Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây Đinh lăng răng trồng tại Thái Bình

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ HƯƠNG GIANG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÂY ĐINH LĂNG RĂNG TRỒNG TẠI THÁI BÌNH KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ... BỘ Y TẾ TRƯ

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ HƯƠNG GIANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÂY ĐINH LĂNG RĂNG TRỒNG TẠI THÁI BÌNH

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ HƯƠNG GIANG

MÃ SINH VIÊN: 1401154

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÂY ĐINH LĂNG RĂNG TRỒNG TẠI THÁI BÌNH

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 PGS TS Nguyễn Mạnh Tuyển

2 DS Đinh Thị Vân

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Dược học cổ truyền

2 Viện Dược liệu

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện khoá luận, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp

đỡ và động viên quý báu từ các thầy giáo, cô giáo, gia đình và bạn bè

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển

đã trực tiếp hướng dẫn, hết lòng truyền đạt những kiến thức quý báu để em có thể hoàn thành khoá luận

Em xin phép gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới DS Đinh Thị Vân cùng các

thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên đang giảng dạy và công tác tại Bộ môn Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội và Khoa Hoá Phân tích – Viện Dược liệu Các thầy

cô, các anh chị đã luôn tận tình hướng dẫn, quan tâm và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành khoá luận

Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo và các cán bộ công tác tại trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, giảng dạy, dìu dắt và truyền nhiệt huyết cho em trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khoá luận cũng như trong học tập

Do điều kiện chủ quan và khách quan, khoá luận này có thể còn có thiếu sót Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý giá của các thầy cô và hội đồng để khoá luận được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Đinh lăng (Polyscias) 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Phân bố của chi Đinh lăng (Polyscias) 2

1.1.3 Đặc điểm thực vật của chi Đinh lăng (Polyscias) 3

1.1.4 Thành phần hoá học của chi Đinh lăng (Polyscias) 3

1.1.5 Tác dụng sinh học của chi Đinh lăng (Polyscias) 13

1.2 Tổng quan về loài Polyscias guilfoylei 15

1.2.1 Đặc điểm thực vật của loài Polyscias guilfoylei 15

1.2.2 Thành phần hoá học của loài Polyscias guilfoylei 15

1.2.3 Tác dụng sinh học của loài Polyscias guilfoylei 18

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 19

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 19

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 19

2.1.2.1 Thuốc thử, dung môi, hóa chất 19

2.1.2.2 Phương tiện và máy móc 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 20

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hoá học 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật học 20

2.3.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất chính bằng phản ứng hoá học 21

2.3.2.2 Chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn 25

2.3.2.3 Phân lập các hợp chất chính 26

2.3.2.4 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 27

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28

3.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật 28

3.1.1 Đặc điểm thực vật mẫu nghiên cứu 28

3.1.2 Xác định tên khoa học của cây Đinh lăng răng 29

3.1.3 Đặc điểm vi học rễ, thân, lá của cây Đinh lăng răng (Polyscias guilfoylei cv quinquefolia) 30

3.1.3.1 Đặc điểm vi phẫu rễ 31

3.1.3.2 Đặc điểm vi phẫu thân 32

3.1.3.3 Đặc điểm vi phẫu lá 33

3.1.3.4 Đặc điểm bột rễ 34

3.1.3.5 Đặc điểm bột thân 35

3.1.3.6 Đặc điểm bột lá 36

3.2 Kết quả nghiên cứu thành phần hoá học 37

3.2.1 Định tính các nhóm chất trong thân và lá cây Đinh lăng răng (Polyscias guilfoylei cv quinquefolia) 37

3.2.2 Quy trình chiết xuất và phân lập các hợp chất trong thân cây Đinh lăng răng (Polyscias guilfoylei cv quinquefolia) 40

3.2.3 Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được 41

3.3 Bàn luận 45

3.3.1 Về đặc điểm thực vật 45

3.3.1.1 Về giám định tên khoa học cho cây Đinh lăng răng 45

3.3.1.2 Về mô tả đặc điểm thực vật của Polyscias guilfoylei cv quinquefolia 46

3.3.2.1 Về định tính nhóm chất trong thân và lá của Polyscias guilfoylei cv quinquefolia 47

3.3.2.2 Về chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

guilfoylei cv quinquefolia Tr 41

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên thiên nhiên quý giá, cung cấp nguyên liệu

cho nền y học cổ truyền nước nhà Chủ tịch Hồ Chí Minh đã từng nói:“Y học phải dựa trên nguyên tắc khoa học, dân tộc, đại chúng Ông cha ta ngày trước có nhiều kinh nghiệm quý báu về cách chữa bệnh bằng thuốc ta, thuốc bắc Ðể mở rộng phạm vi y học, các cô, các chú cũng nên chú trọng nghiên cứu và phối hợp thuốc Đông và thuốc Tây” Thực hiện lời dạy của Bác, ngày nay, xu hướng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm

các hoạt chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ưu điểm

không độc hại hoặc rất ít độc tính, dễ hấp thu và chuyển hoá trong cơ thể

Chi Đinh lăng (Polyscias) là chi lớn thứ hai trong họ Nhân sâm (Araliaceae) với

nhiều loài đã được sử dụng làm thuốc Tuy nhiên cho đến nay trên thế giới mới chỉ có

một số loài đã được nghiên cứu về thành phần hoá học như P filicifolia Bail., P scutellaria (Burm f.) Merr., P amplifolia (Baker) Harms, P.dichroostachya Baker, P fulva, P murrayi Harms và Polyscias sp nov Cây Đinh lăng răng là một trong những

loài Đinh lăng được trồng phổ biến tại Thái Bình, được người dân sử dụng làm cây cảnh cũng như làm thuốc tương tự Đinh lăng lá xẻ để tăng cường sức khỏe, nâng cao sức đề kháng, giảm đau đầu, giảm mệt mỏi, Tuy nhiên, hiện có rất ít nghiên cứu về đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của loài Đinh lăng này

Do đó, để bổ sung cơ sở dữ liệu thực vật, hóa học cũng như nâng cao công dụng

và giá trị ứng dụng thực tiễn của cây Đinh lăng răng, chúng tôi tiến hành khoá luận:

“Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Đinh lăng răng trồng tại Thái Bình" với mục tiêu:

1 Mô tả đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học và mô tả đặc điểm vi học của cây Đinh lăng răng

2 Chiết xuất, phân lập và nhận dạng 1-2 hợp chất từ thân của cây Đinh lăng răng

Họ Nhân sâm (Araliaceae)

Chi Đinh lăng (Polyscias)

1.1.2 Phân bố của chi Đinh lăng (Polyscias)

Chi Đinh lăng chứa khoảng 114-150 loài (tuỳ theo quan điểm phân loại), chủ yếu phân bố ở khu vực Madagascar, đặc biệt ở một số đảo ở Thái Bình Dương [1], [25], [48] Ở Việt Nam, các loài thuộc chi Đinh lăng được trồng ở nhiều nơi để làm cảnh và làm hàng rào, chỉ có vài loài được sử dụng làm thuốc [17], cụ thể gồm các loài Đinh lăng sau [9]:

 Đinh lăng lá nhỏ thường gọi là cây Lá gỏi hay Đinh lăng lá xẻ, tên khoa học:

Polyscias fruticosa L Harms.- Nothopanax fruticosus (L.) Miq Tieghemopanax fruticosus Vig

 Đinh lăng lá tròn: Polyscias balfouriana Baill

 Đinh lăng trổ còn gọi là Đinh lăng viền bạc: Polyscias guilfoylei (Cogn Marche)

Baill

 Đinh lăng lá to còn gọi là Đinh lăng ráng, tên khoa học là Polyscias filicifolia

(Merr) Baill

 Đinh lăng đĩa: Lá to tròn, tên khoa học là Polyscias scutellarius (Burm F.) Merr

 Đinh lăng lá răng: Lá 2 lần kép, thân màu xám trắng, tên khoa học là Polyscias serrata Balf

1.1.3 Đặc điểm thực vật của chi Đinh lăng (Polyscias)

Chi Đinh lăng (danh pháp khoa học: Polyscias) gồm các cây gỗ nhỏ hay nhỡ có

dáng mảnh và có tán lá đẹp, thường xanh, không gai Lá kép lông chân vịt hay lá đơn

có thùy chân vịt hoặc lá kép lông chim với các lá chét có hình dạng thay đổi; lá kèm không có hay hợp lại ở gốc thành một phần phụ nhỏ Cụm hoa tán tạo thành chùm hay chùy; cuống hoa có khớp rụng hay hơi có khớp; đài nguyên hay có 5 răng; cánh hoa 5, tiền khai van Bộ nhị 5, bao phấn hình trứng hay thuôn Bầu dưới 2 ô, ít khi 3-4 ô; vòi nhụy 2-4 rời hay hợp ở gốc Quả dẹt, ít khi gần hình cầu Hạt dẹt [1]

1.1.4 Thành phần hoá học của chi Đinh lăng (Polyscias)

Chi Đinh lăng là chi lớn thứ hai trong họ Nhân sâm [42], nhưng cho đến nay trên

thế giới chỉ có một số loài của chi Polyscias đã được nghiên cứu như: P fruticosa (L.) Harms., P filicifolia Bail., P scutellaria (Burm f.) Merr., P amplifolia (Baker) Harms,

P dichroostachya Baker, P fulva, P murrayi Harms và Polyscias sp nov [17], [28]; trong đó đặc biệt là loài P fruticosa (L.) Harms được quan tâm và nghiên cứu rất nhiều

về thành phần hoá học Thành phần hoá học của một số loài thuộc chi Đinh lăng

(Polyscias) được công bố trong các nghiên cứu trước đây được trình bày trong Bảng

1.1

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Polyscias

glucopyranosid (55)

Polyscias

filicifolia Balf

stigmasterol (7); spinasterol (8); quercetin–3,7,3’,4’–

tetrametyl eter (17); acid oleanolic (26); 3–O–β–D–

glucopyranosyl stigmasterol (11); kaempferol–3,7–di–

O–α–L–rhamnopyranosid (18); acid 3–O–β–D–

lichexanthon (19); β–sitosterol (6); 3–O–β–D–

glucopyranosyl stigmasterol (11); 3–O–β–D–

glucopyranosyl β–sitosterol (9); acid oleanolic (26);

heptadeca–1,8–dien–4,6–diyn–3–ol–10–on (3);

falcarinol (4) và panaxydol (5); acid oleanolic (26)

[15], [36]

Polyscias

scutellaria

stigmasterol (7); spinasterol (8); 3–O–β–D–

glucopyranosyl stigmasterol (11); acid 3–O–β–D–

OH O

HO OH

Các saponin có aglycon là acid oleanolic

octadecen–1,3,4–triol (62)

Hình 1.1 Các hợp chất được phân lập từ chi Polyscias

1.1.5 Tác dụng sinh học của chi Đinh lăng (Polyscias)

Đinh lăng được gọi là “nhân sâm của người nghèo” vì có những tác dụng tương

tự Nhân sâm, như là tăng cường sức dẻo dai, nâng cao sức đề kháng của cơ thể, giảm

mệt mỏi, bổ dưỡng, giúp ăn ngon, ngủ yên, tăng khả năng lao động và làm việc bằng trí

óc, tăng cân và chống độc….[5], [13] Cụ thể các nghiên cứu cho thấy:

Nước sắc rễ của cây Đinh lăng lá xẻ có tác dụng làm tăng sức dẻo dai của cơ thể trên thí nghiệm cấp tính tương tự như Nhân sâm [13] Các thí nghiệm trên chuột cho thấy Đinh lăng lá xẻ có tác dụng lợi tiểu, làm tăng sức đề kháng của chuột đối với các bức xạ siêu cao tần [8], [13] Đinh lăng lá xẻ có tác dụng tăng lực, tăng cân, tăng khả năng chịu đựng của bộ đội và các vận động viên thể thao [5], [9]

Năm 1992, Lutomski J và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của các

hợp chất trong cây Đinh lăng lá xẻ Các hợp chất polyacetylen như dien-4,6-diyn-3,10-diol phân lập được từ cây Panax vietnamensis và Polyscias fruticosa cho thấy có hoạt tính kháng vi khuẩn Gram dương, kháng nấm Candida albican nhưng

(8E)-heptadeca-1,8-không kháng được vi khuẩn Gram âm [35]

Năm 1998, Bernard Bensita Mary và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu dịch

chiết n-butanol của lá cây Đinh lăng lá xẻ với liều 500 mg/Kg có tác dụng hạ sốt, giảm đau,

chống viêm và diệt nhuyễn thể trên chuột nhắt trắng [21]

Năm 2001, Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã dùng chuột nhắt trắng để thử nghiệm tác dụng chống trầm cảm và stress của Đinh lăng lá xẻ Cao Đinh lăng có tác dụng chống trầm cảm và phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress với liều 45-180 mg/Kg thể trọng, khoảng liều này cũng có tác dụng khác như tăng lực, kích thích hoạt động của não bộ và nội tiết, tăng sức đề kháng của cơ thể, chống viêm và xơ vữa động mạch [10] Dịch chiết cồn của rễ Đinh lăng được nuôi cấy mô trong 6 tháng đã thể hiện tác dụng tăng lực dài ngày, chống stress nóng và kháng viêm thực nghiệm tương tự như dịch chiết cồn của rễ cây Đinh lăng lá xẻ 5 năm tuổi trồng trong điều kiện tự nhiên [6]

Năm 2007, một nghiên cứu khác của Nguyễn Thị Thu Hương và Phạm Thị Mỹ Loan về tác dụng của dịch chiết cồn 96% và cồn 45% lá Đinh lăng lá xẻ trên mô hình thực nghiệm gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid cho thấy, bột cao lá Đinh lăng lá xẻ (50-100 mg/Kg) ức chế sự giảm trọng lượng lách, tuyến ức gây bởi cyclophosphamid và làm tăng chỉ số thực bào ở cả nhóm chuột bình thường và nhóm chuột bị gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid [10] Dịch chiết cồn của rễ Đinh lăng lá xẻ được nuôi cấy mô trong 6 tháng đã thể hiện tác dụng tăng lực dài ngày,

chống stress nóng và kháng viêm thực nghiệm tương tự như dịch chiết cồn của rễ cây Đinh lăng 5 năm tuổi trồng trong điều kiện tự nhiên [4]

Năm 2008, Nguyễn Trần Châu và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu cao lá Đinh lăng lá xẻ ở liều 200 mg/Kg và 500 mg/Kg có khả năng làm giảm lượng

làm giảm nồng độ cholesterol trong máu so với lô không điều trị Cao lá Đinh lăng ở liều

200 mg/Kg có tác dụng chống oxy hóa và hạ cholesterol ở chuột nhắt tốt hơn so với liều

500 mg/Kg [4]

Năm 2011, Varadharajan và cộng sự đã chứng minh được hoạt tính lợi tiểu của cao chiết ete dầu hỏa của rễ Đinh lăng lá xẻ trên động vật thí nghiệm [46]

Năm 2012, các nhà nghiên cứu của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam đã chứng minh trên in vitro tác dụng ức chế enzym α-amylase

lượt là 4,61 µg/ml và 59,4 µg/ml [14]

1.2 Tổng quan về loài Polyscias guilfoylei

1.2.1 Đặc điểm thực vật của loài Polyscias guilfoylei

Polyscias guilfoylei Bail thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) Cây bụi, cao 3-4m,

thân cây ít phân nhánh Lá đa dạng Lá có màu lục sáng, viền trắng, chia lông chim đều đặn, cuống lá ngắn và to, có sọc hay có đốm, lá chét thuôn, có răng không đều [17]

1.2.2 Thành phần hoá học của loài Polyscias guilfoylei

Năm 2009, Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã công bố kết quả nghiên cứu về thành phần

hoá học của Polyscias guilfoylei gồm các hợp chất sau [17]:

glucopyranosyl ester (69)

Năm 2019, Ashmawy và cộng sự đã công bố 9 hợp chất phân lập được từ Polyscias guilfoylei [18], cụ thể là:

HO

tamarixetin–3,7–di–O–α–L–rhamnopyranoside (75)

Hình 1.2 Các hợp chất được phân lập từ loài Polyscias guilfoylei

1.2.3 Tác dụng sinh học của loài Polyscias guilfoylei

Năm 2019, Ashmawy và cộng sự vừa công bố dịch chiết lá của Polyscias guilfoylei có

Cioffi (năm 2008) cũng đánh giá tác dụng chống tế bào ung thư ở người: J774.A1,

HEK-293, và WEHI-164 Kết quả cho thấy hợp chất 3–β–O– [β–D–glucopyranosyl–(1→2)–

α–L–arabinopyranosyl]–echinocysticacid–28–[O–β–D–glucopyranosyl–(1→6)–O–β–

D–glucopyranosyl] ester ức chế các tế bào ung thư ở người nói trên [26]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cây Đinh lăng răng thu hái vào tháng 8/2018 tại huyện

Tiền Hải - Thái Bình, đã được giám định tên khoa học là Polyscias guilfoylei (W.Bull) L.H.Bailey cv quinquefolia Tiêu bản thực vật hiện đang được lưu giữ tại Phòng tiêu

bản cây thuốc - Bộ môn Thực Vật, Trường Đại học Dược Hà Nội (Số hiệu

ẩm dưới 10%, cho vào túi PE kín để bảo quản tại nơi thực hiện khoá luận (Bộ môn Dược học cổ truyền và Khoa Hoá Phân tích - Viện Dược liệu)

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

2.1.2.1 Thuốc thử, dung môi, hóa chất

pha đảo RP-18 (30 - 50 µm, Merck) Dung môi công nghiệp n-hexan, ethyl

2.1.2.2 Phương tiện và máy móc

sephadex LH-20

- Máy đo phổ khối lượng LCMS8045 của Shimadzu, Nhật Bản (Viện Dược liệu)

từ hạt nhân hai chiều (HMBC) của hãng Bruker (500MHz), Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, VAST

- Máy đo góc quay cực Anton Paar DMA 5000M (Viện Dược liệu)

- Kính hiển vi Nikon DS-Fi2, máy ảnh kỹ thuật số Canon, Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội

- Máy cô quay 5 lít và 20 lít của BÜCHI, Thụy Sĩ

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

- Lẫy mẫu, mô tả đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học

- Mô tả đặc điểm vi phẫu rễ, thân, lá

- Mô tả đặc điểm bột rễ, thân, lá

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hoá học

- Định tính các nhóm chất chính từ phần trên mặt đất của cây bằng phản ứng hóa học thường quy

- Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hoá học của một số hợp chất trong thân cây

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật học

- Nghiên cứu về hình thái

 Quan sát tại thực địa và mô tả đặc điểm hình thái thực vật về: dạng sống; thân; lá (hình dạng phiến, chóp, gân, gốc, cuống, kích thước…)

 Lấy mẫu toàn cây, ép tiêu bản và lưu giữ tiêu bản

 Xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu dựa vào khóa phân loại tới họ, chi

và loài trong tài liệu Đối chiếu với mô tả trong các tài liệu chuyên sâu về thực vật So sánh đối chiếu với mẫu tiêu bản tại một số phòng tiêu bản mẫu khô

- Nghiên cứu về đặc điểm vi học

 Vi phẫu: Tiêu bản vi phẫu thân được cắt ngang ở đoạn thân thứ 3 tính từ đầu

của lá trưởng thành Sau đó, các mảnh cắt được nhuộm và làm tiêu bản vi phẫu

Quan sát, mô tả và chụp ảnh các đặc điểm vi phẫu qua kính hiển vi

 Soi bột: Bộ phận dùng được phơi khô, nghiền thành bột, lên tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi xác định và chụp ảnh những đặc điểm của bột qua kính hiển

Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn dung tích 125 ml Lắc kỹ 2 lần với cloroform, mỗi lần 8 ml Gạn dịch chiết cloroform vào cốc có mỏ, loại nước bằng natri sulfat khan Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô và đem bốc hơi trên nồi cách thuỷ đến khô Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng sau:

 Phản ứng của khung steroid

- Phản ứng Liebermann – Bouchardat: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1 ml anhydrid

giữa hai lớp chất lỏng thấy xuất hiện vòng màu tím đỏ Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá

 Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh

- Phản ứng Baljet: Hoà tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều

cho tan hết cắn Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (gồm 1 phần dung dịch acid

picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) Phản ứng dương tính nếu ống nghiệm thấy xuất hiện màu đỏ đến tím, so sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn

- Phản ứng Legal: Hoà tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 90% Nhỏ 1

giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều, phản ứng dương tính nếu ống nghiệm thấy xuất hiện màu đỏ cam, so sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn

 Phản ứng của phần đường

- Phản ứng Keller - Kiliani: Hoà tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 90%

chất lỏng trong ống Nếu có glycosid tim thì mặt tiếp xúc ở giữa hai lớp chất lỏng thấy xuất hiện vòng màu tím đỏ Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên sẽ có màu xanh lá

b Định tính alcaloid

Cân khoảng 3 gam bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml Thêm 20 ml

1N 2 lần, mỗi lần 5 ml Gộp các dịch chiếu nước thu được vào 3 ống nghiệm:

- Ống 1: 1ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Mayer

Phản ứng dương tính nếu ống nghiệm xuất hiện kết tủa trắng

- Ống 2: 1ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Dragendorff

Phản ứng dương tính nếu ống nghiệm xuất hiện kết tủa vàng

- Ống 3: 1ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Bouchardat

Phản ứng dương tính nếu ống nghiệm xuất hiện kết tủa nâu

c Định tính flavonoid:

Cân khoảng 10 gam dược liệu (đã được sấy khô và chia nhỏ) cho vào bình nón, thêm

dùng để tiến hành các phản ứng định tính flavonoid

- Phản ứng Cyanidin: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm một ít bột

magnesi kim loại (khoảng 10 mg) Nhỏ từng giọt HCl đặc (3-5 giọt) Để yên 1-2

- Phản ứng với kiềm: Nhỏ 1-2 giọt dịch chiết lên một mảnh giấy lọc Sấy khô rồi để

lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nắp Phản ứng dương tính nếu màu vàng của dịch chiết tăng lên, có thể so sánh với giọt dịch chiết đối chứng

xanh đen

d Định tính coumarin:

Cân khoảng 10 gam dược liệu (đã được sấy khô và chia nhỏ) cho vào bình nón, thêm

dùng để tiến hành các phản ứng định tính coumarin

- Phản ứng đóng mở vòng lacton:

Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết:

Ống 1: thêm 0.5 ml dung dịch NaOH 10%

Ống 2: để nguyên

Đun cách thuỷ cả 2 ống đến sôi, để nguội, quan sát hiện tượng Nếu có coumarin sẽ quan sát thấy ống 1 xuất hiện tủa đục màu vàng, ống 2 dung dịch vẫn trong Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml nước cất Lắc đều rồi quan sát thấy:

Ống 1: dung dịch trong suốt

Ống 2: tủa đục

Acid hoá ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại đục như ống 2

- Phản ứng diazo hoá: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, kiềm hoá bằng dung

dịch NaOH 10%, đun cách thuỷ đến sôi rồi để nguội, thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu đỏ

e Định tính saponin:

- Khả năng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm lớn 0,1 gam bột dược liệu, thêm 5 ml nước

Lắc mạnh theo chiều dọc trong 1 phút (30 lần lắc) Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt Nếu lớp bọt bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có saponin

- Phản ứng Salkowski: Cho 2 gam bột dược liệu vào ống nghiệm, thêm 10 ml ethanol

90%, đun sôi cách thuỷ, lọc nóng Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm nhỏ,

mặt phân cách xuất hiện màu đỏ hoặc tím đỏ, lắc thấy đồng nhất

f Định tính anthranoid:

- Phản ứng Borntraeger:

Cân khoảng 2 gam bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 10 ml

bình gạn dung tích 50 ml Để nguội Thêm 5 ml cloroform, lắc nhẹ, gạn bỏ lớp nước, giữ lớp cloroform để làm phản ứng

Lấy 1 ml dịch chiết cloroform, cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1 ml dung dịch NaOH 10% Lắc nhẹ Phản ứng dương tính nếu lớp kiềm chuyển sang màu đỏ

g Định tính tanin:

Cân khoảng 5 gam bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 50 ml nước cất, đun sôi cách thuỷ 20 phút, lọc nóng Dịch lọc để nguội làm các phản ứng định tính tanin như sau:

đen

- Phản ứng với dung dịch chì acetat 10%: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước,

thêm 2-3 giọt dung dịch chì acetat 10% Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa bông

- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước,

thêm 2-3 giọt dung dịch gelatin mới pha Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa bông trắng

h Định tính đường khử:

Cân khoảng 5 gam bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 50 ml nước cất, đun sôi cách thuỷ 20 phút, lọc nóng Dịch lọc để nguội, lấy 2 ml cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml thuốc thử Fehling A và 0,5 ml thuốc thử Fehling B, đun cách thuỷ

10 phút Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa đỏ gạch

i Định tính acid hữu cơ:

Cân khoảng 5 gam bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 50 ml nước cất, đun sôi cách thuỷ 20 phút, lọc nóng Dịch lọc để nguội, lấy 3 ml cho vào ống

j Định tính polysaccharide:

Cân khoảng 5 gam bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 50 ml nước cất, đun sôi cách thuỷ 20 phút, lọc nóng Dịch lọc để nguội, lấy 3 ống nghiệm lớn, cho vào mỗi ống:

Ống 1: 3 ml dịch lọc và 5 giọt thuốc thử Lugol

Ống 2: 3 ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol

2.3.2.2 Chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn

Theo phương pháp chiết các phân đoạn theo độ phân cực tăng dần của dung môi

- Thân cây được cắt nhỏ, sấy khô và được xay thô, sau đó được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol; cất thu hồi dung môi được cắn, hòa cắn vào

nước, lần lượt lắc phân đoạn với dung môi có độ phân cực tăng dần (hexane; buthanol; ethyl acetate; nước) Cất thu hồi dung môi các phân đoạn thu được cắn n- hexane (cắn Hexane); cắn ethyl acetate (cắn EtOAc); cắn n-buthanol (cắn BuOH);

Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn

2.3.2.3 Phân lập các hợp chất chính

Các phân đoạn được phân lập bằng sắc ký cột silica gel pha thường (Merck), sắc

ký cột silica gel pha đảo RP-18, cột Sephadex LH-20 Sắc ký lớp mỏng được thực hiện

theo dõi vết các chất từ các phân đoạn Sắc ký đồ được quan sát dưới đèn tử ngoại ở

ethanol

a Sắc ký cột (CC)

Nguyên tắc: Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các thành

phần trong mẫu với hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất rửa giải, pha tĩnh

là chất hấp phụ dạng bột mịn được nhồi trong cột thủy tinh Có thể triển khai liên tục với các hệ dung môi khác nhau có độ phân cực thay đổi từ yếu đến mạnh Chất nhồi cột

là silica gel pha thường hoặc silica gel pha đảo

Dược liệu

- Chiết với ethanol 96%, 3 lần x 4 giờ/ lần

- Thu hồi dung môi

Cắn chiết ethanol

- Phân tán trong nước

- Lắc với n-hexan (3 lần)

Phân đoạn nước

- Thu hồi dung môi

Phân đoạn nước

- Thu hồi dung môi

- Lắc với ethyl acetat (3 lần)

 Cột thủy tinh: chọn cột thủy tinh thành dày thích hợp, chiều dài cột gấp 3 lần thể tích silica gel cần thiết cho quá trình phân lập

 Pha tĩnh: lựa chọn pha tĩnh phụ thuộc vào độ phân cực của mẫu cần tách

 Phương pháp nạp cột và đưa mẫu lên cột:

Hạt silica gel được nạp vào cột theo phương pháp nạp cột ướt sử dụng hỗn hợp dung môi chính là pha động để rửa giải Lựa chọn pha động rửa giải căn cứ vào bản mỏng sắc ký Mẫu phân lập được đưa lên cột bằng cách phân tán mẫu trong silica gel, sau đó, làm khô silica gel, nghiền mịn rồi đưa lên cột

 Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa được hứng bằng ống thủy tinh Dịch rửa giải trong các ống được gom lại dựa vào kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng

b Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Được sử dụng để thăm dò hệ dung môi tách và theo dõi quá trình rửa giải

Nguyên tắc: dựa trên cơ chế hấp phụ Chất phân tích sau khi chấm lên bản mỏng

sẽ di chuyển trên một lớp chất hấp phụ mịn, theo một chiều nhất định Quá trình chạy sắc ký phụ thuộc vào hệ dung môi pha động và khả năng hấp phụ của thành phần trong chất phân tích sẽ tạo ra các vết sắc ký ở các vị trí khác nhau

 Bản mỏng: sắc ký TLC được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn pha thường

 Hiện màu bản mỏng: sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 và 365 nm hoặc bản mỏng được phun dung dịch acid sulfuric 10% sau đó sấy nóng bản mỏng ở 110 độ C trong khoảng 5 - 10 phút

2.3.2.4 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa vào các tính chất hóa lý (trạng thái, màu sắc, độ quay cực, ) và dữ liệu phổ khối (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt

các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các tài liệu đã công bố

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật

3.1.1 Đặc điểm thực vật mẫu nghiên cứu

Cây gỗ nhỏ, cao khoảng 2-3m Rễ cọc ăn sâu xuống đất, có nhiều rễ phụ Thân

gỗ phân nhánh từ gốc; thân già có màu nâu đường kính 4-6 cm, thân non màu xanh đậm, đường kính từ 0,8-1,2 cm, có đốm trắng nhỏ; bề mặt thân có nhiều nốt sần; có sẹo dạng nhẫn là vết tích của bẹ lá sau khi rụng

Lá kép lông chim 2 lần dài 18-36 cm; cuống lá dài 12-20 cm có bẹ lá dài 1,5-2

cm ôm lấy thân, mặt ngoài màu xạnh đậm có nốt sần, mặt trong màu xanh nhạt; ở mấu đầu tiên của lá kép, có 2-5 nhánh Lá chét 22 đến 32; cuống dài 1-3 cm, đường kính 0,1-0,2 cm, cuống có cánh rộng khoảng 0,1-0,2 cm mỗi bên; phiến lá màu xanh đậm, hai mặt đều nhẵn, hình dạng đa dạng: hình gần tròn, hình gốc lệch, ngọn lá chia 2 thùy hoặc

xẻ sâu thành 2-3 thùy đều hoặc không đều nhau, kích thước 2-6 cm × 2-6 cm; gốc lá thường tròn hoặc hơi tù; gân lá hình mạng có 2-5 gân chính xuất phát từ gốc, nổi rõ 2

mặt; mép lá có răng thưa cách nhau 0,5 đến 1 cm (Hình 3.1)

Hình 3.1 Đặc điểm thực vật của mẫu Đinh lăng răng

(Ghi chú: 1a Toàn cây; 1b Rễ cây; 1c Gốc cây; 1d Hình thái thân từ già đến non; 2a

Bẹ lá; 2b, 2c, 2d, 2e Lá kép lông chim; 2f Hình thái lá chét; 2g Mặt dưới lá 2h Mặt

trên lá; 2i Mép lá.)

3.1.2 Xác định tên khoa học của cây Đinh lăng răng

Qua phân tích những đặc điểm hình thái về thực vật của Đinh lăng răng thu được tại huyện Tiền Hải - Thái Bình, đồng thời kết hợp so sánh với các tài liệu tham khảo

phân loại thuộc chi Đinh lăng (Polyscias) [9], [27], [44] (Bảng 3.1.) và sự giúp đỡ của

Th.S Nghiêm Đức Trọng (Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội), mẫu

nghiên cứu được giám định có tên khoa học là Polyscias guilfoylei (W.Bull) L.H.Bailey cv quinquefolia (Phụ lục 1.)

Bảng 3.1 Khóa phân loại chi Polyscias [44] và thứ trồng trọt [27]

1b Lá kép lông chim 1 hoặc 2 lần

2a Hoa dạng đầu, không có cuống; cuống lá có phần

bẹ ngắn, không bọc quanh hoặc có cánh

P nodosa

2b Hoa dạng tán, có cuống nhỏ rõ ràng; cuống lá có

bẹ ôm quanh thân, gốc lá có cánh

3a Lá chét 1-5, bẹ lá hình elip rộng tới hình bầu

dục hoặc hình thận, đỉnh lá tròn, gốc lá phẳng hoặc tròn (hiếm khi kiểu cắt tròn)

P scutellaria

3b Lá chét 5-15, bẹ lá hình elip tới hình trứng,

đỉnh và gốc lá nhọn hoặc nhọn hoắt

4b Mép lá chét hình răng cưa sắc nét P.guilfoylei

Các thứ của loài Polyscias guilfoylei [43]

1 Lá chét không đều và nông đến thùy sâu, rìa xanh

2 Lá chét 5 thùy, giống như kiểu cây sồi (Quercus) cv quercifolia

2’.Lá chét nhiều thùy, giống như cần tây (Apium) cv quinquefolia

1’ Lá chét mép răng cưa, nông hoặc xẻ rất sâu, rìa

trắng

3.1.3 Đặc điểm vi học rễ, thân, lá của cây Đinh lăng răng (Polyscias guilfoylei cv quinquefolia)

vỏ (Hình 3.2)

Hình 3.2 Vi phẫu rễ của Đinh lăng răng

(Ghi chú: 1 Bần; 2 Tinh thể calci oxalat; 3 Mô mềm vỏ; 4 Ống tiết, 5 Libe sơ cấp;

6 Libe thứ cấp; 7 Tia ruột; 8 Gỗ thứ cấp; 9 Mô mềm ruột.)