Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Bù ốc leo (Dregea volubilis (L.f.) Benth.ex Hook.f.) họ Thiên lý (Asclepiadaceae)

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯỜNG THỊ ÚT LIÊN 1401355 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY BÙ ỐC LEO Dregea volubilis L.. Về định tính các nhóm chất hóa

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HÀ NỘI - 2019

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LƯỜNG THỊ ÚT LIÊN

1401355 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA

CÂY BÙ ỐC LEO

(Dregea volubilis (L f.) Benth ex Hook.f.),

HỌ THIÊN LÝ (Asclepiadaceae) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

2 Bộ môn Dược liệu Trường Đại học Dược Hà Nội

LỜI CẢ M ƠN

Trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thành khóa luận tốt nghiệp tại Bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Dược liệu, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của thầy cô, anh chị, bạn bè và gia đình

Lời cảm ơn đầu tiên tôi xin gửi đến PGS TS Nguyễn Hoàng Tuấn, người thầy tận

tụy đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin trân trọng cảm ơn cảm ơn PGS TS Đỗ Thị Hà đã tạo điều kiện, định hướng

dẫn dắt tôi từ những ngày đầu bỡ ngỡ đến với khóa luận

Xin chân thành cảm ơn Dược sĩ Vũ Thị Diệp, người chị, người thầy đáng quý đã đồng hành, hết mực chỉ bảo, động viên, giúp đỡ tôi trong quãng thời gian thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đã tận tình dạy bảo tôi trong suốt những năm tháng ngồi trên ghế nhà trường

Xin cảm ơn toàn thể các anh chị, bạn bè cùng làm việc, nghiên cứu trên bộ môn Dược liệu và Viện Dược liệu đã giúp đỡ, động viên tôi trong khoảng thời gian thực hiện khóa luận này

Cuối cùng, cho tôi được gửi sự biết ơn vô hạn tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn ở bên cạnh, động viên, ủng hộ tôi trong suôt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5, năm 2019

Sinh viên

Lường Thị Út Liên

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về họ Thiên lý Aclepiadaceae 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật họ Thiên lý 2

1.1.3 Phân loại thực vật họ Thiên lý 2

1.2 Tổng quan về chi Dregea 5

1.2.1 Đặc điểm hình thái thực vật của chi Dregea 5

1.2.2 Phân bố 5

1.3 Tổng quan về loài Dregea volubilis 7

1.3.1 Đặc điểm thực vật 7

1.3.2 Sinh thái 8

1.3.2 Phân bố 8

1.3.3 Thành phần hóa học 8

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.2.1 Nội dung nghiên cứu đặc điểm thực vật 16

2.2.2 Nội dung nghiên cứu hóa học 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu cảm quan 16

2.3.2 Phương pháp giám định tên khoa học 16

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu hiển vi 17

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu hóa học 17

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 24

3.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật 24

3.1.1 Đặc điểm thực vật 24

3.1.2 Giám định tên khoa học 26

3.1.3 Đặc điểm vi phẫu lá 26

3.1.4 Đặc điểm vi phẫu thân 27

3.1.5 Đặc điểm bột lá 28

3.1.6 Đặc điểm bột thân 29

3.2 Nghiên cứu về hóa học 30

3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học 30

3.2.2 Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ Bù ốc leo 31

3.3 Bàn luận 37

3.3.1 Về thực vật 37

3.3.2 Về định tính các nhóm chất hóa học trong dược liệu 38

3.3.3 Về chiết xuất và phân lập chất 38

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

4.1 Kết luận 40

4.2 Kiến nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chi Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

Herbarium of National University khối lượng/thể tích

Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

Phản ứng Sắc ký lớp mỏng

Số thứ tự Phân họ Tài liệu tham khảo Thành phố

Tông thể tích/thể tích Thuốc thử Ánh sáng tử ngoại (Ultra violet) doublet

singlet triplet

Độ dịch chuyển hóa học (đơn vị là ppm) Hằng số tương tác (đơn vị là Hz)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Hệ thống phân loại thực vật họ Thiên lý ở Việt Nam 3

Bảng 1.2 Các loài thuộc chi Dregea ở Việt Nam và phân bố của chúng 6

Bảng 1.3 Thành phần hóa học của loài Dregea volubilis 10 Bảng 3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất của bộ phận trên mặt đất

Bù ốc leo

30

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR của DV1 và taraxerol 36

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình ảnh loài Dregea volubilis (L f) Benth & Hook 8 Hình 1.2 Các hợp chất polyoxypregnan glycosid phân lập được từ Bù ốc leo 12 Hình 1.3 Các hợp chất polyhydoxy pregnan phân lập được từ Bù ốc leo 13 Hình 1.4 Hợp chất flavonoid phân lập được từ cây Bù ốc leo 13 Hình 1.5 Các hợp chất pentacyclic triterpenoid phân lập được từ cây Bù ốc leo 14 Hình 1.6 Một số hợp chất hợp chất phenolic có trong cây Bù ốc leo 14 Hình 3.1 Ảnh chụp cây và một số bộ phận của cây Bù ốc leo 25 Hình 3.2 Ảnh vi phẫu lá Bù ốc leo 27 Hình 3.3 Ảnh vi phẫu thân Bù ốc leo 28 Hình 3.4 Một số đặc điểm của bột lá Bù ốc leo 29 Hình 3.5 Một số đặc điểm của bột thân Bù ốc leo 30 Hình 3.6 Sơ đồ điều chế các cao chiết từ dược liệu Bù ốc leo 32 Hình 3.7 Sắc ký đồ của cao dichlomethan từ Bù ốc leo 33 Hình 3.8 Sơ đồ phân lập cao dichlomethan từ Bù ốc leo 34 Hình 3.9 Hình ảnh chất phân lập được 34 Hình 3.10 Cấu trúc hóa học của DV1 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Bù ốc leo (Dregea volubilis) mọc ở một số vùng của nước ta (Ninh Bình,

Nghệ An, Ninh Thuận…) [2], [10] Từ lâu ông cha ta đã sử dụng lá của loài cây này để làm rau ăn Với tính vị đắng, cay, thanh mát, có tác dụng thanh nhiệt, tiêu viêm, trừ thấp, chỉ thống, chỉ thổ Bù ốc leo được dùng để trị mụn nhọt, áp xe, cảm mạo, viêm phế quản, chữa ung thư thực quản, đau dạ dày, các bệnh về mắt, trị rắn cắn [2] Ngoài ra nhân dân còn dùng rễ, thân mềm như một vị thuốc gây nôn, long đờm [10], và dùng lớp bột nâu trên quả để trị bệnh cho gia súc [10]

Trên thế giới đã có một số thử nghiệm lâm sàng trên chuột chỉ ra những tác dụng đáng chú ý của cây như: chống viêm, chống đục thủy tinh thể [12], [16] Ngoài ra còn

có nhiều nghiên cứu khác chỉ ra hoạt tính chống ung thư, tác dụng trên hệ thần kinh trung ương [23], diệt côn trùng [17], giun sán…[15], [18]

Tuy nhiên ở Việt Nam, cây Bù ốc leo và những công dụng của nó ít được người dân biết đến và chưa có nhiều nghiên cứu về loài cây này Do đó, nghiên cứu về cây là rất cần thiết để góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu về Bù ốc leo làm nền tảng cho việc khai thác sử dụng dược liệu này bền vững, an toàn, hiệu quả Đồng thời giúp nhận biết, tránh nhầm lẫn và ứng dụng dược liệu trong phòng, chữa bệnh một cách hợp lý, khoa học

Xuất phát từ những thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành

phần hóa học của cây Bù ốc leo (Dregea volubilis (L f.) Benth ex Hook.f.), họ Thiên

lý (Asclepiadaceae)” được thực hiện với những mục tiêu sau:

1 Mô tả đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi phẫu thân, lá, đặc điểm vi học bột thân, bột lá và giám định tên khoa học của cây Bù ốc leo

2 Định tính các nhóm chất trong cây bằng phản ứng hóa học

3 Chiết xuất, phân lập và xác định một hợp chất từ bộ phận trên mặt đất của cây

Bù ốc leo

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về họ Thiên lý Aclepiadaceae

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo Thực vật học [6] vị trí phân loại của họ Thiên lý (Asclepiadaceae) trong giới thực vật như sau:

Giới (Kingdom) Thực vật (Planta)

Ngành (Division) Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp (Class) Hai lá mầm (Magnoliopsida)

Phân lớp (Subclass) Bạc hà (Lamiidae)

Bộ (Order) Long đởm (Gentianales)

Họ (Family) Thiên lý (Asclepiadaceae)

1.1.2 Đặc điểm thực vật họ Thiên lý

Cây thường là dây leo, cây cỏ nhiều năm, cây bụi, ít khi là cây gỗ, lá đơn, nguyên, thường mọc đối, đôi khi mọc vòng Không có lá kèm Toàn cây có nhựa mủ trắng hay trong Cụm hoa thường là xim, có khi có chùm hoặc trông như tán Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5 Đài 5 dính nhau ở gốc thành ống ngắn Tràng 5, dính liền thành hình ống, tiền khai hoa vặn, thường có phần phụ ở mặt trong và có tuyến mật Nhị 5, bao phấn dính với núm nhụy hình khối 5 mặt; hạt phấn dính nhau tạo thành khối 4 hạt phấn hoặc hình thành khối phấn có chuôi và gót dính để dính vào sâu bọ nhờ đó khối phấn này sẽ được đưa sang hoa khác để thụ phấn [6] Bộ nhị có cấu trúc đặc biệt là cơ quan truyền phấn –

là cấu trúc đặc trưng của họ Thiên lý (Asclepiadaceae), đặc điểm quan trọng để phân biệt với họ Trúc đào (Apocynaceae) [1] Bộ nhụy gồm 2 lá noãn, bầu trên, rời nhau ở bầu và vòi, chỉ dính nhau ở núm nhụy, nhiều noãn Quả gồm 2 đại, hạt thường có mào lông ở một đầu [6]

1.1.3 Phân loại thực vật họ Thiên lý

Họ Thiên Lý (Asclepiadaceae R Br.) có khoảng 250 chi với hơn 2000 loài, phân

bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [2] Tính đến năm 2007, kể từ công trình phân loại họ Thiên lý (Aclepiadaceae R Br.) ở Đông Dương của J Costatin (1912), là người đầu tiên nghiên cứu phân loại một cách hệ thống và tương đối đầy đủ về họ này

đã được công bố trong Thực vật chí đại cương Đông Dương, đã hơn 90 năm trôi qua chưa có công trình khảo cứu phân loại nào về loài này ở Việt Nam Nó vẫn là công trình

thực vật chí duy nhất để tra cứu, định loại họ Thiên lý ở Đông Dương và ở Việt Nam [4]

Cho đến năm 2017, Việt Nam có 49 chi với 143 loài, phân bố trong cả nước Giá trị tài nguyên có khoảng 60 loài (35 chi), quan trọng nhất là làm thuốc, ngoài ra làm cảnh, rau ăn…[2]

Trên cơ sở hệ thống phân loại của S Liede & F Albert (1994), và theo thực vật chí Việt Nam tập 15, họ Thiên lý ở Việt Nam được xếp trong 3 phân họ, 6 tông và 49 chi, 143 loài; trong đó có 1 chi và 13 loài chưa đủ thông tin như sau:

Bảng 1.1: Hệ thống phân loại thực vật họ Thiên lý ở Việt Nam [1], [2]

(1 tông, 3 chi, 9 loài trong đó

có 2 loài chưa đủ thông tin)

Trib.2 Secamoneae

(3 chi, 9 loài, trong đó có 2 loài chưa đủ thông tin)

12 Toxocarpus (7 loài, trong

đó có 2 loài chưa đủ thông tin)

13 Genianthus (1 loài)

14 Secamone (1 loài)

Subfam.3 Aclepiadoideae

(4 tông, 34 chi, 117 loài,

trong đó 10 loài chưa đủ

thông tin)

Trib.3 Fockeae

(1 chi, 1 loài)

15 Fockea (1 loài)

Trib.4 Marsdenieae 16 Hoya (31 loài, trong đó 2

loài chưa đủ thông tin)

(17 chi, 80 loài, trong đó 5 loài chưa đủ thông tin)

17 Dischidia (13 loài, trong

đó 1 loài chưa đủ thông tin)

24 Gymnema (7 loài, trong đó

2 loài chưa đủ thông tin)

33 Ceropegia (4 loài, trong

đó 2 loài chưa đủ thông tin)

41 Cynanchum (6 loài, trong

đó 2 loài chưa đủ thông tin)

42 Pentatropis (2 loài)

43 Merrillanthus (1 loài)

44 Tylophora (9 loài, trong

đó 1 loài chưa đủ thông tin)

1.2 Tổng quan về chi Dregea

1.2.1 Đặc điểm hình thái thực vật của chi Dregea

Chi Dregea gồm các loài thường là cây bụi trườn, leo hay cỏ bò, không có rễ phụ

phát triển trên thân Lá mọc đối Cụm hoa xim hình tán Thùy đài nhỏ, hình trứng nhọn đầu đôi khi tù; gốc đài không có hoặc có 5 tuyến Tràng hình bánh xe; tràng không dính nhau thành ống đứng, cánh hoa vặn, phủ nhau bên phải Tràng phụ đơn, gồm 5 vảy nạc, hình cầu, dính với cột nhị-nhụy Chỉ nhị dính nhau; bao phấn hai ô; trung đới kéo dài thành phần phụ; hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh; cơ quan truyền phấn có gót đính và 2 chuôi; khối phấn hướng lên; chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn Đầu nhụy hình nón hay gồ ghề; đỉnh bầu không thót lại thành hình vòi nhụy Quả nang dày, có các khía lồi dạng cánh [2] Hạt có mào lông [21]

1.2.2 Phân bố

Trên thế giới: trên thế giới có khoảng 12 loài, phân bố ở châu Á và châu Phi [2],

[21]

Ở Việt Nam: chi Dregea là một chi nhỏ của họ Thiên lý Theo thống kê trong

Thực vật chí Việt Nam tập 15 - Họ Thiên lý (Asclepiadaceae) do Trần Thế Bách biên

soạn, tính đến năm 2017, chi Dregea ở Việt nam có 2 loài: Bù ốc leo (Dregea volubilis (L f.) Benth & Hook.) và Bù ốc Đà Lạt (Dregea cuneifolia Tsiang & P T Li) [2] Tuy

nhiên, năm 2011, Trần Thế Bách và cộng sự khi nghiên cứu thực địa tại khu vực Tây

Nguyên, Vườn quốc gia Kon Ka Kinh đã phát hiện một loài Dregea chưa xác định Khi

so sánh với tiêu bản của các loài Dregea đã biết, năm 2018, loài này được xác định là loài mới, có tên khoa học là Dregea taynguyenensis T.B Tran & Rodda [15]

KHÓA ĐỊNH LOẠI CÁC LOÀI THUỘC CHI DREGEA Ở VIỆT NAM [2]

1A Phiến lá hình trứng rộng-hình tim Khối phấn ngắn hơn 0,5 mm Bầu có lông……

……… … 1 D volubilis 1B Phiến lá hình thuôn Khối phấn dài 0,6 mm Bầu nhẵn ……… 2 D cuneifolia

1C Phiến lá hình elip thuôn Khối phấn ngắn hơn 0,58 mm Bầu nhẵn………

- Việt Nam: Lạng Sơn (Hữu Lũng: Hữu Liên), Ninh Bình (Vườn quốc gia Cúc Phương), Nghệ An (Tương Dương: Tam Đình), Ninh Thuận (Phan Rang-Tháp Chàm, Ninh Hải, Vườn quốc gia Núi Chúa), Tp Hồ Chí Minh và một số tỉnh Trung và Nam Bộ

- Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia, Indonexia

[2], [7], [10]

- Việt Nam: Lâm Đồng (Đà Lạt)

- Trung Quốc (Quảng Tây)

1.3 Tổng quan về loài Dregea volubilis

Cây leo dài đến 12 m Cành màu xám tái, vỏ có bì khổng, cành non xanh, nhẵn

Lá mọc đối; phiến lá hình trứng rộng, cỡ 7-18 x 4-17 cm, nhẵn hay có lông mềm; đỉnh nhọn hay có mũi ngắn; gốc hình tim nông; gân bên 4 cặp; cuống lá dài 2,5-6 cm [2], [21]

Cụm hoa rũ xuống, nhiều hoa, xếp thành xim, dạng tán; cuống cụm hoa dài 2-6

cm, có lông Cuống hoa dài 2-2,5 cm Hoa màu xanh hay màu xanh-vàng nhạt, thơm Thùy đài hình trứng-thuôn, dài 2,5-3 mm, có lông, tràng hoa hình bánh xe, nhẵn; thùy tràng hình trứng rộng, vặn, phủ nhau bên phải, cỡ 6-12 x 5-12 mm, có lông Tràng phụ đơn, gồm 5 vảy nạc, màu xanh-màu vàng nhạt, đường kính 4-4,5 mm Chỉ nhị dính nhau; bao phấn hai ô; trung đới kéo dài thành phần phụ màu trắng; hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh; cơ quan truyền phấn có gót đính và 2 chuôi; khối phấn hướng lên, thuôn; chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn Bầu có lông Quả đại, hình trứng hẹp, cỡ 10-15 x 3-4 cm Hạt hình trứng dẹt cỡ 1,2 x 0,6 cm; mào lông dài 4,5 cm [2], [7], [21]

Hình 1.1 Hình ảnh loài Dregea volubilis (L f) Benth & Hook [2]

1 cành mang hoa; 2 hoa; 3 đài (mở ra); 4 tràng (mở ra); 5 tràng phụ, cột nhị nhụy;

6 cơ quan truyền phấn và khối phấn (pollinarium); 7 nhụy; 8 quả; 9 hạt;

1.3.2 Sinh thái

Bù ốc leo ra hoa tháng 4-9, mùa quả tháng 7-12 Mọc ở các trảng cây bụi hay các

đồi cây rải rác, thường gặp ở các bờ nước [2], [7]

1.3.2 Phân bố

Ở Việt Nam, Bù ốc leo thường phân bố ở Lạng Sơn (Hữu Lũng - Hữu Liên), Ninh Bình (Vườn quốc gia Cúc Phương), Nghệ An (Tương Dương: Tam Đình), Ninh Thuận (Phan Rang-Tháp Chàm, Ninh Hải, Vườn quốc gia Núi Chúa), Hồ Chí Minh, một

số tỉnh Trung và Nam Bộ và một số nơi khác [2], [7], [10]

1.3.3 Thành phần hóa học

Nghiên cứu định tính cho thấy toàn cây Dregea volubilis chứa các nhóm chất:

terpen, sterol, flavonoid, và glycosid…[12] Lá chứa alcaloid, glycosid, steroid, phenol, đường, saponin, courmarin và phytosterol; vỏ thân chứa polyphenol, flavonoid, alcaloid, proanthocyanydin; quả chứa alcaloid, terpenoid, steroid, courmarin, tannin, protein, phenolic, carbohydrat, glycosid, tinh bột, phytosterol, lipid, aminoacid, lignin, flavonoid [13]

Đáng chú ý rằng, khi so sánh thành phần hóa học giữa mẫu thu được ở Thái Lan (do Yoshimura và cộng sự thực hiện, năm 1983-1985) và mẫu thu được ở Ấn Độ nhận thấy có sự khác nhau đáng kể về phần sapogenin Ở mẫu Ấn Độ, thành phần gồm drevogenin D và P, còn mẫu ở Thái Lan thành phần gồm drevogenin A, dervyssogenin

K2, marsectohexol và derbyssogenin G khác nhau ít hay nhiều ở thành phần carbohydrat Hơn nữa, chỉ mẫu ở Ấn Độ chứa flavonol [23]

Do vậy thành phần hóa học của cây còn phụ thuộc vào điều kiện sinh thái khác nhau

Bảng 1.3 Thành phần hóa học của loài Dregea volubilis

1 Polyoxypregnan glycosid

drevogenin-D-3-O-β-D-glucopyranosyl (1→4)-6-deoxy-3-O-methyl-β-D-

allopyranosyl cymaropyranosyl (1→4)-β-D-

(1→4)-β-D-cymarosepyranosid (1)

[23]

drevogenin D-3-O-β-D-glucopyranosyl (1→4)-6-deoxy-3-O-methyl-β-D-

allopyranosy cymaropyranosyl (1→4)-β-D-

(1→4)-β-D-digitoxopyranosid (2 )

drevogenin P-3-O- β-D-glucopyranosyl (1→4)-6-deoxy-3-O-methyl-β-D-

allopyranosy cymaropyranosyl (1→4)-β-D-

(1→4)-β-D-cymaropyranosid (3)

drevogenin A

3-O-3-O-methyl-6-deoxy-oleandropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-

β-D-allopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosid (4)

[28]

drevogenin A (1→4)-3-O-methyl-6-deoxy-β-D-

3-O-β-D-glucopyranosyl-oleandropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-

allopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosid (5)

drevogenin A

3-O-3-O-methyl-6-deoxy-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-

β-D-allopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosid (6)

drevogenin A (1→4)-3-O-methyl-6-deoxy-β-D-

3-O-β-D-glucopyranosyl-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-

allopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosid (7)

drevogenin C (1→4)-3-O-methyl-6-deoxy-β-D-

3-O-β-D-glucopyranosyl-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-

allopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosid (8)

drebyssogenin K2

3-O-3-O-methyl-6-oleandropyranosyl-(1→4)-β-D-

deoxy-β-D-allopyranosyl-(1→4)-β-D-

cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosid (9)

drebyssogenin K2

3-O-3-O-methyl-6-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-

deoxy-β-D-allopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosid (10)

2 Polyhydoxy pregnan

drevogenin A (11), dregealol (12), volubilogenon (13), volubilol (14), isodrevogenin P (15) ,17α-marsdenin (16), drevogenin D (17), drevogenin P (18), ß-sitosterol (19), drebbysogenin

R 1 R 2 R 3 R 4 R 1 R 2 R 3 R 4 (4): Ra Ac isoval O (7): Rd Ac isoval O (5): Rb Ac isoval O (8): Rd Cin Ac O (6): Rc Ac isoval O (9): Ra H H

(10): Rc H H

Hình 1.2 Các hợp chất polyoxypregnan glycosid phân lập được từ Bù ốc leo [23], [28]

(12) R1 = H, R2= tigloyl (13) R1 = OH, R2 = H (14) R1 = OH, R2 = H (15) R1 = R2 = H (17) R1 = R2 = H (16) R1 = H, R2 = OH

(11)

(18) (19)

Hình 1.3 Các hợp chất polyhydoxy pregnan phân lập được từ Bù ốc leo [22] (20)

Hình 1.4 Hợp chất flavonoid phân lập được từ cây Bù ốcleo [13], [15]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất (lá, thân, cụm hoa, quả) được thu hái tại bản Vàng Pheo, xã Mường So, huyện Phong Thổ, tỉnh Lai Châu Tiêu bản thực vật khô có cành mang lá, cuống lá, phiến lá, cụm hoa và đang được lưu giữ tại Bảo tàng Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội với mã số tiêu bản HNU

024062 (Phụ lục 2) Mẫu được thu hái vào ngày 25/4/2018 Sau khi thu hái, một phần thân và lá được được bảo quản trong ethanol 60º để làm vi phẫu thực vật Phần thân và

lá còn lại được làm nhỏ, sấy khô ở 50ºC, bảo quản trong túi nilon sạch làm nguyên liệu nghiên cứu về mặt hóa học và làm mẫu vi học bột (thân, lá)

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

 Dụng cụ, thiết bị, máy móc:

- Tủ sấy Memmert, Binder-FD115

- Máy cắt vi phẫu cầm tay, dao, bộ dụng cụ nhuộm tiêu bản

- Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm, đũa thủy tinh, pipet, bình gạn, phiến kính, lam kính…

- Kính hiển vi quang học LEICA DM 1000

- Máy cô quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi)

- Đèn tử ngoại CAMAG

- Cột sắc ký dùng chất hấp phụ là silicagel F254 cỡ hạt 0,04-0,063 mm (Merck)

- Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C

- Máy ảnh kỹ thuật số SONY Cybershot

- Máy đo phổ:

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Brucker Avance 500 Hz (Viện Hóa học)

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy Melting point M-560

 Hóa chất, dung môi:

- Dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: javel, cloralhydrat, acid acetic 5%, xanh methylen, đỏ son phèn

- Dùng trong nghiên cứu thành phần hóa học: TT Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat, TT diazo mới pha, FeCl3 5%, geletin 1%, chì acetat 5%, TT Lugol, dung

dịch natri nitroprussiat, TT ninhydrin 3%, ethanol 96%, n-hexan, diclomethan, ethyl acetat, methanol, n-butanol, toluen, acid acetic, acid formic…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nội dung nghiên cứu đặc điểm thực vật

- Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu cây Bù ốc leo thu hái ở Lai Châu

- Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

- Mô tả đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu

+ Vi phẫu: Lá, thân

+ Bột: Lá, thân

2.2.2 Nội dung nghiên cứu hóa học

- Định tính sơ bộ các nhóm chất thường gặp trong thân và lá cây Bù ốc leo bằng các phản ứng hóa học

- Khảo sát các thành phần có trong dịch chiết phân đoạn dichlomethan của bộ phận trên mặt đất cây Bù ốc leo bằng sắc ký lớp mỏng

- Phân lập các thành phần có trong phân đoạn dichloromethan của bộ phận trên mặt đất cây Bù ốc leo bằng phương pháp sắc ký cột

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu cảm quan

Quan sát và mô tả đặc điểm thực vật, hình dáng, kích thước, màu sắc, mùi bằng mắt thường và chụp ảnh trong điều kiện có đủ ánh sáng tự nhiên, tốt nhất là ánh sáng mặt trời

2.3.2 Phương pháp giám định tên khoa học

Thu thập các mẫu cây Bù ốc leo ở Lai Châu Các mẫu sau khi thu thập được xử

lý và làm tiêu bản theo quy trình làm tiêu bản trong tài liệu [5] Đối chiếu với các mô tả trong các tài liệu chuyên sâu về thực vật như:

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu hiển vi

- Đặc điểm vi phẫu: Mẫu dược liệu (lá, thân) được cắt, nhuộm, lên tiêu bản theo các bước như trong tài liệu [5] và chụp ảnh

- Đặc điểm bột: Lá và thân của dược liệu được nghiền nhỏ thành bột bằng thuyền tán, rây lấy bột mịn qua rây 180, lên tiêu bản và quan sát, mô tả đặc điểm của bột và chụp ảnh [9]

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu hóa học

2.3.4.1 Định tính các nhóm chất thường gặp trong bộ phận trên mặt đất của Bù ốc leo bằng các phản ứng hóa học

Định tính sơ bộ các nhóm chất: tiến hành định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học đặc trưng cho từng nhóm chất theo các tài liệu [3], [4]

Quy ước: Ống nghiệm nhỏ: dung tích 5 ml; ống nghiệm lớn dung tích 20 ml

a Định tính các thành phần trong dịch chiết ether dầu hỏa

Cân khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình chiết soxhlet Chiết bằng ether dầu hỏa đến khi dung môi trong bình chiết không màu Dịch chiết đem cất thu hồi bớt dung môi Dịch chiết đậm đặc thu được dùng để làm các phản ứng định tính chất béo, phytosterol và carotenoid

b Định tính các thành phần trong dịch chiết ethanol

Bã dược liệu sau khi chiết bằng ether dầu hỏa để bay hơi dung môi đến khô

Chiết hồi lưu với 50 ml ethanol 90o trong 30 phút Dịch chiết được lọc và cô còn

10 ml để làm các phản ứng định tính flavonoid, coumarin, saponin, acid hữu cơ, acid amin và đường tự do

 Định tính saponin:

- Phản ứng tạo bọt: cho vào ống nghiệm lớn 1 g bột dược liệu, thêm 5 ml nước

Lắc mạnh trong 5 phút Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt Nếu bọt bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin

- Phản ứng Salkowski: lấy 10 ml dịch chiết cồn cho vào bình cầu và thêm 10 ml

acid sulfuric loãng Đun cách thủy sinh hàn ngược trong 4 giờ Để nguội và chiết với cloroform Lấy khoảng 2 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm Thêm từ từ 1 ml acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm, mặt tiếp xúc giữa hai lớp xuất hiện vòng màu tím

 Định tính coumarin

- Phản ứng mở và đóng vòng lacton: cho vào hai ống nghiệm mỗi ống 1 ml

dịch chiết ethanol, ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên Sau đó đun cả hai ống nghiệm trên cách thủy sôi trong vài phút Ống thứ nhất có màu vàng xuất hiện Sau đó thêm vào mỗi ống 2 ml nước cất thấy ống thứ nhất trong hơn ống thứ hai,

nhưng khi acid hóa thì cả hai ống đều đục như nhau (phản ứng dương tính)

- Phản ứng với thuốc thử diazo: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ethanol,

thêm vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy tới sôi, để nguội, thêm vài giọt thuốc thử diazo (mới pha), thấy xuất hiện tủa màu đỏ gạch (phản ứng dương tính)

- Vi thăng hoa: cho vào một lọ penicillin một ít dịch chiết ethanol Cô cách thủy

cho đến khi bay hơi hết ethanol rồi đậy lên miệng lọ một phiến kính, trên có một ít bông thấm nước và tiếp tục đun Lấy phiến kính và nhỏ giọt KI 10%; soi kính hiển vi thấy có tạo tinh thể màu nâu

 Định tính flavonoid

- Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda): cho 2 ml dịch chiết ethanol vào một

ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại, rồi thêm 3 – 5 giọt acid HCl đậm đặc, đun nóng cách thủy sau vài phút thấy xuất hiện màu tím đỏ (phản ứng dương tính)

- Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%: cho 2 ml dịch chiết ethanol vào một ống

nghiệm, thêm 2-3 giọt FeCl3 5%, thấy dung dịch có màu xanh sẫm

- Phản ứng với kiềm: nhỏ vài giọt dịch chiết ethanol lên một mảnh giấy lọc, hơ

khô rồi đặt mảnh giấy lên miệng lọ amoniac đặc thấy màu vàng hiên rõ, khi soi dưới đèn tử ngoại thấy có màu vàng sáng (phản ứng dương tính)

 Định tính acid hữu cơ

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ethanol và cô tới cắn Hòa cắn trong 1 ml

nước và thêm vài tinh thể natri carbonat thấy có bọt khí nổi lên

- Ống 1: 1 ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Mayer Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng hoặc vàng nhạt

- Ống 2: 1 ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Bouchardat Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa nâu

- Ống 3: 1 ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Dragendorff Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa vàng cam đến đỏ

 Định tính anthranoid (phản ứng Borntraeger)

Cho vào ống nghiệm 1 g bột dược liệu, thêm dung dịch H2SO4 25%, tới ngập dược liệu rồi đun sôi trong vài phút Lọc dịch chiết vào bình gạn, để nguội rồi chiết trên bình gạn với 5 ml ether Lấy 1 ml dịch ether cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml KOH 10%, quan sát màu của lớp dung dịch KOH (đỏ)

- Ống 2: lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% (TT), phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa bông

- Ống 3: lấy 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%, phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa bông trắng

 Định tính glycosid tim

Cân khoảng 5 g bột dược liệu cho vào một bình nón dung tích 100 ml, thêm 50

ml nước cất, ngâm ở nhiệt độ phòng 24 giờ Lọc dịch chiết vào cốc có mỏ Loại tạp bằng lượng thừa dung dịch chì acetat 30%, lọc loại tủa Dịch lọc chuyển qua bình gạn, chiết trên bình gạn với CHCl3 hai lần, mỗi lần 10 ml Dịch chiết được chia vào các ống nghiệm

sạch rồi cô đến cắn, để làm các phản ứng sau:

- Phản ứng Liebermann

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 1 ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống 450 Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá

Pha thuốc thử Baljet: Cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch acid picric 1% và

9 phần dung dịch NaOH 10% Lắc đều

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha cho đến khi xuất hiện màu đỏ da cam So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim thấy ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng

- Phản ứng Legal

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều sẽ xuất hiện màu đỏ cam