25,0 %, tương ứng sau 72 giờ
- Bước đầu ghi nhận khả năng ức chế sinh trưởng M aeruginosa ≥ 90% tại nồng độ 500 µg/mLở quy mô phòng thí nghiệm và hiệu quả trên 60 % quy mô ngoài trời với mẫu nước hồ tự
nhiên Độc tính của cao chiết tổng etanol Mần tưới đối với Daphnia magna và Lemna minor ghi nhận là thấp hơn so với M aeruginosa
Chương 2 Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu
Trình bày đối tượng nghiên cứu, các phương pháp nghiên cứu và mô tả thực nghiệm
Chương 3 Kết quả và thảo luận
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Công thức cấu tạo các chất sạch được phân lập từ cây Mần tưới Eupatorium fortunei
Tại Việt Nam, Mần tưới cùng nhiều loài thực vật khác đã được khảo sát ảnh hưởng ức chế
lên sinh trưởng của M aeruginosa và C vulgaris [2, 3] Kết quả thực nghiệm cho thấy những ưu điểm nổi bật của cao chiết tổng Mần tưới so với các loài thực vật khác đó là khả năng ức chế chọn
lọc lên VKL độc M aeruginosa và tảo lục C vulgaris Hiệu suất tổng hơp cao chiết tổng methanol,
cao chiết tổng nước của Mần tưới tương ứng được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1 Hiệu suất tạo cao chiết tổng trong các dung môi khác nhau
(g cao chiết/100g mẫu thực vật khô)
Etanol 9,17 Metanol 12,75
W (Nước) 7,75
Trang 53
Bảng 3.2 Hiệu suất tạo cao chiết phân đoạn từ cao chiết tổng etanol Mần tưới
Cao chiết phân đoạn n-hexan 18,97 Cao chiết phân đoạn etyl axetate 16,10 Cao chiết phân đoạn nước (W) 60,27
Hình 3.1 Quy trình phân lập các hợp chất sạch từ từ cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới
Trang 6(1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 7,20 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-5), and 6,81 (1H, dd, J = 7,5, 2,0 Hz, H-6)], một nhóm methyl bậc 4 tại δH
1,58 (3H, s, H-10) Ngoài ra còn có các tín hiệu của proton ở vùng trường trung bình δH 4,57; 3,74 và 3,65
Trang 7dữ liệu trên gợi ý hợp chất EfD4.7 có dạng khung thymol khá phổ biến trong chi Eupatorium
Thực tế các số liệu 1H và 13C-NMR của EfD4.7 rất tương đồng với số liệu đã công bố của hợp chất 8,9-dihydroxythymol, ngoại trừ sự xuất hiện của nhóm hydroxymethyl thay vì nhóm methyl tại C-7 Phân tích trên phổ hai chiều HMBC cũng đã chỉ ra các tương tác từ H-7 (δH
4,52) đến C-1, C-2 và C-6, từ H-9 (δH 3,76 và 3,65) đến C-4, C-8 và C-10, và từ H-10 (δH 1,58) đến C-4, C-8 và C-9 Như vậy có thể kết luận hợp chất EfD4.7 là 7,8,9-trihydroxythymol, một hợp chất mới lần đầu tiên được công bố
Hình 3.3 Hợp chất
8,10-
didehydro-7,9-dihydroxythymol(EfD4.8)
Chất rắn màu trắng HR-ESI-MS (positive):
m/z181.0864 [M + H]+ (tính toán lý thuyết trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS 181,0865 cho công thức
C10H13O2).1H NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C NMR (125 MHz, CD3OD) [Bảng 3.4] Hợp chất EfD 4.8 thu được dưới dạng chất rắn màu trắng Phổ 1H và 13C-NMR của EfD4.8 rất tương đồng với phổ của EfD4.7 ngoại trừ sự xuất hiện của 1 nhóm methylene ngoại vòng (δC/δH 114,8/5,41 and 5,20) thay vì nhóm methyl C-10 như chất EfD4.7 Điều này cũng được khẳng định dựa vào số liệu phổ khối lượng phân giải cao Công thức phân tử C10H13O2 của EfD4.8 được xác định dựa trên pic ion phân tử tại m/z Các tương tác HMBC cũng khẳng định cấu trúc của hợp chất EfD4.8
Trang 86
Hình 3.4 HSQC spectra of EfD4.7 Hình 3.5 HMBC of EfD4.7
Hình 3.6 HSQC spectra of EfD4.7 Hình 3.7 HMBC of EfD4.7
Trang 93.2.1 Đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng VKL độc Microcystis aeruginosa TC3 của các
cao chiết tổng Mần tưới
Hình 3.8 Ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới nồng độ 200 (A) và 500 µg/mL (B) lên sinh trưởng của
M aeruginosa tính theo mật độ quang (tại bước sóng 680 nm)
Sự ức chế sinh trưởng của chủng M.aeruginosa được quan sát rõ nhất dưới ảnh hưởng
của cao chiết etanol Mần tưới nồng độ 500 µg/mL với hiệu suất chế (IE) tính theo mật độ quang
là 91,50 % cao hơn so với các cao chiết methanol (IE là 78,50) và cao chiết nước (IE là 61,72
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50
B
A
Trang 108
Hình 3.9 Ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới nồng độ 200 (A) và 500 µg/mL (B) lên sinh trưởng
của M aeruginosa tính theo hàm lượng chlorophyll a
Trong khi đó tại mẫu thí nghiệm bổ sung cao chiết etanol và metanol nồng độ 500 µg/mL sinh khối VKL đều thấp hơn với mẫu đối chứng ở các thời điểm khảo sát T3, T6 và T10 (p<0,05) ghi nhận hiệu quả ức chế sinh trưởng tại ngày T10 là 88,28 % và 69,10 % Mẫu bổ sung cao chiết nước ở 500 µg/mL ghi nhận hiệu quả ức chế là 52,51 % với sinh khối tại ngày T10 là 3,12
± 0,37 µg/L, tuy nhiên ở nồng độ 200 µg/L lại kích thích sinh trưởng nhẹ so với mẫu đối chứng (p<0,05) Các mẫu cao chiết thực vật được tạo ra trong dung môi etanol thể hiện hoạt tính chống oxy hóa cao hơn đồng thời có chứa hàm lượng các hợp chất phenol cao hơn so với cao chiết từ dung môi metanol và nước Ngoài ra, các hợp chất phenol đã được chứng minh trong
các nghiên cứu trước có khả năng ức chế sinh trưởng lên chủng M aeruginosa Dung môi etanol được lựa chọn để điều chế cao chiết tổng Mần tưới phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn
3.2.1 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết tổng etanol Mần tưới lên sinh trưởng của Microcystis aeruginosa và Chlorella vulgaris
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00
Trang 119
Hinh 3.10 Sinh trưởng của M.aeruginosa
dưới tác dụng của cao chiết tổng etanol
Mần tướitính theo mật độ quang (A),
hàm lượng chlorophyll a (B) và mật độ
tế bào (C)
Hinh 3.11 Sinh trưởng của C vulgaris dưới tác dụng của cao chiết tổng etanol Mần tưới tính theo mật độ quang (A), hàm lượng chlorophyll a (B) và mật độ tế bào (C)
Kết quả nghiên cứu trong cả hai dải nồng độ 200 và 500 µg/L với hai phương pháp phân
tích đánh giá sinh trưởng của VKL đều chứng minh cao chiết tổng etanol Cỏ lào thể hiện độc tính mạnh hơn đối với chủng M.aeruginosa so với cao chiết tổng etanol Mần tưới
Bảng 3.5 cho thấy cao chiết etanol Mần tưới thể hiện sự tác động có chọn lọc rõ rệt giữa hai
đối tượng M.aeruginosa và C vulgaris với các giá trị ức chế sinh trưởng lên C vulgaris ghi nhận được đều thấp hơn M aeruginosa ở cả ba phương pháp phân tích (p<0,05)
Bảng.3.5 Hiệu qủa ức chế sinh trưởng của cao chiết etanol Mần tưới lên M.aeruginosa và
IE % (Chla)
IE (TB)
IE % (OD)
IE % (Chla)
IE (%) (TB)
200 µg/mL 56,10 61,32 51,72 32,89 35,89 41.73
500 µg/mL 87,80 90,13 68,6 70,59 66,42 55,61
3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn lên sinh trưởng của Microcystis
aeruginosa và Chlorella vulgaris
Hình 3.12 Sinh trưởng của M aeruginosa dưới tác dụng của cao chiết phân đoạn etyl axetat (A)
và cao chiết phân đoạn nước (B) Mần tưới tính theo mật độ quang
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60
Trang 1210
Hình 3.13 Sinh trưởng của M.aeruginosa dưới tác dụng của cao chiết phân đoạn ethyl axetat (A)
và cao chiết phân đoạn nước (B) Mần tưới tính theo hàm lượng chlorophyll a
Kết quả chỉ ra trong hình 3.12 và 3.13 bằng phương pháp đo mật độ quang và hàm lượng chlorophyll a đều phản ảnh xu hướng tương tự, chứng minh cao chiết phân đoạn etyl acetat
ảnh hưởng mạnh hơn lên sinh trưởng của M.aeruginosa so với cao chiết phân đoạn nước sau
10 ngày thí nghiệm Tại nồng độ 200 và 500 µg/mL cao chiết phân đoạn n ước ức chế nhẹ lên
M.aeruginosa ghi nhận giá trị tại ngày T10 đo mật độ quang là 0,354 ± 0,015 và 0,199 ±
0,016, giá trị đo hàm lượng chlorophyll a tương ứng là 5,76 ± 0,38 và 3,96 ± 0,223 µg/L,
thiết lập hiệu suất ức chế tương ứng lên sinh trưởng M.aeruginosa tại 200 µg/mL là 18-20%
và tại 500 µg/mL là 45 -60% Kết quả phân tích đối với cao chiết etyl axetat cho thấy hiệu
quả ức chế rõ rệt tại nồng độ 200 và 500 µg/mL sau 10 ngày tác động lên M.aeruginosa, mật
độ quang tương ứng là 0,102 ± 0,03; 0,031 ±0,001 và hàm lượng chlorophyll a là 1,78± 0,018
và 0,27 ± 0,019 µg/L, hiệu suất sinh trưởng cao nhất đạt trên 90% đối với công thức thực nghiệm etyl axetat 500 µg/mL
Hình 3.14 Sinh trưởng của C.vulgaris dưới tác dụng của cao chiết phân đoạn ethyl axetat (A) và
cao chiết phân đoạn nước Mần tưới (B) tính theo mật độ quang
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50
E-W-100 E-W-200 E-W-500
Trang 1311
Hình 3.15 Sinh trưởng của C.vulgaris dưới tác dụng của cao chiết phân đoạn ethyl axetat (A) và
cao chiết phân đoạn nước Mần tưới (B) tính theo hàm lượng chlorophyll a
So sánh với tác động lên sinh trưởng M.aeruginosa, đối với C.vulgaris các cao chiết thể hiện
độc tố thấp hơn (p<0,05) Cao chiết nước tại 500 µg/mL, ngày T10 giá trị mật độ quang 0,260 ± 0,013, thấp hơn không đáng kể với công thức đối chứng (OD 0,391 ±0,0228) ghi nhận hiệu quả ức chế là 32,33%, tương tự với kết quả đo hàm lượng chlorophyl a với IE là 40,16% Cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới thể hiện độc tính mạnh hơn so với cao chiết phân đoạn nước khi tác động
lên C.vulgaris Tại ngày T10 mẫu thực nghiệm C.vulgaris phơi nhiễm cao etyl axetat tại nồng độ
500 µg/mL cho giá trị OD là 0,090 ± 0,0136, chlorophyll a 11,25 ± 2,21 µg/L so cho giá trị ức chế sinh trưởng tương ứng là 76,98 % và 78,40 %
Bảng 3.6 Hiệu suất ức chế sinh trưởng của cao chiết phân đoạn ethyl axetat và cao chiết phân
đoạn nước Mần tưới M aeruginosa và C.vulgaris tại nồng độ 200 và500 µg/mL
M.aeruginosa C.vulgaris
IE % (DO)
IE % (Chla)
IE % (DO)
IE % (Chla) E-Ethyl 200 78,79 74,68 64,19 56,59 E-Ethyl 500 93,55 96,16 76,98 78,40 E-W-200 26,40 18,07 15,43 21,37 E-W-500 58,62 43,46 32,33 40,16
Từ bảng 3.6 so sánh hiệu quả ức chế sinh trưởng của cao chiết phân đoạn etyl axetat và
cao chiết phân đoạn nước Mần tưới lên M.aeruginosa và C.vulgaris chúng tôi lựa chọn cao
chiết phân đoạn etyl axetat cho bước nghiên cứu tiếp theo phân lập các chất sạch để thử hoạt
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
E- W-100 E- W-200 E- W-500