Nghiên cứu phân biệt một số dược liệu chứa berberin ở Việt Nam

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 3.7 SKĐ alcaloid của 5 mẫu: Hoàng liên, Vàng đắng, Hoàng bá, Hoàng đằng, Berberin đối chiếu với hệ dung môi: n-butanol : ethyl acetat : acid formic : nước 33 Hì

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

- -

KHƯƠNG NGUYỄN LƯU LY

NGHIÊN CỨU PHÂN BIỆT MỘT SỐ DƯỢC LIỆU CHỨA BERBERIN

Ở VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

KHƯƠNG NGUYỄN LƯU LY

Mã sinh viên: 1401389

NGHIÊN CỨU PHÂN BIỆT MỘT SỐ DƯỢC LIỆU CHỨA BERBERIN

Ở VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn :

1 PGS.TS Nguyễn Viết Thân

2 NCS Nguyễn Thị Thu Huyền

Nơi thực hiện:

Bộ môn Dược liệu

HÀ NỘI - 2019

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự hướng dẫn

và giúp đỡ của thầy cô, gia đình và bạn bè

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới

PGS.TS Nguyễn Viết Thân và NCS Nguyễn Thị Thu Huyền, hai người thầy đã trực

tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị đang công tác tại Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài

Tôi cũng xin cảm ơn NCS Nguyễn Thanh Tùng, DS Nguyễn Văn Phương, các

bạn sinh viên đang nghiên cứu tại bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình làm đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể thầy cô giáo và cán bộ trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình chỉ bảo và mang lại cho tôi những kiến thức cùng kinh nghiệm quý báu trong suốt những năm học tập và nghiên cứu khoa học tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn và sự yêu thương tới gia đình, bạn bè, những người đã luôn ở bên động viên và là chỗ dựa tinh thần cho tôi những lúc khó khăn trong học tập cũng như trong cuộc sống

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019 Sinh viên

Khương Nguyễn Lưu Ly

MỤC LỤC

DANH MỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ………1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 BERBERIN 2

1.1.1 Cấu trúc hóa học 2

1.1.2 Tính chất vật lý, hóa học 2

1.1.2.1 Tính chất vật lý 2

1.1.2.2 Tính chất hóa học 3

1.1.3 Tác dụng dược lý và ứng dụng 3

1.2 CÁC DƯỢC LIỆU CHỨA BERBERIN 5

1.2.1 Hoàng liên 5

1.2.2 Vàng đắng 7

1.2.3 Hoàng bá 9

1.2.4 Hoàng đằng 12

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 14

2.1.1.Đối tượng nghiên cứu 14

2.1.2 Hóa chất 14

2.1.3 Máy móc và dụng cụ nghiên cứu 14

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.2.1 Nội dung nghiên cứu 15

2.2.1.1 Mô tả đặc điểm cảm quan 15

2.2.1.2 Nghiên cứu đặc điểm hiển vi 15

2.2.1.3 Định tính thành phần hóa học 15

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.2.1 Mô tả đặc điểm cảm quan 15

2.2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm hiển vi 15

2.2.2.3 Định tính thành phần hóa học 16

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 23

3.1.1 Nghiên cứu đặc điểm cảm quan 23

3.1.1.1 Hoàng liên 23

3.1.1.2 Vàng đắng 23

3.1.1.3 Hoàng bá 23

3.1.1.4 Hoàng đằng 23

3.1.2 Nghiên cứu đặc điểm hiển vi 24

3.1.2.1 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu 24

a Hoàng liên 24

b Hoàng bá 25

3.1.2.2 Đặc điểm hiển vi bột dược liệu 26

a Hoàng liên 26

b Vàng đắng 26

c Hoàng bá 27

d Hoàng đằng 28

3.1.3 Nghiên cứu thành phần hóa học 29

3.1.3.1 Định tính bằng phản ứng hóa học 29

3.1.3.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 31

3.2 BÀN LUẬN 34

3.2.1 Về đặc điểm cảm quan 34

3.2.2 Về đặc điểm hiển vi 36

3.2.3 Về thành phần hóa học 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

1 KẾT LUẬN 44

2 KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ASK Protein quy định tín hiệu chết theo chương trình của tế bào

(Apoptosis Signalregulated Kinase)

HPTLC High performance thin layer chromatography

(Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao)

LDL Lipid tỷ trọng thấp (Low density lipoproteins)

MAPK Protein hoạt hóa phân bào (Mitogen activated protein kinases) MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal Inhibitory Concentration) NF-κB Yếu tố nhân κB (Nuclear factor κB)

DANH MỤC CÁC BẢNG

trang

Bảng 3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm hợp chất trong các mẫu

dược liệu nghiên cứu bằng phản ứng hóa học 30-31

Bảng 3.2

Kết quả phiên giải sắc ký đồ của các mẫu nghiên mẫu khai triển trong hệ dung môi: n-butanol : ethyl acetat : acid formic : nước = 3:5:0,5:0,2

32-33

Bảng 3.3

Kết quả phiên giải sắc ký đồ của các mẫu nghiên mẫu khai triển trong hệ dung môi: n-butanol : acid acetic : nước = 7:1:1,5

Bảng 3.6 Hình dạng và kích thước tinh thể Canxi oxalat của các mẫu

Bảng 3.7 Đặc điểm đặc trưng của bột các mẫu dược liệu nghiên cứu 38

Bảng 3.8 So sánh đặc điểm vi phẫu của các mẫu dược liệu nghiên cứu

trong đề tài và tiêu chuẩn trong Dược điển Việt Nam V 39

Bảng 3.9 So sánh sự khác nhau của mô tả đặc điểm vi phẫu theo

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 3.7

SKĐ alcaloid của 5 mẫu: Hoàng liên, Vàng đắng, Hoàng bá, Hoàng đằng, Berberin đối chiếu với hệ dung môi: n-butanol : ethyl acetat : acid formic : nước

33

Hình 3.9 Sơ đồ tổng quát vi phẫu dược liệu Vàng đắng 40 Hình 3.10 Sơ đồ tổng quát vi phẫu dược liệu Hoàng đằng 41

ĐẶT VẤN ĐỀ

Berberin là một alcaloid có nhân isoquinolin, được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong y học cổ truyền và y học hiện đại Từ lâu, berberin đã được sử dụng để điều trị các bệnh như lỵ trực khuẩn, tiêu chảy, đau mắt, ăn uống kém tiêu Dược liệu chứa berberin thường được ngâm rượu uống, có công dụng làm giảm các triệu chứng của huyết áp cao như hoa mắt, nhức đầu, chóng mặt, đau ngang lưng Rễ sắc đặc hoặc ngâm rượu dùng để ngậm chữa đau răng Hiện nay, berberin đã được chứng minh có hiệu quảtrong điều trị các bệnh như tiểu đường, tăng huyết áp, ung thư, tăng lipid máu…[6], [25], [27], [30], [33], [39], [49], [61]

Hoạt chất berberin được phát hiện trong 150 loài thuộc nhiều họ khác nhau Ở Việt Nam có khoảng 20 loài thuộc các họ Hoàng liên (Ranunculaceae), họ Hoàng liên gai (Berberidaceae), họ Tiết dê (Menispermaceae), họ Cam (Rutaceae), họ Thuốc phiện

(Papaveracae) có chứa berberin [15] Trong đó, các loài thuộc chi Berberis L., họ

Berberidaceae là những cây thuốc quý hiếm, đã bị khai thác quá mức dẫn đến cạn kiệt nguồn nguyên liệu và được ghi trong Sách đỏ của Việt Nam [1]

Ngày nay, một số dược liệu chứa berberin tại Việt Nam chủ yếu được nhập (có nguồn gốc) từ Trung Quốc Khi nghiền thành bột rất khó phân biệt các dược liệu này, mặt khác một vài dược liệu có đặc điểm cảm quan bên ngoài khá giống nhau dẫn đến dễ

bị nhầm lẫn trong quá trình thu hái, sử dụng Do đó, việc nhận biết và phân biệt các dược liệu chứa berberin trở nên rất quan trọng Với mong muốn đưa ra một số tư liệu có thể dùng làm cơ sở để có cái nhìn tổng quát, chi tiết hơn về sự khác nhau của chúng nên

chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân biệt một số dược liệu chứa Berberin ở Việt Nam” với hai mục tiêu nghiên cứu:

1 So sánh đặc điểm cảm quan, đặc điểm hiển vi của các mẫu nghiên cứu

2 So sánh thành phần hóa học của các mẫu nghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 BERBERIN

- Tên thường gọi: Berberin

- Dạng muối trong Dược điển Việt Nam V: Berberin clorid dihydrat [7]

- Dạng muối sulfat dễ tan trong nước tỷ lệ 1/150 [45], tan trong ethanol

- Dạng muối acetat và phosphat tan tốt hơn trong nước tỷ lệ 1/30 [45]

- Dưới ánh sáng tử ngoại UV, berberin phát huỳnh quang màu vàng đậm [28]

 Nhiệt độ nóng chảy:

- Berberin (base): 144oC

- Berberin clorid dihydrat: 204-206oC

1.1.2.2 Tính chất hóa học

* Phản ứng trao đổi gốc muối

Berberin tự do có tính chất như một base yếu, có khả năng tạo muối bằng cách thay thế nhóm OH, tạo muối berberin không giống như các alcaloid khác mà tạo muối giống hydroxyd kim loại (loại đi phân tử nước)

* Phản ứng khử nối đôi của vòng isoquinolin

Liên kết đôi C=N của berberin dễ tham gia phản ứng cộng nucleophin Ngoài ra, nhân thơm chứa N có thể mất mạch kép khi có tác nhân khử cho các hydro alcaloid không màu

1.1.3 Tác dụng dược lý và ứng dụng

Các tác dụng đã được chứng minh (trên lâm sàng) của berberin bao gồm:

 Tác dụng kháng khuẩn: Berberin đã được chứng minh có tác dụng chống lại vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh, virus, giun sán Berberin có khả năng ức chế các vi

Streptococcus mutans, Bacillus anthracis, Streptococcus suis và Enterococcus faecium [26], [29], [47], [53] và một số vi khuẩn Gram âm như Actinobacillus pleuropneumoniae [32], Shigella dysenteriae [35] và Escherichia coli [23] Trong đó, Mycobacterium tuberculosis, Trichophyton mentagrophytes và một số chủng Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Cryptococcus neoformans biểu hiện mức độ nhạy cảm vừa

phải với berberin [30] Về khả năng chống nấm, berberin thể hiện tác dụng ức chế yếu

đối với Candida albicans khi sử dụng đơn độc; trong khi kết hợp với fluconazole, giá

trị MIC giảm mạnh xuống 14,27 µM [31]

 Tác dụng hạ đường huyết: Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng berberin có hiệu quả

hạ đường huyết tương đương với metformin, cơ chế tác dụng của berberin trong hạ đường huyết là ức chế enzym aldose reductase, qua đó làm giảm glucose máu và ngăn ngừa sự kháng insulin [19], [20]

 Tác dụng giảm mỡ máu: Berberin làm giảm mạnh hàm lượng cholesterol, LDL cholesterol, triglycerid trong máu và làm giảm xơ vữa động mạch Berberin có cơ chế tác dụng khác biệt so với nhóm statin cho nên không gây ra các tác dụng không mong muốn điển hình của statin [25], [34]

 Tác dụng trên thần kinh: Berberin có thể ngăn chặn và trì hoãn quá trình tiến triển của bệnh Alzheimer nhờ tác dụng làm giảm các yếu tố nguy cơ như tăng huyết áp, đái tháo đường và rối loạn lipid máu đồng thời cải thiện hội chứng chuyển hóa liên quan đến bệnh Alzheimer Berberin có thể làm giảm xơ vữa động mạch, làm chậm quá trình stress oxy hóa và viêm dây thần kinh của bệnh Alzheimer Tuy nhiên, một số nghiên cứu lại chỉ ra rằng berberin làm tăng sự phát triển của xơ vữa động mạch và hình thành các tế bào bọt Do đó cần nghiên cứu thêm để làm rõ vai trò của berberin trong bệnh Alzheimer [24] Ngoài ra, berberin còn có tác dụng chống trầm cảm; tác dụng chống co giật của berberin có thể được ứng dụng trong điều trị bệnh động kinh [22]

 Tác dụng chống ung thư: Các nghiên cứu đã cho thấy berberin có khả năng ức chế

sự tăng sinh của các tế bào khối u thông qua tương tác với các đích theo nhiều cơ chế khác nhau Berberin có thể làm thay đổi biểu hiện của gen gây ung thư và các gen liên quan đến gây ung thư bằng cách điều hòa hoạt động của protein hoạt hóa phân bào (MAPK), berberin kích hoạt sự phosphoryl hóa gen ức chế khối u p53 trong các tế bào

cơ trơn mạch máu [39] Ngoài ra, berberin còn có tác dụng ức chế sự biểu hiện gen và protein của N-acetyltransferase và tác dụng này phụ thuộc vào liều và thời gian trong

ống nghiệm [40] Berberin tác động vào enzym topoisomerase I và ức chế sự di chuyển của các chuỗi DNA bị lỗi thông qua một cơ chế tương tự như tác nhân chống ung thư camptothecin và là chất độc với topoisomerase I [49] Hơn nữa, berberin tương tác với DNA và RNA, hình thành các phức hợp ADN - berberin hay ARN - berberin là cơ sở cho việc thể hiện tác dụng chống ung thư của chất này Berberin hydroclorid làm giảm sản xuất protein sốc nhiệt 27 (HSP27) trong tế bào khối u của ung thư tử cung (HeLa S3), phổi (H69), dạ dày (KATO III), đại tràng (COLO 205), tuyến tiền liệt (DU145) và thần kinh (SK-N-MC ) [33] Do đó, berberin hydroclorid có lợi cho việc ngăn ngừa sự tiến triển ác tính của các khối u

 Các tác dụng khác:

Berberin liều thấp có tác dụng kích thích tim, làm giãn mạch vành; liều cao ức chế

hô hấp làm tê liệt trung tâm hô hấp trong khi tim vẫn đập Berberin còn có tác dụng hạ nhiệt, gây tê, lợi mật, Trong cơ thể, berberin được khử hóa thành tetrahydroberberin

có tác dụng an thần, giãn cơ và hạ huyết áp nhẹ [6] Không những thế berberin còn ức chế co thắt cơ trơn, ức chế nhịp nhanh thất, giảm viêm, tăng số lượng tiểu cầu ở bệnh nhân giảm tiểu cầu nguyên phát và thứ phát, kích thích bài tiết mật và tăng thải bilirubin Nhiều bằng chứng cũng cho thấy berberin dùng đường tiêm tĩnh mạch có thể đóng một vai trò trong việc ngăn chặn tái phát tình trạng nhịp nhanh thất và tử vong đột ngột sau khi bị tổn thương do thiếu máu cơ tim [30]

1.2 CÁC DƯỢC LIỆU CHỨA BERBERIN

1.2.1 Hoàng liên

1.2.1.1 Nguồn gốc, tiềm năng và trữ lượng

Thân rễ đã phơi hay sấy khô của cây Hoàng liên chân gà (Coptis teeta Wall.) và

một số loài Hoàng liên khác (Coptis teetoides C.Y.Cheng., Coptis chinensis Fronclo.),

họ Hoàng liên (Ranunculaceae) [17]

Hiện nay, Hoàng liên thường được sử dụng như một loại thuốc chính trong các bài cổ truyền của Trung Quốc Hoàng liên được xử lý bằng 28 phương pháp trước khi

sử dụng trên lâm sàng, trong đó, một số phương pháp được lấy từ sách y học cổ đại của

Trung Quốc Ngày nay, Hoàng liên thường được chế biến với rượu vang, Zingiber docinale Rosc (Zingiberaceae) và Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth (Rutaceae) để có

các công dụng khác nhau.Hoàng liênđã được sử dụng dưới dạng bột, thuốc viên hoặc

loài đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam Hoàng liên cũng được trồng nhiều tại Trung Quốc do đó vị thuốc chủ yếu còn phải nhập [17]

1.2.1.2 Đặc điểm cảm quan

Thân rễ là những mẩu cong queo, dài 3 cm trở lên, rộng 0,2 cm đến 0,8 cm, có nhiều đốt khúc khuỷu và phân nhiều nhánh Mặt ngoài màu vàng nâu hay vàng xám, mang vết tích của rễ con và của cuống lá Chất cứng rắn, vết bẻ ngang không phẳng, phần gỗ màu vàng tươi, tia ruột có lỗ rách, phần vỏ và ruột màu vàng đỏ, cũng có khi rỗng Không mùi, vị rất đắng và tồn tại lâu [8]

1.2.1.3 Thành phần hóa học

Thân rễ Hoàng liên có 5-8% alcaloid toàn phần trong đó chủ yếu là berberin

C20H19NO3 Ngoài ra còn có palmatin C21H23NO3, coptisin C19H15NO3, worenin

C21H15NO4, columbamin C20H20NO4 (OH), jatrorrhizin, magnoflorin, epiberberin… [6], [14], [17], [42]

Ngoài alcaloid, trong thân rễ Hoàng liên còn có tinh bột, các acid hữu cơ như acid ferulic [6], lignans, phenylpropanoids, flavonoid, sacarid và steroid [42]

1.2.1.4 Tác dụng dược lý

Ngoài các tác dụng dược lý của berberin, Hoàng liên còn được chứng minh có thêm một số tác dụng như:

 Tác dụng chống vi khuẩn và ký sinh trùng

Mặc dù ban đầu Hoàng liên không có tác dụng ức chế đối với một số vi khuẩn như

Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis và Proteus Vulgaris, tuy nhiên sau khi chế biến với gừng, Hoàng liên lại thể hiện rõ tác dụng này, đặc biệt với Pseudomonas aeruginosa [58] Tác dụng kháng khuẩn của các alcaloid của Hoàng liên đối với vi khuẩn

Gram dương mạnh hơn so với vi khuẩn Gram âm, điều này có thể được giải thích bởi

sự khác nhau về cấu trúc màng tế bào của hai nhóm vi khuẩn [60] Hoàng liên không có

tác dụng đối với ký sinh trùng sốt rét nhưng tác dụng rõ rệt với Leishmania tropica và Leishmania espundia [14]

 Tác dụng trên đường tiêu hóa

Hoàng liên có tác dụng kích thích tiêu hóa, điều trị một số bệnh trên đường tiêu hóa như viêm dạ dày, viêm ruột và lỵ [6], [14]

 Tác dụng trên tim và tuần hoàn

Hoàng liên có tác dụng hạ huyết áp [6], [14] và làm giảm đáng kể các yếu tố nguy

cơ chính của các bệnh tim mạch như ngăn ngừa xơ vữa động mạch, giảm lipid máu, phòng ngừa đái tháo đường

Hoàng liên được dùng để điều trị các bệnh:

- Chữa tiêu hóa kém, viêm loét dạ dày và ruột: Ngày dùng 3 - 4 g dạng thuốc sắc hoặc cao lỏng [6], [17]

- Chữa lỵ amip và lỵ trực khuẩn: Ngày dùng 3 - 6 g chia thành 3 lần, uống trong

7-15 ngày, dưới dạng thuốc sắc [6], [14], [17]

- Chữa bệnh sốt nóng nhiều, vật vã mất ngủ [6], [14]

- Chữa bệnh trĩ [6], [17]

- Chữa viêm tai giữa có mủ: Dùng dung dịch Borat – Hoàng liên: Hoàng liên 10 g, acid boric bột 3 g thêm nước cất, đun sôi 1 giờ, lọc, thêm nước cất cho đủ 100 ml, đem tiệt khuẩn rồi nhỏ vào tai mỗi ngày 2 - 3 lần [6]

- Dịch chiết Hoàng liên nhỏ vào mắt chữa đau mắt đỏ: Dùng dung dịch Hoàng liên

5 - 30% nhỏ vào mắt [6], [14], [17]

- Chữa thổ huyết, chảy máu cam, chữa mụn nhọt có mủ, nhiễm khuẩn [6], [14], [17]

- Chữa ngộ độc do ba đậu, khinh phấn [14]

1.2.2 Vàng đắng

1.2.2.1 Nguồn gốc, tiềm năng và trữ lượng

Thân hoặc rễ đã phơi hoặc sấy khô của cây Vàng đắng [Coscinium fenestratum (Gaertn.) Colebr., Syn Menispermum fenestratum Gaertn.], họ Tiết dê

(Menispermaceae) [8] Cây mọc hoang ở vùng núi Đông Nam Bộ, Nam Trung Bộ, Tây Nguyên của Việt Nam và ở một số nước nhiệt đới khác [17]

Vàng đắng có hàm lượng berberin trong thân và rễ cây cao, nguồn nguyên liệu nhiều, dễ thu hái, có ở nhiều vùng của Việt Nam, biên giới Việt Lào và Campuchia Do

đó, hiện nay Vàng đắng được đưa vào làm nguồn nguyên liệu chính để chiết xuất berberin

1.2.2.2 Đặc điểm cảm quan

Đoạn thân hình trụ, đường kính 1,5 - 6 cm, dài ngắn không nhất định, mặt ngoài màu vàng, có vết bạc loang lổ, có đoạn có bướu phình to tròn, có vết lõm tròn do vết tích của cành non và cuống lá, có vết khía và nứt dọc nhỏ, đôi chỗ bong mất lớp bần Đoạn rễ hình trụ, màu vàng sẫm, không có bướu Mặt cắt ngang có lớp vỏ mỏng màu nâu nhạt, phần gỗ màu vàng có tia tủy hình nan hoa bánh xe, lỗ chỗ có nhiều chấm nhỏ (mạch lỗ) Không mùi, vị đắng [6]

Người dân những vùng có Vàng đắng mọc hoang thường dùng thân và rễ cây này

để làm thuốc nhuộm Ngoài ra, Vàng đắng còn được sử dụng như vị thuốc chữa sốt, sốt rét, lỵ và đau mắt Dạng bào chế thường là thuốc bột hoặc thuốc viên Liều dùng từ 4 -

6 g/ngày

Dùng làm nguyên liệu để chiết berberin Berberin clorid dùng để chữa lỵ, ỉa chảy, đau mắt; dùng đường uống với liều 0,02 g-0,20 g/ngày dưới dạng thuốc viên Người ta còn dùng để chữa bệnh về gan, mật, vàng da, ăn uống khó tiêu

Ngoài ra, dạng dung dịch 0,5% đến 1% dùng nhỏ mắt để chữa đau mắt hoặc rửa mắt [6], [14], [17]

1.2.3 Hoàng bá

1.2.3.1 Nguồn gốc, tiềm năng và trữ lượng

Hoàng bá là vỏ thân, vỏ cành già cạo sạch vỏ ngoài phơi hay sấy khô của cây

Quan hoàng bá Phellodendron amurense Rupr hoặc của cây Xuyên hoàng bá Phellodendron amurense Rupr var sachalinense Fr Schmidt đều thuộc họ Cam

(Rutaceae)

Hoàng bá được trồng ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Viễn Đông của Nga

Vị thuốc này cũng được trồng ở một số vùng tại Việt Nam [50] Tuy nhiên, dược liệu này chủ yếu được nhập từ Trung Quốc.Quan hoàng bá được xếp vào cấp độ thứ hai của thực vật có nguy cơ tuyệt chủng tại Trung Quốc Quan Hoàng bá và Xuyên Hoàng bá

có thể được sử dụng thay thế cho nhau khi ứng dụng trên lâm sàng vì cả hai loài đều có thành phần hóa học tương tự.Hoàng bá đã được xem là một trong 50 loại thảo dược cơ bản trong thảo dược học Trung Quốc, có tác dụng điều trị toàn diện và dùng làm nguyên liệu chiết xuất berberin [50]

1.2.3.2 Đặc điểm cảm quan

Vỏ thân màu vàng nâu, dày 0,3 cm đến 0,5 cm, dài 20 cm đến 40 cm, rộng 3 cm đến 6 cm Mặt ngoài còn sót lại lớp bần màu nâu đất, có những vết lõm sần sùi và rãnh dọc, mặt trong màu nâu nhạt, có nhiều vết nhăn dọc nhỏ, dài, vết bẻ lởm chởm, chất rắn, nhẹ, màu vàng rơm [TLTK]

Vỏ cành dày 0,15 cm đến 0,20 cm, mảnh dài cuộn lại thành hình ống Mặt ngoài

có lớp thụ bì màu nâu xám, khi bong ra để lộ lớp bần màu nâu sẫm, trên có lấm tấm nhiều vết lỗ vỏ, mặt trong màu nâu nhạt hơn, có những vết nhăn nhỏ, dọc Chất giòn, dễ

bẻ, mặt bẻ lởm chởm, để lộ mô mềm màu vàng rơm [8]

1.2.3.3 Thành phần hóa học

Trong vỏ Hoàng bá có khoảng 1,6% berberin, một lượng nhỏ phellodendrin (C20H23O4N+), magnoflorin (C20H24O4N+), jatrorrhizin (C20H20O4N+), palmatin (C21H22O4N+), candixin (C11H18ON+), menisperin (C21H26O4N) Ngoài ra trong vỏ Hoàng bá còn có những chất có tinh thể không chứa nito: obakullacton (C26H30O8) (limonin), obakunon (C26H30O7); hợp chất sterolic: 7 – dehydrostigmasterol, chất béo… Trong vỏ xuyên hoàng bá chứa khoảng 3% berberin [6], [14]

1.2.3.4 Tác dụng dược lý

Ngoài các tác dụng dược lý của berberin, Hoàng bá còn được chứng minh có thêm một số tác dụng như:

 Tác dụng kháng khuẩn

Dịch chiết Hoàng bá có tác dụng tốt hơn trên vi khuẩn Gram dương so với vi khuẩn

gram âm Vi khuẩn nhạy cảm nhất với Hoàng bá là Streptococcus pyogenes [55] Đối

với các vi khuẩn trong khoang miệng, Hoàng bá có tác dụng ức chế mạnh vi khuẩn

Porphyromonas gingivalis; ức chế vừa phải Streptococcus mutans; ức chế một phần Streptococcus sanguis Tuy nhiên Hoàng bá không có tác dụng ức chế đối với Streptococcus gây ra viêm màng phổi [57].Vi khuẩn Mycoplasma hominis gây nhiễm

trùng đường sinh dục và đường hô hấp trên ở người rất nhạy cảm với Hoàng bá

 Tác dụng bảo vệ dạ dày

Các alcaloid trong Hoàng bá có khả năng làm giảm diện tích các vết loét Không những thế tác dụng chống loét của tất cả các alcaloid này có thể vượt trội hơn so với omeprazole Bên cạnh đó, các alcaloid còn làm tăng đáng kể mức độ tăng trưởng biểu

bì [54] Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng Hoàng bá có thể bảo vệ niêm mạc dạ dày thông qua các hợp chất sulfhydryl nội sinh và các hợp chất nhạy cảm với diethyl dithiocarbamat [51]

 Tác dụng chống ung thư

Theo tài liệu nghiên cứu, có 3 hợp chất trong Hoàng bá được phát hiện có tác dụng

ức chế 3 loại tế bào ác tính bao gồm các dòng tế bào ung thư bạch cầu K562 và HEL, dòng tế bào ung thư vú MDA và dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 [50] Có 9 hợp chất của Hoàng bá có tác dụng hiệu quả nhất trong điều trị ung thư tiền liệt tuyến, bao gồm: magnoflorin-O-glucuronide, phy-droxybenzyl)-6, 7-dihydroxy-N-methyl tetrahydro isoquinolin-7-O-p-D-glucopyranosid, magnoflorin, menisperin-O-glucuronide, menisperin, berberin, Jatrorrhizin, obaculacton, andobacunon [38] Polysacarid từ dịch chiết nước của Xuyên hoàng bá có tác dụng kích hoạt tế bào miễn dịch của cơ thể như NK cell là một tế bào miễn dịch đặc hiệu có chức năng nhận biết và tiêu diệt tế bào ung thư [46]

 Tác dụng chống oxy hóa

Hoạt tính chống oxy hóa của Quan Hoàng bá tỷ lệ thuận với nồng độ chiết xuất của nó Bên cạnh đó, dịch chiết ethanol của Hoàng bá thể hiện tác dụng chống oxy hóa

tốt hơn dịch chiết nước do có nồng độ các phenolic và flavonoid cao hơn [55] Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng phellodendrin từ Hoàng bá có thể đóng vai trò chống oxy hóa bằng cách điều chỉnh con đường AKT/NF-𝜅B trong phôi cá ngựa Ngoài ra, phellodendrin có thể hoạt hóa AKT và NF-𝜅B, IKK và COX-2, điều đó dẫn đến sự điều hòa dương của các protein chống oxy hóa [37]

 Tác dụng khác

Hoàng bá kích thích phát triển xương theo chiều dọc [36] Ngoài ra, Hoàng bá còn

có thể kích hoạt hệ thống fibrinogen nên có tác dụng cầm máu [41] Magnoflorin và phellodendrin có trong Hoàng bá có thể ức chế đáp ứng miễn dịch [43]

1.2.3.5 Công dụng và liều dùng

- Thuốc bổ đắng, giúp kích thích tiêu hóa Hoàng bá được dùng trong điều trị kiết

lỵ, tiêu chảy, hoàng đản do viêm ống mật, viêm đường tiết niệu, đái đục, trĩ, đau mắt, viêm tai, di tinh, phụ nữ khí hư, sốt, ra mồ hôi trộm Ngày dùng 6 - 12g dạng thuốc sắc hay thuốc bột [6], [14]

- Điều trị các bệnh viêm màng não, viêm phổi, viêm tai giữa có mủ, viêm xoang hàm mạn tính [17]

- Điều trị viêm âm đạo do trùng roi, viêm gan cấp tính, sốt, bụng trướng, đau vùng gan, tiểu tiện đỏ Ngoài ra, Hoàng bá còn có công dụng điều trị cao huyết áp, suy nhược tâm thần Liều dùng dùng 4 - 16g/ngày, dạng thuốc sắc, rượu thuốc [17]

- Dùng ngoài để rửa mắt, đắp chữa mụn nhọt, vết thương [6], [14]

- Dùng làm nguyên liệu chiết berberin [6], [14]

- Đông y coi Hoàng bá có vị đắng, lạnh, không độc có tác dụng tả tướng hỏa, thanh thấp nhiệt

Một số bài thuốc có Hoàng bá:

Kiện vị kém tiêu hóa, hoàng đản do viêm ống mật: Hoàng bá 12 g, chi tử 12 g, cam

thảo 6 g, nước 600 ml Sắc còn 200 ml Chia 3 lần uống trong ngày

Người có thai đi lỵ: Hoàng bá tẩm mật sao cho cháy, tán nhỏ Dùng một củ tỏi

nướng chín, bóc vỏ giã nát thêm bột Hoàng bá vào viên bằng hạt ngô Ngày uống 3 lần mỗi lần 30 - 40 viên

Lở miệng, loét lưỡi: Hoàng bá chẻ nhỏ, ngậm Nước có thể nuốt hay nhổ đi

1.2.4 Hoàng đằng

1.2.4.1 Nguồn gốc, tiềm năng và trữ lượng

Vị thuốc là thân già và rễ phơi khô của cây Hoàng đằng (Fibraurea recisa Pierre hay F.tinctoria Lour.), họ Tiết dê (Menispermaceae) [17] Chi Fibraurea ở châu Á và ở Việt Nam có 2 loài Fibraurea tinctoria Lour và Fibraurea recisa Pierre

Cả hai loài đều phân bố tương đối phổ biến ở khắp các vùng núi thấp (từ 1000m trở xuống) và trung du cả hai miền Nam, Bắc của Việt Nam Mức độ phân bố phong phú hơn ở các vùng núi từ Nghệ An trở vào đặc biệt các tỉnh Tây Nguyên và Đông Tây

Nguyên, Sông Bé và Tây Ninh Riêng loài Fibraurea recisa Pierre có nhiều hơn ở các

tỉnh Tây Nguyên [18].Hoàng đằngcó giá trị cả về kinh tế và khoa học, được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền.Trong tự nhiên, loài cây này trước đây rất phong phú nhưng

do khai thác không bền vững nên hiện nay có nguy cơ bị tuyệt chủng Hoàng đằng chủ yếu được xuất sang thị trường Trung Quốc

1.2.4.2 Đặc điểm cảm quan

Những đoạn thân và rễ hình trụ thẳng hoặc hơi cong, dài 10 cm đến 30 cm, đường kính 0,6 cm đến 3 cm Mặt ngoài màu nâu có nhiều vân dọc và sẹo của cuống lá (đoạn thân) hay sẹo của rễ con (đoạn rễ) Mặt cắt ngang có màu vàng gồm 3 phần rõ rệt: phần

vỏ hẹp; phần gỗ có những tia ruột xếp thành hình nan hoa bánh xe; phần ruột ở giữa tròn

và hẹp Thể chất cứng, khó bẻ gãy, vị đắng [8]

1.2.4.3 Thành phần hóa học

Hoạt chất trong Hoàng đằng là alcaloid, trong đó alcaloid chính là palmatin (chiếm tỷ lệ 1-2%) Ngoài ra còn một ít jatrorrhizin và columbamin, magnoflorin, palmatrubin [6], [14]

Ngoài ra, Irokawa và cộng sự tìm thấy ba diterpenglycosid là tenophylloloside 3, fibleucinoside 4 và fibraurinoside 5 có trong Hoàng đằng Trước đó, một số tác giả đã phát hiện được hai diterpen khác là fibleucine 1 và fibraucine 2 [14]

1.2.4.4 Tác dụng dược lý

Bên cạnh các tác dụng dược lý của berberin, Hoàng đằng còn được nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của palmatin:

Theo Phạm Duy Mai và cộng sự, palmatin trong Hoàng đằng có khả năng ức chế

tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) và phế cầu khuẩn (Streptococcus), còn đối với các loại

vi khuẩn khác (lỵ, thương hàn…) thì không thấy có tác dụng rõ rệt Tác dụng ức chế vi khuẩn của palmatin kém hơn so với các loại kháng sinh thông thường [6], [14]

1.2.4.5 Công dụng và liều dùng

Dùng làm thuốc chữa đau mắt, sốt rét, lỵ, bệnh về gan, chữa viêm ruột, tiêu chảy

và dùng làm thuốc bổ đắng Liều dùng đối với thuốc bổ đắng là 0,20-0,40 g/ngày; thuốc sắc chữa viêm ruột, tiêu chảy, lỵ dùng với liều 4-12 g/ngày [6], [14]

Làm nguyên liệu chiết palmatin Palmatin clorid chiết từ Hoàng đằng dùng chữa tiêu chảy, lỵ Dùng dưới dạng viên: người lớn uống 5 - 10 viên/ngày (0,02 g/viên), trẻ

em dùng viên 0,005 g, uống tùy theo tuổi Liều hàng ngày chia ra 2 hay 3 lần uống [6], [14]

Đơn thuốc có Hoàng đằng: Hoàng đằng tán bột làm thành viên 0,01 g Ngày uống

10 - 20 viên để chữa lỵ amip và trực trùng [14]

Có thể dùng palmatin để điều chế ra tetrahydropalmatin là một chất có tác dụng an thần [6]

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1.Đối tượng nghiên cứu

 Thu thập nhiều mẫu trên thực địa và thị trường chia thành 4 nhóm nghiên cứu: Hoàng liên, Vàng đắng, Hoàng bá và Hoàng đằng

 Mẫu Hoàng liên: Thu mua trên thị trường

 Mẫu Vàng đắng: Thu mua trên thị trường miền Trung và được cung cấp bởi Công

ty Cổ phần xuất nhập khẩu dược liệu Việt Nam

 Mẫu Hoàng bá: Thu mua trên thị trường và lấy mẫu tại Sa Pa

 Mẫu Hoàng đằng: Thu mua trên thị trường và lấy mẫu tại Lào Cai

 Cách thức lấy mẫu:

Đối với mỗi dược liệu nghiên cứu: Lấy 50 g mẫu ở từng bao gói

 Tạo mẫu đồng nhất: Mẫu sau khi lấy được trộn đều để có một mẫu đồng nhất dùng cho thử nghiệm [6]

2.1.2 Hóa chất

 Dược liệu khô: Khoảng 50 g mỗi dược liệu

 Dung môi: Ethanol 90% (2000 ml), ethanol 25% (200 ml), chloroform (1000 ml), ether dầu hỏa (80 ml), dd H2SO4 5%, dung dịch H2SO4 1N, dung dịch NH3 6N (80 ml) Ngoài ra còn có methanol, ethylacetat, n-butanol, acid acetic, acid formic và nước

 Thuốc thử: anhydrid acetic, H2SO4 đặc, TT bouchardat, TT dragendoff, TT mayer,

dd FeCl3 5%, HCl đặc, gelatin, chì acetat 10%, dung dịch NaOH 10%, dung dịch NH3đặc, dung dịch H2SO4 đặc, TT Diazo, bột Mg, acid piric, chì acetat 30%, tinh thể

Na2CO3…

 Chất đối chiếu Berberin clorid (lấy mẫu từ Viện Dược liệu)

2.1.3 Máy móc và dụng cụ nghiên cứu

- Hệ thống sắc ký bản mỏng bán tự động CAMAG (HPTLC): Máy chấm Linomat

5, buồng chụp ảnh TLC Visualizer

- Tủ sấy MEMMERT (Đức)

- Máy xay

- Bếp điện Goldsun

- Cân kỹ thuật Sartorius TE412

- Cân phân tích Precisa (xuất xứ Thụy Sỹ)

- Kính hiển vi truyền hình Camera DMLS Leica

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nội dung nghiên cứu

2.2.1.1 Mô tả đặc điểm cảm quan

2.2.1.2 Nghiên cứu đặc điểm hiển vi

- Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu

- Nghiên cứu đặc điểm hiển vi bột dược liệu

+ Phát hiện vết bằng thiết bị UV-Visualizer

2.2.2.Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Mô tả đặc điểm cảm quan

Quan sát, mô tả hình dạng, màu sắc, mùi vị, kích thước dược liệu bằng mắt thường

và chụp ảnh

2.2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm hiển vi

Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu thân rễ Hoàng liên, vỏ thân Hoàng bá đã bị cạo bỏ

Tiến hành làm vi phẫu thân rễ Hoàng liên, vỏ thân Hoàng bá đã bị cạo bỏ lớp bần theo phương pháp trong tài liệu Kiểm nghiệm Dược liệu bằng phương pháp hiển vi [16] gồm các bước:

+ Chọn mặt cắt ngang của thân rễ Hoàng liên, vỏ thân Hoàng bá mang đầy đủ đặc điểm của dược liệu

+ Làm mềm thân rễ Hoàng liên bằng phương pháp làm mềm lạnh, làm mềm vỏ thân Hoàng bá bằng phương pháp làm mềm nóng

+ Sử dụng dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay để cắt tiêu bản mẫu nghiên cứu: Cắt cốt khoai, đặt đoạn dược liệu đã làm mềm vào trong cốt, cắt và lựa chọn những lát cắt mỏng + Tẩy lát cắt dược liệu bằng Javen trong 15 phút sau đó ngâm tiếp trong Cloramin B bão hòa tới khi lát cắt trắng hoàn toàn để tẩy sạch các chất trong tế bào, chỉ giữ lại màng

tế bào và tinh thể nhằm quan sát tiêu bản dễ hơn

+ Rửa sạch bằng nước cất nhiều lần

+ Ngâm Cloralhydrat 75% trong 20 phút để tẩy tinh bột khoai còn dính trên lát cắt, tinh bột trong thân rễ Hoàng liên, vỏ thân Hoàng bá và cũng làm tiêu bản sáng hơn + Rửa lại nhiều lần bằng nước

+ Ngâm trong dung dịch acid acetic 5% để tẩy clorid của Cloramin B và Cloralhydrat 75% còn sót lại đồng thời trung hòa Javen

+ Rửa lại nước cất

+ Ngâm xanh methylen đã pha loãng trong vòng 1 phút

+ Rửa lại nhiều lần bằng nước cất

+ Ngâm đỏ carmin trong vòng 1 phút

+ Rửa sạch nhiều lần bằng nước cất

Quan sát, mô tả cấu tạo giải phẫu thân rễ Hoàng liên, vỏ thân Hoàng bá qua kính hiển vi

Chụp lại các đặc điểm cấu tạo giải phẫu đặc trưng

Khảo sát đặc điểm bột dược liệu: Mẫu nghiên cứu được cắt nhỏ, sấy khô ở nhiệt

độ 600C, tán và rây qua rây để thu được bột mịn đồng nhất Soi bột trong nước dưới kính hiển vi, xác định các thành phần trong bột dược liệu

2.2.2.3 Định tính thành phần hóa học

 Định tính bằng các phản ứng hóa học thường quy

Định tính bằng phản ứng hóa học theo tài liệu Dược liệu học [3], [4], [5], [6]

 Chuẩn bị dược liệu:

Sấy khô dược liệu ở 600C, nghiền nhỏ thành bột bằng máy xay

Tiến hành: Cân 1 g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 50ml Thêm 30 ml dung

dịch acid sulfuric 1N Đun đến sôi, để nguội, lọc dịch lọc rồi chia thành 2 phần bằng nhau:

- Phần 1 (Định tính alcaloid khác ngoài berberin): Đưa vào bình gạn dung tích 125

ml Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến PH = 9 - 10 Chiết alcaloid base bằng chloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5ml) Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng natri sulfat khan, dịch chiết choloroform đem làm phản ứng định tính Lấy một phần dịch chiết chloroform đã được chuẩn bị ở trên, đem lắc với acid sulfuric 1N hai lần, mỗi lần 5ml Gộp các dịch chiết nước

- Phần 2 (Định tính Berberin): Thêm natri clorid vào dịch lọc khuấy mạnh cho tan

hết natri clorid rồi để một thời gian cho berberin kết tủa Gạn lấy phần tủa sau đó hòa tan tủa trong ethanol 96o, lấy dịch làm phản ứng định tính

Đối với cả 2 phần sau khi thu được dịch làm phản ứng định tính, chia đều vào 4 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống nghiệm 1ml Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:

 Ống 1: Thuốc thử Mayer, phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa màu từ trắng đến vàng

 Ống 2: Thuốc thử Bouchardat, phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa nâu đến đỏ nâu

 Ống 3: Thuốc thử Dradendorff, phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa vàng cam đến đỏ

 Ống 4: Dung dịch nước bão hòa acid piric, phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa vàng

Tiến hành: Lấy 20 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 250 ml, thêm 40 ml cồn

900 Đun cách thủy sôi 5 phút Lọc nóng, dịch lọc thu được đem đun cách thủy ở 800C Gạn lấy phần dịch, bỏ phần tạp tách ra dưới đáy bình, cô cách thủy đến cắn Hòa tan cắn trong 5 ml ethanol 70%, được dịch chiết cồn, thực hiện các phản ứng định tính sau:

a Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda)

- Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết Thêm một ít bột magie kim loại (khoảng

10 mg) Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt) Để yên một vài phút, phản ứng dương tính nếu dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ

b Phản ứng với kiềm:

- Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút, đối chiếu với tờ giấy nhỏ giọt dịch chiết đối chứng thấy màu vàng của vết đậm lên rõ rệt thì phản ứng dương tính

- Phản ứng với dung dịch NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, phản ứng dương tính khi thấy dịch chiết chuyển

- Cho vào 2 ống nghiệm nhỏ mỗi ống 1ml dịch chiết cồn

+ Ống 1: thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%

+ Ống 2: để nguyên

- Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi Để nguội rồi quan sát

+ Ống 1: Trong suốt

+ Ống 2: Có tủa

- Acid hóa cả 2 ống bằng dung dịch HCl 10%, ống 1 sẽ trở lại tủa đục như ống 2

b Phản ứng với thuốc thử Diazo:

- Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10% Thêm vài giọt thuốc thử diazo (mới pha), lắc đều, đun nóng trên nồi cách thủy

trong vài phút, phản ứng dương tính khi dung dịch có màu đỏ gạch

* Định tính anthranoid

Tiến hành: Lấy khoảng 15 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 30 ml

nước cất Đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc hoặc qua một lớp bông mỏng vào trong bình gạn dung tích 100 ml Làm nguội dịch lọc Thêm 5 ml ether (hoặc chloroform) Lắc nhẹ, gạn bỏ lớp nước Giữ lớp ether (hoặc chloroform) để làm phản ứng

Phản ứng Borntraeger: Định tính anthranoid toàn phần (dạng glycosid và dạng tự

Tiến hành: Cân khoảng 10 g dược liệu khô đã tán nhỏ vào một bình nón dung tích 250

ml Thêm 100 ml cồn 25% rồi ngâm trong 24 giờ Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100 ml Thêm vào dịch chiết 3 ml chì acetat 30%, khuấy đều Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ dung tích 100 ml Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1 ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat

Chuyển toàn bộ dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100 ml Chiết glycosid tim bằng cách lắc với chloroform 2 lần, mỗi lần 8 ml Gạn lớp chloroform vào một cốc có

mỏ đã được sấy khô Gộp các dịch chiết chloroform và loại nước bằng natri sulfat khan

a Phản ứng của khung steroid (Phản ứng Liebermann – Burchardt):

- Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, bốc hơi cách thủy đến khô, để nguội Thêm 1

ml anhydrid acetic, lắc đều cho hết cắn Nghiêng ống 450 Cho từ từ theo thành ống 0,5

ml acid H2SO4 đậm đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Ở mặt tiếp xúc giữa 2 chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ Lớp chất lỏng ở phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá – phản ứng dương tính

b Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh

- Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 0,5 ml thuốc mới pha (gồm 9 phần dd NaOH 10% và 1 phần dd acid piric 1% trong nước) Phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện màu đỏ da cam

c Phản ứng của phần đường

- Phản ứng Keller – Kiliani:

Thuốc thử được pha làm 2 dung dịch:

+ Dung dịch 1: 100 ml acid acetic đậm đặc trộn với 1 ml dung dịch FeCl3 5% + Dung dịch 2: 100 ml acid sulfuric đậm đặc trộn với 1 ml dung dịch FeCl3 5% Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, cho dung dịch 1 vào rồi cho thêm dung dịch

2 Phản ứng dương tính khi ban đầu mặt ngăn cách có màu đỏ hoặc nâu đỏ và dần dần

sẽ thấy lớp trên có màu xanh từ dưới khuếch tán lên

* Định tính Saponin

Tiến hành: Phản ứng tạo bọt:

- Lấy 2 g dược liệu, cho vào bình nón 100 ml, thêm 20 ml nước cất, đun sôi nhẹ, lọc Dịch lọc cho vào một ống nghiệm và lắc ống nghiệm 5 phút theo chiều dọc Để yên 15 phút rồi quan sát hiện tượng tạo bọt Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin

* Định tính Tanin

Tiến hành: Lấy 10 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, cho vào đó 30 ml

H2O, đun sôi trong 2 phút Để nguội, lọc qua giấy lọc thu được dịch lọc để định tính bằng các phản ứng sau:

a Phản ứng với FeCl3 5%:

- Cho 2 ml dịch lọc ở trên vào ống nghiệm, thêm vài giọt FeCl3 5% (TT) Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt

b Phản ứng với dung dịch gelatin 1%:

- Cho 2 ml dịch lọc trên vào một ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch gelatin 1% Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa bông trắng

c Phản ứng với chì acetat 10%:

- Cho 2 ml dịch lọc trên vào một ống nghiệm, thêm 2 giọt chì acetat 10% (TT) Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa bông

* Định tính tinh bột

Tiến hành: Nhỏ 1 - 2 giọt nước cất lên phiến kính nhỏ Dùng mũi mác lấy 1 ít dược liệu

cho vào giọt nước Đậy lam kính lên, rồi nhỏ 1 - 2 giọt dung dịch iod - iodid loãng vào cạnh lam kính, dung dịch iod-iodid sẽ thấm vào trong Phản ứng dương tính khi soi kính hiển vi thấy các hạt tinh bột màu xanh

* Định tính acid hữu cơ

Tiến hành: Cho khoảng 2 g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 5 ml nước cất đun

sôi trực tiếp trong 10 phút, để nguội, lọc Lấy dịch lọc cho thêm ít tinh thể Na2CO3 Phản ứng dương tính khi xuất hiện bọt khí

* Định tính đường khử tự do

Tiến hành: Cho khoảng 3 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 1 ml nước cất,

đun sôi Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác Thêm 1 ml dung dịch thuốc thử Fehling A và 1 ml dung dịch Fehling B Đun cách thủy sôi vài phút Phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện màu đỏ gạch

* Định tính acid amin

Tiến hành: Lấy 3 ml dịch chiết cồn cho vào ống nghiệm Thêm 1 - 3 mảnh ninhydrin,

đun sôi 2 phút, phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện màu tím

* Định tính chất béo, caroten

Tiến hành: Cân khoảng 5 g bột dược liệu cho vào cốc có mỏ 100 ml Thêm 10 ml ether

dầu hỏa, bọc kín, ngâm 1 giờ Lọc qua giấy lọc gấp nếp thu được dịch lọc

- Định tính chất béo: Nhỏ vài giọt dịch chiết ether dầu hỏa trên giấy lọc, sấy nhẹ cho bay hết hơi dung môi Phản ứng dương tính khi trên giấy lọc còn vết mờ

- Định tính carotenoid: Cô 2 ml dịch chiết ether dầu hỏa tới cắn Thêm 1 - 2 giọt acid sulfuric đặc, phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện màu xanh ve

 Định tính alcaloid bằng sắc ký lớp mỏng

- Chiết xuất alcaloid

Lấy 0,1 g bột dược liệu, thêm 5 ml methanol (TT), lắc mạnh trong 30 phút, lọc, lấy dịch lọc làm dung dịch thử [6], [8]

- Tiến hành sắc ký lớp mỏng:

 Chuẩn bị bản mỏng: Bản mỏng tráng sẵn Silicagel GF254 (Merck), hoạt hóa ở

1100C/1 giờ, sau đó lấy ra để nguội để triển khai sắc ký

 Chuẩn bị pha động: Pha động là 1 số hỗn hợp các dung môi sau:

- Hệ II: Cloroform : Methanol : amoniac (9,0:1,0:0,5)

- Hệ III: Ethyl acetat : methanol : nước (100:13,5:10)

- Hệ IV: N–butanol : acid acetic : nước (7,0:1,0:1,5)

- Hệ V: N–butanol : ethyl acetat : acid formic : nước (3,0:5,0:0,5:0,2)

- Hệ VI: Cloroform : acid acetic : nước (7,0:1,0:2,0)

- Hệ VII: Toluen: ethylacetat: methanol: iso-propanol: amoniac (12,0:6,0:3,0:3,0:1,0)

- Hệ VIII: Chloroform : butanol (1,0:7,0)

- Hệ IX: Methanol : nước: amoniac (8,0:1,0:1,0)

- Hệ X: Chloroform : methanol : amoniac (14,0 : 5,0 : 1,0)

Bình sắc ký được bão hòa dung môi, khai triển theo chiều từ dưới lên trên

 Chuẩn bị dung dịch đối chiếu: Hòa tan 0,5mg berberin clorid vào 1ml methanol được dung dịch có nồng độ 0,5mg/ml

 Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Lấy 0,1g bột dược liệu, thêm 5ml methanol, lắc mạnh trong 30 phút, lọc, lấy dịch lọc làm dung dịch thử

- Phát hiện vết bằng thiết bị UV-Visualizer, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm

Kiểm tra số lượng vết tách, đồng thời đánh giá khả năng tách của các hệ dung môi, lựa chọn hệ dung môi có khả năng tách tốt nhất để tiến hành định tính

Với hệ dung môi tách tốt nhất, phun thuốc thử Dragendorff và chụp hình sắc ký

đồ, so sánh các vết berberin dựa trên giá trị Rf , màu sắc

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1.1 Mô tả đặc điểm cảm quan

3.1.1.1 Hoàng liên

Dược liệu là những mẩu cong queo, dài 2 cm trở lên, rộng 0,2 - 0,6 cm, có nhiều đốt và phân nhiều nhánh trông giống hình chân gà Mặt ngoài màu vàng nâu, mang vết tích của rễ phụ và của cuống lá Cứng rắn, phần gỗ màu vàng tươi, tia ruột có lỗ rách, phần vỏ và ruột màu vàng đỏ, cũng có khi rỗng

3.1.1.2 Vàng đắng

Dược liệu là những lát cắt ngang hình bầu dục dày 0,3 - 0,8 cm, đường kính 1 - 6

cm, dài ngắn không nhất định Mặt cắt ngang có lớp vỏ mỏng màu nâu nhạt nhìn rõ hai lớp, lớp ngoài sáng hơn lớp trong; phần gỗ màu vàng có tia tủy hình nan hoa bánh xe,

lỗ chỗ có nhiều chấm nhỏ, nhìn rõ mạch gỗ trong thớ gỗ; phần trung tâm tròn hẹp, nằm trong cùng

3.1.1.3 Hoàng bá

- Dược liệu nghiên cứu được chia làm 2 nhóm:

+ Dược liệu đã được thái thành các mảnh hình chữ nhật và đã bị loại bỏ lớp bần, dày 1,5 - 4 mm, dài 5 - 6 cm, rộng 0,5 - 1 cm, mặt ngoài màu vàng lục có vết rãnh dọc, mặt trong màu vàng xám, cứng, vết bẻ có xơ, màu vàng, tươi

+ Dược liệu là những mảnh hình chữ nhật dày 1 - 3 mm, dài 15 - 20 cm, rộng 9 - 12

cm, mặt ngoài màu nâu nhạt có rảnh dọc, thỉnh thoảng có những phần bần còn sót lại Mặt trong màu vàng tươi hơn Vết bẻ có xơ, màu vàng tươi

- Sau khi thu lấy, nhóm mẫu thứ 2 được thái thành các mảnh hình chữ nhật có độ dài tương đương với nhóm 1 sau đó trộn đều với nhau rồi đem làm thực nghiệm

3.1.1.4 Hoàng đằng

Dược liệu là những lát cắt ngang hình bầu dục dày 0,3 – 1 cm, đường kính 1 2cm, có khi tới 10 cm Mặt ngoài màu vàng xám hoặc vàng nâu, có nhiều vân dọc, ngang không đều, sần sùi, thỉnh thoảng có vết sẹo Cứng, dai, khó bẻ gẫy Mặt cắt ngang phẳng, màu vàng tươi, chia làm 3 phần rõ rệt: vỏ mỏng, nhìn rõ hai lớp, lớp ngoài màu sáng hơn lớp trong, mỗi lớp chiếm khoảng 1/2 phần vỏ; gỗ có nhiều tia tỏa thành hình nan hoa bánh xe, nhìn rõ mạch gỗ trong thớ gỗ, phần trung tâm tròn hẹp, nằm trong cùng