Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Hồng rừng thu hái tại Lào Cai

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY HỒNG RỪNG THU HÁI TẠI LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019...

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY HỒNG RỪNG THU HÁI TẠI LÀO CAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY HỒNG RỪNG THU HÁI TẠI LÀO CAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian làm khóa luận, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ,động viên

từ thầy cô, gia đình và bạn bè

Để bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển - Bộ môn Dược học cổ truyền - Trường đại học Dược

Hà Nội, DS Văn Thùy Linh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Văn Tài, TS Lê Thành Nghị, ThS Nguyễn Thị Thu Trang - Khoa Hóa thực vật - Viện Dược liệu đã hướng dẫn, dạy em rất nhiều điều bổ ích trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị, các bạn tại bộ môn Dược học cổ truyền, bộ môn Thực vật - Trường đại học Dược Hà Nội, khoa Hóa thực vật - Viện Dược liệu, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam, Trạm kiểm lâm Núi Xẻ - Sa Pa, Vườn quốc gia Hoàng Liên đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho em trong suốt quá trình nghiên cứu

Em xin cảm ơn Ban giám hiệu, cùng toàn thể thầy cô Trường đại học Dược Hà Nội đã dạy em những kiến thức bổ ích, giúp đỡ tạo điểu kiện cho em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè trong suốt thời gian qua đã ở bên động viên, khích lệ giúp em hoàn thành tốt khóa luận

Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Lê Thị Hà

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN ….2

1.1 Tổng quan về chi Diospyros L 2

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Diospyros L 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Diospyros L 2

1.2 Tổng quan loài Diospyros kaki 3

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Diospyros kaki 3

1.2.2 Một số cây thuộc loài Diospyros kaki 3

1.2.3 Thành phần hóa học 4

1.2.4 Tác dụng dược lý 7

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Đối tượng nghiên cứu 10

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 10

2.1.2 Thiết bị và hóa chất nghiên cứu 10

2.2 Phương pháp nghiên cứu 11

2.2.1 Giám định tên khoa học và đặc điểm thực vật của cây nghiên cứu 11

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 11

2.2.3 Phân lập các hợp chất chính 12

2.2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc 14

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 15

3.1 Đặc điểm thực vật của cây Hồng rừng 15

3.1.1 Đặc điểm hình thái 15

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu lá của cây Hồng rừng 17

3.1.3 Đặc điểm bột lá của cây Hồng rừng 20

3.2 Thành phần hóa học của lá cây Hồng rừng 21

3.2.4 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ cắn EtOAc 36

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 40

4.1 Đặc điểm thực vật 40

4.2 Chiết xuất, phân lập, tinh chế, xác định cấu trúc các hợp chất 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký cột

HPLC High performance liquid choromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao ESI-MS Electro spray ionization spectrometry

Phổ khối lƣợng ion hóa phun bụi điện

Lipoprotein phân tử lƣợng cao

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Công thức hóa học của các flavonoid chính trong lá loài D kaki [25] 5

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phương pháp hóa học…… 24 Bảng 3.2 Khối lượng các cắn phân đoạn từ dịch chiết ethanol lá Hồng rừng……… 27

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Một số terpenoid chính trong lá hồng 6

Hình 3.1 Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng cây Hồng rừng……….16

Hình 3.2 Đặc điểm hoa cái của cây Hồng rừng 16

Hình 3.3 Đặc điểm hoa đực của cây Hồng rừng 17

Hình 3.4 Đặc điểm quả và hạt cây Hồng rừng 17

Hình 3.5 Vi phẫu phần gân lá của lá Hồng rừng 19

Hình 3.6 Vi phẫu phần phiến lá Hồng rừng 20

Hình 3.7 Ảnh bột lá Hồng rừng 21

Hình 3.8 Sơ đồ chiết xuất các cắn phân đoạn từ lá cây Hồng rừng 26

Hình 3.9 Hình ảnh TLC của cao toàn phần với hệ II (DCM:MeOH 96:4) 28

Hình 3.10 Hình ảnh TLC của cắn EtOAc với hệ V (DCM:MeOH 96:4) 30

Hình 3.11 Sắc ký đồ khảo sát pha động (methanol:nước cất 55:45) bằng phương pháp HPLC phân tích 33

Hình 3.12 Sắc ký đồ khảo sát pha động (methanol:nước cất 55:45) bằng phương pháp HPLC điều chế 34

Hình 3.13 Quá trình phân lập chất từ cắn phân đoạn EtOAc 35

Hình 3.14 Hình ảnh TLC của LH1 ( DCM 100%) 36

Hình 3.15 Cấu trúc hóa học của hợp chất LH1 37

Hình 3.16 Hình ảnh TLC của A1 (DCM : MeOH 5:1) 37

Hình 3.17 Các tương tác chính (H→C) trên phổ HMBC, HSQC của hợp chất A1 39

Hình 3.18 Cấu trúc hóa học của hợp chất A1 39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, với xu hướng “trở về với thiên nhiên’’ nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam đã và đang đẩy mạnh việc nghiên cứu, bào chế sản xuất các chế phẩm có nguồn gốc từ thảo dược, thành phần từ tự nhiên để hỗ trợ, phòng ngừa và điều trị bệnh, cũng như nâng cao sức khỏe con người

Với vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên ưu đãi, Việt Nam có một thảm thực vật phong phú và đa dạng với khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao, trong đó có khoảng 4.000 loài được sử dụng làm thuốc Tuy vậy, hiện mới có khoảng 300 loài cây và vị thuốc được sử dụng ở mức độ tương đối phổ biến theo kinh nghiệm dân gian hoặc theo

y học cổ truyền mà chưa được nghiên cứu kỹ và đầy đủ [1] Điều này cho thấy triển vọng lớn của Việt Nam trong lĩnh vực nghiên cứu và phát triển thuốc từ thảo dược

Chi Diospyros L thuộc họ Thị (Ebenaceae) là một chi lớn trên thế giới với hơn

500 loài, được phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới, đa dạng nhất là ở khu vực Đông Nam Á, một số loài ở Tây Á, Nhật Bản và Đông Nam nước Mỹ [35] Một số loài

thuộc chi Diospyros L đã được thế giới nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa, điều

trị ung thư, hạ cholesterol máu, hạ huyết áp, kháng khuẩn … [25], [39]

Hồng rừng là một trong những cây thuộc chi Diospyros L tồn tại và phát triển

tự nhiên trên địa bàn Lào Cai Lá cây Hồng rừng là một vị thuốc nam quý được người dân địa phương sử dụng theo kinh nghiệm với tác dụng: thanh lọc gan, hạ men gan, giải độc gan do rượu bia, Tuy nhiên hiện nay có rất ít nghiên cứu về đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của dược liệu lá cây Hồng rừng

Do đó để bổ sung cơ sở dữ liệu về đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của

dược liệu này chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành

phần hóa học của cây Hồng rừng thu hái tại Lào Cai” với một số mục tiêu cụ thể

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Diospyros L

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Diospyros L

Theo hệ thống phân loại thực vật của Armen Takhtajan 1987, vị trí phân loại

của chi Diospyros L được tóm tắt như sau [3], [35]:

1.2 Tổng quan loài Diospyros kaki

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Diospyros kaki

Cây cao tới 27 m Cành non phủ lông dày đặc Lá mọc so le, cuống lá 0,8 - 2

cm Phiến lá hình mác, hình elip, hình trứng, đôi khi có hình thìa, kích thước 5 - 18 x 2,6 - 9 cm, mặt trên phiến lá thường có lông mịn; ngọn lá nhọn; 5 - 7 gân bên mỗi bên Hoa đực mọc thành xim 3 - 5 hoa; đài hoa dài như tràng hoa, có lông cả 2 mặt; thùy 4; tràng hoa màu trắng, trắng vàng hoặc đỏ, kích thước 6 - 10 mm; 14 - 24 nhị Hoa cái đơn độc; đài hoa kích thước 3 cm hoặc hơn; thùy 4; tràng hoa màu trắng vàng, kích thước 1 - 1,6 cm; mép thùy uốn cong ra phía ngoài; 8 - 16 nhị lép; bầu nhẵn hoặc có lông mịn Quả mọng màu vàng đến màu cam, hình cầu hoặc hình trứng Hạt màu nâu sẫm, kích thước 1,3 - 1,6 cm x 7,5 - 9 × 4 - 5 mm Mùa hoa tháng 5 - 6, mùa quả tháng

9 - 10 [5], [7], [22]

 Phân bố

Loài Diospyros kaki có nguồn gốc từ Trung Quốc Ở Trung Quốc, nó được

trồng nhiều ở An Huy, Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng Tây, Tứ Xuyên, Vân Nam, Chiết Giang…[22] Sau đó, được du nhập sang các nước Đông Nam Á khác như: vùng Bắc Thái Lan, đảo Java, Malaysia Ngoài ra, ở Italia, Israel, Brazil, Mỹ cũng trồng loài này [7]

Ở Việt Nam, loài này được trồng nhiều ở các tỉnh miền Bắc từ Thanh Hóa trở

ra Ở miền Nam, loài này được trồng ở Đà Lạt [7]

1.2.2 Một số cây thuộc loài Diospyros kaki

Chưa có nghiên cứu nào thống kê về số lượng thứ trong loài D kaki Tuy nhiên, trong Thực vật chí Trung Quốc có đề cập đến 3 thứ của loài D kaki Các thứ này có

nhiều đặc điểm hình thái giống mẫu nghiên cứu vì vậy chúng tôi mô tả hình thái thực

vật của 3 thứ dưới đây để có căn cứ khoa học phân biệt với mẫu nghiên cứu

Diospyros kaki var macrantha: cành nhẵn Mặt trên của phiến lá nhẵn , mặt

dưới của phiến lá có lông rất thưa Đài hoa đực hình mác, kích thước 10 x 2,7 mm, nhẵn; tràng hoa 9 - 10 mm, tràng hoa màu đỏ; thùy kích thước 2 x 2,3 mm, bên ngoài nhẵn; bầu đầy lông [22]

Diospyros kaki var kaki: cành non dày đặc lông mịn Cuống lá nhẵn, mặt trên

phiến lá nhẵn, mặt dưới phiến lá có hoặc không có lông Tràng hoa đực kích thước 6 -

9 mm Đài hoa cái có thùy hình trứng Quả mọng 3,5 - 8,5 cm [22]

Diospyros kaki var silvestris: cành non phủ đầy lông mịn; cuống lá, phiến lá

phủ đầy lông mịn Tràng hoa đực kích thước 6 - 9 mm Đài hoa cái có thùy hình trứng Quả mọng 2 - 5 cm, phủ đầy lông [22]

1.2.3 Thành phần hóa học

 Flavonoid

Năm 2005, G Chen và cộng sự đã phân lập được isorhamnetin-3-O-glucopyranosid, vitexin, 2’’-O-rhamnosyl vitexin từ dịch chiết n-buthanol của lá hồng [11]

β-D-Năm 2007, G Chen và cộng sự đã phân lập được 2 hợp chất mới và 11 hợp chất đã biết từ dịch chiết ethyl acetat của lá hồng thu hái tại Trung Quốc 11 hợp chất

đã biết là: acid 4,4’-dihydroxy-α-truxillic, tatarin C, myricetin, annulatin, trifolin, astragalin, hyperin, isoquercetin, rutin, quercetin, kaempferol Trong số các hợp chất

đã biết này, acid 4,4’-dihydroxy-α-truxillic, tatarin C, myricetin, annulatin là 4 hợp

chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Diospyros Hai hợp chất mới phân lập được là:

4,6-dihydroxy-2-O-β-D-glucopyranosylbenzophenon và acid barbinervic [12]

Năm 2009, G Chen và cộng sự đã phân lập được 1 hợp chất C-glycosylflavon

là 8-C-[α-L-rhamnopyranosyl-(1->4)]-α-D-glucopyranosyl apigenin cùng 6 hợp chất

đã biết khác là 2’’-O-rhamnosyl vitexin, kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid, myricetin-3-O-α-L-rhamnopyranosid, myricetin-3-O-β-D-glucopyranosid, blumeol C glucosid, byzantionosid B từ dịch chiết n-buthanol của lá hồng [10]

Một số flavonoid chính trong lá của loài D kaki là: kaempferol (1);

O-α-L-rhamnopyranosid (2); O-β-D-xylopyranosid (3); O-β-D-galactopyranosid (4); kaempefrol-3-O-α-L-arabinopyranosid (5); kaempferol- 3-O-β-D-glucopyranosid (6); kaempferol-3-O-(2’’-O-galloyl)-β-D-glucopyranosid (7);

kaempferol-3-quercetin (8); quercetin-3-O-α-L-arabinopyranosid (9);

quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosid (10); glucopyranosid (11) ;

quercetin-3-O-β-D-Bảng 1.1 Công thức hóa học của các flavonoid chính trong lá loài D kaki [25]

Năm 2008, Phuong Thien Thuong và cộng sự đã phân lập đƣợc 14 triterpenoid

từ dịch chiết methanol của lá hồng Trong số đó, 2 triterpenoid nhóm ursan mới là acid

3α,19α-dihydroxyurs-12,20-di24,28-dioic (1) và acid 3α,19α-dihydroxyurs-12 - 24,28-dioic (2) và 12 triterpenoid đã biết là acid coussaric (3); acid barbinervic (4); acid 24-hydroxyl-3-epi-ursolic (5); acid rotungenic (6); acid pomolic (7); acid 24- hydroxyursolic (8); acid ursolic (9); acid 19,24-dihydroxyurs- 12-en-3-on-28-oic (10); acid 24-hydroxyl-3-epi- oleanolic (11); acid 3α,24,29-trihydroxyolean-12-en- 28-oic (12); acid oleanolic (13); acid spathodic (14) [38]

en-Hình 1.1 Một số terpenoid chính trong lá hồng

Ngoài ra, một số triterpen khác cũng đƣợc phân lập từ lá hồng nhƣ: α-amyrin; uvaol; uvasol; acid 19α-hydroxyursolic; acid 19α,24-dihydroxyursolic; lupeol; acid betulinic; acid betulic [39]

 Hợp chất khác

Naphthoquinon: 3-bromo-plumbagin; 3-methoxy-7-methyl-uglon, martinon, hydroxy-isodiospyrin; diospyrin; isodiospyrin; neodiospyrin; mamegakinon, 7-methyl-uglon

8'-Sterol: campesterol; stigmasterol; β-sitosterol

Coumarin: 6-7-hydroxyl-7-hydroxy coumarin, scopoletin

Tanin: shibuol

1.2.4 Tác dụng dược lý

Từ lâu, lá hồng (D kaki) đã trở thành một vị thuốc quan trọng trong nền y học

cổ truyền Trung Quốc để điều trị các bệnh như: đột quỵ do thiếu máu não cục bộ, đau thắt ngực, xuất huyết, tăng huyết áp, xơ vữa động mạch và một số bệnh nhiễm trùng [39] Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về lá hồng cho thấy nó có các tác dụng dược lý nổi bật sau:

 Tác dụng chống oxy hóa

Theo nghiên cứu của J.Q Shi và cộng sự, cao chiết ethanol từ lá hồng (600 mg/kg) làm chậm sự thoái hóa của mỡ, tác dụng chống oxy hóa cao hơn một chút so với hesperidin (100 mg/kg) và polyphenol (100 mg/kg) [31]

Flavonoid từ lá hồng làm giảm đáng kể mức độ các loại oxy phản ứng và malondialdehyd, làm tăng hoạt động của các enzym catalase, superoxid dismutase, glutathion peroxidase trong tế bào E1 theo cách phụ thuộc vào liều [34]

Cao chiết từ lá hồng và trà lá hồng có tác dụng làm sạch gốc oxy tự do và chống oxy hóa Trong nghiên cứu cơ chế của chúng trên các tế bào nguyên bào xương

bị tổn thương do stress oxy hóa, L.J Sun và cộng sự đã phát hiện ra rằng flavonoid từ

lá hồng làm giảm quá trình chết tế bào do H2O2 gây ra trong các tế bào MC3T3-E1 Kết quả cho thấy cơ chế phân tử của flavonoid từ lá hồng trong chống chết tế bào có liên quan đến việc ngăn chặn sự chuyển vị của NF-kB/p65 vào nhân Hiệu quả bảo vệ của flavonoid từ lá hồng có thể cung cấp một phương pháp đầy hứa hẹn để điều trị bệnh loãng xương [33]

Tác dụng chống oxy hóa của lá hồng không chỉ nhờ có flavonoid mà còn nhờ các hợp chất triterpenoid Theo nghiên cứu của G Chen, khi các tế bào được ủ trước với năm hợp chất triterpenoid được phân lập từ lá hồng thì superoxid gây ra bởi N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin bị ức chế đáng kể theo cách phụ thuộc nồng độ Các hợp chất này cũng ngăn chặn superoxid gây ra bởi acid arachidonic ở nồng độ cao [9]

 Chống xơ vữa động mạch

Cao chiết từ lá hồng và trà lá hồng làm giảm triglycerid, cholesterol, LDL-C, trong khi đó làm tăng tỷ lệ HDL trong huyết thanh của chuột được ăn với chế độ ăn giàu chất béo [24]

Lá hồng giúp làm giảm sự tích lũy các giọt lipid ở gan, cải thiện hoạt động của HMG-CoA và ACAT ở gan Trong khi đó, hàm lượng triglycerid, cholesterol và acidic sterol trong phân cao hơn đáng kể ở nhóm chế độ ăn giàu chất béo chứa 5% bột lá hồng Kết quả, chỉ ra rằng lá hồng cải thiện nồng độ lipid trong huyết tương và ở gan, thông qua tăng lipid trong phân ở chuột được cho ăn nhiều chất béo Điều này có thể là

do hợp chất phenolic và hàm lượng cao chất xơ có trong bột lá hồng [21]

 Tác dụng giảm đường huyết

Dịch chiết ethanol, ethyl acetat, n-buthanol và nước từ lá hồng làm giảm đáng

kể glucose máu, chỉ số kháng insulin và làm tăng đáng kể chỉ số nhạy cảm với insulin trên chuột bị đái tháo đường gây ra bởi Streptozotocin [14] Tác dụng giảm đường huyết, cải thiện dung nạp glucose, tăng hoạt tính superoxid, glutathion perosidase, hexokinase, giảm malondialdehyd trong gan của dịch chiết nước là nhờ polysaccarid trong lá hồng

Trong nghiên cứu của U.J Jung và cộng sự, thực hiện bổ sung vào chế độ ăn thường của chuột 5% bột lá hồng trong 5 tuần Kết quả chỉ ra rằng lá hồng làm giảm glucose máu, HOMA-IR, triglycerid máu, cholesterol máu cũng như trọng lượng gan, giọt lipid gan, triglycerid, cholesterol ở gan Tác dụng hạ đường huyết có liên quan đến giảm hoạt động của các enzym gluconeogen cũng như tăng nồng độ glycogen, tăng hoạt động của glucokinase và mức độ mRNA của nó trong gan Ngoài ra, lá hồng

có thể là một chiến lược ăn kiêng hiệu quả để cải thiện bệnh tiểu đường týp 2 kèm theo rối loạn lipid máu và gan nhiễm mỡ bằng cách điều chỉnh một phần hoạt động hoặc biểu hiện gen của các enzym liên quan đến chất chống oxy hóa, glucose và lipid [19]

 Tác dụng kháng khuẩn

MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) và MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu) của lá hồng được xác định tương ứng là 0,313 g/ml và 0,625 g/mL đã được kiểm tra cho thấy

có tác dụng chống lại sự hư hỏng thực phẩm, mầm bệnh truyền qua thực phẩm

(Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Fluorescence pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Proteus vulgaris) và tỷ lệ kháng khuẩn hơn 90% Hợp chất thân dầu dễ bay hơi phân lập từ lá hồng có tác dụng ức chế mạnh Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis nhưng nó có tác dụng ức chế yếu đối với Escherichia coli MIC đối với Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và Escherichia coli lần lượt là:

3,13µL/mL, 3,13µL/mL, 25,00 µL/mL [13]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

- Mẫu hoa, quả làm tiêu bản và giám định tên khoa học

- Lá Hồng rừng được thu hái tại huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai vào tháng 5 năm

2018, được sử dụng để nghiên cứu thành phần hóa học Sau khi thu hái, lá Hồng rừng được rửa sạch, sấy ở 60 ˚C đến khô, làm nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín,

để nơi khô ráo, thoáng mát làm nguyên liệu nghiên cứu

2.1.2 Thiết bị và hóa chất nghiên cứu

 Thiết bị và dụng cụ

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy Stuart

- Máy phân tích độ ẩm Precisa (Thụy Sỹ)

- Máy siêu âm có gia nhiệt hiệu Power sonic 405

- Bếp điện

- Máy đo phổ: cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối (MS)

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Tủ sấy chân không Heraeus Vacutherm

- Cân phân tích Precisa, cân kỹ thuật Sartorius

SPD HPLC điều chế Shimadzu (Nhật Bản) bao gồm: hệ bơm LC-20AP, detector SPD – M20A , hệ thống tiêm mẫu tự động SIL 10AP, bộ phận ổn nhiệt của Shimadzu Phần mềm điều khiển Labsolution

- Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm

 Hóa chất nghiên cứu

- Dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: nước cất, nước tẩy javen, acid acetic 5%, xanh methylen, đỏ carmin, glycerin

- Dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu thành phần hóa học: nước, ethanol, methanol, dichloromethan, ethyl acetat, aceton, acid formic, acid acetic, n-hexan, n-buthanol, Na2SO4,, silica gel…

- Nước cất hai lần, methanol (HPLC)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Giám định tên khoa học và đặc điểm thực vật của cây nghiên cứu

- Quan sát bằng mắt thường, mô tả và chụp ảnh đặc điểm hình thái thực vật, điều kiện sinh trưởng và phát triển của cây Hồng rừng

- Thu hái, làm tiêu bản mẫu cành mang hoa, quả và lưu giữ tiêu bản

- Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm bộ phận sinh sản, so sánh với các tài liệu phân loại thực

vật của chi Diospyros L [22] dưới sự hướng dẫn của các chuyên gia phân loại

- Định tính flavonoid: phản ứng Shinoda, phản ứng với dung dịch kiềm

- Định tính sterol: phản ứng Lieberman - Burchard

- Định tính saponin: thử nghiệm tính tạo bọt

- Định tính tannin: phản ứng với dung dịch gelatin 1%

- Định tính coumarin: phản ứng mở - đóng vòng lacton

- Định tính acid amin,đường khử

- Định tính alcaloid với thuốc thử Mayer, Dragendorff

2.2.2.2 Chiết xuất cao toàn phần và cắn phân đoạn

Tiến hành: dược liệu khô đã xay thô được chiết bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ thường với ethanol 90%, sau mỗi 24 giờ rút dịch chiết 1 lần, chiết 3 lần bằng bình chiết, gộp dịch chiết lại và cất thu hồi dung môi ở áp suất giảm trên máy cất quay chân không tại nhiệt độ 40 ˚C được cao toàn phần

Sau đó, cao toàn phần được phân tán trong nước và chiết lần lượt với dung môi

có độ phân cực tăng dần: n-hexan, dichloromethan, ethyl acetat, n-buthanol Mỗi phân

đoạn được chiết nhiều lần bằng dung môi chiết đến khi quan sát thấy không màu hoặc màu rất nhạt Gộp các dịch chiết của mỗi phân đoạn này lại và cất quay thu hồi dung môi để thu được cắn phân đoạn tương ứng Các cắn phân đoạn thu được gồm: cắn n-hexan, cắn DCM, cắn EtOAc, cắn n-BuOH Phần dịch chiết còn lại sau khi chiết với các dung môi đem cô cạn để thu được cắn nước Cân, tính khối lượng và tỷ lệ các cắn

2.2.3 Phân lập các hợp chất chính

 Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography-TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel tráng sẵn Alufolien 60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với chiều dày lớp silica gel là 0,2

Phát hiện vệt chất trên bản mỏng: tùy thuộc nhóm chất cần định tính mà sử dụng thuốc thử khác thích hợp Nếu để phát hiện các flavonoid, bản mỏng được phun các thuốc hiện FeCl3/EtOH 5% hoặc H2SO4 10%/EtOH 96%, sau đó được hơ nóng ở nhiệt độ thích hợp, đánh dấu vệt chất trên bản mỏng, tính giá trị Rf và ghi màu sắc của các vệt chất

 Sắc ký cột thường (Column chromatography-CC)

Sắc ký cột thường được thực hiện dưới trọng lực của dung môi trên silica gel theo cơ chế sắc ký hấp phụ và được sử dụng để phân tách các phần chiết, phân lập và tinh chế các hợp chất

Chuẩn bị cột (phương pháp nhồi cột ướt): Loại cột và lượng silica gel sử dụng phụ thuộc vào khối lượng chất cần tách

Chuẩn bị mẫu: mẫu chất hoặc cắn được hòa tan trong một lượng vừa đủ dung môi dễ bay hơi thích hợp Trộn dung dịch thu được với silica gel cỡ hạt 40-63 µm với

tỷ lệ 1 g chất/ 1,2 - 1,5 g silica gel Hỗn hợp này được làm bay hơi dung môi đến khi khô kiệt thu được bột mịn của mẫu chất hấp phụ trên silica gel

Triển khai sắc ký cột: mở khóa dưới để cho dung môi chảy ra khỏi cột, cho đến khi bề mặt dung môi cách bề mặt silica gel khoảng 2 mm Cho từ từ mẫu tẩm trên silica gel lên cột Khi đưa mẫu lên cột cần phải chú ý đảm bảo cho bề mặt của lớp chất phía trên cột sắc ký tạo thành mặt phẳng ngang

Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi được xác định nhờ vào các khảo sát thăm

dò TLC, tốc độ rửa giải 20 giọt/phút, thu các phân đoạn theo thể tích thích hợp

Khảo sát sắc ký các phân đoạn bằng TLC, gộp các phân đoạn cho sắc ký đồ TLC giống nhau lại, sau đó cất quay loại kiệt dung môi để thu được các nhóm phân đoạn

Phương pháp này được sử dụng để tách và làm sạch chất rắn Việc làm sạch chất rắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của hợp chất mục tiêu và của tạp chất trong dung môi hoặc một hệ dung môi đã chọn

Để tiến hành khảo sát pha động chuẩn bị mẫu phân tích nồng độ khoảng 20 µg/ml Mẫu được đem siêu âm và lọc qua màng lọc cellulose acetat 0,45 µm Các điều kiện sắc ký khác được giữ cố định

Điều chỉnh thành phần pha động để tìm chương trình đảm bảo khả năng tách chất mục tiêu ra khỏi nền mẫu và pic thu được có tính đối xứng nhất

HPLC điều chế

Khi đã tìm được chương trình chạy trên hệ thống HPLC phân tích, ta sẽ mở

rộng quy mô lên HPLC điều chế

2.2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc

Các phương pháp phổ là các phương pháp hiện đại và hữu hiệu nhất để xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ Các phương pháp được sử dụng để xác định cấu trúc

các hợp chất trong khóa luận này bao gồm:

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR) và (13C-NMR) được đo trên máy Bruker Avance 500 MHz NMR spectrometer với chất chuẩn nội TMS (tetramethyl silan)

- Phổ DEPT

- Phổ khối lượng (ESI-MS)

- Phổ COSY

- Phổ HSQC, HMBC

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Đặc điểm thực vật của cây Hồng rừng

3.1.1 Đặc điểm hình thái

Cây gỗ lớn cao 5 - 7 m Vỏ cây già có màu nâu đỏ, sần sùi, đôi khi có đốm

trắng; thân non màu xanh, phủ lông dày mịn màu trắng Lá đơn, mọc so le Cuống 0,7

- 1 cm, phủ lông dày, ngắn, mịn, màu trắng Phiến lá hình bầu dục, hoặc hình trứng kích thước 3 - 4 cm × 5 - 8 cm, mặt dưới màu xanh nhạt, mặt trên màu xanh đậm, cả 2 mặt phủ lông dày đặc, mềm, màu trắng Gốc lá tròn, hình tim hoặc cụt; ngọn lá tròn, tù hoặc hơi nhọn; mép lá nguyên Gân lá hình lông chim, gân chính nổi rõ ở mặt dưới, gân bên 4 - 5 cặp, hệ gân cấp 3 tạo tạo thành hình mạng; gân có mang lông dày đặc, mềm, màu trắng

Hoa mọc đơn độc ở nách lá, hoa đơn tính, kích thước 0,6 - 0,8 cm × 0,8 - 1,2

cm Cuống dài 0,1 - 0,3 cm phủ lông dày, ngắn, mịn, màu trắng

Hoa cái đều Đài 4 hàn liền ở gốc, phần trên chia làm 4 thùy hình bầu dục, màu xanh, ống đài đường kính 0,7 - 0,8 cm, cao 0,3 - 0,4 cm, mặt trong nhẵn, mặt ngoài phủ lông; thùy hình bầu dục rộng 0,4 - 0,5 cm, dài 0,7 - 0,8 cm, mép thùy uốn cong ra phía ngoài Tràng 4 hàn liền, phía trên chia làm 4 thùy hình bầu dục; màu trắng xanh, bên ngoài phủ lông, phía trên nhiều lông hơn ở gốc tràng; ống tràng 0,4 - 0,5 cm, phần thùy dài 0,4 - 0,5 cm Nhị 8, rời, hình dải, kích thước 0,1 cm × 0,3 - 0,5 cm, màu xanh nhạt phủ lông dày đặc, mềm, màu trắng Bầu hàn liền hình cầu dẹt, cao 0,2 - 0,3 cm, đường kính 0,3 - 0,4 cm; màu vàng nhạt; gốc bầu nhẵn, phía trên vòi nhụy 4 phủ lông dày đặc, mềm, màu trắng; mặt cắt ngang bầu có 8 ô mang 8 noãn.

Hoa đực đều Đài 4 hàn liền ở gốc, phần trên chia làm 4 thùy hình bầu dục, màu xanh, ống đài đường kính 0,7 - 0,8 cm, cao 0,3 - 0,4 cm, mặt trong nhẵn, mặt ngoài phủ lông; thùy hình bầu dục rộng 0,4 - 0,5 cm, dài 0,7 - 0,8 cm, mép thùy uốn cong ra phía ngoài Tràng 4 hàn liền, phía trên chia làm 4 thùy hình bầu dục; màu trắng xanh, bên ngoài phủ lông, phía trên nhiều lông hơn ở gốc tràng; ống tràng 0,4 - 0,5 cm, phần thùy dài 0,4 - 0,5 cm Nhị nhiều (19 nhị), rời, hình sợi, kích thước 0,1 - 1,2 cm × 0,3 - 0,5 cm, màu xanh nhạt mang các lông dày, mềm, màu trắng; bao phấn dài dọc theo chỉ nhị, nứt dọc

Quả đơn, hình cầu, màu xanh đường kính 3 - 5 cm, khi chín có màu vàng có 4 đài tồn tại Hạt dẹt màu nâu đỏ, kích thước 1,2 cm × 2,0 cm

Hình 3.1 Đặc điểm cơ quan sinh dƣỡng cây Hồng rừng

a Cành mang lá; b Thân già; c Thân non; d Hình dạng phiến lá;

e Mặt dưới lá; f Mặt trên lá; g Gốc lá; h1, h2, h3 Ngọn lá

Hình 3.2 Đặc điểm hoa cái của cây Hồng rừng

a Cụm hoa; b Hoa nguyên vẹn; c Hoa nhìn từ dưới lên; d Hoa nhìn từ trên

xuống;e Hoa bổ dọc; f Đài hoa; g Tràng hoa; h Nhị; i Bầu; k Bầu cắt ngang

Hình 3.3 Đặc điểm hoa đực của cây Hồng rừng

a Hoa nguyên vẹn; b Hoa bổ dọc; c Đài hoa; d Tràng hoa; e Nhị

Hình 3.4 Đặc điểm quả và hạt cây Hồng rừng

1 Quả nguyên; 2 Quả bổ dọc; 3 Hạt

Dựa trên các đặc điểm thực vật, cây Hồng rừng thu hái vào tháng 5 năm 2018

tại Sa Pa, Lào Cai được giám định tên khoa học là: Diospyros kaki Thunb var silvestris Makino bởi PGS.TS Trần Thế Bách – Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ

Việt Nam ( phụ lục 2)

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu lá của cây Hồng rừng

Mẫu dược liệu tươi được ngâm trong cồn 70˚, cắt tiêu bản Sau đó, tẩy mẫu bằng dung dịch cloramin B trong thời gian ít nhất 30 phút Rửa sạch cloramin B 3 lần bằng nước cất Nếu mẫu chứa nhiều tinh bột có thể ngâm trong dung dịch cloran hydrat trong 30 phút sau đó rửa sạch Ngâm tiếp mẫu trong acid acetic trong 15 phút Rửa sạch mẫu 3 lần bằng nước cất Nhuộm màu xanh bằng dung dịch xanh methylen trong thời gian từ 5-30 giây Rửa sạch mẫu 3 lần bằng nước cất Nhuộm màu đỏ bằng cách ngâm vào dung dịch đỏ carmin khoảng 30 phút Rửa sạch mẫu 3 lần bằng nước

hiện như sau: nhỏ vào giữa phiến kính 1 giọt chất lỏng được dùng làm môi trường quan sát ( nước, glycerin…), dùng kim mũi mác hoặc bút lông đặt vi phẫu cần quan sát vào giọt chất lỏng, đậy lá kính lại (chú ý không để lẫn bọt khí dưới lá kính).Sau đó, tiến hành soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học, chụp ảnh và mô tả vi phẫu [2]

Mô tả: Vi phẫu lá hồng rừng có gân chính lồi rõ ở mặt dưới

Phần gân lá: Từ dưới lên trên lần lượt gồm: Biểu bì dưới (1) gồm một lớp tế bào xếp sít nhau, vách hóa cutin mang các lông che chở đơn bào thuôn nhọn, lông che chở

đa bào (10) hoặc lông tiết đầu đa bào (11) Mô dày góc (2) dưới gồm 4 đến 8 hàng tế bào, thành dày, bắt màu hồng đậm xếp thành đám sát biểu bì dưới Mô mềm gồm các

tế bào thành mỏng có kích thước lớn rải rác có chứa các tinh thể calcioxalat hình đa giác hoặc hình khối (7) Bó libe-gỗ ở chính giữa gân lá có dạng hình cung, gỗ phía trong, libe phía ngoài, bề dày của lớp gỗ gấp 1,5 - 2 lần lớp libe Mô dày góc trên là 5 -

7 hàng tế bào xếp thành đám sát biểu bì trên của gân lá bắt màu hồng đậm Biểu bì trên

là một lớp tế bào, có mật độ lông đa bào nhiều hơn biểu bì dưới, nhưng ít lông che chở đơn bào

Hình 3.5 Vi phẫu phần gân lá của lá Hồng rừng

1 Biểu bì dưới; 2 Mô dày; 3 Libe; 4 Gỗ; 5 Libe ; 6 Mô mềm;

7 Tinh thể Calci oxalat; 8 Mô dày trên; 9 Biểu bì trên; 10 Lông che chở; 11 Lông tiết

Phần phiến lá: Bề dày của phiến lá hẹp, chỉ khoảng 1/8 - 1/6 bề dày phần gân lá Biểu bì dưới (1) là một lớp tế bào vách hóa cutin mang các lông che chở Mô khuyết (2) gồm các tế bào thành mỏng, xếp lộn xộn để hở nhiều khoảng trống chứa khí Mô giậu (3) là một hàng tế bào dài, hình chữ nhật, xếp sít nhau theo chiều dọc, bên trong chứa nhiều lục lạp, bề dày chiếm khoàng một nửa mặt cắt ngang của phiến lá Biểu bì trên (4) gồm một lớp tế bào xếp sít nhau có vách hóa cutin

Hình 3.6 Vi phẫu phần phiến lá Hồng rừng

Phần phiến lá: 1 Biểu bì dưới; 2 Mô khuyết; 3 Mô giậu; 4 Biểu bì trên

3.1.3 Đặc điểm bột lá của cây Hồng rừng

Dược liệu sau khi thu hái được sấy khô, nghiền bột, rây qua lưới được bột mịn Bột dược liệu được đặt lên trên phiến kính có sẵn giọt nước cất, đậy lá kính và quan sát các đặc điểm dưới kính hiển vi quang học Tiến hành chụp ảnh và mô tả các đặc điểm bột dược liệu

Bột lá có màu xanh thẫm, vị hơi chát Soi kính hiển vi thấy có mảnh biểu bì mang khí khổng dạng hỗn bào Mảng mô mềm với các tế bào tròn, thành mỏng, xếp thưa nhau Nhiều lông che chở đơn bào và đa bào nằm rải rác trong vi trường, kích thước khác nhau, chiều dài từ 50 - 200 µm và các lông tiết dài 80 - 150 µm, phần đầu lông tiết đa bào, thuôn dẹt, đường kính khoảng 20 - 40 µm, thấy rõ thể cứng bên trong, chiều dài phần đầu tương đương phần chân dẹt Quan sát được sợi và các bó sợi nằm rải rác với đường kính khoảng 10 - 30 µm Các tinh thể calcioxalat nhiều, đa dạng, có hình khối cầu, hình thoi và cả hình lập phương, từ 10 - 40 µm, rải rác có các mảnh mạch xoắn, mạch mạng và mạch điểm

Hình 3.7 Ảnh bột lá Hồng rừng

1 Biểu bì mang lỗ khí; 2 Mảnh mô mềm; 3 Lông che chở đa bào; 4 Lông che chở đơn bào; 5a,b Lông tiết; 6 Sợi; 7 Tinh thể calcioxalat; 8, 9 Mảnh mạch xoắn;

10 Mảnh mạch mạng; 11 Mảnh mạch điểm

3.2 Thành phần hóa học của lá cây Hồng rừng

3.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học

Các phản ứng định tính sơ bộ các nhóm chất trong dược liệu được thực hiện theo phương pháp thường quy [6]

Cao ethanol thu được sau khi chiết bột dược liệu bằng ethanol 90%, đem hòa tan lại bằng ethanol 96% và thực hiện phản ứng định tính

Phản ứng Shinoda

- Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết ethanol Thêm một ít bột magnesi kim loại sau đó nhỏ vài giọt HCL đậm đặc, lắc đều rồi đun vài phút Quan sát hiện tượng xảy ra

- Kết quả: xuất hiện màu hồng đậm

- Nhận xét: phản ứng dương tính

Phản ứng với dung dịch kiềm

- Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết ethanol, thêm vài giọt NaOH 10% Quan sát hiện tượng xảy ra

- Kết quả: màu vàng của dung dịch tăng lên rõ rệt

từ từ theo thành ống nghiệm 1 - 2 ml H2SO4 đặc Quan sát hiện tượng xảy ra

- Kết quả: thấy vòng ngăn cách giữa 2 lớp dung dịch có vòng màu đỏ tím, lớp dung dịch phía trên chuyển sang màu xanh tím

- Kết quả: thấy bọt còn bền vững sau 15 phút

 Định tính tannin

Chiết 10 g dược liệu bằng nước trên bếp cách thủy trong 15 - 20 phút Để nguội, lọc lấy dịch lọc làm phản ứng định tính

Phản ứng với dung dịch gelatin (1%)

- Lấy 2 ml dịch lọc, thêm vài giọt dung dịch gelatin - muối NaCl, khuấy đều Làm hai ống chứng để so sánh (một ống chỉ chứa dịch lọc, một ống chỉ chứa thuốc thử gelatin - muối) Sau đó quan sát hiện tượng

- Kết quả: ống thử thấy xuất hiện tủa bông trắng

- Cho vào 2 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống 2 ml dịch chiết Ống thứ nhất thêm

5 giọt NaOH 10% Ống nghiệm thứ hai thêm một lượng tương đương nước cất Đun cách thủy 2 ống trong 2 phút Để nguội, thêm vào mỗi ống 4 ml nước cất

- Kết quả: ống thứ nhất trong hơn ống thứ hai Khi acid hóa ống thứ nhất này trở nên đục tương đương ống thứ hai

- Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5

ml dung dịch Fehling B, đun cách thủy 10 phút và quan sát hiện tượng

- Kết quả: xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch lắng ở đáy ống nghiệm

- Nhận xét: phản ứng dương tính

 Định tính alcaloid

Cân khoảng 10 g bột dược liệu, thấm ẩm bằng NH4OH 25% (bột vừa đủ ẩm), chiết dược liệu với dung môi chloroform bằng bình chiết hồi lưu hoặc bình chiết Soxhlet trong 1 - 2 giờ Dịch chiết sau lắc với dung dịch acid sulfuric 2% Dịch acid này được dùng để kiểm tra alcaloid bằng thuốc thử định tính chung:

Thuốc thử Mayer

- Nhỏ một vài giọt thuốc thử vào dịch chiết

- Kết quả: không thấy có tủa màu trắng ngà xuất hiện

- Nhận xét: phản ứng âm tính

Thuốc thử Dragendorff

- Nhỏ vài giọt thuốc thử vào dịch chiết

- Kết quả: không thấy có kết tủa màu cam đến đỏ xuất hiện

- Nhận xét: phản ứng âm tính

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phương pháp hóa học

STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận sơ bộ

Ghi chú:

(-) âm tính, (+) dương tính không rõ, (++) dương tính rõ, (+++) dương tính rất rõ

Nhận xét: qua các phản ứng định tính trên, sơ bộ kết luận trong lá cây Hồng

3.2.2 Chiết xuất

3.2.2.1 Xác định hàm ẩm dược liệu

Lấy khoảng 2 g mẫu lá Hồng rừng đã làm nhỏ trải đều lên đĩa cân của máy phân tích độ ẩm, đậy đĩa cân và đợi máy tự hiện kết quả Đo 3 lần lấy kết quả trung bình

Độ ẩm của mẫu nghiên cứu xác định được là 10,3% ± 0,6%

3.2.2.2 Chiết xuất

Mẫu lá Hồng rừng sau khi được rửa sạch, làm khô, xay nhỏ, đem cân thu được

10 kg bột lá khô Bột lá khô này được ngâm chiết với ethanol 90%, ở nhiệt độ phòng, sau mỗi 24 giờ rút dịch chiết 1 lần, chiết 3 lần bằng bình chiết, gộp dịch chiết lại Dịch chiết đem cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tại 40˚C thu được 2.150 g cao toàn phần

Phân tán cao toàn phần với một lượng vừa đủ nước nóng ở 60˚C Áp dụng phương pháp chiết lỏng - lỏng, chiết hỗn hợp trên với dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần: n-hexan, dichloromethan, ethyl acetat và n-buthanol

Chiết với dung môi n-hexan: thêm vào hỗn hợp khoảng 2 lít dung môi n-hexan, lắc đều hỗn hợp trong bình chiết, để yên cho dung môi phân lớp, gạn lấy lớp dung môi n-hexan Lớp nước trong bình tiếp tục thêm 2 lít dung môi n-hexan Tiến hành làm lặp lại 4 - 5 lần cho đến khi lớp dung môi hữu cơ chỉ còn màu vàng nhạt Gộp các phân lớp n-hexan lại đem cô quay thu hồi dung môi ở áp suất giảm tại 40˚C được cắn phân đoạn n-hexan (883 g)

Tiếp tục làm tương tự lần lượt với các dung môi: dichloromethan, ethyl acetat, n-buthanol thu được các cao tương ứng là cắn DCM (192,62 g), cắn EtOAc (246,76 g), cắn BuOH (292,6 g) Phần dịch chiết nước còn lại sau khi đã được chiết với các dung môi trên được hòa loãng và tiến hành cô loại nước thu được cắn nước (478,34 g)

Dược liệu khô đã xay nhỏ (10 kg)

Cắn nước (478,34 g) Cắn BuOH (292,6 g)

Dịch chiết nước Dịch chiết n-buthanol

n-buthanol Ngâm EtOAc 24h x 3 lần

Bảng 3.2 Khối lượng các cắn phân đoạn từ dịch chiết ethanol lá Hồng rừng

đoạn

Khối lượng dược liệu (g)

Khối lượng cắn

(g)

% so với dược liệu khô

3.2.3.1 Khảo sát sơ bộ cao toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng

- Dịch chấm sắc ký: cao toàn phần hòa tan hoàn toàn trong methanol

- Bản mỏng sắc ký: bản mỏng silica gel tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức), hoạt hóa ở 110˚C trong 1 giờ, bảo quản trong bình hút

ẩm

- Hệ dung môi khai triển:

Hệ I: Ethyl acetat - Chloroform (60:40)

Hệ II: Dichloromethan - Methanol (96:4)

Hệ III: Toluen - Ethyl acetat - Acid acetic (10:4:1)

Hệ IV: Toluen - Ethyl acetat - Acid acetic (58:33:9)

Tiến hành: chấm dịch chấm sắc ký đã chuẩn bị ở trên lên bản mỏng Sấy nhẹ

cho khô lần lượt đặt vào bình sắc ký đã bão hòa hệ dung môi trên Sau khi khai triển sắc ký xong, lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc ký, sấy nhẹ cho bay hơi bớt dung môi Quan sát bản mỏng ở ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366

nm, sau đó hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10%/ EtOH 96%, hơ nóng trên bếp điện ở 120˚C trong thời gian thích hợp

Kết quả: sau khi khảo sát cao toàn phần với các hệ dung môi I, II, III, IV nhận

thấy sắc kí đồ chạy bởi hệ II (DCM - MeOH) cho nhiều vết rõ ràng nhất Hình 3.9.

- Ở ánh sáng thường, quan sát thấy có 1 vết mờ màu vàng nhạt

- Ở ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, quan sát thấy có 4 vết trong đó 2 vết rõ màu nâu đen, 2 vết mờ

- Ở ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm, quan sát thấy có 9 vết trong đó 4 vết màu hồng cam, 1 vết rõ màu xanh, 4 vết mờ

- Sau khi phun thuốc thử, quan sát ở ánh sáng thường thấy có 7 vết trong đó có 1 vết to màu tím hồng, 3 vết màu tím nhạt, 1 vết màu vàng nâu, 2 vết màu vàng nhạt

Hình 3.9 Hình ảnh TLC của cao toàn phần với hệ II (DCM:MeOH 96:4)

Chú thích:

a Không phun thuốc thử, ánh sáng thường

b Không phun thuốc thử, ánh sáng tử ngoại 254 nm

c Không phun thuốc thứ, ánh sáng tử ngoại 366 nm

d Phun thuốc thử, ánh sáng thường

Nhận xét: qua khảo sát TLC trên, ta thấy hệ II (DCM:MeOH 96:4) cho kết quả

tách tốt nhất

3.2.3.2 Khảo sát sơ bộ thành phần cắn phân đoạn EtOAc bằng sắc ký lớp mỏng

- Dịch chấm sắc ký: cắn phân đoạn EtOAc hòa tan hoàn toàn trong methanol

- Bản mỏng sắc ký: bản mỏng silica gel tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức), hoạt hóa ở 110˚C trong 1 giờ, bảo quản trong bình hút

ẩm