Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn chịu mặn có khả năng cố định đạm, tổng hợp INDOLE ACETIC ACID trên mô hình canh tác lúa – tôm ở Bạc Liêu, Sóc Trăng và Kiên Giang

Những nội dung nghiên cứu của đề tài được thực hiện nhằm đạt đến mục tiêu tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn bản địa, chịu mặn có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA hiệu quả lên cây

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn thầy PGS TS Nguyễn Hữu Hiệp, thầy đã tận tình hướng dẫn khoa học, tư vấn thiết kế các thí nghiệm, hướng dẫn cách tiếp cận các kiến thức khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu, từ đó giúp tôi hoàn thành luận án Xin Chân thành cảm ơn và tri ân sâu sắc đến thầy

Chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh học, Khoa Sau đại học đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập và nghiên cứu Chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Nghiên Cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh học, trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập và nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Sở Giáo Dục và Đào Tạo tỉnh Sóc Trăng, Lãnh đạo trường THPT Hoàng Diệu đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Chân thành cảm ơn em Nguyễn Thị Thúy Duy và các em sinh viên đã hỗ trợ tôi hoàn thành nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo và cán bộ Trung tâm giống cây trồng tỉnh Sóc Trăng đã hỗ trợ tôi khảo nghiệm các dòng vi khuẩn trong điều kiện ngoài đồng

Sau cùng xin được cảm ơn những người thân trong gia đình và đồng nghiệp đã hết lòng giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu

TÓM TẮT

Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn chịu mặn có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA trên mô hình canh tác lúa – tôm ở Bạc Liêu, Sóc Trăng

và Kiên Giang” được thực hiện từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 3 năm 2018

Những nội dung nghiên cứu của đề tài được thực hiện nhằm đạt đến mục tiêu tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn bản địa, chịu mặn có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA hiệu quả lên cây lúa chịu mặn, sản xuất theo mô hình canh tác lúa – tôm Kết quả nghiên cứu của đề tài đạt được như sau:

Hai trăm mười sáu dòng vi khuẩn đã được phân lập từ 65 mẫu đất vùng rễ lúa chịu mặn ở 3 tỉnh Bạc Liêu, Sóc Trăng và Kiên Giang trên môi trường Burk không đạm có bổ sung muối 10‰ Tất cả các dòng vi khuẩn được phân lập đều

có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA Ba mươi lăm dòng vi khuẩn vừa có khả năng tổng hợp NH4+ với hàm lượng ≥ 1,0 µg/mL vừa tổng hợp IAA với hàm lượng ≥ 15,0 µg/mL được chọn để định danh và khảo nghiệm khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA hữu hiệu lên cây lúa LP5 Hai mươi dòng vi khuẩn thuộc

chi Bacillus, 4 dòng thuộc chi Burkholderia, 3 dòng thuộc chi Enterobacter, 3 dòng thuộc chi Geobacillus và 1 dòng thuộc chi Paracocus

Đánh giá hiệu quả của 35 dòng vi khuẩn được tuyển chọn lên chiều cao và trọng lượng khô lên cây lúa LP5 trồng trong dung dịch khoáng Yoshida ở giai

đoạn 20 ngày, 4 dòng vi khuẩn: Bacillus sp PL2, Burkholderia sp PL9, Enterobacter sp LĐ1 và Acinetobacter sp GH1-1 có độ hữu hiệu cao để tiến

hành khảo nghiệm trên cây lúa LP5 ở điều kiện nhà lưới

Hai dòng vi khuẩn Burkholderia sp PL9 và Acinetobacter sp GH1-1 có

khả năng cung cấp từ 25 – 50% nhu cầu đạm cho sinh trưởng và phát triển của cây lúa ở điều kiện nhà lưới

Kết quả thí nghiệm ngoài đồng cho thấy 2 dòng vi khuẩn Burkholderia sp PL9 và Acinetobacter sp GH1-1 có ảnh hưởng tốt đến sự tăng trưởng và năng

suất của giống lúa LP5 trồng trên nền đất nhiễm mặn sản xuất lúa theo mô hình lúa – tôm ở xã Gia Hòa 2, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng Chủng dòng vi

khuẩn Burkholderia sp PL9 hoặc Acinetobacter sp GH1-1 kết hợp với bón

50% phân đạm cho năng suất lúa khác biệt không ý nghĩa so với lúa không chủng vi khuẩn và có bón 100%N hóa học Như vậy, trồng lúa LP5 ở đất nhiễm mặn trong mô hình lúa – tôm có chủng vi khuẩn và bón bổ sung 50%N giúp tiết kiệm 50% phân bón đạm hóa học

Từ khóa: Cố định đạm sinh học, năng xuất, sản xuất lúa – tôm, tổng hợp

IAA, vi khuẩn chịu mặn

ABSTRACT

Thesis “Isolation and identification of salinity tolerant bacteria which can fix nitrogen and synthesize IAA in rice production system rice-shrimp in Bac Lieu, Soc Trang and Kien Giang provinces″ was carried out from

December 2014 to March 2018 The purpose of this thesis was to select good indigenous bacteria which can fix nitrogen and synthesize IAA in rice production system rice-shrimp

The results of the thesis were as lested below

Two hundred and sixteen bacterial isolates were isolated from 65 rhizosphere soil samples collected from 3 provinces Bac Lieu, Soc trang and Kien Giang on nitrogen free Burk medium containing sodium chloride (10‰) These isolates could fix nitrogen and synthesise IAA Thirty five isolates had the capacity of nitrogen fixing (NH4+) ≥ 1,0 µg/mL and synthesizing IAA ≥ 15,0 µg/mL as well These strains were chosen for identifying and testing of their effectiveness on nitrogen fixing and IAA synthesizing capacity on rive variety LP15 Twenty bacterial isolates were identified as Bacillus genus, 4 isolates

belonged to Burkholderia genus, 3 isolates belonged to Burkholderia genus, 3

isolates belonged to Geobacillus and one isolate belonged to Paracoccus genus Based on the effectiveness of thirty five strains on the height and dry weight of rice seedlings grown in Yoshida medium after 20 days, 4 strains

Bacillus sp PL2, Burkholderia sp PL9, Enterobacter sp LĐ1 and Acinetobacter sp GH1-1 which had high capacity of fixing nitrogen and

synthsizing IAA were chosen to test their effectiveness on rice grown in the

nethouse Two strains Burkholderia sp PL9 and Acinetobacter sp GH1-1 had

high effectiveness on rice growth could support 25 – 50% of nitrogen for rice

growth in nethouse condition In the field experiment, strains Burkholderia sp PL9 and Acinetobacter sp GH1-1 had good effects on rice growth and yield of rice variety LP5 Rice LP5 inoculated with either strain Burkholderia sp PL9

or strain Acinetobacter sp GH1-1 and supplied 50% nitrogen had the same yield

as uninoculated rice applied 100% nitrogen So, inoculated rice grown in rice production system rice-shrimp could save up to 50% of nitrogen fertilizer

Keywords: Biological nitrogen fixation, IAA synthesis, production system

rice-shrimp, salanity tolerant bacteria, yield

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận án “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn chịu mặn có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA trên mô hình canh tác lúa – tôm ở Bạc Liêu, Sóc Trăng và Kiên Giang” này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả này chưa được dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác

Cán bộ hướng dẫn Tác giả luận án

PGS TS NGUYỄN HỮU HIỆP NGUYỄN ANH HUY

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN……… i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iii

MỤC LỤC v

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH i

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT i

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.2.2 Nội dung nghiên cứu 2

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 3

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 3

1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3

1.4.1 Thời gian nghiên cứu 3

1.4.2 Địa điểm nghiên cứu 3

1.5 Những đóng góp của luận án 3

1.6 Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học 4

1.6.1 Ý nghĩa khoa học 4

1.6.2 Ý nghĩa thực tiễn 4

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Đất nhiễm mặn và mô hình sản xuất lúa – tôm ở đồng bằng sông Cửu Long 5

2.1.1 Đất nhiễm mặn 5

2.1.2 Tính chống chịu mặn của cây lúa 6

2.1.3 Hiện trạng sản xuất lúa – tôm ở đồng bằng sông Cửu Long 8

2.2 Vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH4+ và tổng hợp IAA 10

2.2.1 Bacillus 10

2.2.2 Burkholderia 11

2.2.3 Enterobacter 11

2.2.4 Rhizobium 12

2.3 Khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA của vi khuẩn vùng rễ lúa 12

2.4 Khả năng chịu mặn của vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA 14

2.5 Cơ chế và các nhân tố ảnh hưởng đến khả năng cố định đạm của vi khuẩn 15

2.6 Tổng hợp IAA của vi khuẩn 23

2.6.1 Lược sử phát hiện IAA 23

2.6.2 Chức năng của IAA 24

2.6.3 Cơ chế tổng hợp IAA ở vi khuẩn 24

2.7 Tương tác giữa vi khuẩn vùng rễ và thực vật 26

2.7.1 Vùng rễ 26

3.1 Nội dung nghiên cứu 29

3.2 Phương tiện nghiên cứu 29

3.2.1 Vật liệu 29

3.2.2 Dụng cụ 29

3.2.3 Thiết bị thí nghiệm 29

3.2.4 Hóa chất và môi trường nuôi cấy 30

3.3 Phương pháp nghiên cứu 30

3.3.1 Thu mẫu đất 30

3.3.2 Phân lập 30

3.3.3 Khảo sát đặc điểm khuẩn lạc và vi khuẩn 32

3.3.4 Xác định khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn 33

3.3.5 Định lượng khả năng tổng hợp IAA của vi khuẩn 36

3.3.6 Định danh các dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH4+ và IAA với hàm lượng cao bằng phương pháp giải trình tự vùng gen 16S rDNA 38

3.3.7 Khảo nghiệm các dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH4+ và IAA hàm lượng cao 40

3.3.8 Cách lấy chỉ tiêu nông học của cây lúa 44

3.4 Tóm tắt các nội dung thí nghiệm 46

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

4.1 Phân lập vi khuẩn chịu mặn sống tự do từ đất sản xuất lúa – tôm có khả năng tổng hợp NH4+ và IAA 47

4.1.1 Kết quả thu mẫu từ đất sản xuất lúa-tôm 47

4.1.2 Kết quả phân lập vi khuẩn chịu mặn sống tự do trong đất sản xuất lúa – tôm, có khả năng cố định đạm NH4+ và tổng hợp IAA 47

4.2 Khả năng tổng hợp NH4+ và tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn được phân lập 50

4.2.1 Khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn được phân lập 50

4.2.2 Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn được phân lập 52

4.3 Khả năng cố định đạm của 4 dòng vi khuẩn có hiệu quả cao với cây lúa ở giai đoạn mạ, ở độ mặn 0‰, 5‰ và 10‰ 54

4.4 Định danh các dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp và tổng hợp IAA với hàm lượng cao bằng kỹ thuật sinh học phân tử 55

4.5 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH4+ và IAA với hàm lượng cao cho canh tác lúa 58

4.5.1 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm hữu hiệu đối với cây lúa trồng trong điều kiện phòng thí nghiệm 58

4.5.2 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm hữu hiệu đối với cây lúa trồng trong chậu trong điều kiện nhà lưới 60

4.5.3 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm đối với cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng 82

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 93

5.1 Kết luận 93

5.2 Đề xuất 93

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 94

TÀI LIỆU THAM KHẢO 95

PHỤ LỤC 102

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Phân loại đất mặn dựa vào các chỉ tiêu pH, EC, SAR, ESP 6

Bảng 2.2: Thang đánh giá mức độ chống chịu mặn ở giai đoạn tăng trưởng của cây lúa 7

Bảng 2.3: Khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA của vi khuẩn vùng rễ lúa đươc phân lập 12

Bảng 2.4: Thành phần cấu tạo nitrogenase 17

Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn NH4+ 35

Bảng 3.2: Giá trị đường chuẩn NH4+ 35

Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR 38

Bảng 3.4: Các nghiệm thức trong thí nghiệm 40

Bảng 3.5: Đặc tính đất thí nghiệm trồng lúa trong chậu thu ở Mỹ Xuyên, Sóc Trăng 41

Bảng 3.6: Các nghiệm thức được bố trí trong thí nghiệm 42

Bảng 3.7: Đặc tính đất thí nghiệm trồng lúa ngoài đồng ở Mỹ Xuyên, Sóc Trăng 43

Bảng 3.8: Các nghiệm thức được bố trí trong thí nghiệm 44

Bảng 4.1: Tổng hợp các mẫu đất được thu để phân lập 47

Bảng 4.2: Các dòng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ lúa nhiễm mặn ở Bạc Liêu, Sóc Trăng và Kiên Giang 48

Bảng 4.3: Tổng hợp đặc điểm khuẩn lạc các dòng vi khuẩn 49

Bảng 4.4: Tổng hợp đặc điểm tế bào vi khuẩn 50

Bảng 4.5: Hàm lượng NH4+ và IAA của 35 dòng vi khuẩn được tuyển chọn 54

Bảng 4.6: Đặc điểm của 35 dòng vi khuẩn tuyển chọn được định danh theo độ tương đồng của đoạn gen 16S rDNA 56

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của 35 dòng vi khuẩn chịu mặn lên sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa LP5 ở giai đoạn 20 ngày tuổi 59

Bảng 4.8: Chiều cao cây lúa (cm) ở các giai đoạn sinh trưởng dưới ảnh hưởng của các nồng độ đạm và vi khuẩn trong nhà lưới 61

Bảng 4.9: Số chồi/bụi ở các giai đoạn sinh trưởng dưới ảnh hưởng của các nồng độ đạm và vi khuẩn trong nhà lưới 63

Bảng 4.10: Ảnh hưởng của các mức phân đạm và các dòng vi khuẩn đến các thành phần năng suất và năng suất thực tế của cây lúa LP5 82

Bảng 4.11: Chiều cao cây lúa ở các giai đoạn sinh trưởng của các nghiệm thức thí nghiệm tại huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng, vụ Đông Xuân 2017-2018 86 Bảng 4.12: Số chồi lúa/m2 ở các giai đoạn sinh trưởng của các nghiệm thức thí nghiệm tại huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng, vụ Đông Xuân 2017-2018 87

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Sơ đồ mặt cắt ngang ruộng tôm sú – lúa truyền thống……… …9

Hình 2.2: Sơ đồ mặt cắt ngang ruộng tôm sú – lúa cải tiến……….9

Hình 2.3: Cấu trúc ruộng sản xuất theo mô hình lúa tôm……… 9

Hình 2.4: Lịch thời vụ sản xuất luân canh tôm – lúa……….10

Hình 2.5: Bản đồ hệ thống gen nif của P stutzeri A1501 (Desnoues, 2003)….16 Hình 2.6: Hệ thống gen nif của một số dòng vi khuẩn (Yan et al., 2008)…… 16

Hình 2.7: Cấu trúc không gian phân tử MoFe-protein (trái) và Fe-protein (phải) (Ibrahim et al., 1999) 17

Hình 2.8: Sơ đồ cấu trúc hóa học của nhân tố Fe và Mo (Mayer et al., 2002)…18 Hình 2.9: Cấu trúc không gian nitrogenase (Burges et al, 1996) 18

Hình 2.10: Chu trình Fe-Protein 19

Hình 2.11: Sơ đồ quá trình khử N2 thành NH3 (Moore et al., 1998) 20

Hình 2.12: Sơ đồ cơ chế cố định đạm sinh học (Moore et al., 1998) …….21

Hình 2.13: Nồng độ oxy ảnh hưởng đến hoạt tính nitrogenase P Stutzeri A1501 ……….22

Hình 2.14: Sơ đồ cấu tạo hóa học IAA (Baca and Elmerich,2007) 24

Hình 2.15: Sơ đồ lộ trình tổng hợp IAA ở vi khuẩn (Patten et al., 2013) 25

Hình 2.16: Sơ đồ phản ứng chuyển hóa indole-3-glycerol phosphate thành tryptophan ……….26

Hình 2.17: Sơ đồ vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus tiết ra enzyme cellulase phá hủy màng tế bào, xâm nhập vào bên trong nhu mô rễ (Edward and Cocking, 2012)……….27

Hình 2.18: Cấu trúc nốt rễ trên cây lúa (Li et al., 1991) ……… 27

Hình 2.19: Vi khuẩn nội sinh rễ lúa (Li et al., 1991) 28

Hình 3.1: Sơ đồ thu mẫu đất vùng rễ lúa 30

Hình 3.2: Sơ đồ pha loãng vi khuẩn 31

Hình 3.3: Sơ đồ phân lập vi khuẩn từ mẫu đất vùng rễ lúa cho đến khi trữ mẫu.32 Hình 3.4: Sơ đồ chủng vi khuẩn 34

Hình 3.5: Phản ứng màu của các ống nghiệm xây đường chuẩn đo NH4+ 35

Hình 3.6: Đồ thị đường chuẩn NH4+ 36

Hình 3.7: Phản ứng màu của các ống nghiệm xây đường chuẩn đo IAA 37

Hình 3.8: Đồ thị đường chuẩn NH4+………37

Hình 3.9: Chu kỳ gia nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi tổng 39

Hình 3.10: Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA các dòng vi khuẩn được phân lập 39

Hình 3.11: Sơ đồ tóm tắt các nội dung thí nghiệm 46

Hình 4.1: Khuẩn lạc của vi khuẩn Burkholderia sp PL9 (A) và Acinetobacter

sp GH1-1(B) trên môi trường Burk không đạm bổ sung muối 10‰ 49

Hình 4.2: Hàm lượng tổng hợp NH4+của 216 dòng vi khuẩn qua 2, 4, 6 ngày khảo sát 51

Hình 4.3: Khả năng tổng hợp NH4+ thay đổi qua ngày 2, ngày 4 và ngày 6 52

Hình 4.4: Hàm lượng tổng hợp IAA của 216 dòng vi khuẩn qua 2, 4, 6 ngày khảo sát 53

Hình 4.5: Khả năng tổng hợp IAA thay đổi qua ngày 2, ngày 4 và ngày 6 53

Hình 4.6: Hàm lượng NH4+được tổng hợp của 4 dòng vi khuẩn ở các nồng độ muối (NaCl) 0‰, 5‰ và 10‰ 55

Hình 4.7: Cây phả hệ (phylogenetic tree) trình bày mối quan hệ di truyền dựa trên vùng gen 16S rDNA của các dòng vi khuẩn vùng rễ lúa chịu mặn được phân lập (theo Neighbor-joining), chỉ số bootstrap 1000……… 57

Hình 4.8: Cây lúa ở giai đoạn 20 ngày trong điều kiện phòng thí nghiệm 58

Hình 4.9: Chiều cao cây lúa LP5 ở giai đoạn 20 ngày tuổi 58

Hình 4.10: Giống lúa LP5 chủng vi khuẩn với các mức phân đạm 60

Hình 4.11: Chiều cao cây lúa trồng trong chậu 61

Hình 4.12: Số chồi/bụi ở các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa trồng trong chậu dưới ảnh hưởng ở mức độ 25%N và vi khuẩn 64

Hình 4.13: Số chồi/bụi ở các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa trồng trong chậu dưới ảnh hưởng ở mức độ 50% đạm và vi khuẩn.……… 64

Hình 4.14: Số chồi/bụi ở các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa trồng trong chậu dưới ảnh hưởng ở mức độ 75% đạm và vi khuẩn……….65

Hình 4.15: Số chồi/bụi ở các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa trồng trong chậu dưới ảnh hưởng ở mức độ 75% đạm và vi khuẩn.……… 66

Hình 4.16: Chỉ số màu lá ở các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa trồng trong chậu dưới ảnh hưởng ở mức độ 25% đạm và vi khuẩn……… 67

Hình 4.17: Chỉ số màu lá ở các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa trồng trong chậu dưới ảnh hưởng ở mức độ 50% đạm và vi khuẩn……… 67

Hình 4.18: Chỉ số màu lá ở các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa trồng trong chậu dưới ảnh hưởng ở mức độ 75% đạm và vi khuẩn……… 68

Hình 4.19: Chỉ số màu lá ở các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa trồng trong chậu dưới ảnh hưởng ở mức độ 100% đạm và vi khuẩn 68

Hình 4.20: Số bông/bụi ở giai đoạn thu hoạch của cây lúa trồng trong chậu ở mức độ bón 25% phân đạm và vi khuẩn 69

Hình 4.21: Số bông/bụi ở giai đoạn thu hoạch của cây lúa trồng trong chậu ở mức độ bón 50% phân đạm và vi khuẩn………70

Hình 4.23: Số bông/bụi ở giai đoạn thu hoạch của cây lúa trồng trong chậu ở mức độ bón 75% phân đạm và vi khuẩn 71Hình 4.24: Chiều dài bông lúa (cm) ở giai đoạn thu hoạch 71 Hình 4.25: Chiều dài bông lúa (cm) ở giai đoạn thu hoạch của cây lúa trồng trong chậu ở mức độ bón 25% phân đạm và vi khuẩn 72Hình 4.26: Chiều dài bông lúa (cm) ở giai đoạn thu hoạch của cây lúa trồng trong chậu ở mức độ bón 50% phân đạm và vi khuẩn 72Hình 4.27: Chiều dài bông lúa (cm) ở giai đoạn thu hoạch của cây lúa trồng trong chậu ở mức độ bón 75% phân đạm và vi khuẩn 73Hình 4.28: Chiều dài bông lúa (cm) ở giai đoạn thu hoạch của cây lúa trồng trong chậu ở mức độ 100% đạm và vi khuẩn 73Hình 4.29: Số hạt chắc/bông ở giai đoạn thu hoạch của cây lúa trồng trong chậu

ở mức độ bón 25% phân đạm và vi khuẩn 74Hình 4.30: Số hạt chắc/bông ở giai đoạn thu hoạch của cây lúa trồng trong chậu

ở mức độ bón 50% phân đạm và vi khuẩn 74Hình 4.31: Số hạt chắc/bông ở giai đoạn thu hoạch của cây lúa trồng trong chậu

ở mức độ bón 75% phân đạm và vi khuẩn 75Hình 4.32: Số hạt chắc/bông ở giai đoạn thu hoạch của cây lúa trồng trong chậu

ở mức độ bón 100% phân đạm và vi khuẩn 75Hình 4.33: Số hạt chắc/bông ở giai đoạn thu hoạch của cây lúa trồng trong chậu

ở mức độ bón 25% phân đạm và vi khuẩn 76Hình 4.34: Số hạt chắc/bông ở giai đoạn thu hoạch của cây lúa trồng trong chậu

ở mức độ bón 50% phân đạm và vi khuẩn 76Hình 4.35: Số hạt chắc/bông ở giai đoạn thu hoạch của cây lúa trồng trong chậu

ở mức độ bón 75% phân đạm và vi khuẩn 77Hình 4.36: Số hạt chắc/bông ở giai đoạn thu hoạch của cây lúa trồng trong chậu

ở mức độ bón 100% phân đạm và vi khuẩn 77Hình 4.37: Trọng lượng khô 1000 hạt (g) của cây lúa trồng trong chậu ở mức

độ bón 25% phân đạm và vi khuẩn 78Hình 4.38: Trọng lượng khô 1000 hạt (g) của cây lúa trồng trong chậu ở mức

độ bón 50% phân đạm và vi khuẩn 78Hình 4.39: Trọng lượng khô 1000 hạt (g) của cây lúa trồng trong chậu ở mức

độ bón 75% phân đạm và vi khuẩn 79Hình 4.40: Trọng lượng khô 1000 hạt (g) của cây lúa trồng trong chậu ở mức

độ bón 100% phân đạm và vi khuẩn 79Hình 4.41: Năng suất của cây lúa trồng trong chậu (g/chậu) ở mức độ bón 25% phân đạm và vi khuẩn 80Hình 4.42: Năng suất của cây lúa trồng trong chậu (g/chậu) ở mức độ bón 50%

Hình 4.43: Năng suất của cây lúa trồng trong chậu (g/chậu) ở mức độ bón 75% phân đạm và vi khuẩn 81Hình 4.44: Năng suất của cây lúa trồng trong chậu (g/chậu) ở mức độ bón 100% phân đạm và vi khuẩn 81Hình 4.45: Giống lúa LP5 chủng 2 dòng vi khuẩn với các mức phân đạm 83Hình 4.46: Chiều cao cây lúa trồng của các nghiệm thức thí nghiệm ngoài đồng tại huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng trong vụ Đông Xuân 2017-2018 ở giai đoạn 44 ngày sau khi cấy 84Hình 4.47: Chiều cao cây lúa trồng ngoài đồng ở giai đoạn 19 ngày với các mức

độ bón phân đạm và vi khuẩn 84Hình 4.48: Chiều cao cây lúa trồng ngoài đồng ở giai đoạn 44 ngày với các mức

độ bón phân đạm và vi khuẩn 85Hình 4.49: Chiều cao cây lúa trồng ngoài đồng ở giai đoạn 65 ngày với các mức

độ bón phân đạm và vi khuẩn 85Hình 4.50: Chiều cao cây lúa trồng ngoài đồng ở giai đoạn thu hoạch với các mức độ bón phân đạm và vi khuẩn 86Hình 4.51: Số chồi/m2 của cây lúa trồng ngoài đồng ở giai đoạn 19 ngày với các mức độ bón phân đạm và vi khuẩn 88Hình 4.52: Số chồi/m2 của cây lúa trồng ngoài đồng ở giai đoạn 44 ngày với các mức độ bón phân đạm và vi khuẩn 88Hình 4.53: Số chồi/m2 của cây lúa trồng ngoài đồng ở giai đoạn 65 ngày với các mức độ bón phân đạm và vi khuẩn 89Hình 4.54: Chiều dài bông lúa (cm) trồng ngoài đồng ở giai đoạn thu hoạch với các mức độ bón phân đạm và vi khuẩn 90Hình 4.55: Chiều dài bông lúa (cm) ở giai đoạn thu hoạch 90Hình 4.56: Tỷ lệ hạt lép (%) của lúa trồng ngoài đồng với các mức độ bón phân đạm và vi khuẩn 91Hình 4.57: Số bông lúa/m2 trồng ngoài đồng ở giai đoạn thu hoạch với các mức

độ bón phân đạm và vi khuẩn 91Hình 4.58: Giống lúa LP5 chủng dòng vi khuẩn với các mức phân đạm 92

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ADN Adenosine diphosphate

ATP Adenosine triphosphate

BĐKH Biến đổi khí hậu

CFU Colony Forming Units

ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long

EC Electrically Conductive

FAO Food and Agriculture Organization GNFMM Glucose Nitrogene Free Mineral Medium IAA indole acetic acid

NFb Nitrogen free Bromothymol

nif Nitrogen fixing

NSKS Ngày sau khi sạ

PCR Polymerase Chain Reaction

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong điều kiện biến đổi khí hậu và sự nóng lên toàn cầu thì xâm nhập mặn là một trong những vấn đề cấp thiết của ngành nông nghiệp vì nó tác động trực tiếp đến năng suất và chất lượng nông sản Trong khi đất nông nghiệp ngày càng bị thu hẹp do nhiễm mặn thì ngược lại dân số thế giới ngày càng tăng, theo

dự báo sản xuất lương thực trên toàn thế giới phải tăng tới 38% vào năm 2025

và lên đến 57% vào năm 2050 (Abrol, 2004)

Việt Nam là quốc gia dễ bị ảnh hưởng bởi tác động của BĐKH Thứ nhất, điều kiện địa lý Việt Nam rất thuận lợi cho sự xâm thực của nước biển, là quốc gia ven biển có đường bờ biển dài và hẹp Cùng với đó là việc một số quốc gia

ở thượng nguồn sông Mekong đã và đang đẩy mạnh xây dựng các “siêu đập” thủy lợi và thủy điện ngăn chặn dòng chảy làm suy giảm lưu lượng nước từ thượng nguồn, đây là yếu tố thuận lợi cho sự xâm thực sâu vào nội đồng của nước biển, đồng thời làm giảm lượng phù sa bồi đắp cho đồng bằng sông Cửu Long Thứ hai, Việt Nam là quốc gia nông nghiệp, có tới 48% dân số dựa vào nông nghiệp làm sinh kế, với trình độ canh tác còn lạc hậu, phụ thuộc chủ yếu thiên nhiên, vì thế khi đất nông nghiệp bị nhiễm mặn thì sản lượng và chất lượng nông sản suy giảm đáng kể Theo Vũ Văn Vụ (1999) khi kỹ thuật canh tác nông nghiệp ngày càng hiện đại, thâm canh ngày càng cao, thì vai trò của chất dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng càng có vai trò đặc biệt vì nó điều chỉnh quá trình sinh trưởng và phát triển của cây một cách hợp lý nhất, làm tăng năng suất

và phẩm chất nông sản

Vi khuẩn vùng rễ có vai trò quan trọng trong nông nghiệp cả về số lượng, chất lượng và tính thân thiện với môi trường Về số lượng, phân đạm sinh học được cố định bởi vi khuẩn chiếm tới 70% tổng lượng đạm trên toàn trái đất

(Peter et al., 2002) Về chất lượng, đạm sinh học không gây hiện tượng dư đạm

ở cây trồng, ngăn ngừa tích lũy nitrate, giảm ô nhiễm nguồn nước (Yang et al.,

2008) Ngoài ra, vi khuẩn vùng rễ còn có tác dụng kích thích sinh trưởng và phát triển bộ rễ giúp tăng sự hấp thu dưỡng chất từ đất, điều này có ý nghĩa cực

kì quan trọng đối với thực vật trong điều kiện nhiễm mặn bởi vì nhiễm mặn là trở ngại hàng đầu trong việc hấp thu dinh dưỡng của thực vật, đồng thời đạm là nhân tố giới hạn của đất mặn Bên cạnh đó, việc sử dụng quá nhiều phân bón vô

cơ đã phát sinh nhiều ảnh hưởng tiêu cực, gây ô nhiễm môi trường và nông sản Theo Võ Minh Kha (2003) chỉ 50 – 60% lượng đạm bón vào trong đất được cây lúa hấp thu, số còn lại sẽ được lưu tồn trong đất hoặc trực di hay rữa trôi dẫn đến sự nhiễm nitrate cho đất và nước, đồng thời dư lượng nitrate cũng tồn dư

gian dài làm cho đất bị chay cứng, giảm độ phì, tăng chi phí sản xuất, giá trị nông sản giảm dẫn đến hiệu quả kinh tế thấp Qua nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, có nhiều dòng vi khuẩn có khả năng thay thế tới 50% phân đạm vô cơ, đồng thời tổng hợp IAA với hàm lượng cao

Vì vậy đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn chịu mặn có khả năng

cố định đạm, tổng hợp IAA trên mô hình canh tác lúa – tôm ở Bạc Liêu, Sóc Trăng và Kiên Giang” được tiến hành nhầm tuyển chọn những dòng vi khuẩn

bản địa vừa có khả năng cố định đạm vừa tổng hợp IAA với hàm lượng cao Đồng thời có hiệu quả trên giống lúa kháng mặn LP5 canh tác theo mô hình lúa – tôm, vừa có tác dụng giảm lượng phân bón hóa học vừa giúp gia tăng năng suất cho cây lúa trồng trên nền đất nhiễm mặn, góp phần duy trì và phát triển hình thức sản xuất lúa-tôm, thân thiện với môi trường và thích ứng với biến đổi khí hậu

1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính: Tuyển chọn được các dòng vi khuẩn chịu mặn, sống tự

do có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA giúp giảm sử dụng phân đạm vô

cơ và cải thiện năng suất lúa trong mô hình canh tác lúa – tôm

Mục tiêu cụ thể

Phân lập các dòng vi khuẩn chịu mặn ở nồng độ muối 10‰ có khả năng

cố định đạm và tổng hợp IAA, sống tự do trong đất vùng rễ lúa sản xuất theo

mô hình canh tác lúa – tôm ở Bạc Liêu, Sóc Trăng và Kiên Giang

Đánh giá tính hiệu quả của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn lên cây lúa chịu mặn trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng ruộng Tuyển chọn được từ 2 – 4 dòng vi khuẩn cho hiệu quả cao, có tiềm năng ứng dụng sản xuất phân vi sinh chịu mặn dùng cho cây lúa trồng trên đất sản xuất theo mô hình lúa – tôm

1.2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1 Phân lập các dòng vi khuẩn chịu mặn có khả năng cố định

đạm và tổng hợp IAA, sống tự do trong đất vùng rễ lúa, sản xuất theo mô hình canh tác lúa – tôm ở Bạc Liêu, Sóc Trăng và Kiên Giang

Nội dung 2 Khảo sát đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa các dòng vi

khuẩn được phân lập

Nội dung 3 Xác định khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA của các

dòng vi khuẩn được phân lập

Nội dung 4 Định danh các dòng vi khuẩn có hiệu quả cao bằng phương

pháp giải trình tự vùng gen 16S rDNA

Nội dung 5 Khảo nghiệm để đánh giá tính hiệu quả của các dòng vi khuẩn

trồng trong điều kiện phòng thí nghiệm, trong nhà lưới và ngoài đồng

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Các dòng vi khuẩn chịu mặn có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA sống tự do trong đất sản xuất theo mô hình canh tác lúa – tôm

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

Dùng môi trường Burk không đạm, bổ sung muối 10‰ phân lập các dòng

vi khuẩn sống tự do trên đất vùng rễ lúa có khả năng cố định đạm, sinh tổng hợp IAA hiệu quả trên cây lúa trong mô hình canh tác lúa – tôm ở ba tỉnh Bạc Liêu, Sóc Trăng và Kiên Giang

Phạm vi của đề tài chỉ khảo sát khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA, không khảo sát khả năng hòa tan lân của vi khuẩn

1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

1.4.1 Thời gian nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu thực tế của Nghiên cứu sinh từ tháng12 năm 2014 đến tháng 3 năm 2018

1.4.2 Địa điểm nghiên cứu

Thu mẫu đất từ các ruộng canh tác theo mô hình lúa – tôm ở 3 tỉnh Bạc Liêu, Sóc Trăng và Kiên Giang

Phân lập vi khuẩn, khảo sát các đặc tính hình thái, sinh hóa, khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA tại phòng thí nghiệm vi sinh vật; thực hiện phản ứng PCR tại phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại Học Cần Thơ Phân tích đặc tính của đất tại Bộ môn Khoa học đất, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, trường Đại Học Cần Thơ

Khảo nghiệm tại Trung tâm giống cây trồng tỉnh Sóc Trăng và ruộng lúa – tôm của ông Lê Sĩ Quang, ấp Bình Hòa, xã Gia Hòa 2, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng

1.5 Những đóng góp của luận án

Hai trăm mười sáu dòng vi khuẩn chịu mặn đã được phân lập có khả năng

cố định đạm và tổng hợp IAA từ đất canh tác theo mô hình lúa – tôm ở Bạc Liêu, Sóc Trăng và Kiên Giang trên môi trường Burk không đạm có bổ sung muối 10‰ Dùng phương pháp Phenol – Nitroprusside để khảo sát khả năng cố định đạm và dùng phương pháp Salkowski để xác định khả năng tổng hợp IAA

Tuyển chọn được 35 dòng vi khuẩn vừa có khả năng tổng hợp NH4+ với hàm lượng ≥ 1,0 µg/mL vừa tổng hợp IAA với hàm lượng ≥ 15,0 µg/mL Để thực hiện định danh và khảo nghiệm khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA hữu hiệu lên cây lúa LP5

Ba mươi lăm dòng vi khuẩn được tuyển chọn được giải trình tự vùng gen 16S rDNA và so sánh tương quan di truyền trên cơ sở dữ liệu NCBI, kết quả định danh được 35 dòng có độ tương đồng đạt từ 84% trở lên Trong đó có 20

dòng thuộc chi Bacillus, 4 dòng thuộc chi Burkholderia, 3 dòng thuộc chi Enterobacter, 3 dòng thuộc chi Geobacillus và 1 dòng thuộc chi Paracocus

Ba mươi lăm dòng vi khuẩn vừa có khả năng tổng hợp NH4+ vừa tổng hợp IAA với hàm lượng cao được chọn để khảo nghiệm hiệu quả lên chỉ tiêu chiều cao cây lúa và khối lượng khô cây lúa ở điểm 20 ngày Kết quả chọn được 4 dòng có hiệu quả cao và khác biệt có ý nghĩa thống kê để tiếp tục khảo nghiệm trên cây lúa trồng trong chậu Bốn dòng vi khuẩn được chủng lên cây lúa kết hợp với bón các mức phân đạm, kết quả cho thấy cả 4 dòng vi khuẩn có khả năng cung cấp từ 25 – 50% nhu cầu đạm cho sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa LP5 trồng trong chậu Từ kết quả khảo nghiệm trong chậu, chọn được 2

dòng cho thử nghiệm ngoài đồng, kết quả dòng Burkholderia sp PL9 và dòng Acinetobacter sp GH1-1 có khả năng thay thế đến 50% phân đạm hóa học cho

cây lúa LP5 trồng trên nền đất nhiễm mặn

1.6 Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học

Kết quả mở ra triển vọng sản xuất phân bón vi sinh chịu mặn chứa 2 chủng

vi khuẩn Burkholderia sp PL9 và dòng Acinetobacter sp GH1-1, dùng trên đất

sản xuất lúa bị nhiễm mặn, góp phần hạn chế hạn chế sử dụng phân đạm vô cơ cho cây lúa trồng trên đất nhiễm mặn

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đất nhiễm mặn và mô hình sản xuất lúa – tôm ở đồng bằng sông Cửu Long

2.1.1 Đất nhiễm mặn

Trên thế giới có khoảng 830 triệu ha đất bị ảnh hưởng mặn bao gồm mặn

và sodic, phân bố chủ yếu ở Châu Phi, Châu Á, Châu Úc và Châu Mỹ Beltran and Manzur, 2005) Đất mặn trải rộng trên những vùng đất khô hạn và bán khô hạn và mở rộng ra những vùng có khí hậu cận nhiệt đới và nhiệt đới, đặc biệt ở những khu vực ven biển nơi có sự xâm thực của nước biển là nguyên

(Martinez-nhân chính gây nhiễm mặn cho đất (Abrol et al., 1988) Theo Bản đồ đất VN (1976) được trích dẫn bởi Trần Minh Tiến và ctv (2013) đất mặn ở đồng bằng

sông Cửu Long có diện tích 884,2 ngàn ha chiếm 27,2% diện tích đất tự nhiên ĐBSCL Theo Harreaves and Merkley (1998) có 3 lý do chính đất nhiễm mặn ảnh hưởng đến nông nghiệp: Thứ nhất muối là chất độc đối với thực vật; thứ hai, muối làm ảnh hưởng xấu đến cấu trúc đất; thứ ba muối làm tăng chất tan, tăng áp suất thẩm thấu trong đất dẫn đến giảm lượng nước hữu dụng cho cây Đất mặn được xem là đất có vấn đề phổ biến trên thế giới, làm hạn chế năng suất cây trồng Tính chất vật lý và hoá học của đất mặn rất đa dạng, biến thiên tuỳ thuộc vào nguồn gốc của hiện tượng mặn, độ pH của đất, hàm lượng chất hữu cơ trong đất, chế độ thuỷ văn và nhiệt độ Đất mặn chứa một lượng muối hoà tan trong nước ở vùng rễ cây, làm thay đổi áp suất thẩm thấu tế bào

rễ làm cây mất nước và giảm khả năng hút chất dinh dưỡng làm thiệt hại đến hoạt động sinh trưởng của cây trồng Mức độ gây hại của đất mặn tuỳ thuộc vào loài cây trồng, giống cây, thời gian sinh trưởng, các yếu tố môi trường đi kèm

theo nó, và tính chất của đất Theo kết quả nghiên cứu của Lâm Văn Tân và ctv

(2014), đất bị ngập mặn trong 2 tuần với nồng độ NaCl 4‰ đất có thể bị mặn

và sodic hóa, gây trở ngại trong sản xuất nông nghiệp

Hội Khoa Học Đất của Mỹ định nghĩa đất mặn là đất có độ dẫn điện (EC) lớn hơn 2 dS/m, không kể đến giá trị tỷ lệ hấp thu sodium (SAR) và pH Tuy nhiên, hầu hết các định nghĩa khác đều chấp nhận đất mặn là đất có độ dẫn điện (EC) cao hơn 4 dS/m ở điều kiện nhiệt độ là 25 ºC, phần trăm sodium trao đổi (ESP) kém hơn 15, và pH < 8,5

Đất mặn được hình thành do các nguyên nhân chính sau: Sự phong hóa đá

và các khoáng chất trong đất phóng thích các muối hòa tan vào trong đất; Nước ngầm chảy qua các trầm tích chứa muối sẽ hòa tan và chuyển đi tích lũy ở những vùng trũng, khô hạn; Sự xâm nhập của nước biển, đây là nguyên nhân chính dẫn đến sự suy giảm chất lượng tầng đất canh tác và làm giảm năng xuất và chất

SO42−, HCO3−, CO32−, NO3− Trong đó ion Cl−, SO42− gây hại nhiều nhất cho cây

trồng (Lê Thanh Bồn, 2009)

Đất bị nhiễm mặn được chia làm ba loại: Đất mặn (saline soils), đất mặn

sodic (saline-sodic soil), đất sodic (sodic soils) Phân loại đất mặn dựa vào hàm

lượng muối, loại muối và sự hiện diện của Na trong đất kiềm Tác động tiêu cực

của đất mặn lên cây trồng tăng dần từ đất mặn, đất kiềm mặn và đất kiềm

Các đại lượng đo lường độ mặn và mức độ kiềm hóa: Độ dẫn điện (EC),

là đại lượng dùng để đo lường độ dẫn điện của các ion hòa tan trong dung dịch

đất hay còn gọi là độ mặn của đất; Độ bảo hòa sodium (ESP), diễn tả mức độ

bảo hòa Na của keo đất; Tỉ số sodium hấp phụ (SAR), cho biết tỉ lệ tương đối

của Na, Ca, và Mg trong dung dịch Tỉ số này cho thấy sự giảm ảnh hưởng bất

lợi của Na khi có sự hiện diện Ca và Mg

Bảng 2.1: Phân loại đất mặn dựa vào các chỉ tiêu pH, EC, SAR, ESP

Đất mặn < 8,5 > 4 < 13 < 15

(Nguồn: Giáo trình giảng dạy của Nguyễn Mỹ Hoa và ctv (2012))

2.1.2 Tính chống chịu mặn của cây lúa

2.1.2.1 Cơ chế chịu mặn của cây lúa

Lúa là cây lương thực quan trọng của nhân loại nhưng là loại cây trồng

nhạy cảm với sự biến đổi của môi trường đặc biệt là thay đổi độ mặn Các vùng

đất canh tác lúa hiện nay phải đối mặt sự xâm nhập mặn diễn ra ngày càng gay

gắt do tác động của biến đổi khí hậu

Đối với cây lúa, tính chống chịu mặn là một tiến trình sinh lý phức tạp,

thay đổi theo các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của cây (Akbar and Yabuno,

1977) Mặn ảnh hưởng đến hoạt động của cây lúa dưới những mức độ thiệt hại

khác nhau theo từng giai đoạn sinh trưởng (Maas and Hoffman 1977) Khả năng

chịu mặn của cây lúa phụ thuộc vào từng giai đoạn: chống chịu ở giai đoạn hạt

nẩy mầm, rất mẫn cảm ở giai đoạn mạ (tuổi lá 2 – 3), chống chịu trong giai đoạn

tăng trưởng, nhiễm trong giai đoạn thụ phấn và thụ tinh, cuối cùng chống chịu

trong thời kì hạt chín (Pearson et al., 1966; IRRI 1967) Tuy nhiên, một vài

nghiên cứu ghi nhận ở giai đoạn lúa trỗ, cây lúa không mẫn cảm với strees do

mặn (Kaddah et at., 1975) Do đó, khi nghiên cứu khả năng chịu mặn của cây

lúa cần nghiên cứu theo từng giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây lúa

Theo Tomoaki et al (2012), cây lúa khi bị nhiễm mặn sẽ giảm khả năng

hấp thu nước, ức chế sự dãn dài tế bào và sự phát triển của lá Khi cây lúa bị

thừa Na+ một cách thụ động sẽ dẫn tới sự thiếu hụt K+, lá bị già cỗi, ức chế hệ

Theo Akita (1986), thiệt hại do mặn thể hiện trước hết là giảm diện tích

lá Trong điều kiện thiệt hại nhẹ, trọng lượng khô có xu hướng tăng lên trong một thời gian, sau đó giảm xuống nghiêm trọng do diện tích lá giảm Trong điều kiện thiệt hại nặng hơn, trọng lượng khô của chồi và rễ suy giảm tương ứng với mức độ thiệt hại Ở giai đoạn, lá già sẽ mất khả năng sống sớm hơn lá non

Tương tự kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Thảo và ctv (2016) cũng

cho thấy tỉ lệ cây sống, chiều cao thân, chiều dài rễ, trọng lượng khô thân lúa đều giảm mạnh khi độ mặn tăng lên Độ mặn cao sẽ ức chế hoạt động của enzyme làm cho cây lúa không thể sử dụng các chất dự trữ trong hạt để phát triển bình thường được (Pongprayoon, 2007)

Bảng 2.2: Thang đánh giá mức độ chống chịu mặn ở giai đoạn tăng trưởng của cây lúa

Cấp Quan sát, đánh giá sinh trưởng cây lúa Mức chống chịu

1 Sinh trưởng bình thường không có triệu chứng ở lá Chống chịu tốt

3 Sinh trưởng gần như bình thường, chóp lá hoặc vài lá

có vết trắng và lá hơi cuốn lại

Chống chịu khá

5 Sinh trưởng chậm lại, hầu hết các lá bị cuốn, chỉ có

vài lá có thể mọc dài ra

Chống chịu trung bình

7 Sinh trưởng hoàn toàn ngưng trệ, hầu hết các lá bị

khô đi, một vài chồi bị chết

Nhiễm

Gregorio et al (1997)

2.1.2.2 Khả năng chịu mặn của một số giống lúa

Shannon and Akbar (1978), không có tính đối kháng giữa chống chịu mặn

và năng suất Do đó tuyển chọn và lai tạo các giống chống chịu mặn là hướng

đi đúng cần phát triển đặc biệt là trong điều kiện ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đang gia tăng

Khi độ mặn trong nước lên đến 4‰ kéo dài liên tục trong một tuần thì các giống lúa mẫn cảm không thể phát triển, một số giống lúa chịu mặn có thể sinh trưởng nhưng năng suất sẽ giảm 20 – 50%, khi nước tưới có độ mặn 3‰ năng suất lúa sẽ giảm 50% (Landon, 1991)

Theo kết quả nghiên cứu của Lê Xuân Thái và Trần Nhân Dũng (2013) dựa trên phân tích PCR với dấu phân tử RM206 đã chọn được 2 giống lúa có khả năng chịu mặn tốt ở nồng độ 4,0 – 6,0‰ là MTL664 và MTL702

Theo Phạm Phước Nhẫn và Phạm Minh Thùy (2011), khi cây lúa bị nhiễm mặn NaCl 2g/L trở lên thì ảnh hưởng đến quá trình phát triển bình thường Mặn làm giảm chiều cao cây, số rễ trên cây, chiều dài rễ, khối lượng khô của rễ và thân theo mức độ nhiễm mặn và thời gian nhiễm mặn Trong 5 giống (OM7347,

tính chịu mặn tương đối tốt so với 4 giống còn lại và giống OM7347 có tính

mẫn cảm nhất

Theo Nguyễn Thị Thanh Thảo và ctv (2016), kết quả nuôi cấy mô cho

thấy hai giống MTL480 và MTL687 có khả năng tái sinh chồi cao (46,02% và

46,63% khi bổ sung 5‰ NaCl vào môi trường nuôi cấy Khi nồng độ NaCl tăng

lên 10‰ thì chỉ có 30,67% mô sẹo của giống MTL480 và 1,7% mô sẹo của

giống MTL687 có khả năng tái sinh Các cây con được chuyển sang nhà lưới,

kết quả ghi nhận 100% cây con tái sinh đều sống sót sau 30 ngày trong điều kiện

mặn 6‰

2.1.3 Hiện trạng sản xuất lúa – tôm ở đồng bằng sông Cửu Long

2.1.3.1 Hiện trạng canh tác lúa – tôm ở đồng bằng sông Cửu Long

Hiện đồng bằng sông Cửu Long có 7 tỉnh sản xuất lúa theo mô hình lúa – tôm là Trà Vinh, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Cà Mau, Bến Tre, Kiên Giang và

Long An, với diện tích 160.000 ha, 3 tỉnh có diện tích canh tác lúa – tôm lớn

nhất ĐBSCL là Kiên Giang, Bạc Liêu và Sóc Trăng (Viện Khoa học Nông

nghiệp Việt Nam, 2015) Theo Tổng cục thủy sản, định hướng phát triển sản

xuất lúa – tôm giai đoạn 2016 – 2020, tầm nhìn đến 2030, diện tích sản xuất lúa

– tôm ở ĐBSCL đến năm 2020 là 200.000 ha với sản lượng 100.000 – 120.000

tấn/năm và đến năm 2030 nâng diện tích sản xuất lên 250.000 ha với năng suất

125.000 – 150.000 tấn/năm

Hiện nay người dân canh tác lúa – tôm theo hai hình thức: Hình thức thứ

nhất là luân canh lúa – tôm, một vụ lúa vào mùa mưa và vụ tôm vào mùa khô

Hình thức này áp dụng phổ biến ở tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu, Bến Tre Sản xuất

theo hình thức này vụ lúa cho năng suất tương đối cao khoảng 6 – 8 tấn/ha;

Hình thức thứ hai là xen canh, trồng lúa và nuôi tôm chung, hình thức này thu

nhập chủ yếu của người nông dân là từ tôm Tôm được nuôi quanh năm, thu

hoạch tôm được chia làm nhiều lần theo kiểu tỉa thưa (thu hoạch tôm lớn, tôm

nhỏ thả nuôi lại), lúa cho năng suất rất thấp, thậm chí là không có thu hoạch,

mục đích của việc trồng lúa là để cải tạo môi trường giúp con tôm phát triển tốt

Canh tác theo mô hình này áp dụng phổ biến ở những vùng đất nhiễm mặn cao

ở tỉnh Cà Mau

Theo Lê Cảnh Dũng (2012), trồng lúa trên nền đất nuôi tôm cho năng suất

rất thấp thậm chí là lỗ nhưng canh tác theo hệ thống tôm – lúa vẫn cho hiệu quả

kinh tế cao hơn mô hình canh tác độc canh cây lúa

2.1.3.2 Cấu trúc ruộng sản xuất theo mô hình lúa tôm

Theo Trương Hoàng Minh và ctv (2013), thiết kế công trình ruộng nuôi

tôm sú – lúa theo hai mô hình Mô hình truyền thống và mô hình cải tiến (Hình

Hình 2.1: Sơ đồ mặt cắt ngang ruộng tôm sú – lúa truyền thống

Hình 2.2: Sơ đồ mặt cắt ngang ruộng tôm sú – lúa cải tiến Qua khảo sát thực tế của tác giả hiện nay có 3 kiểu cấu trúc ruộng nuôi tôm theo mô hình lúa – tôm, tùy theo mục đích canh tác của người nông dân và điều kiện thổ nhưỡng: Kiểu thứ nhất (Hình 2.3 A) để nguyên đất ruộng làm lúa vào mùa mưa, mùa khô cho nước mặn vào nuôi tôm, không đào mương, xẻ rãnh Sản xuất theo hình thức luân canh, một vụ tôm một vụ lúa trên năm, vụ lúa cho năng suất trung bình từ 5 – 7 T/ha; Hình thức thứ hai, đào mương bao xung quanh ruộng lúa, nuôi tôm xen canh với trồng lúa Một năm sản xuất được hai

vụ tôm và một vụ lúa, vụ lúa cho năng suất thấp (Hình 2.3 B); Hình thức thứ 3, đào mương xung quanh ruộng lúa kết hợp với xẻ nhiều mương nhỏ trên mặt ruộng (Hình 2.3 C), hình thức này là sự cải tiến của hình thức thứ hai, mục đích

là cải thiện diện tích mặt nước để nuôi được nhiều tôm hơn

Hình 2.3: Cấu trúc ruộng sản xuất theo mô hình lúa – tôm

2.1.3.2 Kỹ thuật canh tác lúa trên nền đất nuôi tôm

Theo Võ Văn Bé và ctv (2013), lúc gieo sạ độ mặn nước phải thấp hơn

0,05‰, và tránh thời điểm triều cường Giai đoạn lúa trổ vào chắc, không gặp

mưa và cũng không bị xâm nhập mặn

Lịch thời vụ: Đối với giống lúa thuộc nhóm A1 (thời gian sinh trưởng 100 ngày) LP5, MTL 547, AS 996, OM 6976, OM 7347, OM 5629, OM 5464, OM

5981, gieo sạ từ 01/9 – 20/9; giống lúa thuộc nhóm B (thời gian sinh trưởng

120 ngày) như ST-5, ST-10, MTL 119, gieo sạ từ 10/8 – 30/8; giống lúa mùa

có lượng mưa hằng năm ít, nước mặn xâm nhập sớm nên chọn những giống có thời gian sinh trưởng ngắn

Hình 2.4: Lịch thời vụ sản xuất luân canh tôm – lúa Chuẩn bị đất, cho nước ngọt vô ra nhiều lần để rữa mặn, rữa phèn Dọn sạch rong, tảo trên ruộng, cỏ dại xung quanh bờ Khi nước đã ngọt phơi đáy ao cho khô mặt ruộng thì tiến hành xới để tạo thông thoáng cho đất và diệt cỏ, xung quanh ruộng, sát phần chân bờ đào rãnh rộng 30 cm, sâu 10 cm đắp thành bờ nhỏ ngăn phèn và mặn từ trong bờ rữa trôi vào ruộng lúa Bón lót phân lân để

hạ phèn

Ủ và xử lý hạt giống, phơi hạt giống từ 1 – 2 giờ để tăng khả năng hút nước và sức nảy nầm Sau đó ngâm hạt giống với dung dịch muối 15% nhằm loại bỏ một số mầm bệnh, hạt lép lững, hạt cỏ Tiếp theo rữa sạch và ngâm trong nước sạch từ 36 – 48 giờ, quan sát thấy mầm lúa có màu trắng đục thì vớt ra, rữa sạch và đem đi ủ từ 12 – 24 giờ, rễ mầm dài khoảng 2 – 3 mm thì đem gieo

Đặc điểm hình thái, sinh hóa

Hình que, hình thẳng, hình hơi cong, dạng sống, sống đơn độc, cặp đôi hoặc thành chuỗi dài, lập bào tử khi lập điều kiện bất lợi Có cả dạng Gram âm

và Gram dương, có khả năng di chuyển Hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc,

có một vài loài kỵ khí bắt buộc Thích nghi đa dạng với các điều kiện môi

trường, từ khí hậu lạnh đến khí hậu nóng, đất acid, đất kiềm, đặc biệt một số

dòng thuộc loài ưa mặn Dòng Bacillus subtilis As-4 có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường có nồng độ muối 10 – 15% (Satapute et al., 2012)

Đặc điểm hình thái và sinh hóa

Thuộc nhóm Gram âm, hình que thẳng hoặc uốn cong, đầu bo tròn, kích thước 0,5 – 1,0 × 1,4 – 4,0 µm, di chuyển nhờ một nhóm chiên mao ở đầu, ngoại

trừ loài B mallei không có khả năng di chuyển và không có roi Khuẩn lạc phần

lớn có bề mặt bóng, trừ những loài gây bệnh cho người có bề mặt khuẩn lạc sần sùi, sống đơn độc hoặc thành đôi

Thuộc nhóm hóa dị dưỡng, hiếu khí bắt buộc, sử dụng oxy như là chất nhận điện tử Một số loài có khả năng hô hấp kỵ khí với quá trình nitrate hóa,

một số dòng thuộc loài B cepacia, B vietnamiensis có khả năng cố định đạm,

phản ứng dương tính catalase, sử dụng đa dạng chất hữu cơ cũng như nguồn

carbon cho sinh trưởng Những dòng thuộc chi Burkholderia sinh trưởng trong

môi trường dinh dưỡng khoáng tối thiểu không cần bổ sung chất hữu cơ Thông thường, những dòng này được phân lập từ tự nhiên, sinh trưởng cực kì chậm nhưng tốc độ sinh trưởng nhanh nếu bổ sung thêm yeast extract vào môi trường nuôi cấy Tế bào của những loài thuộc chi Burkholderia tích lũy những hạt nhỏ như là nguồn cung cấp carbon (poly-βhydroxy-butyrate, PHB, có thể là một phần của hợp chất copolymer với poly-β-hydroxyvalerate, PHA) Protein được

tìm thấy ở dạng liên kết với những hạt nhỏ Dòng B pseudomallei và một số dòng B mallei sử dụng PHB ngoại bào cho sinh trưởng Tất cả những loài thuộc chi Burkholderia đều có khả năng tích lũy PHB và sử dụng polymer nội bào khi cần thiết Thông thường các loài thuộc chi Burkholderia sinh trưởng tốt ở 30ºC

Có những dòng tăng trưởng tốt ở 37ºC và thậm chí đến 40ºC Nhu cầu oxy, tất

cả các dòng sinh trưởng tốt trong điều kiện hiếu khí Một số dòng (B mallei, B pseudomallei, B caryophylli, B plantarii, B vandii) còn có thể sử dụng nitrate như là chất nhận điện tử trong điều kiện kị khí Theo Gillis et al (1995) dòng

B vietnamiensis có khả năng khử nitrate thành nitrite

2.2.3 Enterobacter

Phân loại

Bộ Enterobacteriales

Họ Enterobacteriaceae

Chi Enterobacter

Đặc điểm hình thái và sinh hóa

Thuộc nhóm Gram âm, yếm khí tùy nghi, hình que thẳng, kích thước 0,6 – 1,0 × 1,2 – 3,0 µm, không có khả năng tạo bào tử, di chuyển bằng chiên mao

(kích thước 4 – 6 µm), sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 30ºC Ladha et al (1983) phân lập được dòng Enterobacter cloacae có khả năng cố định đạm từ cây lúa cạn

(dryland rices) và cây lúa nước (wetland rices)

Đặc điểm hình thái và sinh hóa

Thuộc nhóm Gram âm, hình que, có kích thước 0,5 – 1,0 × 1,2 – 3,0 µm, không có khả năng tạo bào tử, di động nhờ 1 – 6 chiên mao, hiếu khí, nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng 25 – 30ºC, pH tối ưu 6,0 – 7,0, thời gian thế hệ (generation times) 1,5 – 5,0 giờ, thông thường khuẩn lạc có màu trắng, trắng sữa, dạng bìa răng cưa, độ nổi mô, đường kính khuẩn lạc từ 2 – 4 mm

2.3 Khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA của vi khuẩn vùng rễ lúa

Nguyễn Thị Phương Oanh et al (2013) đã phân lập được 5 dòng vi khuẩn

đất vùng rễ lúa vừa có khả năng cố định đạm cao vừa có khả năng tổng hợp IAA tốt (Bảng 2.3)

Bảng 2.3: Khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA của vi khuẩn vùng rễ lúa đươc phân lập

STT Dòng vi

khuẩn

Tổng hợp NH4+ (g/L) Tổng hợp IAA (g/L) Ngày

hàm lượng nitơ lần lượt 4,78 – 15,91µg/mL, 9,03 – 13,47 µg/mL, 6,51 – 16,60

µg/mL

Nguyễn Lân Dũng và ctv (2012), các dòng vi khuẩn thuộc chi Azotobacer

trung bình khi tiêu thụ hết 1 gam các chất sinh năng lượng có khả năng đồng

hóa được 10 – 15 mg nitơ cung cấp cho cây trồng Ngoài ra vi khuẩn

Azotobacter còn có khả năng tổng hợp các kích thích tố sinh trưởng Vi khuẩn

Azotobacter chỉ cố định nitơ khi nồng độ PO42− trong môi trường đạt 4 mg/mL

và ngưng cố định đạm khi nồng độ PO42− lên đến 800 mg/mL Đặc biệt

Azotobacter có khả năng phát triển trong môi trường có nồng độ muối

2,5 – 3,0% NaCl

Lwin et al (2012) đã phân lập được 18 dòng Bacillus spp từ vùng đất

Madalay, Myanmar có khả năng tổng hợp IAA với hàm lượng từ 53,1 – 71,1

ppm

Park et al (2005) phân lập vi sinh vật cố định đạm trên đất trồng cây mè,

cây lúa mì, cây đậu nành, rau diếp, cây lúa, ở tỉnh Chungbuk, Hàn Quốc Đã

phân lập được 5 dòng vi khuẩn cố định đạm trên 150 nmol/giờ/mg protein và

tổng hợp IAA từ 100,4 – 255 µg/mL Trong đó Bacillus fusiformis cố định đạm

cao nhất lên tới 3677,81 nmol/giờ/mg protein và tổng hợp 255 µg/mL IAA

Reetha et al (2014) đã phân lập được Bacillus subtilis từ đất trồng củ hành

trong vườn thực vật trường Đại Học Annamalai, Ấn Độ Có khả năng tổng hợp

IAA với hàm lượng 12,67 ± 0,325 µg/mL Kết quả khảo nghiệm với cây hành

trồng trong chậu cho thấy có sự tăng rõ rệt về chiều dài rễ và thân, khối lượng

tươi và khô của rễ và thân so với đối chứng

Theo Nguyễn Hữu Hiệp và ctv (2012) khi chủng dòng vi khuẩn

Azospiirilum lipoferum R29B1 và bón 50% phân đạm cho các chỉ tiêu về thành

phần năng suất tương đương với nghiệm thức không chủng vi khuẩn và bón

100N khi thực hiện thí nghiệm trong nhà lưới

Ngô Thanh Phong (2012), phân lập được 150 dòng vi khuẩn bản địa từ các

mẫu đất được thu ở đồng bằng sông Cửu Long Có 86/150 dòng vi khuẩn có

khả năng tổng hợp NH4+ cao hơn 5 mg/L, trong đó có hai dòng P stutzeri PS4

và B vietnamiensis BV3 có khả năng cung cấp đến 50% đạm sinh học cho cây

lúa cao sản

Theo Liu and Zhao (2006), Bacillus megaterium C4 có khả năng cố định

đạm sống trong rễ cây lúa, cây bắp, thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương Bacillus

megaterium Azw-1, phát triển ở nhiệt độ từ 10 – 40°C, nhiệt độ tối ưu 30°C, pH

từ 4,0 – 10, pH tối ưu 7,0, độ mặn từ 2 – 8%, độ mặn tối ưu 3% (Saini et al.,

2016)

2.4 Khả năng chịu mặn của vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA

Theo Nguyễn Thị Pha và Nguyễn Hữu Hiệp (2014), phân lập vi khuẩn cố định đạm từ đất vùng rễ lúa nhiễm mặn ở 2 tỉnh Kiên Giang và Trà Vinh, kết quả đã phân lập được 178 dòng vi khuẩn, trong đó có 3 dòng tổng hợp NH4+ đạt

từ 4,0 – 4,8 µg/mL

Theo Diouf et al (2015), nghiên cứu về khả năng chống chịu mặn của các

dòng vi khuẩn Vi khuẩn được nuôi trong môi trường TY broth bổ sung NaCl với các nồng độ từ 0 đến 600 mM Kết quả cho thấy có tới 50% các dòng vi khuẩn được nuôi trong môi trường có bổ sung NaCl không có sự khác biệt với được nuôi trong môi trường không bổ sung NaCl

Theo Garg and Manchanda (2008), nghiên cứu ảnh hưởng độ mặn lên khả năng tạo nốt khi chủng vi khuẩn vùng rễ lên cây đậu Kết quả cho thấy số lượng nốt tăng lên ở độ mặn 4 và 6 dSm-1, nhưng giảm xuống ở 8 dSm-1 Mặc dù số lượng nốt tăng, nhưng sinh khối khô của nốt, tỉ lệ nốt trên thân, hàm lượng Lb, hoạt tính enzyme nitrogenase đều giảm khi tăng nồng độ muối

Theo Talbi et al (2013) loài Burkholderia phymatum GR01N có khả năng

chống chịu cao với các nhân tố bất lợi của môi trường trong cả hai điều kiện sống tự do và cộng sinh Trong điều kiện sống tự do, tế bào được nuôi trong môi trường thay đổi NaCl hoặc sucrose, kết quả cho thấy không có sự khác biệt về

số lượng tế bào sống khi nuôi trong môi trường lỏng chứa 150, 300, 400 nM

NaCl Ngược lại, Rhizobium tropici CIAT899R số tế bào sống giảm đáng kể khi

môi trường chứa 300 hoặc 400 nM NaCl Ảnh hưởng mặn lên số lượng nốt sần, khối lượng khô của nốt sần, trọng lượng khô cây, hàm lượng nitơ trong cây, hàm lượng Lb trong nốt sần Số lượng nốt sần trên cây tăng đáng kể khi chủng CIA899R so với dòng GR01N trong điều kiện có hoặc không có 25 nM NaCl Tuy nhiên, ở nồng độ 35 nM NaCl, số lượng nốt sần trên cây được chủng dòng CIA899R giảm đáng kể so với chủng dòng GR01N, nhưng đường kính nốt sầ không có sự khác biệt giữa hai chủng Khối lượng khô của cây không có sự khác biệt giữa các chủng ở 25 nM NaCl, nhưng có ảnh hưởng tiêu cực ở 35 nM NaCl, dòng CIA899R giảm 41%, dòng GR01N giảm 9%

Theo Satapute et al (2012), loài Bacillus subtilis AS-4 chịu được nồng độ

muối từ 10 – 15%, sinh trưởng tốt ở 27ºC và pH 7,0 Đây là dòng vi khuẩn sống

tự do có khả năng cố định đạm nên có thể được dùng làm phân bón sinh học dùng cho các vùng đất nhiễm mặn

Theo Diouf et al (2015), nghiên cứu về khả năng chống chịu mặn của các

dòng vi khuẩn Vi khuẩn được nuôi trong môi trường TY broth bổ sung NaCl với các nồng độ từ 0 đến 600 nM Kết quả cho thấy có tới 50% các dòng vi khuẩn được nuôi trong môi trường có bổ sung NaCl không có sự khác biệt với

Theo Sachdev et al (2009), Klebsiella pneumoniae có khả năng tổng hợp

IAA với hàm lượng 27,5 mg/mL sau 72 giờ nuôi trong điều kiện pH 8,0, ở 37ºC, nồng độ NaCl 5‰, có bổ sung tiền chất tryptophan (1 mg/mL)

2.5 Cơ chế và các nhân tố ảnh hưởng đến khả năng cố định đạm của vi khuẩn

2.5.1 Cơ chế cố định đạm ở vi khuẩn

Nguồn nitơ vô cơ trong không khí rất lớn, chiếm 78,16%, nhưng cây trồng

không hấp thu trực tiếp được Một số vi sinh vật sơ hạch có hệ thống gen nif có

khả năng cố định nitơ vô cơ thành nguồn phân đạm sinh học cung cấp cho cây

trồng Hệ thống gen nif giải mã tạo ra hệ enzyme nitrogenase, hệ enzyme nitrogense thuộc nhóm enzyme EC1 (Oxidoreductases) xúc tác các phản ứng

oxy hóa khử, chuyển hóa N2 không khí thành NH3, NH3 trong tự nhiên phản ứng với H2O tạo thành NH4+ là nguồn phân đạm cung cấp cho cây trồng

Hệ thống gen nif

Sinh vật sơ hạch có khả năng cố định đạm, sống cộng sinh hay sống tự do

đều chứa gen nif trong hệ gen Theo Desnoues (2003) vùng gene mã hóa hệ enzyme nitrogenase ở Pseudomonas stutzeri A1501 cũng tương tự Azotobacter

vinelandii gồm 3 nhóm genes (Hình 2.5):

(1) nifB fdx ORF3 nifQ ORF5 ORF6;

(2) nifLA-rnfABCDGEF-nifY2/nafY;

(3) ORF13 ORF12-nifHDK-nifTY ORF1 ORF2-nifEN

Gene nifB ở dòng vi khuẩn A vinelandii 104399 là một đoạn ADN dài 650

bp, nằm trong plasmid p64 Lần đầu tiên được khuếch đại (PCR) bằng đoạn mồi:

Mồi xuôi 5’CTATTCGGAAGAGGCGCACCAC3’

Mồi ngược 5’CGGGCTCGMRATCAGCGGCATG3’

Hình 2.5: Bản đồ hệ thống gen nif của P stutzeri A1501 (Desnoues, 2003) Theo Yan et al (2008), hệ thống gen nif đã được xác định ở Pseudomonas như: nifH, nifE và nifY, nifB, nifA và nifL, nifQ, nifK, nifT, nifD…(Hình 2.6)

Nitrogenase

Protein của nitrogenase

Nitrogenase có cấu tạo gồm hai thành Fe-protein (dinitrogenase reductase)

và MoFe-protein (dinitrogenase), hai thành phần này có thể đem ly tâm để tách

rời (Ibrahim et al., 1999) Fe-protein sử dụng năng lượng thủy phân MgATP,

cung cấp điện tử để MoFe-protein hoạt hóa cố định đạm

Hình 2.7: Cấu trúc không gian phân tử MoFe-protein (trái) và Fe-protein

(phải) (Ibrahim et al., 1999)

MoFe-protein: Màu tím và màu vàng là thể α của α 2 β 2 -tetramer Màu xanh và màu cam là thể

β; Fe- protein: nhóm Fe 4 S 4 , một ADP và hai ion Mg 2+

Phức hợp Fe-protein nhỏ hơn MoFe-protein, có khối lượng phân tử

60 – 64 kDa (Burges et al., 1996; Mayer et al., 2002), chứa một nhóm Fe4S4

Một phân tử Fe-protein thủy phân hai phân tử MgATP và vận chuyển một

electron đến MoFe-protein

Phức hợp MoFe-protein là một α2β2-tetramer chứa hai thể α và hai thể β,

khối lượng phân tử 240 – 250 kDa (Mayer et al., 2002) Phức hợp MoFe protein

chứa hai nhóm metal – sulfur là P-cluster và FeMo cofacter Nhóm P-cluster

nằm giữa bề mặt thể α và thể β Nhóm FeMo cofacter gồm M-cluster và FeMoco

nằm bên trong thể α

Bảng 2.4: Thành phần cấu tạo nitrogenase

Thành phần Azoferredoxin (kDa) Mollybdoferredoxin (kDa)

Hình 2.8: Sơ đồ cấu trúc hóa học của nhân tố Fe và Mo (Mayer et al., 2002)

FeMo-cofactor (trái) và P-cluster (phải) với liên kết sulfur của cysteine Fe (màu nâu), S (màu

vàng), Mo (màu xám), C (màu đen), N (màu xanh), O (màu đỏ)

Sự vận chuyển electron từ Fe-protein đến MoFe-protein xảy ra bằng con

đường hình thành phức hợp giữa Fe-protein và MoFe-protein (Burges et al,

1996) Sự sắp xếp sao cho khoảng cách giữa nhóm Fe4S4 của Fe-protein và cluster của MoFe-protein là ngắn nhất, khoảng 15 Å, đây là khoảng cách cần thiết để sự vận chuyển electron xảy ra dễ dàng Phức hợp Fe-protein chỉ có khả năng thủy phân MgATP khi ở trạng thái phức hợp

Hình 2.9: Cấu trúc không gian nitrogenase (Burges et al, 1996)

MoFe-protein (trái) và Fe-protein (phải)

Chu trình Fe-protein (the Fe-protein cycle)

protein thủy phân MgATP và chuyển electron đến Moprotein protein bị oxy hóa tạo hai phân tử MgADP (Feox(MgADP)2 + MoFe) Ở giai đoạn này protein không liên kết với MoFe-protein

Fe-Hình 2.10: Chu trình Fe-Protein Giai đoạn tiếp theo tạo phức hợp giữa protein Fe-protein phải ở trạng thái khử và liên kết với MgATP (Fered(MgATP)2MoFe) Trong phức hợp này MgATP được tách ra để tạo MgADP và Pi (Pi là chữ viết tắt của phosphate và tồn tại ở hai dạng HPO42− và H2PO4−) và một electron được truyền đến MoFe-protein và một phân tử phosphate được giải phóng

MgATP + H2O  MgADP + Pi

Kế tiếp, phức hợp phá hủy với tốc độ 5 S-1 trong điều kiện bảo hòa protein, Feox(MgADP)2 + MoFered Electron trong MoFe-protein được sử dụng như là cơ chất chuyển đổi Khi chu trình kết thúc, Fe-protein trở về cấu trúc ban đầu và tiếp tục tham gia vào chu trình mới

Fe-Ngoài ra, trong quá trình vận chuyển e- cần năng lượng do ATP cung cấp ATP kết hợp với protein chứa Fe qua 1 cầu nối Mg và sau đó được thuỷ phân thành ADP và Pi Sự thuỷ phân làm thay đổi hình dạng của protein enzim, e-

được vận chuyển lên phức hệ Fe–Mo Để vận chuyển 1e- cần 2 ATP Phức hệ Fe–Mo thực chất là N2-reductase Phức hệ nhỏ hơn là 1 protein chứa Fe, phức

hệ lớn hơn là protein chứa Fe/Mo, phức hệ lớn này thực chất là reductase

dinitrogen-Để vận chuyển e- từ phức Fe/Mo đến N2 thì sự thay đổi hoá trị Mo có một vai trò quan trọng

1 2e- và 2H+ được kết hợp với nguyên tử Mo

2 Nguyên tử H2 đang gắn với enzim bị đẩy ra bởi N2

3 N2 được khử thành –N=N do tiếp nhận H+ + e-

4 -N=N được khử thành =N–NH2 do tiếp nhận H+ + e-

5 =N–NH2 được khử thành NH3 do tiếp nhận H+ + e-, NH3 được tách ra

Nguyên tử N đang gắn với enzyme được khử thành NH3 do tiếp nhận 3e

-và 3H+ và sau đó NH3 được tách ra khỏi phức hệ

Sự gắn N2 với phức hệ Fe–Mo cần 1 liên kết trước đó của phức hệ này với

H2 Vì vậy, kết quả là bên cạnh tạo ra NH3 còn xuất hiện H2, phân tử này có thể được tách ra thành H+ và e- và e- này được đưa trở lại hệ thống

Vận chuyển electron để khử cơ chất trong quá trình thủy phân cần ít nhất

4 phân tử ATP, mỗi phân tử ATP vận chuyển được 2 electron và phụ thuộc vào

nhiệt độ (Hadfield and Bulen, 1969) và pH (Jeng et al., 1970)

Hình 2.11: Sơ đồ quá trình khử N2 thành NH3 (Moore et al., 1998)

Cố định đạm sinh học có thể được trình bày theo phương trình rút gọn sau đây, trong đó 2 phân tử amoniac được sản xuất từ 1 phân tử N2 cùng với 16ATP, 8 điện tử và 8 ion H+

N2 + 8H+ + 8e− + 16ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi

Quá trình cố định N2 thành NH3, NH3 sẽ kết hợp với các hợp chất khác

để tạo thành đạm sinh học theo hình sau đây:

Hình 2.12: Sơ đồ cơ chế cố định đạm sinh học (Moore et al., 1998)

2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng cố định đạm ở vi khuẩn

2.5.2.1 Oxygen

Sự khử dinitrogen thành amonia (NH3) bởi enzyme nitrogenase đòi hỏi một lượng lớn ATP (lên tới 40 ATP/N2) Thông thường vi khuẩn cố định đạm tổng hợp ATP bằng con đường phosphoryl hóa, luôn đòi hỏi cung cấp oxi Tuy nhiên enzyme nitrogenase sẽ bị biến tính khi hàm lượng O2 vượt quá 10 mM (Appleby, 1984) Nitrogenase rất nhạy cảm với oxygen, Fe-protein rất nhạy cảm với oxygen, trong khi MoFe-Protein thì không bị ảnh hưởng bởi oxygen

Có hai cơ chế bảo vệ hệ thống nitrogenase: Bảo vệ cấu trúc và bảo vệ hệ thống hô hấp Bảo vệ cấu trúc, cấu trúc enzyme bị thay đổi do sự tác động của oxygen, dẫn đến sự xúc tác cố định dinitrogen không diễn ra Bảo vệ hệ thống

hô hấp, oxygen được thải bỏ hoàn toàn, kết quả là quá trình hô hấp tăng lên (Modak and Haber, 2002) Điều này cho phép enzyme nitrogenase duy trì trạng thái xúc tác

Azospirllum spp thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí, đòi hỏi nồng độ oxy phải

ở mức thấp cho hydrogenase hoạt động Trong điều kiện hiếu khí hoàn toàn, sự

cố định nitrogen xảy ra khi nitrogenase được bảo vệ Loài Azotobacter

hiếu khí bởi vì hệ thống trao đổi khí và cấu trúc của nitrogenase được bảo vệ và bởi hệ thống enzyme nitrogen nằm bên trong tế bào Một cơ chế khác là nitrogenase hoạt động trong điều kiện vi hiếu khí Những loài thuộc chi

Azosipirillum trong điều kiện vi hiếu khí thì mới cố định đạm Azosipirillum brasilense không sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí và N2 là nguồn carbon

duy nhất Loài Azosipirillum có khả năng cố định đạm tối ưu trong điều kiện oxy trong khoảng 0,507 – 0,709 kPa (Rivera-Ortiz et al., 1975; Seefeldt et al.,

2004)

Theo Desnoues (2003), hoạt tính nitrogenase P stutzeri A1501 cao nhất ở

nồng độ oxy 1%, giảm dần khi nồng độ oxy tăng lên 1,5%, 2%, và đến 4% (Hình 2.13)

Hình 2.13: Nồng độ oxy ảnh hưởng đến hoạt tính nitrogenase P Stutzeri A1501

2.5.2.2 Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của tất cả sinh vật, trong giới hạn sinh lý, nhiệt độ càng cao thì hô hấp diễn ra càng mạnh

Mỗi loài có ngưỡng chịu nhiệt và nhiệt độ tối ưu khác nhau, loài Azospirillum

sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ ở nhiệt độ 32 – 40ºC Đây là nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của vi khuẩn cố định đạm vùng nhiệt đới Hoạt tính enzyme nitrogese của

Azospirillum nhạy cảm khi nhiệt độ xuống dưới 15ºC

2.5.2.3 pH

Sự tác động qua lại giữa dịch tiết của rễ, pH đất và hoạt động của vi sinh vật có tác dụng giữ ổn định giá trị pH Giá trị pH tác động đến sự trao đổi ion trong đất, ảnh hưởng lên khả năng hấp thu chất dinh dưỡng ở cây, đồng thời pH tác động trực tiếp lên bộ rễ và hoạt động của vi sinh vật Vì thế pH đất quyết định chỉ số đa dạng và độ phong phú của vi sinh vật vùng rễ

Azospirillum sinh trưởng ở pH 6,8 – 7,8, điều kiện pH này phù hợp với bề

mặt tế bào rễ của cây thân thảo như cây lúa Rễ của cây thân thảo cung cấp điều kiện và pH tối ưu để vi khuẩn phát triển ngay cả khi pH trong đất thấp

Theo Fierer và Jackson (2006), pH của đất có ảnh hưởng lớn đến sự đa dạng và phong phú của quần xã sinh vật hơn cả ảnh hưởng của nhiệt độ, lượng mưa và vĩ độ Sự đa dạng của vi khuẩn cao nhất ở đất trung tính và thấp nhất ở đất chua Tác động của pH lên rễ cây chủ yếu là do các độc tính của các ion

Al3+, Mn2+, H+ trong đất chua (Kinraide and Yermiyahu, 2007) hoặc do HCO3−

trong đất kiềm (Tang et al., 1993)

2.5.2.4 Ẩm độ

Ẩm độ tác động trực tiếp đến sinh trưởng của cây và tác động gián tiếp thông qua hoạt động của vi sinh vật Có mối tương quan thuận giữa hoạt động

của enzyme nitrogenase và độ ẩm của đất (Lance et al., 1995) Đất có đủ ẩm độ

sẽ giúp cây chủ sinh trưởng tốt, cung cấp đủ carbohydrate cho hoạt động của vi sinh vật Tốc độ khử acetylene tăng theo hàm số mủ và tuyến tính với sự tăng

ẩm độ trong đất Thứ nhất, vi khuẩn cố định đạm sống trong vùng đất ngập nước

có hoạt tính nitrogenase cao hơn vùng ẩm thấp và khô hạn Điều này liên quan đến nồng độ oxy trong đất, nồng độ oxy trong đất tăng dần từ vùng đất ngập nước đến vùng ẩm thấp và cao nhất ở vùng đất khô hạn Thứ hai, trong vùng đất

có ẩm độ cao quá trình phản nitrate (denitrification) diễn ra thấp

2.5.2.5 Hàm lượng đạm vô cơ trong đất

Hàm lượng đạm vô cơ trong đất cao sẽ ức chế khả năng cố định đạm của

vi khuẩn, bởi vì sự tổng hợp enzyme nitrogenase được điều khiển bởi enzyme glutamate synthetase, đây là enzyme xúc tác cho tổng hợp glutamin từ NH3 Nếu trong môi trường có ít NH3 thì glutamate synthetase kích thích tổng hợp nitrogenase, ngược lại khi nồng độ NH3 cao thì ức chế sự tổng hợp nitrogenase

Do đó đất lúa có lượng đạm vô cơ cao do bón phân hóa học sẽ ức chế khả năng

cố định đạm của vi khuẩn

2.6 Tổng hợp IAA của vi khuẩn

2.6.1 Lược sử phát hiện IAA

Năm 1880, Charle Darwin đã công bố hiện tượng quang hướng động ở

thực vật trong quyển sách “The power of moment of plant” Đến năm 1926, nhà thực vật học người Hà Lan Fritz W Went xuất bản “the Avena coleoptile curvature test” mô tả và xác định hàm lượng auxin Năm 1934 nhà sinh hóa

Kogl đã xác định được công thức hóa học của auxin và đặt tên là idole acetic acid (IAA) Thimann (1935) đã tách được IAA từ môi trường nuôi cấy nấm

Hình 2.14: Sơ đồ cấu tạo hóa học IAA (Baca and Elmerich,2007)

2.6.2 Chức năng của IAA

Auxin có vai trò quan trọng và đa dạng trong quá trình sinh trưởng và phát

triển ở thực vật Ở mức độ tế bào, auxin truyền đạt tín hiệu và hoạt hóa cho quá

trình phân chia, dãn dài và biệt hóa tế bào trong toàn bộ chu trình sống của thực

vật Ở mức độ cơ thể, auxin có vai trò quan trọng trong sự hình thành rễ, ưu thế

đỉnh, hướng động và sự lão hóa của cây (Guilfoyle et al., 1998)

2.6.3 Cơ chế tổng hợp IAA ở vi khuẩn

Trong tự nhiên, IAA được tổng hợp từ hai nguồn: Thứ nhất, là sản phẩm

nội tiết được tổng hợp trong mô thực vật Thứ hai, là sản phẩm ngoại tiết được

tiết ra bởi các vi sinh vật, các vi sinh vật này rất dồi dào trong đất bao gồm vi

khuẩn và nấm Theo Khalid et al (2004) có đến 80% vi khuẩn vùng rễ có khả

năng tổng hợp IAA

Ở thực vật, vi khuẩn và nấm, IAA được chuyển hóa từ tiền chất tryptophan

hoặc không có tryptophan (Baca and Elmerich, 2007) Cơ chế tổng hợp IAA ở

thực vật và vi sinh vật cơ bản là giống nhau, có ít nhất năm lộ trình khác nhau

để tổng hợp IAA (Spaepen and Vanderleyden, 2011)

Theo Koga et al (1991), có ba lộ trình tiêu biểu cho sự biến đổi tiền chất

Ở vi khuẩn, lộ trình indole-3-pyruvic acid là chủ yếu tổng hợp IAA từ tiền chất L-tryptophan Tổng hợp IAA theo lộ trình indole-3-pyruvic acid ở vi khuẩn

Azospirillum brasilense (Carreño-López et al., 2000)

2.6.3.1 Tổng hợp IAA từ tiền chất Tryptophan

Ở vi khuẩn, IAA được tổng hợp qua 2 bước: Bước 1, tryptophan được chuyển thành IAM nhờ xúc tác của enzyme tryptophan-2-monooxygenase

(IaaM), enzyme này được mã hóa bởi gen iaaM; Bước 2, IAM được tổng hợp

thành IAA nhờ enzyme IAM hydrolase (IaaH), enzyme này được mã hóa bởi

gen iaaM Hai gen này phụ thuộc vào nhau và phụ thuộc vào đặc điểm của mỗi loại vi khuẩn (Spaepen et al., 2007)

Hình 2.15: Sơ đồ lộ trình tổng hợp IAA ở vi khuẩn (Patten et al., 2013)

2.6.3.2 Tổng hợp IAA không cần tiền chất Tryptophan

Vi khuẩn Pseudomonas spp có khả năng tổng hợp IAA mà không sử dụng

tiền chất L-Tryptophan Từ indole-3-glycerol phosphate  acid

idole-3-Theo Last et al (1991), khi môi trường không có tryptophan thì một số vi

sinh vật có khả năng chuyển indole-3-glycerol phosphate thành tryptophan (Hình 2.14)

Hình 2.16: Sơ đồ phản ứng chuyển hóa indole-3-glycerol phosphate thành tryptophan

2.7 Tương tác giữa vi khuẩn vùng rễ và thực vật

2.7.1 Vùng rễ

Vùng rễ hay hệ rễ (Rhizosphere) được biết đến như là một lớp đất mỏng bao quanh rễ cây; là nơi các đặc tính lý học, hóa học và sinh học đã được thay đổi bởi sự phát triển và hoạt động của rễ Vùng rễ là nơi có sự tương tác sinh hóa giữa đất, thực vật và vi sinh vật Là nơi trực tiếp diễn ra sự tương tác giữa thực vật và đất nên có vai trò quyết định đến năng suất sơ cấp trên trái đất Vùng

rễ là nơi tập trung của đa dạng sinh học và có lẽ là môi trường sống năng động nhất trên trái đất (Jones and Hisinger, 2008) Đây là nơi dịch tiết của rễ đóng vai trò tích cực trong sự điều chỉnh các tương tác trong vùng rễ Dịch tiết vùng

rễ có thể điều chỉnh các quần xã vi sinh vật đất, giúp cây chống chịu các loài xâm hại, tạo điều kiện cho các quan hệ cộng sinh có lợi, cải thiện đặc tính lý

hóa của đất, ức chế sự tăng trưởng của các loài thực vật canh tranh (Sanon et al., 2009) Vùng rễ là nơi dồi dào dinh dưỡng bởi dịch tiết rễ và dòng chất dinh

dưỡng hòa tan trong dịch đất được vận chuyển hướng về rễ do hoạt động hút nước và hấp thu chất dinh dưỡng của rễ Sự dồi dào chất dinh dưỡng tại vùng

rễ, làm cho vi sinh vật quần tụ nhiều và đa dạng

2.7.2 Xâm nhập của vi khuẩn vào rễ lúa

Theo Hallman (2001) vi khuẩn xâm nhập vào bên trong mô thực vật qua các lỗ tự nhiên như thủy khổng, khí khổng, lỗ rễ, hay các lỗ được tạo ra từ sự

ma sát với đất hay vết bệnh hay các vết thương do côn trùng gây ra hoặc ở vị trí hình thành rễ phụ, các vi lỗ… Con đường quan trọng và có khả năng nhất là qua vết thương và vi lỗ, khi bắt đầu hình thành lông hút Ngoài ra vi khuẩn còn có thể tiết ra enzyme celulase để phá vỡ lớp vách celulose của rễ non để xâm nhập

vào bên trong thực vật, gặp ở vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus (Edward and Cocking, 2012) Vi khuẩn cố định đạm Parasponia và Aeschynomene khi được chủng vào rễ, chúng tiết ra enzyme celulase phá vỡ vách celulose (Cocking et al., 1992)

Hình 2.17: Sơ đồ vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus tiết ra enzyme

cellulase phá hủy màng tế bào, xâm nhập vào bên trong nhu mô rễ (Edward

and Cocking, 2012)

Theo Chen et al (1993), hai dòng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum brasilense và Azorhizobium caulindans có khả năng tạo para-nodule trên rễ cây lúa mì Kết quả tương tự cũng thấy được ở dòng vi khuẩn cố định đạm Serbania

khi chủng lên rễ cây lúa cũng có khả năng tạo cấu trúc giống nốt rễ với mật số

cao (Hình 2.18) (Li et al.,1991)

Vi khuẩn sống xung quanh hoặc trên bề mặt rễ lúa, khi gặp điều kiện thuận lợi có khả năng xâm nhập vào bên trong nhu mô rễ Theo Bashan (1986), vi khuẩn tiến đến bề mặt rễ cây theo cơ chế hóa hướng động hoặc ngẫu nhiên Rễ cây tiết ra một số dưỡng chất nhằm lôi kéo vi khuẩn đến và quần tụ trên bề mặt

rễ Rễ cây lúa mì tổng hợp và phóng thích chất kích thích thu hút vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens và Azospirillum brasilense hướng đến rễ lúa

Hình 2.19: Vi khuẩn nội sinh rễ lúa (Li et al., 1991)