Phân lập carpain và khảo sát hàm lượng carpain trong một số mẫu lá đu đủ

Trong đó, một số nhóm chất đã xác định được cấu trúc cụ thể của ít nhất một hợp chất như sau: - Các vitamin trong lá cây Đu đủ gồm vitamin B9 [42], vitamin B1 thiamin, vitamin B2 ribofla

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về cây Đu đủ (Carica papaya L.) 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Nguồn gốc và phân bố 2

1.1.4 Thành phần hóa học 3

1.1.5 Hoạt tính sinh học 4

1.2 Hợp chất carpain 9

1.2.1 Công thức cấu tạo và một số tính chất vật lý 9

1.2.2 Tác dụng sinh học 9

1.2.3 Một số nghiên cứu về phân lập carpain 10

1.2.4 Một số phương pháp định lượng carpain trong lá Đu đủ 11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 13

2.1.2 Các trang thiết bị nghiên cứu 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Chiết xuất, phân lập và tinh chế carpain từ lá Đu đủ 15

2.3.2 Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng carpain tinh chế được 17

2.3.3 Xây dựng và thẩm định phương pháp HPTLC để bán định lượng carpain trong các mẫu lá Đu đủ 17

2.3.4 Áp dụng phương pháp HPTLC để khảo sát hàm lượng carpain trong một số mẫu lá Đu đủ thu tại miền bắc Việt Nam 18

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Phân lập carpain từ lá Đu đủ 20

3.1.1 Chiết xuất, phân lập và tinh chế carpain từ lá Đu đủ 20 3.1.2 Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng carpain tinh chế được 21 3.2 Khảo sát hàm lượng carpain trong một số mẫu lá Đu đủ thu tại miền bắc Việt Nam

23

3.2.1 Khảo sát và xây dựng phương pháp 23 3.2.2 Thẩm định phương pháp HPTLC đã xây dựng 24 3.2.3 Áp dụng phương pháp HPTLC đã xây dựng và thẩm định để khảo sát hàm lượng carpain trong một số mẫu lá Đu đủ thu hái tại miền bắc Việt Nam 27

3.3 Bàn luận 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự chỉ bảo tận

tình, sự quan tâm từ các thầy cô, gia đình và bạn bè

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn

Quỳnh Chi, người thầy luôn dành rất nhiều thời gian, tâm huyết để hướng dẫn tôi, luôn

hết lòng lắng nghe, quan tâm, động viên tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình

thực hiện khóa luận

Tôi xin bày tỏ lòng cảm tạ và biết ơn sâu sắc tới ThS Phạm Tuấn Anh, người

thầy luôn nghiêm khắc rèn giũa để tôi có lối tư duy và phương pháp làm việc khoa học,

người luôn gợi mở những hướng đi trong nghiên cứu, luôn đưa ra những lời khuyên hữu

ích trong học tập và cuộc sống

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới toàn thể thầy cô, anh chị kỹ thuật viên

tại Bộ môn Dược liệu nói riêng và Trường Đại học Dược Hà Nội nói chung, những

người luôn sẵn sàng chia sẻ những kinh nghiệm, cho tôi những lời khuyên, sự giúp đỡ

và sự động viên kịp thời trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các anh chị, bạn bè và các em

đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt khoảng thời gian học tập tại trường, luôn chia sẻ

những khó khăn trong cả học tập và cuộc sống

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và sự yêu thương tới gia đình tôi, những

người luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc nhất, luôn tiếp thêm động lực để tôi cố gắng

hơn trong quá trình học tập, nghiên cứu

Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Cao Thị Thu Hằng

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

13C-NMR: Carbon-13 nuclear magnetic resonance

1H-NMR: Proton nuclear magnetic resonance

AcOH: Acid acetic

AOAC: Association of Official Analytical Chemists

COSY: Correlation Spectroscopy

DEPT: Distotionless Enhancement by Polarization Transfer EtOAc: Ethyl acetat

HMBC: Heteronuclear Multiple-Bond Correlation

HPTLC: High Performance Thin Layer Chromatography

HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation

IR: Infrared Radiation

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Khảo sát hệ dung môi sắc ký 23

Bảng 3.2 Kết quả thẩm định khoảng tuyến tính carpain 25

Bảng 3.3 Kết quả thẩm định độ thích hợp hệ thống 26

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hàm lượng carpain trong các mẫu lá Đu đủ 28

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của một số alcaloid được phân lập từ lá Đu đủ 4

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của carpain 9

Hình 2.1 Cây Đu đủ (Carica papaya L.) 13

Hình 2.2 Sơ đồ của quá trình chiết xuất, phân lập, tinh chế carpain 16

Hình 3.1 Hình ảnh sắc ký đồ chất phân lập được 20

Hình 3.2 So sánh với chất đối chiếu carpain 21

Hình 3.3 Hình ảnh tinh thể thu được 21

Hình 3.4 Tinh thể quan sát dưới kính hiển vi 21

Hình 3.5 Công thức cấu tạo của carpain 22

Hình 3.6 Thẩm định độ đặc hiệu 24

Hình 3.7 Đồ thị mô tả tương quan giữa diện tích pic và lượng carpain của vết 25

Hình 3.8 Thẩm định độ thích hợp của hệ thống 26

Hình 3.9 Sắc ký lớp mỏng dãy dung dịch đối chiếu và các mẫu lá Đu đủ 27

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Đu đủ là cây trồng phổ biến ở Việt Nam và nhiều nước nhiệt đới khác với mục đích chính là lấy quả Các bộ phận khác của cây thường chỉ được xem là phụ phẩm và không nhận được nhiều sự quan tâm Trong khi đó, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành

và cho thấy dịch chiết lá Đu đủ có tác dụng tốt với nhiều bệnh nguy hiểm như ung thư, đái tháo đường, tăng huyết áp Dược liệu cũng được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để điều trị sốt xuất huyết Một thử nghiệm lâm sàng tại Ấn Độ năm 2016 cũng đã chứng minh được tác dụng này [35] Đồng thời, hầu hết các nghiên cứu đều không phát hiện thấy độc tính của dịch chiết lá Đu đủ

Carpain, alcaloid chính trong lá Đu đủ, được cho là đóng vai trò quan trọng trong

đa số tác dụng của bộ phận này Đồng thời carpain cũng được xem là chất đặc trưng có trong lá Đu đủ Do đó, lựa chọn carpain là một marker để đánh giá chất lượng, xây dựng tiêu chuẩn cho lá Đu đủ và các chế phẩm liên quan là cần thiết Tuy nhiên, trên thị trường hiện nay chưa có công ty nào cung cấp chất chuẩn carpain và cũng chưa có nghiên cứu nào khảo sát hàm lượng carpain trong các mẫu lá Đu đủ thu hái tại nhiều vùng ở Việt Nam

Vì vậy, đề tài “Phân lập carpain và khảo sát hàm lượng carpain trong một số

mẫu lá Đu đủ” được tiến hành với hai mục tiêu:

1 Phân lập carpain từ lá Đu đủ làm chất đối chiếu

2 Khảo sát hàm lượng carpain trong một số mẫu lá Đu đủ thu tại miền bắc Việt Nam bằng HPTLC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây Đu đủ (Carica papaya L.)

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo Hệ thống phân loại của Takhtajan [64], vị trí phân loại của cây Đu đủ Carica

papaya L được tóm tắt như sau:

Hoa màu vàng lục nhạt, mọc ở kẽ lá; hoa đực và hoa cái cùng gốc hoặc khác gốc; cụm hoa đực dài, phân nhánh, đài hợp có 5 răng ngắn, tràng 5 cánh hàn liền hình phễu, nhị xếp thành 2 vòng trên ống tràng, nhụy tiêu giảm; cụm hoa cái có 2-3 hoa, đài và tràng gồm những bộ phận hơi dính nhau ở gốc, không có nhị lép, bầu 1 ô, nhiều lá noãn

Quả mọng to, hình trứng ngược hoặc thuôn dài, khi chín màu vàng đỏ, thịt quả dày, trong ruột quả có nhiều hạt màu đen [2], [3], [5]

1.1.3 Nguồn gốc và phân bố

Mặc dù chưa được biết chính xác, cây Đu đủ được cho là có nguồn gốc từ vùng đất thấp phía nam Mexico qua miền đông Trung Mỹ và bắc Nam Mỹ Cây này có lẽ được người Tây Ban Nha đưa vào Philippines vào khoảng năm 1550 [5], [39], [55] Rồi

từ đây, cây được đưa vào khu vực nhiệt đới của châu Á và châu Phi Ở Việt Nam, Đu

đủ là cây trồng khá lâu đời trong nhân dân và chưa xác định được cụ thể thời gian cây được nhập vào nước ta [2]

Hiện nay, Đu đủ đã trở thành cây ăn quả quan trọng ở Việt Nam cũng như nhiều nước nhiệt đới khác [3] Tổng sản lượng trên thế giới vào năm 1988 lên đến 3,68 triệu tấn [2] Các nước trồng nhiều Đu đủ là Braxin, Ấn Độ, Mexico, Zaia, Australia, Columbia, Coasta Rica, Ecuador, Hawai, Nigeria, Peru, Sri LanKa, Venezuela, Nam Phi, Đài Loan, Mozambique, Cuba, Jamaica, Bangladesh và hầu hết các nước Đông Nam Á [2], [53]

1.1.4 Thành phần hóa học

1.1.4.1 Các hợp chất vô cơ

Lá cây Đu đủ có chứa nhiều muối khoáng như Ca, K, Na, Mg, Zn, Mn, P, Fe Nhờ

đó, lá Đu đủ có tác dụng tốt trong việc cấu tạo chất làm đông máu, duy trì chức năng tim, hệ thống thần kinh hay sự co cơ [12], [24]

1.1.4.2 Các hợp chất hữu cơ

Các nhóm chất được tìm thấy trong lá cây Đu đủ bao gồm carbohydrat, acid amin, protein, acid hữu cơ, saponin, glycosid tim, iridoid, anthranoid, coumarin, tanin, steroid, vitamin, glycosid cyanogenic, flavonoid và alcaloid [12], [26], [30], [31], [33], [42], [46], [48], [60], [71] Trong đó, một số nhóm chất đã xác định được cấu trúc cụ thể của

ít nhất một hợp chất như sau:

- Các vitamin trong lá cây Đu đủ gồm vitamin B9 [42], vitamin B1 (thiamin), vitamin B2 (riboflavin), vitamin C (acid ascorbic) và vitamin E [24]

- Một coumarin đã được xác định cấu trúc là 5,7-dimethoxycoumarin [16]

- Ba glycosid cyanogenic đã được phân lập là prunasin, tetraphyllin B [37] và sambunigrin [59]

- Các acid hữu cơ đã được xác định cấu trúc bao gồm: acid protocatechuic, acid

p-coumaric, acid caffeic, acid chlorogenic [16]

- Hai flavonoid là quercetin và kaempferol được xác định có mặt trong lá cây Đu

đủ [9], [16] Ngoài ra, manghaslin, clitorin, rutin, nicotilorin cũng được xác định

là có mặt trong dịch chiết methanol lá Đu đủ [25], [34]

- Các alcaloid đã được xác định trong lá Đu đủ gồm acid carpamic (1) [1], methyl carpamat (2) [34], carpain (3) [9], [18], [21], [27], [34], [46], [63], [72], [74], cholin [2], pseudocarpain (4) [2], [27], [34], carpinin [24], dehydrocarpain I (5), dehydrocarpain II (6) [18], carpainon [8] Một số alcaloid khác (nicotin, cotinin,

myosmin) cũng xuất hiện ở mức độ vi lượng [2]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của một số alcaloid được phân lập từ lá Đu đủ

1.1.5 Hoạt tính sinh học

1.1.5.1 Theo kinh nghiệm dân gian

Tại nhiều nước trên thế giới, người dân sử dụng lá Đu đủ theo kinh nghiệm dân gian để chữa bệnh Ở Indonesia, Ấn Độ, một số quốc gia Nam Mỹ, châu Á và châu Phi,

người ta ghi nhận được việc sử dụng lá Đu đủ để dự phòng và điều trị sốt rét [10], [34], [38], [69], [70] Người dân Indonesia còn sử dụng lá Đu đủ để tăng tiết sữa cho phụ nữ mới sinh, trừ giun, kích thích tiêu hóa và những bệnh sốt khác [2] Ở những đảo Admiratly và Bougainville, nhựa lá tươi được đắp lên vết thương cho nhanh lành Dịch chiết nước nóng lá Đu đủ ở Tây Phi được dùng để tẩy giun còn ở Mozambique thì dùng

để hạ sốt [55]

Cũng theo cuốn Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam, lá Đu đủ tươi giã nát, gói vào miếng gạc, đắp vào 2 bên thái dương chữa đau đầu hoặc đắp trị mụn nhọt, tiêu sưng tấy Nước sắc đặc lá Đu đủ khô có tác dụng sát khuẩn, dùng rửa vết thương, lở loét

và tẩy được vết máu trên vải, quần áo Nhân dân còn dùng lá Đu đủ liên tục trong thời gian dài để chữa ung thư Nhựa mủ từ lá Đu đủ dùng để chữa chai chân, hột cơm, tàn nhang, hắc lào mới phát, eczema, vẩy nến [2]

1.1.5.2 Theo y học hiện đại

Nhiều nghiên cứu khoa học đã được tiến hành và cho thấy lá Đu đủ có các tác dụng dược lý như sau:

 Kháng khuẩn

Cây Đu đủ cho thấy tác dụng kháng nhiều loại vi khuẩn Cao lá Đu đủ có tác dụng

trên vi khuẩn Typhimurium mentagrophytes và Staphylococcus aureus [2] Nghiên cứu

của Chandra và cộng sự về ba loại dịch chiết của lá Đu đủ (dịch chiết nước, n-hexan và

ethanol) cho thấy: Cả ba loại dịch chiết đều ức chế các chủng vi khuẩn Staphylococcus

aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa, trong đó dịch

chiết nước có khả năng ức chế kém hơn [17] Năm 2013, Mangalanayaki và Nirosha tiến hành nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá Đu đủ với 3 dung môi khác nhau Kết quả cho thấy các dịch chiết đều có khả năng chống lại cả vi khuẩn Gram

âm và Gram dương nhưng trên Gram dương tốt hơn, hoạt tính cao nhất (đường kính

vòng vô khuẩn là 16 mm) được quan sát trên vi khuẩn Salmonella typhi, nồng độ ức chế

tối thiểu (MIC) dao động trong khoảng 50-200 mg/ml [43]

 Diệt ký sinh trùng

Nước sắc lá Đu đủ được dùng để phòng và điều trị sốt rét ở Indonesia và một số nước châu Phi, cả dịch chiết cồn và dịch chiết nước lá Đu đủ được chứng minh có tác

dụng điều trị sốt rét trên mô hình in vivo [34], [47] Tuy nhiên, tác dụng này đối kháng

với acid artesunic nên hầu như không có khả năng cho việc kết hợp hai phương pháp điều trị này [47] Năm 2014, Julanti và cộng sự công bố có mối liên quan giữa tác dụng

điều trị sốt rét và các alcaloid trong lá Đu đủ Trên mô hình in vitro, carpain được chứng minh có hoạt tính cao và chọn lọc Tuy nhiên, trên mô hình in vivo tác dụng này của

carpain lại không rõ [34]

Gần đây, một số nghiên cứu cho thấy thân và lá Đu đủ có hoạt tính trừ giun đáng

kể và có thể là một loại thuốc tiềm năng do hiệu quả về mặt chi phí và tính sẵn có Saumendu Deb Roy tiến hành nghiên cứu trên loài giun đất Ấn Độ trưởng thành

(Pheretima posthuman) Kết quả thu được là dịch chiết cồn có hiệu quả cao hơn dịch

chiết cloroform, với thuốc đối chiếu là albendazol [57]

 Tác dụng kháng ung thư

Tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau của dịch chiết lá Đu đủ đã được phát hiện như tế bào ung thư vú MCF-7 [73], tế bào ung thư tuyến tiền liệt [49], tế bào ung thư da [67]

Cao cồn của lá Đu đủ được nghiên cứu trong một số mô hình ung thư thực nghiệm

và được chứng minh có các tác dụng ức chế sự phát triển u báng gây bởi tế bào ung thư Sarcoma TG 180 ở chuột nhắt trắng [2]

Trong một số báo cáo, tuy không có thông tin đầy đủ, nhưng đã quan sát thấy việc kéo dài thời gian sống sau khi uống dịch chiết lá Đu đủ trên 5 bệnh nhân ung thư phổi,

3 bệnh nhân ung thư dạ dày, 3 bệnh nhân ung thư vú, 1 bệnh nhân ung thư tụy, 1 bệnh nhân ung thư gan và 1 bệnh nhân ung thư máu [68]

 Tác dụng trên huyết học

Nghiên cứu của Ikpeme và cộng sự đã đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết cồn lá, hạt và thịt quả cây Đu đủ trên chuột cống trắng Kết quả chỉ ra dịch chiết lá làm tăng hematocrit máu, nồng độ hemoglobin máu, tăng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu [31]

Tác dụng làm tăng tiểu cầu của lá Đu đủ cũng được ghi nhận ở nhiều nghiên cứu khác Kathiresan Sathasivam tiến hành cho chuột nhắt trắng uống hỗn dịch bột lá Đu đủ trong dầu cọ, định kỳ lấy máu xét nghiệm trong 72 giờ, thấy số lượng tiểu cầu tăng rõ

rệt so với nhóm chứng chỉ uống dầu cọ và nước muối sinh lý [36] Nước ép lá Đu đủ cũng cho thấy tác dụng làm tăng tiểu cầu mạnh hơn so với hydrocortison trên chuột thí nghiệm [65]

Ngoài ra, một số báo cáo cho thấy có sự tăng tiểu cầu ở bệnh nhân mắc sốt xuất huyết Dengue sau khi uống dịch chiết lá Đu đủ Dựa trên kết quả xét nghiệm máu về chỉ

số bạch cầu trung tính, số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu trước và sau khi điều trị cũng như cảm nhận của bệnh nhân, nghiên cứu của Nisar Ahmad và cộng sự kết luận rằng dịch chiết nước của lá Đu đủ có tiềm năng chống lại sốt xuất huyết Dengue [44] Bác sĩ Sanath Hettige cũng tiến hành nghiên cứu tác dụng của dịch chiết lá Đu đủ trên

70 bệnh nhân sốt xuất huyết Kết quả số lượng bạch cầu và tiểu cầu tăng, quá trình đông máu bình thường và chức năng gan được hồi phục [24] Một thử nghiệm khác được thực hiện bởi Subenthiran và cộng sự ở Malaysia nhằm đánh giá tác dụng của nước ép lá Đu

đủ tươi trên 228 bệnh nhân mắc sốt xuất huyết cũng cho kết quả tương tự [61]

 Tác dụng chống tăng đường huyết

Một số nghiên cứu về tác dụng chống tăng đường huyết, điều trị đái tháo đường của lá Đu đủ đã được công bố Nghiên cứu của Isela E Juárez-Rojob và cộng sự trên

mô hình gây tăng đường huyết ở chuột cống trắng chỉ ra rằng: Sau 20 ngày điều trị bằng dịch chiết lá Đu đủ, nồng độ glucose, triglycerid và transaminase trong máu của chuột đều giảm Điều này cho thấy tiềm năng trong việc sử dụng lá Đu đủ cho bệnh nhân đái tháo đường [33] Pedro và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tác dụng của dịch chiết lá

Đu đủ trên mô hình chuột bị gây đái tháo đường bằng streptozotocin Kết quả chỉ ra dịch chiết lá Đu đủ bảo tồn các đảo tụy, cải thiện khả năng tiết insulin và bảo vệ các tế bào nuôi cấy khỏi các tác động bất lợi của streptozotocin [40] Dịch chiết lá Đu đủ cũng được chứng minh làm chậm thời gian khởi phát tác dụng hạ đường huyết của glimepirid

và tăng tác dụng hạ đường huyết (nhưng không ảnh hưởng đến thời gian khởi phát tác dụng) của metformin, qua đó cải thiện hiệu quả điều trị đái tháo đường [23]

 Tác dụng chống oxy hóa

Tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết lá Đu đủ được công bố trong nhiều nghiên

cứu Tebekeme O và Diepreye E đã tiến hành nghiên cứu trên mô hình in vitro và chỉ

ra rằng dịch chiết lá Đu đủ có khả năng chống oxy hóa và gốc tự do đáng kể Dịch chiết

cũng làm giảm hydroperoxid, tác nhân gây ra tan máu và peroxy hóa lipid, khi so sánh với acid ascorbic (p < 0,05) với các giá trị IC50 lần lượt là 7,33 mg/ml và 1,58 mg/ml để

ức chế quá trình tan máu và peroxy hóa lipid [66], [32], [56], [52] Các hợp chất nhóm flavonoid, vitamin A và C được cho là có vai trò chính trong tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết lá Đu đủ [42]

 Kháng nấm

Sikandar Khan Sherwani và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của dịch chiết nước

lá Đu đủ trên 6 loài nấm hoại sinh, 5 loài nấm trên da và 6 loài nấm men và chỉ ra: dịch chiết lá Đu đủ có khả năng chống lại đa số các loại nấm trên và dịch ép cho tác dụng tốt hơn dịch chiết bằng cách đun sôi [60]

 Tác dụng chống viêm và điều hòa miễn dịch

Đã có nhiều nghiên cứu trên mô hình in vitro và in vivo cho thấy hiệu quả của dịch

chiết lá Đu đủ trong việc chống viêm và điều hòa miễn dịch [48], [45], [20] Ví dụ, Owoyele và cộng sự đã chỉ ra rằng: dịch chiết lá Đu đủ có tác dụng giảm viêm rõ rệt trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan, giảm rõ rệt số u hạt được tạo thành trên mô hình gây u hạt, giảm rõ rệt sự phù nề từ ngày theo dõi thứ 4 đến ngày theo dõi thứ 10 trên mô hình gây viêm khớp bằng formaldehyd Tuy nhiên, các thử nghiệm lâm sàng về tác dụng này vẫn còn thiếu [58]

 Tác dụng điều trị tăng huyết áp

Dịch chiết methanol của lá Đu đủ có tác dụng hạ huyết áp tương tự như của enalapril và độ nhạy của baroreflex (một phản xạ được kích thích bởi sự tăng áp lực lên thành mạch máu) được bình thường hóa ở những con chuột bị tăng huyết áp tự nhiên Hoạt động của enzyme chuyển angiotensin trong huyết tương và bệnh cơ tim cũng được giảm xuống mức tương đương với nhóm được điều trị bằng enalapril [25]

 Tác dụng trên thần kinh trung ương

Gupta và cộng sự tiến hành nghiên cứu tác dụng trên thần kinh trung ương ở chuột cống đực của dịch chiết cồn lá Đu đủ Dịch chiết (cao khô) ở liều ≥ 5 mg/kg có tác dụng làm giãn cơ Liều ≥ 10 mg/kg tiêm màng bụng gây tác dụng an thần phụ thuộc liều Liều

≥ 50 mg/kg bảo vệ động vật hoàn toàn khỏi cơn động kinh gây ra bởi pentylenetetrazol,

trong khi liều 5 mg/kg có tác dụng bảo vệ 50% Với liều 100-200 mg/kg cho tác dụng bảo vệ 100% khỏi cơn co giật do sốc điện [28]

 Tác dụng giảm đau

Hoạt tính giảm đau của dịch chiết lá Đu đủ (n-hexan, ethyl acetat, ethanol) đã được nghiên cứu trên mô hình chuột bị gây đau bằng acid acetic (phương pháp Siegmund) Kết quả cho thấy dịch chiết ethanol với mức liều 0,70 mg/kg cho thấy hoạt động giảm đau tốt nhất, có thể so sánh với aspirin [29]

1.2 Hợp chất carpain

1.2.1 Công thức cấu tạo và một số tính chất vật lý

Cấu trúc đầy đủ của carpain được Coke và Rice xác định vào năm 1965, bao gồm hai phân tử chứa vòng piperidin giống nhau được liên kết bởi hai nhóm lacton [19]:

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của carpain

- Tên IUPAC:

- Carpain tan tốt trong ether và cloroform [14], khó tan trong nước nhưng dạng muối clorid thì tan tốt trong nước [22]

- Nhiệt độ nóng chảy: 119-120°C [18], [54], 118-120°C [19]

1.2.2 Tác dụng sinh học

Nhiều nghiên cứu chỉ ra carpain trong lá Đu đủ có liên quan đến nhiều tác dụng sinh

- Teeratad chứng minh rằng carpain, alcaloid chính trong lá Đu đủ có tác dụng

gây giãn cơ trơn tử cung in vitro trên tử cung chuột cống cô lập [62]

- Carpain cũng được chứng minh có hoạt tính gây độc mạnh trên cả bốn dòng tế bào ung thư người: ung thư biểu mô KB, ung thư máu HL-60, ung thư phổi LU-1, ung thư vú MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/ml) [4]

- Năm 2014, Julanti và cộng sự công bố có mối liên quan giữa tác dụng điều trị sốt rét và các alcaloid trong lá Đu đủ Carpain được chứng minh có hoạt tính cao và chọn

lọc trên mô hình in vitro Tuy nhiên, trên mô hình in vivo tác dụng này của carpain lại

không rõ [34]

- Parag Savla và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tính hiệu quả của phân đoạn tert-butyl methyl ether từ dịch chiết methanol của lá Đu đủ (được cho là carpain thông qua phổ NMR, MS, IR) trong việc bảo vệ hệ thần kinh và nhận thấy: phân đoạn này không gây độc tế bào và có hiệu quả bảo vệ thần kinh chống lại yếu tố gây độc thần kinh, mang lại sự ổn định rõ rệt cho các vi ống nội bào [50]

1.2.3 Một số nghiên cứu về phân lập carpain

Carpain là alcaloid chính trong lá Đu đủ và được phân lập đầu tiên vào năm 1890 bởi Greshoff [22], [27] Từ đó đến nay đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành để chiết xuất alcaloid này từ lá Đu đủ, đều trải qua ba bước chính: chiết xuất (sử dụng cồn acid hay kiềm hóa rồi chiết bằng dung môi hữu cơ), loại tạp để thu được alcaloid toàn phần (chuyển dạng hay sử dụng sắc ký trao đổi ion) và phân lập carpain từ alcaloid toàn phần (kết tinh trong dung môi thích hợp, dùng sắc ký cột mở hoặc sắc ký lỏng điều chế) Cụ thể như sau:

- Chiết bột lá Đu đủ bằng ethanol có chứa 1% acid acetic Sau đó, dịch chiết được

cô đặc đến khi khối lượng không đổi Hòa tan lại cắn bằng dung dịch acid trong nước

để loại nhựa Dung dịch acid này tiếp tục được loại tạp bằng cách chiết với ether Tinh

chế alcaloid toàn phần bằng cách chuyển dạng muối - base Kết tinh, tinh chế lại bằng ether, aceton hoặc 2-butanon thu được carpain [54], [27], [19], [18]

- Năm 2014, Julianti và cộng sự cũng tiến hành chiết xuất và phân lập carpain như sau: Thấm ẩm bột dược liệu bằng MeOH-NH4OH (1:1), chiết bằng n-hexan, cô dịch chiết dưới áp suất giảm thu lấy cắn Hòa tan cắn trong MeOH, ly tâm thu lấy dịch trong Acid hóa dịch thu được bằng HCl 1N rồi lọc lấy dịch Loại tạp bằng sắc ký trao đổi ion, thu được alcaloid toàn phần Tiến hành sắc ký lỏng điều chế trên cột C18, pha động gồm nước và acetonitril (cả hai dung môi đều có 0,1% acid formic) thu được carpain [34]

- Năm 2015, Wang và cộng sự tiến hành như sau: Bột lá Đu đủ được ngâm với dung dịch ethanol/nước/HCl, thu lấy dịch Cô toàn bộ dịch chiết dưới áp suất giảm, sau

đó cắn được hòa tan bằng dung dịch acid trong nước, lọc rồi loại tạp bằng ether dầu hỏa Phần acid được kiềm hóa bằng amoniac rồi chiết bằng cloroform Tiến hành tách lấy carpain bằng sắc ký cột mở với pha tĩnh là silica gel, sử dụng pha động là methanol-cloroform (5:95), kiểm tra bằng bản mỏng với thuốc thử Dragendorff [72]

- Năm 2017, Do Thi Hoa Vien và cộng sự cũng sử dụng cột silica gel để phân lập carpain như sau: Dùng EtOH chiết xuất bột lá Đu đủ, thu được dịch chiết tổng Sau đó

sử dụng dung môi thích hợp để thu alcaloid toàn phần Sử dụng phương pháp sắc ký cột

mở silica gel, pha động CH2Cl2-MeOH (với tỷ lệ MeOH thay đổi từ 0 đến 20%), thu được 5 phân đoạn Sau đó, phân đoạn thứ ba tiếp tục được tách bằng sắc ký cột mở (với pha động CH2Cl2-MeOH tỷ lệ 95:5), thu được chất CP2 CP2 được kết tinh với CH2Cl2-n-hexan (tỷ lệ 3: 1) Bay hơi dung môi, thu được carpain tinh khiết [21]

- Năm 2018, nhóm nghiên cứu đã tiến hành chiết xuất và phân lập carpain từ lá Đu

đủ như sau: Bột dược liệu ban đầu được loại tạp bằng n-hexan Loại bỏ dung môi, làm khô tự nhiên sau đó chiết bằng n-hexan trong môi trường kiềm Gạn lấy dịch chiết, lọc

và thu hồi dung môi để lấy cắn Phân lập carpain bằng sắc ký cột mở, pha tĩnh là silica gel, pha động là CH2Cl2-MeOH (10:1) Kiểm tra và gộp lấy các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, sử dụng thuốc thử hiện màu là Dragendorff

1.2.4 Một số phương pháp định lượng carpain trong lá Đu đủ

Đã có nhiều nghiên cứu về xác định hàm lượng carpain trong lá Đu đủ Một số phương pháp xác định hàm lượng carpain trong lá Đu đủ đã được báo cáo là:

- Tách carpain bằng sắc ký lớp mỏng điều chế: Chấm dịch alcaloid toàn phần của

lá Đu đủ lên bản mỏng, khai triển, hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff thấy có

3 vết hiện màu cam rõ Cạo lấy từng vết, phản hấp phụ bằng dung môi thích hợp, xác định lại cấu trúc của từng hợp chất thu được Carpain được định lượng bằng cách cân lượng chất thu được sau khi phản hấp phụ [18]

- Sử dụng HPLC hay UPLC cột C18 kết hợp detector MS [9], [51], [63], [74]

- Sử dụng HPLC cột C18 với detector PDA ở bước sóng 205 nm [21]

Những nghiên cứu trước đây cho thấy hàm lượng carpain dao động mạnh trong khoảng 0,011-3,7% và chưa có sự thống nhất về ảnh hưởng của tuổi của lá tới hàm lượng carpain

- Barger và cộng sự công bố rằng hàm lượng carpain tăng theo tuổi của lá từ 0,07% Nhưng nghiên cứu sau đó của chính nhóm tác giả này lại chỉ ra hàm lượng carpain ở lá già thấp hơn lá non [13], [14], [15]

0,022 Năm 1970, Organ và cộng sự chỉ ra: carpain chiếm khoảng 0,0115% trong lá Đu

đủ và hàm lượng của carpain đều thấp trong 12 tháng liên tiếp chứ không tăng lên ở lá non như báo cáo của Barger [46]

- Năm 2005, một nhóm tác giả đủ ở Eksotika I đã tiến hành chiết xuất carpain từ

lá Đu đủ và thu được 18,5 g carpain từ 500 g lá, tương ứng với 3,7% [41]

- Năm 2014, Julianti và cộng sự tiến hành khảo sát hàm lượng carpain trong 29 mẫu lá Đu đủ khác nhau ở Indonesia và thấy rằng hàm lượng carpain trong lá Đu

đủ dao động từ 0,02-0,31% [63]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu: Mẫu lá Đu đủ là lá bánh tẻ, màu xanh, không ngả màu được thu hái tại 13 vùng:

- Tháng 10/2018: Yên Sở (Hoàng Mai, Hà Nội)

- Tháng 2/2019: Chương Mỹ (Hà Nội), Bắc Giang, Hải Phòng, Vĩnh Phúc, Hà Nam, Hưng Yên, Lào Cai, Tuyên Quang

- Tháng 4/2019: Gia Lâm, Phú Xuyên, Đông Anh (Hà Nội), Bắc Ninh

Mẫu thu hái tại Yên Sở, Hoàng Mai, Hà Nội vào tháng 5/2018 (cùng nguồn cung

cấp với mẫu tháng 10/2018) đã được giám định tên khoa học là Carica papaya L (tiêu

2.1.2 Các trang thiết bị nghiên cứu

2.1.2.1 Hóa chất và dụng cụ

Hóa chất và thuốc thử trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích:

- Hóa chất: dung dịch amoniac đặc, acid sulfuric

- Dung môi hữu cơ: n-hexan, methanol, aceton, dicloromethan, toluen, ethyl acetat, acid acetic, butanol

- Thuốc thử Dragendorff theo quy định của Dược điển Việt Nam V [6], được chuẩn

bị như sau:

+ Dung dịch 1: hòa tan 0,85 g bismuth nitrat base (TT) trong 40 ml nước và 10

ml acid acetic (TT)

+ Dung dịch 2: Hòa tan 8 g kali iodid (TT) trong 20 ml nước

+ Trộn đồng thể tích dung dịch 1 và 2, thêm 100 ml nước và 20 ml acid acetic

(TT) vào mỗi 10 ml hỗn hợp thu được

- Bản mỏng tráng sẵn HPTLC, TLC silica gel 60F254 của hãng MERCK (Đức)

- Dụng cụ: các dụng cụ thí nghiệm thường quy (vải lọc, bông, giấy lọc, bình nón, bình gạn, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, pipet, chỉ thị vạn năng ), các dụng cụ thí nghiệm khác (mao quản, bình triển khai sắc ký )

- Chất đối chiếu carpain (được Ngô Huy Trung phân lập và xác định cấu trúc [7])

2.1.2.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

- Tủ sấy MEMMERT (Đức)

- Cân phân tích Precisa (Thụy Sĩ), độ chính xác 0,1 mg

- Cân kỹ thuật Sartorius (Đức), độ chính xác 0,01 g

- Bể siêu âm Wisd (Trung Quốc)

- Máy cất quay Buchi ROTAVAPOR R-200 (Thụy Sỹ)

- Cân xác định hàm ẩm OHAUS (Trung Quốc)

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt

- Kính hiển vi soi nổi Stereo Blue (Đức)

- Hệ thống HPTLC CAMAG gồm hệ thống chấm sắc ký tự động Linomat V, bình khai triển tự động ADC2, buồng chụp sắc ký Visualizer, máy tính với phần mềm VisionCATs (Thụy Sỹ)

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AscendTM 500 (Mỹ)

- Máy đo phổ khối LC-MSD-Trap-SL

- Máy đo phổ hồng ngoại FT/IR6300, hãng Jasco (Mỹ)

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu của đề tài là phân lập carpain từ lá Đu đủ và khảo sát hàm lượng carpain trong một số mẫu lá Đu đủ, nội dung nghiên cứu bao gồm những bước sau:

- Chiết xuất, phân lập và tinh chế carpain từ lá Đu đủ

- Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng carpain tinh chế được

- Xây dựng và thẩm định phương pháp HPTLC để bán định lượng carpain trong các mẫu lá Đu đủ

- Áp dụng phương pháp HPTLC để khảo sát hàm lượng carpain trong một số mẫu

lá Đu đủ thu tại miền bắc Việt Nam

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chiết xuất, phân lập và tinh chế carpain từ lá Đu đủ

- Chiết xuất: 2,1 kg bột dược liệu được kiềm hóa bằng dung dịch amoniac đậm đặc

để chuyển alcaloid có trong cây về dạng base Tiến hành chiết siêu âm 3 lần, mỗi lần 30 phút với dung môi n-hexan

- Loại tạp: Dịch chiết n-hexan thu được đem chuyển dạng bằng dung dịch acid sulfuric 1% để loại tạp không tan trong acid Dung dịch alcaloid dạng muối thu được đem kiềm hóa đến pH = 9 bằng dung dịch amoniac đậm đặc, alcaloid dạng base được chiết bằng dicloromethan Cất thu hồi dung môi đến cắn, thu được cắn alcaloid toàn phần

- Kết tinh: Cắn alcaloid toàn phần được hòa tan trong lượng tối thiểu aceton (đun nóng nhẹ trên bếp cách thủy) và để kết tinh lạnh qua đêm Tinh thể thu được đem rửa trên phễu thủy tinh bằng aceton lạnh Tiến hành kết tinh lại 4 lần để thu được tinh thể sạch

- Tiến hành kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết của chất kết tinh được bằng cách sử dụng sắc ký lớp mỏng với ba hệ dung môi khác nhau

- So sánh chất kết tinh được với chất đối chiếu carpain đã được nhóm nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc trước đó bằng sắc ký lớp mỏng

Sơ đồ quá trình chiết xuất, phân lập và tinh chế carpain có thể tóm tắt như sau:

Hình 2.2 Sơ đồ của quá trình chiết xuất, phân lập, tinh chế carpain

Alcaloid toàn phần

Carpain

Aceton Hòa tan, để lạnh cho kết tinh

Rửa tinh thể (lạnh)

Alcaloid dạng muối

1 NH4OH đến pH = 9

2 9,45 lít dicloromethan

Lắc chuyển dạng 3 lần

Cô quay

Alcaloid dạng base

3,15 lít dung dịch H2SO4 1% Lắc chuyển dạng 3 lần

Cắn

Hòa tan 1,05 lít

n-hexan

Dịch chiết n-hexan n-hexan

thu hồi

Lọc, cất thu hồi dung môi

Bột lá đã kiềm hóa

Bột lá (2,1 kg)

1,47 lít dung dịch amoniac đậm đặc Thấm ẩm 30 phút

Chiết siêu âm 3 lần 37,8 lít

n-hexan

2.3.2 Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng carpain tinh chế được

- Quan sát hình dạng tinh thể trên kính hiển vi soi nổi

- Đo nhiệt độ nóng chảy của tinh thể

- Chất phân lập được được nhận dạng dựa trên các dữ liệu phổ khối MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT135) và 2 chiều (HSQC, HMBC, COSY), phổ hồng ngoại IR và so sánh với các dữ liệu tương ứng đã được công bố

2.3.3 Xây dựng và thẩm định phương pháp HPTLC để bán định lượng carpain trong các mẫu lá Đu đủ

Quy trình HPTLC dùng để bán định lượng carpain trong lá Đu đủ được khảo sát

để lựa chọn phương pháp chiết xuất, hệ dung môi khai triển, sau đó tiến hành thẩm định các tiêu chí: độ đặc hiệu, độ tuyến tính, tính thích hợp của hệ thống Cụ thể được tiến hành như sau:

2.3.3.1 Khảo sát và xây dựng phương pháp

 Phương pháp chiết xuất

- Cân chính xác khoảng 5,0 g bột lá Đu đủ, xác định hàm ẩm

- Chiết siêu âm 4 lần, mỗi lần 15 phút với 20 ml dung môi MeOH

- Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, cô cách thủy đến cạn

- Cắn được hòa tan bằng MeOH và cho vào bình định mức 10 ml, điều chỉnh thể tích bằng MeOH, thu được dung dịch mẫu thử để chấm sắc ký

 Khảo sát hệ dung môi khai triển

Thông qua tham khảo các nghiên cứu trước về sắc ký lớp mỏng của dịch chiết lá

Đu đủ, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát các hệ dung môi với các tỷ lệ khác nhau:

- Toluen – Ethyl acetat – Methanol – Amoniac

- n-Butanol – Acid acetic – Nước

- Dicloromethan – Methanol – Amoniac

2.3.3.2 Thẩm định phương pháp bán định lượng

 Thẩm định độ đặc hiệu

- Chuẩn bị dung dịch thử theo quy trình trên

- Chuẩn bị dung dịch đối chiếu: Hòa tan khoảng 5 mg carpain trong 10 ml MeOH thu được dung dịch đối chiếu

- Chuẩn bị dãy dung dịch đối chiếu:

+ Pha dung dịch gốc 1 mg/ml: Cân chính xác khoảng 10 mg carpain, hòa tan bằng MeOH và cho vào bình định mức 10 ml, thêm MeOH đến vạch

+ Pha dãy nồng độ: Tiến hành hút lần lượt 0,5; 1,0; 2,5; 3,5 ml dung dịch gốc, cho vào bình định mức 5ml, thêm MeOH đến vạch thu được dãy dung dịch đối chiếu có nồng độ tương ứng là 0,1; 0,2; 0,5; 0,7 mg/ml

- Chấm đồng thời trên một bản mỏng dãy dung dịch đối chiếu với thể tích 2µl, khai triển với hệ dung môi đã chọn, hiện màu với thuốc thử Dragendorff

- Sử dụng phần mềm VisionCATs để xác định diện tích pic sắc ký của carpain, xây dựng phương trình hồi quy biểu diễn mối tương quan của diện tích pic và lượng carpain của vết sắc ký, xác định hệ số tương quan r

- Yêu cầu: 0,99 ≤ r ≤ 1 [11]

 Thẩm định độ thích hợp của hệ thống

- Chấm 6 lần trên cùng 1 bản mỏng 2 µl dung dịch carpain 0,5 mg/ml

- Tiến hành khai triển và hiện màu, sử dụng phần mềm để xác định diện tích pic của vết carpain

- Yêu cầu: RSD của diện tích pic carpain giữa các mẫu không vượt quá 2,0% [11]

2.3.4 Áp dụng phương pháp HPTLC để khảo sát hàm lượng carpain trong một số mẫu lá Đu đủ thu tại miền bắc Việt Nam

- Chuẩn bị dung dịch thử từ 13 mẫu lá Đu đủ theo quy trình trên

- Chấm trên cùng một bản mỏng thể tích thích hợp các dung dịch thử và dãy dung dịch đối chiếu, khai triển sắc ký, hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff và sử

dụng phần mềm VisionCATs để xác định diện tích pic carpain trên sắc ký đồ của các mẫu thử và mẫu đối chiếu

- Dựa vào phương trình hồi quy thể hiện mối tương quan giữa diện tích pic và lượng carpain trong các vết của dãy dung dịch đối chiếu để đưa ra nồng độ carpain trong các mẫu thử Dựa vào nồng độ này, tính toán hàm lượng carpain trong các mẫu lá theo công thức sau:

H (%) = C×10×10

-6

m×(100-RH)/100×100 Trong đó: H (%): hàm lượng carpain trong mẫu lá Đu đủ

C (µg/ml): nồng độ carpain trong mẫu thử tương ứng

m (g): khối lượng bột lá Đu đủ ban đầu

RH (%): độ ẩm của bột lá Đu đủ ban đầu

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Phân lập carpain từ lá Đu đủ

3.1.1 Chiết xuất, phân lập và tinh chế carpain từ lá Đu đủ

- Quá trình chiết xuất, phân lập và tinh chế carpain từ lá Đu đủ được thực hiện theo

Hình 3.1 Hình ảnh sắc ký đồ chất phân lập được

Hệ I: Dicloromethan – Methanol – Amoniac (20:1,5:0,1)

Hệ II: Toluen – Ethyl acetat – Methanol – Amoniac (3:3:1,5:0,1)

Hệ III: n-Butanol – Acid acetic – Nước (4:1:5, lấy lớp trên)

Hình 3.2 So sánh với chất đối chiếu carpain

I: Tinh thể phân lập được II: Chấm chồng tinh thể mới phân lập và chất đối chiếu carpain III: Chất đối chiếu carpain

3.1.2 Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng carpain tinh chế được

- Đo nhiệt độ nóng chảy: 119,0-120,1°C

- Quan sát tinh thể dưới kính hiển vi soi nổi, nhận thấy tinh thể có dạng hình kim:

Hình 3.3 Hình ảnh tinh thể thu được Hình 3.4 Tinh thể quan sát dưới kính

hiển vi

- Dựa trên dữ liệu phổ:

+ Phổ khối ESI-MS cho tín hiệu pic [M+H]+ với giá trị m/z = 479,2, tương ứng

công thức phân tử C28H50O4N2 với khối lượng phân tử M = 478,7 g/mol

+ Kết quả phổ IR cho thấy một vân phổ với cường độ trung bình ở tần số 3423,03

cm-1, đặc trưng cho liên kết N-H và một tín hiệu mạnh ở tần số 1718,26 cm-1, tương ứng với dao động hóa trị của liên kết C=O

+ Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) cho tín hiệu của 1 nhóm CH3 tại độ dịch chuyển δH 1,06 ppm (3H; d; J = 6 Hz); 1 pic của CH gắn với oxy tại độ dịch chuyển 4,77 ppm (1H, s); 2 pic proton của nhóm CH lần lượt ở δH 2,88 ppm và 2,60 ppm Các pic proton còn lại của nhóm CH2 tại độ dịch chuyển δH từ khoảng

độ dịch chuyển δC 66,6 ppm thể hiện liên kết với oxy

Kết hợp với các dữ liệu phổ COSY, HSQC, HMBC, so sánh với các tài liệu đã công bố [4], [34] khẳng định tinh thể phân lập được là carpain

Hình 3.5 Công thức cấu tạo của carpain

13C-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 14,9 (CH3-15, 15’), 21,7 (C-3, 3’), 21,6 (C-7, 7’), 22,6 (C-14, 14’), 22,6 (C-13, 13’), 24,9 (C-4, 4’), 26,0 (C-6, 6’), 25,4 (C-5, 5’), 30,8 (C-2, 2’), 33,7 (C-8, 8’), 49,8 (C-11, 11’), 52,3 (C-9, 9’), 66,6 (C-12, 12’), 169,7 (C=O)

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 1,06 (6H, d, J = 6,0 Hz, H-15, 15’), 1,20 (2H, m, H-14a, 14’a), 1,45 (22H, m, H-4, 4’ + H-5, 5’ + H-6, 6’ + H-7, 7’+ H-8a, 8’a + H-8b, 8’b, + H-14b,14’b), 1,65 (6H, m, H-3, 3’ + H-13a, 13’a), 2,02 (2H, d, H-13b, 13’b), 2,32 (2H, m, H-2a, 2’a), 2,43 (2H, m, H-2b, 2’b), 2,60 (2H, s, H-9, 9’), 2,87

(2H, d, J = 6Hz, H-11, 11’), 4,77 (2H, s, H-12, 12’)

3.2 Khảo sát hàm lượng carpain trong một số mẫu lá Đu đủ thu tại miền bắc Việt Nam

3.2.1 Khảo sát và xây dựng phương pháp

- Lựa chọn hệ dung môi sắc ký

Bảng 3.1 Khảo sát hệ dung môi sắc ký

n-Butanol – Acid acetic – Nước

(4:1:5, lấy lớp trên)

+ Các vết đã tách nhưng không gọn + Cùng thể tích chấm như các hệ khác nhưng vết to hơn rất nhiều

Dicloromethan – Methanol – Amoniac

- Phương pháp chuẩn bị mẫu thử: Chiết khoảng 5,0 g bột dược liệu bằng siêu âm

4 lần, mỗi lần 15 phút bằng 20ml dung môi MeOH, cô dịch chiết trên bếp cách thủy đến cạn, hòa tan bằng MeOH vào bình định mức 10 ml, điều chỉnh thể tích bằng MeOH

- Kết quả lựa chọn điều kiện sắc ký:

+ Pha tĩnh: Bản mỏng silica gel 60F254, hoạt hóa ở 110°C trong 2 tiếng

+ Lượng dung môi khai triển: 10 ml

+ Lượng dung môi bão hòa: 20 ml

+ Thời gian bão hòa dung môi: 20 phút

+ Thời gian ổn định bản mỏng: 10 phút

+ Thể tích tiêm mẫu: 2 µl

+ Thông số chấm bản mỏng: băng chấm 5 mm, khoảng cách giữa 2 vết là 4 mm, khoảng cách bờ là 20 mm, khoảng cách đáy 10 mm

+ Khoảng di chuyển của dung môi: 80 mm

+ Thuốc thử hiện màu: Dragendorff

3.2.2 Thẩm định phương pháp HPTLC đã xây dựng

 Thẩm định độ đặc hiệu

Hình 3.6 Thẩm định độ đặc hiệu

I: mẫu thử II: mẫu trắng III: mẫu đối chiếu

- Nhận xét:

+ Sắc ký đồ của mẫu thử có vết tương ứng về màu sắc và vị trí với vết carpain trong dung dịch đối chiếu

+ Trên mẫu trắng không xuất hiện vết này

- Kết luận: Phương pháp đạt độ đặc hiệu để xác định carpain trong lá Đu đủ

 Thẩm định độ tuyến tính

Bảng 3.2 Kết quả thẩm định khoảng tuyến tính carpain

Dung dịch

carpain gốc

Mẫu dung dịch đối chiếu (mg/ml)

Thể tích tiêm (µl)

Lượng carpain/ vết (ng)

Diện tích pic (Au)

Hình 3.7 Đồ thị mô tả tương quan giữa diện tích pic và lượng carpain của vết

- Nhận xét: giá trị r = 0,996 nằm trong khoảng yêu cầu

- Kết luận: Phương pháp đạt độ tuyến tính bán định lượng carpain trong khoảng

212 – 2120 ng/vết, tương ứng với nồng độ từ 0,106 - 1,06 mg/ml ở thể tích chấm

2 µl

 Thẩm định độ thích hợp của hệ thống

Tiến hành chấm liên tiếp 6 vết mẫu đối chiếu nồng độ 0,530 mg/ml với thể tích 2

µl trên cùng một bản mỏng Khai triển sắc ký theo quy trình trên