Nghiên cứu loại Cafein từ dịch chiết lá chè bằng phương pháp hấp thụ

Nhằm ứng dụng phương pháp hấp phụ vào việc tạo ra sản phẩm cao Chè ít cafein, đề tài “Nghiên cứu loại cafein từ dịch chiết lá Chè bằng phương pháp hấp phụ” được thực hiện với mục tiêu:

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng và sâu sắc tới DS Trần Trọng

Biên, tổ Chiết xuất - bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội

đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ và tạo điệu kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Văn Hân, TS Bùi Thị Thúy

Luyện đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Trường đại học Dược Hà Nội, các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Công Nghiệp Dược đã tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè luôn bên cạnh ủng

hộ, động viên, giúp đỡ em những lúc khó khăn để em có thể đạt được kết quả ngày hôm nay

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Thu Hà

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về cây Chè 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố 2

1.1.2 Tình hình sản xuất Chè tại Việt Nam 2

1.1.3 Thành phần hóa học 2

1.2 Một số nghiên cứu về loại cafein từ Chè xanh 6

1.2.1 Loại cafein từ lá Chè 6

1.2.2 Loại cafein từ dịch chiết lá Chè 8

1.3 Một số chất hấp phụ sử dụng trong nghiên cứu 9

1.3.1 Montmorillonit 9

1.3.2 Nhựa macroporous 13

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 15

2.1.1 Nguyên liệu 15

2.1.2 Chất chuẩn và hóa chất 15

2.1.3 Thiết bị thí nghiệm 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Chiết xuất và điều chế cao thô 17

2.3.2 Quá trình hấp phụ 18

2.3.3 Phương pháp định lượng cafein và EGCG 19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21 3.1 Thẩm định phương pháp định lượng cafein và EGCG trong lá Chè xanh

3.1.1 Độ đặc hiệu 21

3.1.2 Độ thích hợp hệ thống 22

3.1.3 Khoảng tuyến tính 22

3.1.4 Độ lặp lại 23

3.1.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 24

3.2 Nghiên cứu sàng lọc các chất hấp phụ 24

3.2.1 Tính chọn lọc của các chất hấp phụ 25

3.3.2 So sánh các chất hấp phụ 26

3.3 Nghiên cứu loại cafein bằng MMT 26

3.3.1 Động học hấp phụ cafein trên MMT 26

3.3.2 Đường hấp phụ đẳng nhiệt 29

3.3.3 Ảnh hưởng của pH dịch chiết 32

3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 32

3.3.5 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol 33

3.4 Quy trình loại cafein 34

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 38

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

(High Performance Liquid Chromatography)

LOQ Giới hạn định lượng (Litmit of Quantifitation)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả thời gian lưu và diện tích píc của dung dịch chuẩn hỗn hợp 22

Bảng 3.2 Mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ cafein và EGCG 23

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng 24

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian đến dung lượng hấp phụ của cafein trên MMT 27

Bảng 3.5 Dữ liệu thực nghiệm mô hình giả bậc 1 28

Bảng 3.6 Dữ liệu thực nghiệm mô hình giả bậc 2 28

Bảng 3.7 Các thông số mô hình động học hấp phụ cafein trên MMT 4 29

Bảng 3.8 Kết quả thực nghiệm hấp phụ đẳng nhiệt của cafein trên MMT ở 25oC 30

Bảng 3.9 Các thông số mô hình hấp phụ đẳng nhiệt của cafein trên MMT ở 25°C 31

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của pH dịch chiết đến quá trình loại cafein 32

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình loại cafein 33

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình loại cafein 34

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của một số loại catechin 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của cafein 5

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của montmorillonit 10

Hình 1.4 Các vị trí tương tác của montmorillonit 11

Hình 3.1 Sắc ký đồ HPLC thẩm định độ đặc hiệu 21

Hình 3.2 Đường chuẩn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ 23

Hình 3.3 Ảnh hưởng của các loại chất hấp phụ đến dung lượng hấp phụ cafein, EGCG và hệ số chọn lọc 25

Hình 3.4 Ảnh hưởng của các loại chất hấp phụ đến tỷ lệ cafein loại đi và tỷ lệ EGCG còn lại trong dịch chiết 26

Hình 3.5 Động học hấp phụ cafein trên MMT 4 27

Hình 3.6 Đồ thị động học hấp phụ cafein từ dung dịch cafein (a) và dịch chiết (b) trên MMT theo mô hình giả bậc 1 28

Hình 3.7 Đồ thị động học hấp phụ cafein từ dung dịch cafein (c) và dịch chiết (d) trên MMT theo mô hình giả bậc 2 28

Hình 3.8 Đường đẳng nhiệt hấp phụ cafein trên MMT ở 25°C 30

Hình 3.9 Đồ thị hấp phụ đẳng nhiệt của cafein trên MMT ở 25°C 31

Hình 3.10 Đồ thị ảnh hưởng của pH dịch chiết đến quá trình loại cafein 32

Hình 3.11 Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình loại cafein 33

Hình 3.12 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình loại cafein 34

Hình 3.13 Sơ đồ tóm tắt quy trình loại cafein từ dịch chiết Chè 35

Hình 3.14 Cao loại cafein 35

Hình 3.15 Sắc ký đồ cao thô (a) và cao loại cafein lần 1,2,3 (b1, b2, b3) 37

Hình 4.1 Minh họa cơ chế hấp phụ cafein trên montmorillonit 39

Hình 4.2 Dịch chiết Chè tự nhiên (1), dịch chiết có MMT và acid citric (2) và dịch chiết có MMT không có acid citric (3) sau khi lắc 1 giờ 40

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chè xanh (Camellia sinensis (L.) Kuntze), thuộc họ Chè - Theaceae, là loài

cây được phát triển mạnh trên nhiều nước trên thế giới [2] Trong Chè xanh, Catechin - nhóm các hợp chất polyphenol đã được biết đến với hoạt tính chống oxy hóa nổi bật giúp giảm thiểu nguy cơ nhiều bệnh như ung thư, tiểu đường, béo phì, lão hóa Trong đó, epigallocatechin gallat (EGCG) là catechin chính trong Chè xanh với hàm lượng lớn nhất (khoảng 50% tổng lượng catechin) [16] Tuy nhiên, trong lá Chè còn chứa một lượng lớn cafein (khoảng 2 %) với các tác động tiêu cực gồm rối loạn giấc ngủ, tăng huyết áp, rối loạn tiêu hóa, sẩy thai [6] Do đó, nhu cầu sử dụng các sản phẩm chứa hàm lượng cafein thấp từ Chè xanh của người tiêu dùng hiện nay ngày càng gia tăng Đến nay đã có nhiều phương pháp loại cafein dựa trên hai hướng tiếp cận là loại bỏ cafein từ lá Chè trong quá trình xử lý nguyên liệu và loại bỏ cafein trong dịch chiết Chè Nhưng chưa có phương pháp nào thực sự hiệu quả vì hàm lượng cafein bị loại đi còn thấp hoặc ngoài cafein còn làm giảm đáng kể các chất khác như catechin trong Chè [32]

Trên thế giới hiện nay, các chất hấp phụ (như montmorillonit) đang ngày càng được phát triển và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực do khả năng hấp phụ chọn lọc, an toàn, kinh tế [25] Nhằm ứng dụng phương pháp hấp phụ vào việc tạo ra

sản phẩm cao Chè ít cafein, đề tài “Nghiên cứu loại cafein từ dịch chiết lá Chè

bằng phương pháp hấp phụ” được thực hiện với mục tiêu:

Khảo sát và lựa chọn được các thông số kỹ thuật thích hợp cho quá trình loại cafein từ dịch chiết lá Chè xanh bằng montmorillonit

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về cây Chè

3 ngăn nhưng chỉ có một hạt do các hạt khác teo đi [5]

Cây Chè được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới, tiêu biểu là Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Nhật Bản và một số nước châu Á Ở nước ta, Chè được trồng khắp nơi, nhất là những vùng đồi, núi thấp, tương đối bằng phẳng Cây thích nghi với khí hậu nhiệt đới, ưa ánh sáng, chịu hạn Chè không kén đất, nhưng chất đất, nhất là các yếu tố vi lượng có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng, hương vị của Chè Đây là nguyên nhân Chè được trồng chủ yếu ở Thái Nguyên, Tuyên Quang,

Hà Giang, Phú Thọ, Lâm Đồng, Đắc Lắc… [4], [5]

1.1.2 Tình hình sản xuất Chè tại Việt Nam

Việt Nam là một nước có sản lượng Chè lớn Năm 2018, tổng diện tích trồng Chè cả nước khoảng 134,7 nghìn hecta, sản lượng Chè búp đạt 1 triệu tấn, với rất nhiều loại Chè thương phẩm khác nhau, trong đó chủ yếu là Chè đen, còn lại là Chè xanh và các loại khác Chè cũng là một trong những mặt hàng xuất khẩu quan trọng của Việt Nam [1], [4]

1.1.3 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của Chè biến đổi phụ thuộc vào giống, tuổi Chè, điều kiện đất đai, địa hình, kỹ thuật canh tác và mùa thu hoạch [2] Trong búp Chè có polyphenol (30 - 36%), cafein (3 - 5%), protein, carbohydrat, theanin, acid amin, acid hữa cơ, chlorophyll, enzym, chất khoáng,… Trong đó, polyphenol (chủ yếu

là các catechin) và cafein là những thành phần quan trọng quyết định hương vị của sản phẩm [1]

1.1.3.1 Catechin

Cấu trúc:

Catechin là tên gọi chung chỉ các flavonoid mang khung flavan-3-ol thường gặp trong lá Chè và còn được gọi là catechin Chè xanh, polyphenol Chè xanh Trong cấu trúc của catechin có 2 C bất đối (C2 và C3), mỗi dẫn chất có 4 đồng phân nên có thể có 24 catechin khác nhau, tuy nhiên hiện nay mới có 12 catechin

đã được được phân lập và xác định cấu trúc từ lá Chè xanh [1]

1 Hình 1.1 Công thức cấu tạo của một số loại catechin

Về cấu tạo, các catechin có thể chia thành 2 nhóm: epicatechin (đồng phân 2R và 3R) và nonepicatechin (catechin), cũng có thể phân thành catechin tự do và

Catechin Chè xanh chủ yếu là các epicatechin, trong đó EGCG chiếm 10 50% tổng lượng catechin Nonepicatechin chỉ chiếm một lượng nhỏ Hàm lượng mỗi catechin trong các giống Chè và các bộ phận của Chè khác nhau, giảm dần theo thứ tự EGCG > EGC > ECG >EC [1]

-Tính chất:

Catechin là các hợp chất không màu, kết tinh hình kim hoặc hình lăng trụ,

có vị chát Tan trong nước và một số dung môi hữu cơ [1]

Catechin có tính khử mạnh, dễ bị oxy hóa, nhạy cảm với enzym oxy hóa trong lá Chè Catechin kém bền với môi trường acid mạnh, phân hủy nhanh trong khoảng pH từ 4 đến 8, đặc biệt kém bền trong môi trường pH > 8 Catechin bền vững nhất trong môi trường acid nhẹ (pH ~ 4) Ngoài ra, catechin còn kém bền với nhiệt độ (> 80oC) [1]

Do vậy để tăng độ ổn định của catechin trong quá trình chiết xuất, cần kiểm soát chất lượng nước, nhiệt độ chiết xuất ,bổ sung các chất chống oxy hóa, ổn định

và điều chỉnh pH (EDTA, acid ascorbic, acid citric…) [1]

Tác dụng dược lý:

Tác dụng nổi bật nhất của các catechin là khả năng chống oxy hóa Trong đó EGCG là chất có hoạt tính cao nhất, hoạt tính chống oxy hóa của EGCG cao gấp

100 lần vitamin C và cao hơn 25 lần so với vitamin E [13] Ngoài ra, catechin còn

có tác dụng chống ung thư, diệt khuẩn, kháng viêm, kháng virus, giảm cholesterol, chống lão hóa, tiểu đường [16] Do vậy, catechin Chè xanh được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghệ thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và dinh dưỡng

2 Hình 1.2 Công thức cấu tạo của cafein

Công thức phân tử: C8H10N4O2 Trọng lượng phân tử: 194,2 [3]

Tính chất:

Cafein ở dưới dạng tinh thể trắng, mịn hay bột kết tinh trắng, không mùi, vị hơi đắng, nóng chảy ở 234oC - 238°C Khi đun nóng ở 100oC cafein sẽ mất nước

và thăng hoa ở khoảng 200oC [3]

Cafein hơi tan trong nước, dễ tan trong nước sôi, cloroform, khó tan trong ethanol và ether, tan trong các dung dịch acid và trong các dung dịch đậm đặc của benzoat hay salicylat kiềm Dung dịch cafein trong nước có phản ứng trung tính với giấy quỳ [3]

Cafein là một chất có hoạt tính base yếu, chỉ tạo muối với các acid mạnh và các muối này không bền, dễ bị phân ly Trong môi trường kiềm, cafein dễ bị phân hủy thành chất có độc tính là cafeidin [3]

Tác dụng dược lý:

Cafein được biết đến là hoạt chất có tác dụng kích thích thần kinh trung ương,

do vậy khi cơ thể tiêu thụ hàm lượng thấp, cafein mang lại nhiều tác dụng có lợi như làm tăng sự tỉnh táo và giảm mệt mỏi [3], [33] Tuy nhiên, nếu tiêu thụ cafein thường xuyên dù ở hàm lượng thấp cũng sẽ gây ra các tác dụng không mong muốn như tăng cảm giác hồi hộp, lo âu, mất ngủ, mệt mỏi, kích ứng đường tiêu hóa, tăng huyết áp, nhịp tim nhanh, đẻ non và sẩy thai [6], [11]

Giới hạn về liều:

EFSA tuyên bố rằng tiêu thụ 5 mg/kg trọng lượng cơ thể có thể tạo ra những thay đổi hành vi nhất thời như tăng hưng phấn, khó chịu, hồi hộp hoặc lo lắng ở trẻ em Bộ Y tế Canada đã có khuyến nghị hạn chế lượng cafein của trẻ em (45mg

đối với trẻ em từ 4 - 6 tuổi; 62,5 mg: 7 - 9 tuổi; và 85 mg: 10 - 12 tuổi), đối với thanh thiếu niên (> 13 tuổi) không quá 2,5 mg/kg trọng lượng cơ thể [8]

Phụ nữ có thai cũng là một đối tượng nhạy cảm với cafein, có một số khuyến nghị của các cơ quan quản lý về hạn chế lượng cafein trong thai kỳ từ 200 đến

300 mg/ngày Khuyến cáo giới hạn lượng cafein tiêu thụ cũng được đưa ra cho những đối tượng có tình trạng sức khỏe đặc biệt như tăng huyết áp, tiểu đường type II hoặc rối loạn nhịp tim [8]

Việc tranh luận về rủi ro tiền ẩn của cafein ngày càng tăng trong cộng đồng khoa học [8] Mặc dù có một số tác dụng dược lý nhất định, nhưng sử dụng thường xuyên và quá mức cafein gây ra nhiều tác dụng bất lợi như trên Cùng với sự phát triển của đời sống xã hội, hiện nay nhu cầu về các loại sản phẩm chứa hàm lượng cafein thấp từ Chè (lá Chè loại cafein, cao Chè loại cafein) là rất lớn Do vậy, việc sản xuất ra sản phẩm cao khô Chè có hàm lượng cafein thấp đã thu hút được nhiều

sự quan tâm của các nhà khoa học

1.2 Một số nghiên cứu về loại cafein từ Chè xanh

Các nghiên cứu về loại cafein trên Chè xanh chủ yếu dựa trên hai hướng tiếp cận: một là loại bỏ cafein từ lá Chè trong quá trình xử lý nguyên vật liệu và hai là loại bỏ cafein trong dịch chiết Chè [32] Sau đây là các phương pháp phổ biến nhất được sử dụng để loại cafein

1.2.1 Loại cafein từ lá Chè

1.2.1.1 Loại cafein bằng dung môi hữu cơ

Phương pháp này dựa trên khả năng hòa tan chọn lọc của các dung môi hữu

cơ đối với cafein so với catechin để chiết loại bỏ cafein Độ tan của cafein trong dung môi hữu cơ gấp khoảng 10 lần so với trong nước ở nhiệt độ phòng [30] Một

số dung môi được sử dụng trong khoảng những năm 1970 là cloroform, methylen chlorid, dichloromethane, ethyl acetat [35] Ưu điểm của phương pháp này là chi phí vận hành tương đối thấp Tuy nhiên, một số thành phần khác có lợi cho sức khỏe đặc biệt là EGCG cũng bị loại bỏ cùng với cafein [7], kèm theo việc sử dụng một lượng lớn các dung môi hữu cơ độc hại và tồn dư dung môi trong sản phẩm

có thể gây nên các vấn đề liên quan đến môi trường và sức khỏe người tiêu dùng

[21]

Gần đây, một dung môi hữu cơ khác thân thiện hơn với môi trường đã được nghiên cứu khả năng loại bỏ cafein là ethyl lactat cho thấy tính chọn lọc với cafein khá cao Hơn nữa, ethyl lactate đã được phê duyệt bởi Cục Quản lý Thực phẩm

và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) là dược phẩm và phụ gia thực phẩm [34] Tuy nhiên, đây là dung môi phân hủy sinh học nên đắt tiền và chưa được ứng dụng nhiều

1.2.1.2 Loại cafein bằng nước nóng

Phương pháp dựa vào tính tan tốt của cafein trong nước nóng để chiết loại

bỏ cafein trong lá Chè xanh Nước là một dung môi an toàn, thân thiện với môi trường, tương đối rẻ tiền và dễ tiếp cận hơn so với các dung môi hữu cơ Chè sau khi khử cafein bằng nước cũng giảm thiểu bị mất đi hương vị so với khử cafein bằng dung môi hữu cơ [35]

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất loại cafein là nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu để loại cafein trong lá Chè tươi là nhiệt độ 100°C, trong 3 phút và tỷ lệ lá Chè với nước là 1:20 (kl/tt) Tuy nhiên phương pháp này chỉ áp dụng với mẫu lá Chè tươi, vì một phần lớn catechin cũng bị mất đi khi thử nghiệm trên các mẫu lá Chè khô Quá trình sấy khô và rây có thể phá hủy các tế bào lá dẫn đến một số thành phần hóa học trong

lá Chè bao gồm catechin và cafein được ép ra trên bề mặt của lá Trong trường hợp này, catechin và cafein dễ dàng hòa tan trong nước khi lá Chè khô được xử

lý nước nóng [19]

1.2.1.3 Loại cafein bằng vi sinh vật và enzym

Cơ chế của phương pháp này là vi sinh vật dùng cafein làm nguồn carbon và nitơ cho quá trình sinh trường và phát triển, từ đó giúp giảm hàm lượng cafein

trong lá Chè Các chủng cho tác dụng tốt là Bacillus sp Mặc dù có ưu điểm là

thân thiện môi trường, không tồn dư hóa chất, không gây độc hại nhưng phương pháp này rất khó để nâng cấp quy mô và đòi hỏi kiểm soát nghiêm ngặt các điều

kiện như chủng vi sinh vật, hàm lượng cafein ban đầu, nhiệt độ tiến hành, thời gian ủ [12], [28]

1.2.1.4 Loại cafein bằng công nghệ biến đổi gen

Con đường sinh tổng hợp cafein trong Chè được đề xuất liên quan đến 3 enzym N-methyltransferase gồm xanthosin methyltransferase, 7-N methylxanthin methyltransferase và 3, 7-dimethylxanthin methyltransferase Hai bước cuối trong quá trình này được xúc tác bởi enzym có tên gọi cafein synthase Do đó, một phương pháp loại cafein được để xuất là tiến hành bất hoạt mRNA sau quá trình dịch mã của cafein synthase mRNA Các giống Chè biến đổi gen cho thấy mức

độ giảm biểu hiện gen cafein synthase và làm giảm 44 - 61% lượng cafein và 46

- 67% lượng theobromin so với nhóm chứng [22] Tuy nhiên, đây là công nghệ mới cần được tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm, kiểm chứng về mức độ hiệu quả và các ảnh hưởng của thực vật biến đổi gen đến sức khỏe con người

1.2.1.5 Loại cafein bằng dung môi siêu tới hạn

Sử dụng dung môi siêu tới hạn là phương pháp hiện đại để loại cafein từ lá Chè xanh Quá trình được tiến hành như sau: lá Chè được nghiền thành các tiểu phân có kích thước nhỏ (< 1 mm), sau đó trộn với đồng dung môi (ví dụ ethanol 95%) để tăng hiệu suất chiết cafein và nạp vào bình chiết CO2 lỏng được bơm theo áp suất định trước, qua hệ thống gia nhiệt và chảy vào bình chiết Cafein hòa tan trong CO2 siêu tới hạn và được chảy qua bình tách, tại đây, cafein được tách khỏi khí CO2 bằng cách giảm áp suất Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất loại cafein như kích thước nguyên liệu, hàm lượng cafein trong nguyên liệu ban đầu, loại và lượng đồng dung môi sử dụng, áp suất, nhiệt độ và tốc độ dòng CO2 [26]

Ưu điểm của phương pháp này là không tồn dư dung môi do CO2 dễ dàng được loại bỏ, ít làm phân hủy các catechin và giữ lại được mùi vị đặc trưng của lá Chè [14] Tuy nhiên phương pháp xử lý này phức tạp và tốn kém hơn so với dung môi lỏng nên chưa được áp dụng nhiều trong thực tế

1.2.2 Loại cafein từ dịch chiết lá Chè

1.2.2.1 Loại cafein bằng kỹ thuật chiết phân bố lỏng lỏng

Phương pháp này sử dụng độ tan và sự phân bố chọn lọc của các hợp chất catechin và cafein trong các dung môi Dịch chiết nước từ lá Chè được chiết phân

bố với dung môi hữu cơ (ethyl acetat), sau đó pha ethyl acetat tiếp tục được chiết phân bố với dung dịch acid citric Trong đó catechin sẽ thu được ở pha ethyl acetat, cafein bị giữ lại ở pha dung dịch acid citric với 78,8% lượng cafein được loại bỏ [9], [29] Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là sử dụng lượng lớn các dung môi hữu cơ độc hại, quy trình gồm nhiều bước, khó nâng quy mô, hiệu suất thu hồi và hàm lượng catechin thu được không cao

1.2.2.2 Loại cafein bằng các chất hấp phụ chọn lọc

Đây là phương pháp được nghiên cứu nhiều nhất trong những năm gần đây nhằm loại bỏ chọn lọc cafein khỏi dịch chiết lá Chè Đã có nhiều nhóm chất hấp phụ từ tự nhiên đến tổng hợp đã được nghiên cứu như than hoạt [37], cyclodextrin [10], nhựa hấp phụ macroporous [31], vật liệu trao đổi ion [32] Ưu điểm lớn nhất của nhóm phương pháp này là việc không sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại Một số chất hấp phụ có dung lượng hấp phụ cao, chọn lọc với cafein, có thể tái sử dụng tốt và dễ dàng nâng quy mô

Tuy nhiên cafein có các tính chất lý hóa kích thước phân tử và độ tan tương

tự như các catechin trong lá Chè, do đó việc loại bỏ triệt để thành phần này rất khó khăn Trong nhiều trường hợp cần kết hợp các phương pháp khác nhau như khử cafein một phần từ nguyên liệu ban đầu và kỹ thuật hấp phụ [37], chiết phân

bố lỏng lỏng và kỹ thuật hấp phụ [20] Các kỹ thuật này có thể tiến hành lần lượt hoặc kết hợp trong cùng một bước tinh chế với trung tâm là phương pháp hấp phụ trên chất mang

1.3 Một số chất hấp phụ sử dụng trong nghiên cứu

1.3.1 Montmorillonit

Montmorillonit (MMT) là một khoáng sét đa chức năng, thành phần chính của bentonit, thuộc họ smectit, được hình thành do sự phong hóa tro núi lửa [23] MMT với các tính chất độc đáo như trương nở và hấp phụ đã được ứng dụng rộng rãi trong y tế và nhiều lĩnh vực trong công nghiệp [27]

1.3.1.1 Cấu trúc

Tinh thể MMT có cấu trúc lớp 2:1, mỗi một lớp gồm 3 tầng xếp chồng lên nhau với 2 tấm silica tứ diện (tetrahedral silicate - Si4O6(OH)4) kẹp 1 tấm nhôm oxyd bát diện (octahedral alumina - Al(OH)6), bề dày và bề rộng của mỗi lớp tương ứng khoảng 1 và 100 -1000 nm [25]

Công thức hóa học được đề xuất là Si8Al3.5Mg0.5O20(OH)4 Nếu thay thế đồng hình phân tử trung tâm Si4+ bởi Al3+ và phân tử trung tâm Al3+ bởi Mg2+ hoặc Fe2+

sẽ tạo ra những lớp có bề mặt tích điện âm Bề mặt mang điện tích được cân bằng qua việc hấp phụ các cation như Li+, Na+, Ca2+ Những cation này có thể dễ dàng thay thế bằng khác cation hữu cơ hoặc vô cơ khác, liên quan đến tính chất ưa nước, trương nở, hấp phụ của montmorillonit MMT cũng mang các nhóm hydroxyl trên bề mặt giúp tăng cường khả năng hấp phụ các phân tử mục tiêu bằng các liên kết yếu như liên kết hydro [27]

3 Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của montmorillonit

1.3.1.2 Tính chất

Tính ưa nước và trương nở

Một trong những tính chất vật lý độc đáo của MMT là tính ưa nước và trương

+

hóa của nước có thể dễ dàng xâm nhập vào lớp xen kẽ Trạng thái vật lý của MMT

có thể thay đổi từ chất rắn khan thành dạng ngậm nước, bán rắn, gel và huyền phù tùy thuộc vào sự gia tăng hàm lượng nước Trong đó sự thay đổi trạng thái vật lý

từ chất rắn khan sang dạng gel được gọi là sự trương nở Sự trương nở này phụ thuộc vào khoáng vật học, kích thước, điện tích âm và năng lượng hydrat hóa của các cation trao đổi Vd: Natri montmorillonit có khả năng tăng thể tích lên tới 20 lần sau khi hấp phụ nước [25], [27]

Tính hấp phụ

Một đặc tính khác của MMT là sự hấp phụ Bởi vì giữa các lớp 2:1 của MMT

có chứa cation trao đổi, một số phân tử xen kẽ vào giữa các lớp bằng cách trao đổi ion Các phân tử với độ phân cự khác nhau chẳng hạn như alcol mạch ngắn, glycerol, carbohydrat, ethylen glycol, aliphatic amin, aromatic amin và các chất màu hữu cơ, được hấp phụ mạnh trên bề mặt của các lớp của MMT Mặt khác, các phân tử không phân cực, như nitơ, argon và ethan không kết hợp được với MMT Cụ thể, các phân tử này có thể được hấp phụ trên bề mặt nhưng không thể xâm nhập vào các lớp kẽ [27]

4 Hình 1.4 Các vị trí tương tác của montmorillonit

Các cơ chế hấp phụ MMT với các phân tử được đề xuất như tạo liên kết hydro, tương tác lưỡng cực - lưỡng cực, tương tác ion - lưỡng cực, liên kết cộng

hóa trị, tạo cặp ion, tương tác ion - pi và trao đổi ion với các vị trí liên kết như bề mặt, cạnh, khoảng cách giữa các lớp [15]

1.3.1.3 Ứng dụng của montmorillonit

MMT là một khoáng sét đa chức năng và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Trong đó, tùy nhu cầu sử dụng mà có các yêu cầu khác nhau về cách khai thác, hoạt hóa, biến tính và chất lượng MMT

Trong y học

MMT là dạng khoáng sét đã được tinh chế để có thể sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm MMT hấp phụ tốt các độc tố như các ion kim loại nặng (As, Cd, Pb, Mn, Ni và Cr), các anion độc, aflatoxin, các hợp chất nitro thơm gây ung thư, virus (ví dụ: rotavirus, coronavirus), làm lành vết thương (các vết loét ở đường tiêu hóa, hội chứng viêm da tiếp xúc) Từ đó MMT có thể dùng như một phương pháp chữa bệnh, giải độc Một trong số các sản phẩm thương mại chứa khoáng sét cấu trúc MMT đã được phát triển và có sẵn trên thị trường dùng trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp tính là SMECTA® [27]

Trong công nghiệp dược phẩm

Ứng dụng nổi bật nhất của MMT là làm tá dược và chất mang trong các hệ đưa thuốc Phức hợp MMT - dược chất có thể được tạo thành bằng kỹ thuật hấp phụ từ dung dịch, đun chảy hoặc nghiền [27] Trong một báo cáo, tỷ lệ sống sót

của Lactobacillus casei trong đường tiêu hóa tăng lên khi được cố định vào natri

montmorillonit [18]

Ngoài ra MMT còn có thể kết hợp với nhiều polyme tự nhiên và tổng hợp tạo thành các vật liệu composit với các đặc tính mới làm thay đổi tính chất và động học giải phóng, hấp thu của nhiều dược chất [27]

Trong các ngành công nghiệp khác

MMT được sử dụng để hấp phụ các chất gây ô nhiễm (các cation kim loại nặng, các chất màu,…) trong môi trường nước, không khí, dung môi hữu cơ MMT còn được sử dụng làm tác nhân hấp phụ protein, làm trong rượu, nước ép hoa quả và dầu ăn Ngoài ra nó còn là tác nhân hấp phụ các độc tố, bổ sung vi

lượng và ứng dụng trong sản xuất thức ăn cho động vật MMT cũng được sử dụng trong công nghiệp khoan dầu, nông nghiệp, xây dựng [23], [27]

1.3.2 Nhựa macroporous

Nhựa macroporous là các polyme liên kết chéo, không ion hóa, đặc trưng bởi

số lượng lớn các lỗ xốp (đường kính > 50 Å) và có khả năng hấp phụ các phân tử nhỏ Nhựa được sản xuất bằng cách polyme hóa các monome (thường sử dụng styren divinylbenzen) với sự có mặt của các chất độn (porogens) không polyme

hóa như toluen, n-heptan, isooctan và isobutanol Các chất độn có thể trộn lẫn với

hỗn hợp monome, không hoà tan polyme, có khả năng bay hơi ở những điều kiện nhất định sau khi kết thúc quá trình polyme hoá để lại những lỗ hổng trong cấu trúc polyme

Khả năng hấp phụ chọn lọc của nhựa macroporous phụ thuộc vào nhiều yếu

tố như: bản chất polyme, đường kính lỗ xốp, diện tích bề mặt riêng, độ phân cực, các nhóm chức đặc trưng của nhựa; khối lượng phân tử, kích thước và độ phân cực của chất tan và các điều kiện tiến hành (nồng độ, pH dịch chiết, nhiệt độ hấp phụ, dung môi,…) Xét theo độ phân cực, nhựa macroporous được chia làm 4 loại: không phân cực (D101, H103,…); phân cực yếu (AB-8, HPD722,…); phân cực trung bình (ADS-17, XAD-8,…); phân cực mạnh (NKA-2, DA201,…) [17], [24]

Nhựa macroporous được phát triển và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, trong lĩnh vực chiết xuất nhựa macroporous được ứng dụng để tinh chế, phân lập các hoạt chất tinh khiết, làm giàu hoạt chất trong các cao dược liệu Trong đó

có nhiều ưu điểm như: cấu trúc đa dạng, khả năng lặp lại và ổn định tốt, phần lớn đều sử dụng các dung môi “xanh” như nước và ethanol, có thể tái sử dụng, phù hợp với nhiều nhóm hoạt chất, chi phí vận hành rẻ, phù hợp khi triển khai ở quy

mô lớn [17]

Cho đến nay, phương pháp hấp phụ đang ngày càng trở nên phổ biến đặc biệt trong lĩnh vực dược phẩm cùng với sự khám phá ngày càng đa dạng các chất hấp phụ trong tự nhiên và tổng hợp nhân tạo Việt Nam hiện nay là quốc gia có ưu thế

về sản xuất và phát triển Chè, tuy nhiên các sản phẩm từ Chè vẫn dừng lại ở mức

yêu cầu cao Chè cần được kiểm soát, chuẩn hóa về nhiều yếu tố như nguyên liệu đầu vào, quy trình sản xuất, các chỉ tiêu chất lượng,… Với mong muốn đa dạng hóa và nâng cao chất lượng các sản phẩm từ Chè, tạo tiền đề ứng dụng các sản phẩm đó trong dược phẩm, nghiên cứu này bước đầu xây dựng quy trình loại cafein từ dịch chiết lá Chè xanh quy mô phòng thí nghiệm bằng công nghệ đơn giản và mang tính ứng dụng cao, sản phẩm được đánh giá hàm lượng các hoạt chất bằng phương pháp phân tích hiện đại như HPLC

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Lá Chè xanh tươi được thu mua tại Đại Từ, Thái Nguyên tháng năm 2018 và được giám định tên khoa học tại bộ môn Thực Vật, trường Đại học Dược Hà Nội Mẫu lá Chè được rửa sạch bằng nước, sấy khô trong tủ sấy tĩnh ở 50oC đến hàm ẩm dưới 5% (khoảng 2 ngày) xay nhỏ (1 - 2 mm) và bảo quản trong túi PE kín ở điều kiện phòng thí nghiệm

- Montmorillonit: Các mẫu MMT được cung cấp bởi Clariant Company (Ấn Độ)

- Than hoạt (kích thước 0,5 - 1 mm) từ Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd (Trung Quốc)

Nhựa macroporous được xử lý bằng cách ngâm rửa với ethanol 96% nhiều lần, sau đó rửa sạch lại bằng nước cất MMT và than hoạt được sử dụng trực tiếp

không qua tinh chế thêm

5

7 Bảng 2.1 Các đặc tính lý hóa của nhựa macroporous

Kích thước hạt (mm)

Độ phân cực

phân cực

Diện tích bề mặt (m2/g)

Tỷ lệ các thành phần chính SiO2 Fe2O3 Al2O3 MgO CaO

Hóa chất

8 Bảng 2.3 Danh mục hóa chất sử dụng

2.1.3 Thiết bị thí nghiệm

- Bình chiết dược liệu bằng inox dung tích 10 Lít (Việt Nam)

- Máy cô quay chân không IKA® RV8 (Đức)

- Máy phun sấy Buchi B290 (Thụy Sỹ)

- Máy đông khô Christ®Alpha 1-LD (Đức)

- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản)

- Máy ly tâm lạnh HERMLE Larbotechnik GmbH-Z326k (Đức)

- Máy lắc điều nhiệt Shaker Incubator, LSI-100B (Nhật Bản)

- Máy khuấy cơ WiseStir HS-120A (Trung Quốc)

- Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S d = 0,1 mg (Thụy Sỹ)

- Các dụng cụ kiểm nghiệm khác

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu thẩm định phương pháp định lượng cafein và EGCG bằng HPLC

- Nghiên cứu sàng lọc chất hấp phụ cho quá trình loại cafein từ dịch chiết Chè

- Khảo sát và lựa chọn được các thông số cho quá trình loại cafein bằng kỹ thuật hấp phụ trên MMT

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chiết xuất và điều chế cao thô

Cân 1,0 kg lá Chè khô, chiết 3 lần × 10,0 L dung môi ethanol 50%, 25°C trong 12 giờ Gộp các dịch chiết và cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm (500 mbar, 70°C) đến khi còn 1/3 thể tích và phun sấy tạo cao khô với các điều kiện:

phun dịch 100%, áp suất khí nóng 400 - 600 mbar, áp suất khí âm -40 mbar Dịch chiết Chè xanh ở các nồng độ khác nhau được tạo thành bằng cách hòa tan cao khô trong thể tích vừa đủ nước cất (nếu không chú thích gì thêm)

2.3.2 Quá trình hấp phụ

2.3.2.1 Thiết kế thí nghiệm hấp phụ

Trong các bình nón giống nhau dung tích 100 ml, cho một lượng chất hấp phụ và 20 ml dịch chiết (hoặc dung dịch cafein) có nồng độ thích hợp, đậy kín và lắc trên máy lắc ngang ở 150 vòng/phút trong điều kiện nhiệt độ và thời gian khảo sát Xác định nồng độ EGCG và/hoặc cafein trong dịch sau hấp phụ bằng HPLC Dung lượng hấp phụ cân bằng (Qe, mg/g) và hệ số chọn lọc của các chất hấp phụ (KAB) đối với cafein và EGCG được tính theo các công thức:

Qe =Co × Vo − 𝐶𝑒 × 𝑉1

CB/CATrong đó: Co, Ce lần lượt là nồng độ cafein hoặc EGCG trong dịch chiết trước hấp phụ, sau hấp phụ (mg/ml); Vo, V1 lần lượt là thể tích dịch chiết trước hấp phụ, sau hấp phụ (ml); W là khối lượng chất hấp phụ (g); A và B tương ứng là EGCG

và cafein; CA, CB tương ứng là nồng độ (mg/ml) của A và B trong dịch chiết sau hấp phụ; RA, RB lần lượt là lượng chất A và B được hấp phụ trong 1 gam chất hấp phụ (mg/g) tại thời điểm cân bằng

2.3.2.2 Động học hấp phụ

Động học hấp phụ cafein trên các chất hấp phụ được nghiên cứu dựa vào các

mô hình động học hấp phụ cơ bản sau:

- Mô hình giả bậc 1 (pseudo-first-order): ln(Qe-Qt) = lnQe - k1t

- Mô hình giả bậc 2 (pseudo-second-order): t/Qt = 1/k2Qe2 + t/Qe

Trong đó: k1 (h-1 hoặc phút-1), k2 (mg/g.h-1 hoặc mg/g.phút-1) là hằng số tốc

độ của mô hình giả bậc 1 và giả bậc 2 tương ứng Qe và Qt là dung lượng hấp phụ (mg/g) tại thời điểm cân bằng và tại thời điểm t tương ứng

2.3.2.3 Đường hấp phụ đẳng nhiệt

Mô hình đẳng nhiệt hấp phụ Langmuir và Freudlich thường được sử dụng để

hình Langmuir giả thiết rằng các chất tan được hấp phụ theo từng lớp đơn phân

tử, năng lượng hấp phụ phân bố đồng nhất và không có sự tương tác giữa các phân

tử chất đã được hấp phụ Trong khi đó, mô hình Freundlich có thể mô tả quá trình hấp phụ từng lớp đơn phân tử như mô hình Langmuir hoặc đa phân tử với giả thiết đưa ra là sự phân bố không đồng nhất của các vị trí hấp phụ ở những mức năng lượng hấp phụ khác nhau Bản chất sự hấp phụ cafein trên các chất hấp phụ được nghiên cứu dựa vào các phương trình sau:

- Mô hình Langmuir: Ce/Qe = Ce/Qm + 1/(QmKL)

- Mô hình Freundlich: lnQe = lnKF + 1/n × lnCe

Trong đó: Ce và Qe tương tự như các công thức ở mục 2.3.2.1; KL (ml/mg)

và KF tương ứng là hằng số Langmuir và Freundlich; 1/n là hằng số kinh nghiệm;

Qm là dung lượng hấp phụ cực đại (mg/g chất hấp phụ)

2.3.3 Phương pháp định lượng cafein và EGCG

Mẫu chuẩn: Dung dịch chuẩn hỗn hợp hoặc chuẩn đơn trong nước có nồng

độ nằm trong khoảng từ 8,0 đến 200,0 μg/ml đối với cafein và từ 12,0 đến 300,0 μg/ml đối với EGCG

Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 200 mg bột lá Chè xanh cho vào bình nón dung tích 100 ml, chiết 2 lần × 40 ml ethanol 50% ở nhiệt độ 50oC, mỗi lần 30 phút, dịch chiết được để nguội về nhiệt độ phòng và gộp vào bình định mức 100

ml, bổ sung nước cất đến vạch, lắc đều, pha loãng đến nồng độ thích hợp và lọc qua màng lọc 0,45 µm

2.3.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng

Độ đặc hiệu: Tiêm lần lượt dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn đơn, mẫu chuẩn

hỗn hợp, mẫu thử vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ và so sánh các píc thu được

- Độ phân giải giữa 2 píc cafein và EGCG có Rs ≥ 1,5

Độ thích hợp hệ thống: Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ

chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính Ghi lại thời gian lưu và diện tích píc sắc ký

Yêu cầu: RSD của thời gian lưu và diện tích píc giữa các lần tiêm mẫu ≤ 2%

Khoảng tuyến tính: Tiến hành chạy sắc ký các dung dịch chuẩn có nồng độ

khác nhau, ghi lại sắc ký đồ và xác định diện tích píc Lập phương trình hồi quy tuyến tính biểu thị mối tương quan giữa diện tích và nồng độ chất phân tích bằng phương pháp bình phương tối thiểu

Yêu cầu: hệ số hồi quy tuyến tính R phải đạt yêu cầu: 0,995 ≤ R ≤ 1 hoặc 0,99 ≤ R2 ≤ 1

Độ lặp lại: Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần một mẫu thử, ghi lại thời gian lưu

và diện tích píc sắc ký

Yêu cầu: RSD của thời gian lưu và diện tích píc giữa các lần tiêm mẫu ≤ 2%

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng: Pha loãng dần một dung dịch

chuẩn, ghi lại sắc ký đồ và xác định tỷ lệ tín hiệu píc/nhiễu đường nền (S/N), giới hạn phát hiện LOD được xác định tại nồng độ có S/N ~ 3 và giới hạn định lượng LOQ được xác định tại nồng độ có S/N ~ 10