ÁP DỤNG kỹ THUẬT QF PCR để CHẨN đoán CHO NHỮNG THAI có NGUY cơ CAO mắc hội CHỨNG DOWN

Hiện nay cónhiều kỹ thuật sàng lọc và chẩn đoán trước sinh hội chứng DS như: siêu âm,dùng bộ ba triple test AFP, βHCG, uE3 ,FISH, nuôi cấy tế bào ối… Đối vớinhững phụ nữ có nguy cơ cao m

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dị tật bẩm sinh đã và đang là một vấn đề quan trọng ngày càng thu hútđược sự quan tâm chú ý của toàn xã hội nói chung và ngành y tế nói riêng Dịtật bẩm sinh không chỉ để lại những hậu quả nặng nề, những thiệt thòi lớn chotrẻ mà còn để lại những gánh nặng lớn, những ảnh hưởng tâm lý sâu sắc củangười mẹ trong những lần mang thai tiếp theo

Hội chứng Down (DS) là một bệnh lý có tần suất cao nhất trong cácbệnh rối loạn NST Theo Who (1972) tần số hội chứng Down là 120 –150/100000 trẻ sơ sinh đẻ sống, có những biểu hiện đặc trưng về hình thái vàchậm phát triển về trí tuệ

Tỷ lệ tử vong của DS cao, khoảng 20% trẻ DS sinh ra chết trước 5 tuổi.44% số trẻ DS còn lại có thể sống tới tuổi 60, nhưng không có khả năng họctập và làm việc [10, 26] Cho đến nay chưa có biện pháp điều trị nào đối vớibệnh di truyền nói chung và hội chứng DS nói riêng, chính vì vậy phòng vàhạn chế bệnh di truyền là việc cấp thiết để giảm bớt những bệnh tật di truyền,giảm bớt gánh nặng về kinh tế cũng như tâm lý cho gia đình và xã hội

Việc chẩn đoán phát hiện sớm các bệnh di truyền ở thời kỳ phôi thai là

vô cùng cấp thiết để có các biện pháp phòng và xử lý kịp thời Hiện nay cónhiều kỹ thuật sàng lọc và chẩn đoán trước sinh hội chứng DS như: siêu âm,dùng bộ ba triple test (AFP, βHCG, uE3 ),FISH, nuôi cấy tế bào ối… Đối vớinhững phụ nữ có nguy cơ cao mắc hội chứng DS trong thời kỳ mang thaiđược đề nghị chọc ối để xét nghiệm di truyền tế bào thai theo phương phápkinh điển đòi hỏi một thời gian dài (14 – 18 ngày), với một thể tích mẫu lớn(10 – 15 ml) mặt khác không phải khi nào cũng được các cặp vợ chồng đồng

ý nên việc chẩn đoán cũng gặp nhiều khó khăn Vấn đề đặt ra trong chẩn đoántrước sinh là thời gian thực hiện kỹ thuật làm sao để có câu trả lời sớm nhất

cho những bà mẹ mang thai biết được tình trạng của mình Gần đây người ta

đã phát hiện ra các trình tự lặp lại ngắn STR có tính đa hình cao ở một sốlocus nhất định trên NST số 21 Nhờ đó khi tiến hành phản ứng nhân genPCR những locus này, chúng ta có thể xác định được số lượng các alen trênhình ảnh điện di Do bất thường số lượng alen tương ứng với bất thường NSTnày nên phương pháp này có thể ứng dụng để chẩn đoán hội chứng bấtthường NST một cách nhanh chóng và chính xác mà không phải qua nuôi cấy

tế bào Kỹ thuật QF – PCR gọi là phản ứng chuỗi polymer hóa huỳnh quangđịnh lượng dùng để khuếch đại các STR Đây là phương pháp xác định dị tật

về gen và NST hiệu quả và nhanh chóng hơn các phương pháp khác Với ưuđiểm vượt trội so với các kỹ thuật trước đây, kỹ thuật QF – PCR có độ đặchiệu cao, thời gian trả kết quả nhanh (1 – 2 ngày), với thể tích mẫu nhỏ (0,5 –

1 ml) và giá thành thấp hơn so với kỹ thuật FISH, hơn nữa nhân lực sử dụng

và khả năng áp dụng với quy mô lớn, đáp ứng được nhu cầu chẩn đoán cao

Kỹ thuật này đã được ứng dụng phổ biến trên thế giới, ở Việt Nam kỹ thuật

QF – PCR vẫn còn là mới vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “ Áp dụng kỹ thuật QF – PCR để chẩn đoán cho những thai có nguy cơ cao bị mắc hội chứng Down” với hai mục tiêu:

1 Ứng dụng kỹ thuật QF – PCR để chẩn đoán trước sinh hội chứng Down.

2 Đánh giá giá trị của kỹ thuật QF – PCR trong chẩn đoán trước sinh hội chứng Down.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Lược sử nghiên cứu về hội chứng Down

Năm 1846 Seguin lần đầu mô tả một hội chứng lâm sàng dưới tên

“Furfuraceous Idiocy” [2]

Năm 1866 John Langdon Down mô tả kỹ hơn dưới tên gọi “Mongolia –Idiocy” sau đó được các nhà lâm sàng gọi là hội chứng Down với 4 đặc điểmchính: đặc điểm bộ mặt (trong đó có mặt tròn, trán thấp, mắt xếch, gáy phẳng,giảm sản xương sống mũi), dị tật tim, chậm phát triển trí tuệ, những thay đổinếp vân da bàn tay [2, 49]

Năm 1959 lần đầu tiên Lejeune J và cộng sự phát hiện được ở trongnhân tế bào sinh dưỡng có 47 NST, do thừa 1 NST NST thừa này có kíchthước nhỏ, tâm đầu và về sau này được xác định là NST thứ 21 nên hội chứng

DS còn có tên gọi “Trisomy 21” [50]

Năm 1960 Polani và cộng sự đã báo cáo trường hợp đầu tiên về rối loạncấu trúc chuyển đoạn NST 21 gây hội chứng Down Fraccaco, Raijer vàLindsten (1960) mô tả đầu tiên một trường hợp Down do chuyển đoạn giữa 2NST nhóm G với nhau (G/G) [37]

Năm 1961 Clacke và cộng sự tìm ra hội chứng Down thể khảm gồm 2dòng tế bào: một dòng tế bào bình thường 46 NST, một dòng tế bào bệnh lý

có 47 NST (46,XX(XY)/47,XX(XY), +21 [38]

1.2 Tần suất của hội chứng Down

Hội chứng Down là bệnh có tần suất cao nhất trong các bệnh rối loạnNST Theo Who (1972) tần suất này là 120 – 150/100000 trẻ sơ sinh, ở Anhtần suất này là 1,67/1000 trẻ sơ sinh [26]

Hội chứng Down có thể do rối loạn số lượng, cấu trúc NST 21 dạngthuần hay dạng khảm Theo Zoltán Papp thì 95% Down là trisomy 21; 4% dochuyển đoạn; 1% là thể khảm [49].

1.3 Các bất thường NST gây nên hội chứng Down

Bất thường NST trong hội chứng Down bao gồm cả bất thường về sốlượng và cấu trúc NST, dưới dạng thuần và dạng khảm [22, 43]

Dạng thuần là các tế bào trong cơ thể đều có cấu trúc di truyền giốngnhau, chỉ có một dòng tế bào thuần nhất có bất thường về số lượng hoặc cấutrúc NST 21

Dạng khảm là cấu trúc di truyền của các tế bào trong cơ thể khác nhau,tồn tại ≥ 2 dòng tế bào, trong hội chứng Down hay gặp: 1 dòng tế bào bìnhthường và 1 dòng tế bào bất thường về số lượng hoặc cấu trúc NST 21

Trong những năm gần đây kết hợp các kỹ thuật di truyền phân tử và laitại chỗ, các nhà di truyền học đã xác định được 5 gen có liên quan đến dấuhiệu lâm sàng của hội chứng Down đã được định vị trong một vùng củanhánh dài (q) của NST 21 [29]

Các gen liên quan đến hội chứng Down bao gồm: gen mã hóa proteinsuperoxide dismutase (SOD – 1) và alpha – A – Cristallin ở vị trí 21q22.1 và21q22.3 Gen Gart và ets – 2 ở vị trí trong 21q21.1 và 21q22.2 Gen mã hóaPhosphofructokinase (pfkl) ở vị trí 21q22.3

Vùng 21q22.3 gây ra những biểu hiện kiểu hình Down điển hình như:chậm phát triển trí tuệ, đặc điểm đặc trưng của bộ mặt, những bất thường ởtay và những dị tật bẩm sinh của tim

Phân tích ở mức phân tử vùng 21q22.1 – q22.3 thấy có chứa những genliên quan đến dị tật bẩm sinh của tim Một gen mới DSCR1 được phát hiện

trên vùng 21q21.1 – q22.2 biểu hiện ở não, tim và được coi như là tác nhângây ra những dị tật của tim và chậm phát triển tâm thần trong hội chứngDown [47]

Việc tìm ra các gen này đã mở ra hướng chẩn đoán hội chứng Down ởmức di truyền tế bào – phân tử và mức phân tử

1.4 Nghiên cứu kiểu hình của hội chứng Down

Penrose L S và Smith G.F (1966), Levine H (1971) [30, 35, 38] đều

có một nhận xét chung rằng những dấu hiệu và các triệu chứng rất đặc trưng ởnhững đứa trẻ mắc hội chứng Down: mặt phẳng, khe mắt xếch, nếp quạt,miệng nửa mở, lưỡi dày và thè ra ngoài Tai nhỏ thấp, hình thù biến dạng, cổngắn và rộng, bàn tay ngắn rộng, ngón tay ngắn, nếp ngang duy nhất ở lòngbàn tay, bàn chân ngắn, tật đa ngón, dính ngón, giảm trương lực cơ

Hình 1.1: Hình ảnh trẻ mắc hội chứng Down

Dựa vào những đặc điểm kiểu hình điển hình của hội chứng Down, trênlâm sàng có thể chẩn đoán đúng 90% trẻ mắc hội chứng Down Tuy nhiên cómột số trường hợp trẻ có một số dấu hiệu lâm sàng của hội chứng Down như:mặt tròn phẳng, hai mắt xa nhau, tai nhỏ, chậm phát triển tâm thần…nhưngkết quả xét nghiệm di truyền tế bào lại bình thường, có lẽ đó là những độtbiến chuyển đoạn nhỏ hoặc nhân đoạn ở những vùng gen liên quan đến hộichứng Down Vì vậy cần phải có những nghiên cứu sâu hơn bằng những kỹthuật di truyền tế bào – phân tử và di truyền phân tử

1.5 Xét nghiệm sàng lọc trước sinh hội chứng Down

Sàng lọc trước sinh áp dụng cho những phụ nữa mang thai, đây là biệnpháp giúp ngăn ngừa không cho ra những đứa trẻ bất thường bẩm sinh Xétnghiệm sàng lọc để phát hiện chẩn đoán sớm các bệnh di truyền nhằm tìmphương pháp phòng ngừa điều trị thích hợp Song xét nghiệm sàng lọc chỉ làbước đầu, tiếp sau cần có các xét nghiệm khẳng định để nâng cao giá trị tin cậycủa xét nghiệm sàng lọc Nhìn chung các test sàng lọc dễ dàng được thực hiệnbởi vì quy trình lấy mẫu đơn giản, an toàn cho thai và cho mẹ, phân tích mẫunhanh, thông tin sàng lọc có giá trị, giá cả phù hợp được cộng đồng chấp nhận

Sau đây chúng tôi xin trình bày một số phương pháp có thể sử dụng chosàng lọc trước sinh thai DS:

- Test sàng lọc theo tuổi mẹ

- Test sàng lọc bằng siêu âm

- Test sàng lọc bằng định lượng một số chất trong huyết thanh mẹ

1.5.1 Test sàng lọc theo tuổi mẹ:

Qua nhiều công trình nghiên cứu người ta thấy rằng tần số sinh sản bị

dị tật bẩm sinh có liên quan nhiều tới tuổi mẹ Như trong hội chứng Down

Bảng 1.1: Mối liên quan giữa tuổi mẹ và tần suất sinh con rối loạn NST

Trong 1000 bà mẹ (Jeffuy A, 1977) [25]

Tuổi mẹ 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49

47, +21 2,4 3,1 4,0 5,2 6,7 8,7 11,2 14,5 18,7 24,1 31,1 40,1 51,8 68,8 88,2 111,2 143,5

Các nguy cơ bất thường NST ở thai tăng lên theo tuổi mẹ Ở những bà

mẹ tuổi cao > 35 tuổi thì nguy cơ không phân ly NST xảy ra ở trứng ngàycàng tăng Tuổi mẹ càng cao thì nguy cơ sinh con dị tật càng cao Theo một sốtác giả, điều này có thể giải thích trong quá trình phát sinh trứng; noãn bào Iđược hình thành ở giai đoạn phôi muộn (khoảng tháng thứ 5 sau khi hợp tửhình thành) tế bào giam hãm ở giai đoạn này nhiều năm, sau tuổi dậy thì một

số noãn bào phát triển tiếp tục sự phân bào giảm nhiễm để tạo thành trứng.Khi quá trình thụ tinh xảy ra thì quá trình giảm nhiễm kết thúc Như vậy tuổicủa mẹ càng cao, trứng càng chịu nhiều tác động với các yếu tố phơi nhiễmlàm tăng nguy cơ của sự không phân chia NST trong quá trình phân bào.

Người ta cũng nhận thấy ở những bà mẹ quá trẻ (dưới 20 tuổi) nguy cơsinh con bị DS lớn hơn ở những bà mẹ 20 – 29 [28] Ở một số nước, người tatiến hành chọc hút dịch ối ở tất cả các thai phụ ≥ 35

Tuổi của bố quá cao > 55 tuổi cũng là yếu tố tăng nguy cơ sinh con dịtật Do vậy qua điều tra bố mẹ ta có thể phát hiện nhóm nguy cơ cao sinh con

dị tật

1.5.2 Test sàng lọc bằng siêu âm.

Qua nhiều công trình nghiên cứu của nhiều tác giả đã đi tới kết luận làsiêu âm sử dụng trong chẩn đoán không có hại gì cho con người, tuy nhiên chỉnên siêu âm khi cần thiết Khác với chụp X quang, sàng lọc bằng siêu âmkhông có hại cho mẹ, cho thai, cho những người thực hiện kiểm tra này [5, 33]

Vì vậy với siêu âm thường quy thường áp dụng ở tuần 12, 22 và 32 Siêu âm cóthể kiểm tra được khả năng sống của thai, số lượng thai, tuổi thai và phát hiệnnhững bất thường hình thái của thai nhi

Việc phát hiện các thai bị dị tật thường tiến hành ở ba tháng giữa, vàsau đây là một số hình ảnh điển hình liên quan tới thai có hội chứng DS [3]

- Thai phát triển bình thường

- Khoảng mờ sau gáy (độ dày da gáy) > 3mm ở 3 tháng đầu, ≥ 6 mm ở

ba tháng giữa

- Ngắn xương cánh tay và xương đùi (< 0,91 của chiều dài mong đợi, tỷ

lệ chiều dài xương đùi/ dài vòng bụng là thấp hơn mong đợi)

- Những dị tật tim bẩm sinh (dị tật vách ngăn tâm thất, vách ngăn tâmnhĩ thường hay gặp nhất)

- Hẹp tá tràng (dấu hiệu bong bong đôi ở 3 tháng thai cuối).

1.5.3 Test sàng lọc bằng định lượng một số chất trong huyết thanh mẹ.

Những chất trong huyết thanh thai phụ được dùng để phát hiện nhữngthai dị tật bẩm sinh phổ biến là: AFP (alpha fetoprotein), HCG (humanchorionic gonodotropin), uE3 (unconjugated estriol), Inhibin A, PAPA-A(prenancy Associated plasma protein - A) [6]

1.5.3.1 AFP (alpha fetoprotein)

*Nguồn gốc: AFP được sản xuất từ túi noãn hoàng và gan của bào thai,

đến cuối thời kì phôi khi túi noãn hoàng teo đi thì gan sản xuất là chủ yếu.AFP là một glucoprotein có trọng lượng phân tử 69 Kdalton chứa 4% carbon,với thành phần protein là alphaglobulin Thời gian bán huỷ trong dịch ối vàhuyết thanh của AFP là 3-5 ngày

*Nồng độ AFP

Trong huyết thanh của thai có thể thấy vào tuần thứ 6, tiếp tục tăng lênđến tuần thứ 12 và duy trì đến tuần thứ 30 có thể ở mức 3 - 4 mg/ml; sau đógiảm dần cho tới khi sinh chỉ còn 10 - 150µg/ml và tiếp tục giảm cho đến 6tháng tuổi thì nồng độ AFP trở về gần giống người trưởng thành < 10ng/ml

Trong dịch ối cũng có thể phát hiện vào tuần thứ 6 của thai nhi, do sựkhuếch tán từ thai vào dịch ối qua bánh rau và sau tuần thứ 10 còn có nướctiểu của thai nhi cung cấp, tăng cao nhất vào tuần 12 - 14 của thai rồi giảmxuống khoảng 1000 ng/ml ở tuần 20, vì thời điểm này có tăng đột ngột thểtích dịch ối Nồng độ AFP tăng ổn định từ tuần tuần thai 15 – 20 [49] Nồng

độ AFP trong dịch ối chỉ bằng 1/200 - 1/100 nồng độ AFP trong huyết thanhcủa thai nhi.

Trong máu mẹ có thể thấy vào tuần thứ 5 - 11 là 6 UI/ml sau đó tăngdần đến tuần thứ 30 nhưng với nồng độ thấp chỉ bẳng 1/50000 nồng độ AFPtrong huyết thanh của thai và bằng 1/500 trong dịch ối [49] AFP chủ yếuđược khuếch tán từ huyết thanh của thai vào dịch ối qua bánh rau tới tuầnhoàn của mẹ

Trên cơ sở nồng độ AFP được ổn định ở các tuần thai kể từ tuần 11 trở

đi, đặc biệt từ tuần 15 trở đi, một số nghiên cứu của các nghiên cứu đã xácđịnh rằng AFP trong huyết thanh của mẹ giảm trong một số bất thường NST:hội chứng Down, hội chứng Turner, Trisomi 18 Nồng độ AFP trong huyếtthanh mẹ giảm < 0,7 MoM (MoM là bội số của giá trị trung vị: Multiple ofmedian)

1.5 3.2 βHCG (Human chorionic gonodotropin)

*Nguồn gốc: βHCG bản chất là một glucoprotein do tế bào lá nuôi bàitiết, có thể thấy HCG trong nước tiểu vào ngày thứ 8 sau khi thụ thai

*Nồng độ β HCG: βHCG tăng nhanh và đạt tối đa vào tuần 8 - 9 sau đógiảm dần vào tuần thứ 12 và duy trì cho tới khi đẻ Có thể định lượng lương

βHCG trong dịch ối, trong huyết thanh và trong nước tiểu của mẹ Nồng độHCG rất cao trong chửa trứng, đặc biệt trong ung thư rau thai Người tathường định lượng βHCG tự do ở trong giai đoạn 3 tháng thai đầu, còn βHCGtoàn phần thường được sử dụng từ 3 tháng thai giữa

Ở những thai DS nồng độ βHCG trong huyết thanh mẹ cao hơn so vớinhững thai bình thường [14, 25, 49]

1.5 3.3 uE 3 (Unconjugated estriol) estriol không liên hợp

*Nguồn gốc: uE3 do hoàng thể bài tiết, từ tháng thứ 4 trở đi có thêm rau

bài tiết

*Nồng độ uE 3 : tăng dần trong máu mẹ suốt thời kì mang thai, cao nhấtvào tháng thứ 9 và đến ngày đẻ thì giảm dần uE3 qua bánh rau vào tuần hoàn

mẹ nên có thể định lượng trong máu mẹ Do có sự dao động lớn về nồng độ,khi đánh giá giá trị uE3 ngoài việc so sánh với nồng độ bình thường người tathường xét nghiệm hai lần để đánh giá quá trình phát triển của thai Nồng độuE3 giảm chứng tỏ tình trạng suy yếu của bánh rau và thai nhi uE3 có sự daođộng lớn về nồng độ và thời gian bán huỷ trong máu mẹ chỉ 20 - 30 phút nêncần chú ý khâu bảo quản mẫu

Trong hội chứng Down nồng độ uE3 giảm [18, 25]

1.5.3.4 Inhibin A

Là một protein có nguồn gốc thai nhi do bánh rau và màng thai lànguồn bài tiết chủ yếu Inhibin là một glycoprotein gồm 2 chuỗi α, β (gồm 2loại βA, βB ) Nếu chuỗi α liên kết với βA thì gọi là Inhibin A, hoặc chuỗi α liênkết với βB gọi là Inhibin B Qua nhiều nghiên cứu phát hiện mức Inhibin Atăng trong những thai có hội chứng Down với mức sàng trung bình 1,63 MoM[15, 42]

1.5.3.5 PAPP-A (pregnancy associated plasma protein A)

Là một glycoprotein có nguồn gốc từ bánh rau [31], thường được dùngtrong 3 tháng đầu của thai kỳ Đối với thai Down nồng độ PAPP-A thườnggiảm với mức sàng trung bình 0,97 MoM [9, 16, 45, 46]

1.5.3.6 Phối hợp các phương pháp định lượng trong các test sàng lọc

Test sàng lọc được thực hiện ở ba tháng giữa là phổ biến, tuy nhiêntrong 3 tháng đầu các test sàng lọc cũng đem lại giá trị cao Các test được sửdụng hiện nay là [41]:

* Trong 3 tháng đầu, các test được thực hiện thường quy như:

- Douple test: PAPP-A + βHCG

Hoặc có thể phối hợp thêm đo độ dày da gáy để tăng hiệu quả sàng lọc

Combined test : PAPP-A + βhCG + độ dày da gáy

Đối với thai Down nồng độ PAPP-A trong huyết thanh mẹ thấp MoM <0,7 và βhCG tự do cao hơn so với thai phụ bình thường MoM > 1,7

* Trong 3 tháng giữa có thể áp dụng các test sau:

- Double test : AFP + βhCG;

- Triple test: AFP + βhCG + uE3

- Quadruple test: AFP + βhCG + uE3 + Inhibin A

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi phối hợp các huyết thanh định lượngđược trong máu mẹ có nguồn gốc từ thai thì hiệu quả sàng lọc tăng lên đáng

kể Xét các test sàng lọc tại quý 2 của thai kỳ (15 – 19 tuần ): nếu chỉ dựa vàotuổi mẹ thì tỷ lệ phát hiện đạt 32% nhưng khi sử dụng các test như double,triple và quadruple tỷ lệ phát hiện lần lượt là 60%, 68%, 79% Đặc biệt trongtest kết hợp Integrated (tuổi mẹ, khoảng sáng sau gáy, các test trong quý đầu

và quý 2 của thời kỳ mang thai) tăng tỷ lệ phát hiện lên 95% [24]

1.6 Các phương pháp lấy mẫu dùng trong chẩn đoán trước sinh thai Down

Sàng lọc chỉ biết được những thai có nguy cơ DS, nhưng để xác địnhchính xác thai DS thì phải làm các xét nghiệm di truyền Các xét nghiệm này

có thể ở mức độ tế bào (phân tích NST), mức độ phân tử (ADN), hoặc cả mức

độ tế bào và phân tử Tất cả các xét nghiệm này chỉ thực hiện được khi cóđược tế bào có nguồn gốc từ thai Người ta sử dụng nhiều phương pháp khácnhau để lấy được tế bào thai

1.6.1.Phương pháp lấy tế bào trực tiếp

Ngày nay, tế bào thai được lấy phổ biến từ chọc hút dịch ối, sinh thiết tuarau, ngoài ra còn lấy máu cuống rốn, soi phôi thai hoặc hút tế bào qua cổ tử cung

1.6.1.1 Chọc hút dịch ối

Chọc ối có hai loại là chọc ối sớm (tuần thai từ 9 – 14) và chọc ối muộn(tuần thai từ 15 – 18)

Chọc ối sớm có thể phát hiện những bất thường thai sớm Thủ thuậtđình chỉ thai ở giai đoạn này dễ thực hiện hơn khi làm ở 3 tháng giữa và hạnchế được những sang chấn về tinh thần và thể xác cho những thai phụ đìnhchỉ thai Tuy nhiên chọc ối sớm sẽ khó khăn hơn, chọc kim nhiều lần và dẫnđến hiện tượng rỉ ối [36] Ngoài ra người ta còn thấy chọc ối sớm làm tăng tỷ

lệ của thai bị dị tật bàn chân vẹo, tăng tỷ lệ bất thường thai và có thể gây racác dạng khảm [12, 19]

Chọc ối ở tuần thai 15 – 18 là tiêu chuẩn vàng áp dụng cho chẩn đoán

di truyền tế bào trước sinh với độ chính xác cao 99,4% - 99,8% và có tỷ lệ sẩythai 0,5 – 0,1% [34] Phân tích karyotyp của tế bào ối có kết quả sau khoảng 2– 3 tuần, vì vậy nếu sản phụ lựa chọn cho loại bỏ thai (do bất thường NST) thì

có thể có nhiều bất lợi hơn so làm ở 3 tháng đầu Người ta có thể tiến hànhchọc dò ối qua thành bụng hoặc qua đường âm đạo (hiện nay ít dùng) thườngkết hợp với siêu âm để xác định vị trí chọc dò Chọc dò ối được tiến hành vàotuần thứ 16 vì:

+ Trước tuần 16 dịch ối ít, ít tế bào, thường gây sẩy thai Sau tuần thứ 16 tửcung to, lượng dịch ối 100 - 180 ml, có thể lấy dịch ối Số tế bào sống bong ra từbào thai và mang đi đủ để làm xét nghiệm và nuôi cấy tế bào thành công

+ Sau tuần thứ 16 tỷ lệ sảy thai tự nhiên bắt đầu giảm

Các tế bào có trong dịch ối là các tế bào có nguồn gốc thai nhi (các tếbào của mẹ có thể lẫn vào nhưng rất ít) dịch ối là mẫu vật đã được sử dụng từlâu để chẩn đoán trước sinh với sự kết hợp siêu âm, kỹ thuật này ngày càngphát triển và được sử dụng rộng rãi

Tuy nhiên chọc dò dịch ối có thể gây ra các tai biến nhất định: rỉ ốihoặc thấm máu âm đạo có thể tới 2- 3 % sản phụ [40] Nhiễm trùng sau chọc

ối hiếm nhưng cũng có thể xảy ra với tỷ lệ 0,05% - 0,15%, có thể do da bụngcủa sản phụ bị nhiễm trùng hoặc chọc nhầm vào ruột nen có thể mang theonấm hoặc vi khuẩn vào túi ối [32] Ngoài ra còn có thể gây ra chảy máu bánhrau hay bất đồng nhóm máu mẹ con.

1.6.1.2 Sinh thiết tua rau

Thời gian tốt nhất để chọc dò tua rau là tuần thứ 8 - 10 của thai kì Cáctua rau thai này được sử dụng làm tiêu bản NST theo phương pháp trực tiếphoặc nuôi cấy Ngoài ra người ta còn dùng tua rau để làm các xét nghiệm ở mứcphân tử

Ta có thể sinh thiết tua rau cổ tử cung hoặc qua thành bụng kết hợp siêu

âm Mặc dầu các tai biến sẩy thai 2 - 3% [27] cao hơn so chọc ối và bất lợinhất của chọc hút tua rau là liên quan tới dạng khảm vì có thể lẫn tế bào mẹ,hoặc do sự phát triển quá nhanh của lớp tế bào cytotrophoblast (lớp trong lánuôi) của rau, có thể gặp 1 – 2 % [23] và liên quan với những nguy cơ sẩythai và có thể có những bất thường bẩm sinh khác, nhưng kỹ thuật này vẫnđược áp dụng nhiều trên thế giới

1.6.1.3 Chọc hút máu cuống rốn

Lấy máu cuống rốn được làm từ tuần thai 18 Ưu điểm lớn nhất của xétnghiệm này là cho kết quả NST thai trong vòng 48 – 72h [17], đánh giá tìnhtrạng hematocrit cho hồng cầu, nhiễm trùng bẩm sinh, bất thường về máu,tình trạng ứ nước thai, tình trạng chuyển hóa Tuy nhiên những chỉ định chochẩn đoán từ máu thai ngày càng hạn chế vì tỷ lệ sẩy thai khá cao 1,4 % , tỷ lệchết trước sinh là 1 4 % (chết sau tuần thai 28) [48] và việc sử dụng tế bào tuarau và dịch ối cho chẩn đoán những bất thường di truyền ở mức phân tử ngày càngphổ biến

1.6.1.4 Sinh thiết mô thai – Nội soi phôi

Mẫu được lấy ở 3 tháng giữa, thường từ tuần thai 15 – 22 được dùngchẩn đoán trước sinh đối với những trường hợp khi phân tích tế bào tua rauhoặc tế bào dịch ối không có hiệu quả Những mẫu da thai có thể sử dụngtrong chẩn đoán những bệnh của thai, để phân tích ADN trong các bệnh về da[13] Xác định dạng khảm NST thai bằng sinh thiết da thai và nuôi cấy tế bàosợi khi máu thai không thể xác định hoặc nghi ngờ thể khảm [11] Tuy nhiêntai biến hay gặp là tỷ lệ sẩy thai sau khi sinh thiết da thai 5 – 7%, đẻ nonkhoảng 10% trường hợp Hay gặp là rỉ ối và nhiễm trùng ối, còn ở mẹ thì cóthể chảy máu, tổn thương bàng quang, hoặc tổn thương ruột [20]

1.6.2 Phương pháp lấy tế bào thai gián tiếp từ máu mẹ

Một số tế bào có nguồn gốc từ thai nhi có thể đi vào máu mẹ; dựa vàocác kỹ thuật phân tử người ta có thể chẩn đoán trước sinh Tỷ lệ các tế bàothai nhi vào máu mẹ rất ít nên hiệu quả của phương pháp này hạn chế

1.7 Kỹ thuật di truyền được áp dụng để chẩn đoán trước sinh thai bị Down

1.7.1 Chẩn đoán bằng phương pháp di truyền tế bào

Từ các mẫu ối và các tế bào tua rau sẽ được tiến hành làm xét nghiệmNST Để xét nghiệm NST, người ta có thể sử dụng phương pháp trực tiếp tức

là tế bào đang phân chia mạnh (không qua nuôi cấy như từ tế bào tua rau) hoặc gián tiếpqua nuôi cấy

Năm 1956 Tjio và Levan đã xác định được chính xác số lượng NST củangười là 46 chiếc bằng kỹ thuật nuôi cấy lympho máu ngoại vi

Năm 1966 qua phân tích NST trong tế bào dịch ối một trường hợptrisomy 21 đầu tiên đã được biết đến [39]

Từ sau năm 1970 kỹ thuật nhuộm băng G và băng R đã được phát hiện

và ứng dụng trong việc xác định NST [8] Phương pháp nhuộm băng G chophép xác định được các vùng của từng NST, các rối loạn của NST: trisomy,chuyển đoạn, đứt đoạn, trisomy từng phần Mặc dù hiện nay đã phát triển kỹthuật băng G với độ phân giải cao nhưng vẫn chưa phát hiện được những rốiloạn như: nhân đoạn, chuyển đoạn, mất đoạn nhỏ

Để phát hiện những trường hợp Down khảm thường nuôi cấy lymphobào máu ngoại vi và sinh thiết mô lấy tế bào sợi nuôi cấy

Với phương pháp này, do các tế bào phải trải qua một thời gian nuôicấy (15 – 20 ngày) nên thời gian trả kết quả cho bệnh nhân lâu

1.7.2 Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền tế bào – Phân tử bằng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang (FISH)

FISH là kỹ thuật tế bào phân tử, dùng một trình tự ngắn của chuỗi ADNsợi đơn, gọi là mẫu ADN dò (được đánh dấu bằng huỳnh quang) Một mẫuADN dò được lai với các ADN đich trên NST của tế bào gian kỳ hoặc cácNST ở kỳ giữa, kết quả được đọc trên kính hiển vi huỳnh quang [4, 21] Mộtmẫu ADN dò sẽ lai với 2 vị trí trên 2 NST của cặp NST tương đồng trongnhân tế bào sinh dưỡng Nếu mẫu dò lai với 3 vị trí thay vì 2 vị trí như bìnhthường trên NST 21 chứng tỏ bệnh nhân có biểu hiện trisomy 21 KhươngTrường năm 2003 đã chẩn đoán hội chứng DS bằng kỹ thuật FISH [28]

Kỹ thuật này có thể phát hiện những bất thường do đoạn gen nhỏ gây ravới độ phân giải cao, phát hiện được bất thường NST ở gian kỳ mà không cầntiến hành nuôi cấy tế bào và nhuộm băng NST [7] Tuy nhiên giá thành kỹthuật còn cao, đòi hỏi thiết bị, chuyên môn cao và mất thời gian đọc nênkhông thể triển khai rộng rãi trên quy mô lớn

1.7.3 Chẩn đoán bằng phương pháp di truyền phân tử - Kỹ thuật QF

1.7.3.1 Khái niệm về kỹ thuật QF - PCR

Kỹ thuật QF – PCR được gọi là phản ứng chuỗi polymer hóa huỳnhquang định lượng dùng để khuếch đại các STR (Short TADNem repeat – Làcác trình tự lặp lại ngắn của đoạn không mã hóa trên ADN có tính đa hình cao

ở một số locus nhất định trên NST) Đây là phương pháp xác định các dị tật

về gen và NST hiệu quả nhanh chóng hơn so với các phương pháp khác Bằng

sử dụng các cặp mồi huỳnh quang, các đoạn ADN được khuếch đại có thểđược quan sát thấy và định lượng được thông qua diện tích các đỉnh (peak)trên hệ thống máy quét tự động Các trường hợp bình thường thấy được thôngqua hình ảnh các đỉnh (peak) với tỷ lệ 1: 1 (Adinolfi và cộng sự, 1997)

1.7.3.2 Vai trò của kỹ thuật QF – PCR trong chẩn đoán trước sinh

Tổng kết nhiều nghiên cứu của các tác giả cho thấy, trong 22504 mẫunghiên cứu được xét nghiệm bằng kỹ thuật QF – PCR và được kiểm chứngbằng phương pháp xét nghiệm tế bào thông thường cho thấy tỷ lệ phát hiệnbất thường số lượng NST ở các NST lựa chọn (13, 18, 21, X, Y) là 98,6%.Trong đó chẩn đoán nhầm ở NST 21 là 3/551 trường hợp Trên thực tế nhữngchẩn đoán nhầm này là do các xét nghiệm không có đầy đủ thông tin, và doNST có những bất thường về cấu trúc (NST hình vòng), đảo đoạn hoặc ở dạngkhảm là những dạng mà kỹ thuật QF – PCR còn hạn chế chưa phát hiện được[1]

Một số tác giả đề xuất sử dụng QF – PCR như một xét nghiệm bổ sungcho xét nghiệm tế bào thông thường (Pertl cộng sự, 1996; Levett cộng sự,2001; Bili cộng sự, 2002) Tuy nhiên theo Man và cộng sự (2001), với nhữngphụ nữ với dấu hiệu bất thường trên siêu âm hay sàng lọc huyết thanh mẹ

dương tính thì cần phải chẩn đoán trước sinh và có thể sử dụng kỹ thuật QF –PCR một mình để chẩn đoán.

Gần đây Ogilvie (2003), Leung và cộng sự (2004) đã đưa ra nhữngthuận lợi vượt trội của kỹ thuật này so với nhược điểm nên đã đề xuất thay thếphương pháp phân tích di truyền tế bào trước sinh sau khi sàng lọc dương tínhđối với hội chứng Down bằng kỹ thuật QF – PCR

Theo Verma và cộng sự (1998) trong tương lai kỹ thuật này có thể trởthành một phương pháp lựa chọn trong chẩn đoán trước sinh đối với các bấtthường NST trên các tế bào phôi phân lập từ máu mẹ Với những ưu điểmvượt trội như: có thể thực hiện trên số lượng tế bào ít, không đòi hỏi nuôi cấy

tế bào nên không cần mẫu tươi hay vô khuẩn, thậm chí có thể phân tích đốivới các mẫu ADN đã bị đứt gãy như mẫu máu khô, ADN nằm ngoài tế bào,hơn nữa việc phân tích dễ, dạng tự động hóa do vậy có thể sử lý nhiều mẫutrong cùng một thời gian, rút gọn thời gian của một xét nghiệm xuống cònkhoảng 5h kể từ khi lấy mẫu nên cho câu trả lời nhanh, chính xác, giá thànhphải chăng, giảm bớt lo lắng cũng như gánh nặng về kinh tế cho sản phụ Dựatrên những xem xét đó, QF – PCR có xu hướng ngày càng tăng sử dụng và trởthành công cụ bổ trợ cũng như thay thế các phân tích tế bào thường quy hiệnnay trong chẩn đoán trước sinh

Chương 2ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là những mẫu dịch ối của các thaiphụ mang thai với tuổi thai ≥ 16 tuần, có kết quả sàng lọc (triple test hoặcdouple test dương tính hoặc siêu âm bất thường, tuổi mẹ cao…Mẫu dịch này

sẽ được phân tích bằng kỹ thuật QF – PCR sau đó đối chứng lại bằng phươngpháp phân tích tế bào thông thường

2.2 Địa điểm lấy mẫu và địa điểm phân tích mẫu

2.2.1 Địa điểm lấy mẫu

Mẫu ối được thu thập tại bộ môn Y sinh học – Di truyền trường Đại học Y

Hà Nội và tại trung tâm chẩn đoán trước sinh Bệnh viện Phụ sản Trung Ương

2.2.2 Địa điểm phân tích mẫu

Phòng chẩn đoán trước sinh Bệnh viện Phụ sản Trung Ương và Bộ môn

Y sinh học – Di truyền trường Đại học Y Hà nội

2.3 Thời gian

Thời gian nghiên cứu từ 01/2011 đến tháng 8/2012

2.4 Phương tiện nghiên cứu

2.4.1 Dụng cụ

- Dụng cụ phải tuyệt đối vô trùng (hấp ướt 120o C trong 20 phút)

- Máy PCR Bio - Rad

- Tủ lạnh sâu (- 30o C), tủ ấm

- Máy đo nồng độ ADN.

- Máy li tâm để bàn

- Máy đọc trình tự tự động ABI 3130 XL (Applied Biosystem)

- Pipet định mức, đầu côn các loại, ống PCR, ống Eppendorf 1,5 ml,ống Falcon, găng tay, giấy thấm đã được vô trùng tuyệt đối

2.4.2 Hóa chất

- Hóa chất dùng để tách chiết ADN: Hạt chelex, PBS, ethanol, TE,Proteinase K

- Hóa chất dùng cho phản ứng QF – PCR: bộ kit của hãng AneufastTM

- Hóa chất điện di huỳnh quang: Hi – DiTM Formamide, GeneScanTM –

500 LIZTM Size StADNard, Capillary 36, POP4, Butffer

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm mô tả.

2.5.2 Cỡ mẫu: N = 70.

2.6 Kỹ thuật sử dụng

Bằng kỹ thuật chọc ối (phụ lục), mẫu ối sẽ được thu thập tại khoa chẩnđoán trước sinh Bệnh viện Phụ sản trung ương và được tiến hành các kỹ thuật sau:

Quy trình phân tích mẫu dịch ối bằng kỹ thuật QF – PCR

2.6.1 Tách chiết ADN

- Bước 1: Giải phóng ADN ra khỏi màng tế bào (bằng cách nghiền,dùng áp suất siêu âm hoặc dùng phương pháp hóa học, sinh học)

- Bước 2: Tách bỏ ADN ra khỏi các chất khác (bổ sung chất hoạt hóaenzyme ADNase và làm biến tính các phân tử protein, dịch hữu cơ )

- Bước 3: Kết tủa, rửa, hòa tan ADN (bằng Ethanol, đệm TE hoặc nước cất)

Mẫu dịch ối

Tách chiết ADN

Đo độ tinh sạch của ADN

Chạy nhân gen bằng kỹ thuật PCR

Điện di mao quản trên máy đọc trình tự tự động ABI

3130 XL

Phân tích dữ liệu bằng phần mềm Genemapper ID 3.2

Kỹ thuật di truyền tế bào (phân tích Karyotyp)

 Quy trình tách chiết ADN bằng hạt chelex

- Bước 1: Lấy dịch ối xét nghiệm vào ống eppendorf, dịch ối để ở nhiệt độphòng

- Bước 2: Ly tâm dịch ối ở 13000 vòng phút/3 phút Loại bỏ dịch trong,

bổ sung thêm 700 UL H2O khử ion, vortex ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 – 3phút Ly tâm 12 000 vòng phút/3 phút

- Bước 3: Lấy Chelex để ở nhiệt độ phòng 5 phút (dùng máy khuẩy từlàm tan Chelex)

- Bước 4: Hút bỏ dịch phía trên để lại cặn tế bào (trong trường hợp cómáu trong mẫu dịch ối, cho 200 µl nước khử ion vào chỗ cặn tế bào Votex và

ly tâm 13000 vòng phút/5 phút rồi bỏ lớp dịch trên Lặp lại các bước này tối

đa 3 lần cho đến khi hết máu trong mẫu)

Bước 5: Cho 30 µl Chelex vào mỗi mẫu, votex (nếu không dùng luônthì bảo quản bằng dung dịch TE ở nhiệt độ - 20oC)

2.6.2 Phương pháp định lượng ADN

* Nguyên tắc

Phương pháp này dựa vào sự hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng

260 nm của các base purin và pyrimidin Giá trị mật độ quang ở bước sóng

260 nm của các mẫu cho phép xác định nồng độ ADN trong mẫu đo Độ tinhsạch của dung dịch dựa vào tỷ số OD 260nm/280nm Một dung dịch acidnucleic được coi là sạch khi tỷ số OD là 1,8 – 2,0

Hình 2.1: Kết quả đo nồng độ ADN bằng máy quang phổ Nanodrop 2.6.3 Khuếch đại trình tự STR bằng kỹ thuật QF – PCR

* Mục đích: Phát hiện và nhân đoạn ADN nhiều lần trong ống nghiệm.

* Thành phần phản ứng PCR: ADN khuôn + Bộ kit của AneufastTM

* Các marker được khuếch đại bằng bộ Aneufast TM QF – PCR

Bảng 2.1: Các marker được sử dụng để chẩn đoán sẽ khuếch đại các

trình tự lặp ngắn STR của các gen liên quan trên NST

Marker phổ biến dùng để chẩn đoán hội chứng Down là S1 (D21S1414,D21S1446) và S2 (D21S1411, D21S1435); Các marker dùng để xác định lạikhi nghi ngờ có hội chứng Down (Extra marker) ở cột M21 (D21S1411,D21S1435, D21S1437, D21S1412, D21S1008).

* Phương pháp: PCR được thực hiện qua nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ

- Giai đoạn tổng hợp: Taq polymerase điều khiển sự gắn tiếp các Nu vàosau ADN mồi dựa vào ADN ban đầu làm khuôn Như vậy, sau mỗi chu kỳ sốbản sao của ADN gấp hai lần và sau n chu kỳ sản phẩm thu được sẽ là 2n

2.6.4 Điện di trên máy ABI 3130 XL

* Nguyên lý: Dùng máy điện di có hai cực âm với dương, sợi ADN

mang điện tích âm khi điện di chạy về cực dương, các đoạn ADN có kíchthước khác nhau sẽ phân tách thành các băng vạch khác nhau