NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ TẠO CHẾ PHẨM PHÒNG CHỐNG KHỐI U TỪ CÂY HOÀN NGỌC PSEUDERANTHEMUM PALATIFERUM (NEES) RALDK

BỘ CÔNG THƯƠNG DNTN TRÀ HOÀN NGỌC CHƯƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TRỌNG ĐIỂM QUỐC GIA PHÁT TRIỂN CÔNG NGHIỆP HÓA DƯỢC ĐẾN NĂM 2020 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ

Trang 1

BỘ CÔNG THƯƠNG DNTN TRÀ HOÀN NGỌC

CHƯƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TRỌNG ĐIỂM QUỐC GIA PHÁT TRIỂN CÔNG NGHIỆP HÓA DƯỢC

ĐẾN NĂM 2020

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

“NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ TẠO CHẾ PHẨM

PHÒNG CHỐNG KHỐI U TỪ CÂY HOÀN NGỌC

PSEUDERANTHEMUM PALATIFERUM (NEES) RALDK.”

Mã số: CNHD ĐT 030/11-12

Cơ quan chủ trì đề tài: DNTN Trà Hoàn Ngọc

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Minh Hằng

HÀ NỘI - 2012

Trang 2

ĐẾN NĂM 2020

Trang 3

DOANH NGHIỆP TƯ NHÂN

TRÀ HOÀN NGỌC

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KHCN

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu quy trình công nghệ tạo chế phẩm phòng

chống khối u từ cây Hoàn Ngọc Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk

Mã số đề tài: CNHD.ĐT.030/11-12

Thuộc:

- Chương trình (tên, mã số chương trình): Chương trình nghiên cứu khoa

học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm 2020

2 Chủ nhiệm đề tài:

Họ và tên: Nguyễn Thị Minh Hằng

Ngày, tháng, năm sinh: 07/08/1979 Nam/ Nữ: Nữ

Fax: 04-37917054 E-mail: minhhang@imbc.vast.vn

Tên tổ chức đang công tác: Viện Hóa sinh biển - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Địa chỉ tổ chức: Viện Hóa sinh biển

Địa chỉ nhà riêng: số 41 ngõ 132 phố Khương Trung, Thanh Xuân, Hà Nội

3 Tổ chức chủ trì đề tài:

Tên tổ chức chủ trì đề tài: Doanh nghiệp Tư nhân Trà Hoàn Ngọc

Trang 4

Điện thoại: 066 3621121 Fax: 066 3621121

E-mail: hoanngoc7nga@yahoo.com

Website: www.hoanngoctea.com

Địa chỉ: 37 Nguyễn Trọng Cát; F - Hiệp Ninh; Thị Xã Tây Ninh

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Bùi Kim Nga

Số tài khoản: 5700211001399

Ngân hàng: Nông nghiệp và phát triển nông thôn Tây Ninh

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Tỉnh Tây Ninh

Thời gian

(Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

…

Trang 5

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Đối với đề tài:

- Lý do thay đổi (nếu có): Không thay đổi

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Số

TT

Số, thời gian ban

Trang 6

4 Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án:

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1 Viện Hóa sinh

biển - Viện

KHCNVN

Viện Hóa sinh biển - Viện KHCNVN

- Xác định các thành phần tritecpen có trong cây Hoàn Ngọc

- Báo cáo về thành phần các

tritecpen có trong rễ vây Hoàn Ngọc

- Xây dựng quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc

- Báo cáo về quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc

- Thử độc tính cấp độc tính bán trường diễn và hoạt tính kháng u

cả sản phẩm

- Báo cáo về độc tính và hoạt tính kháng u của sản phẩm

2 Viện kiểm

nghiệm thuốc

trung ương

Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương

Xây dựng tiêu chuẩn cơ

sở cho sản phẩm tổng tritecpen từ

rễ cây Hoàn ngọc, kiểm nghiệm sản phẩm theo tiêu chuẩn cơ

sở và đánh giá độ ổn định của sản phẩm

Tiêu chuẩn

cơ sở cho sản phẩm

- Phiếu kiểm nghiệm chất lượng sản phẩm

- Kết luận về

độ ổn định của sản phẩm

- Lý do thay đổi (nếu có): không thay đổi

Trang 7

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1 TS Nguyễn Thị

Minh Hằng

TS Nguyễn Thị Minh Hằng

Nghiên cứu qui trình chiết xuất và thành phần hóa học của sản phẩm

Báo cáo về thành phần trotecpen của cây Hoàn Ngọc, quy trình chiết xuất tổng tritecpen

2 Bùi Phước Hòa Bùi Phước Hòa Trồng, thu hái

và cung cấp nguyên liệu cây Hoàn Ngọc

Báo cáo về tình hình trồng và thu hái cây Hoàn Ngọc

3 Bùi Kim Nga Bùi Kim Nga Trồng, thu hái

và cung cấp nguyên liệu cây Hoàn Ngọc

Báo cáo về tình hình trồng và thu hái cây Hoàn Ngọc

4 PGS TS.Nguyễn

Văn Hùng

PGS TS.Nguyễn Văn Hùng

Báo cáo về thành phần trotecpen của cây Hoàn Ngọc

5 TS Đoàn Thị Mai

Hương

TS Đoàn Thị Mai Hương,

6 TS Phạm Văn

Cường

TS Phạm Văn Cường

Báo cáo về thành phần trotecpen của cây Hoàn

Trang 8

của sản phẩm Ngọc

8 CN Hà Thị Thoa CN Hà Thị Thoa Nghiên cứu

qui trình chiết xuất và thành phần hóa học của sản phẩm

9 TS Đỗ Thị Thảo TS Đỗ Thị Thảo Thử độc tính

và khả năng kháng u

Báo cáo về độc tính và khả năng kháng u

- Lý do thay đổi ( nếu có): Không thay đổi

1 Đi khảo sát tại Vườn thực vật

Bắc Kinh Trung Quốc

Số đoàn: 01 gồm 04 người Kinh phí: 115,9 triệu đồng

- Lý do thay đổi (nếu có): Do sự thay đổi về tỷ giá của USD/VND nên kinh phí

dự toán chỉ đủ cho đoàn 04 người

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

- Lý do thay đổi (nếu có):

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Trang 9

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

1 Tổng quan tài liệu và xây dựng

đề cương

Nguyễn Thị Minh Hằng

2 Nội dung 1: Xây dựng tiêu

chuẩn nguyên liệu

Chăm sóc cây Hoàn Ngọc theo

độ tuổi từng năm và thu hái

nguyên liệu theo từng độ tuổi:

- Thu hái cây Hoàn Ngọc theo

độ tuổi từng năm và xử lí

nguyên liệu thành dạng bột

khô

6/2011

1/2011-Bùi Kim Nga Bùi Phước Hòa và cộng sự

Nghiên cứu thành phần tổng

tritecpen từ cây Hoàn Ngọc

theo độ tuổi từng năm:

- Phân lập các chất tritecpen từ

mẫu cây Hoàn Ngọc

- Xác định cấu trúc hóa học của

các chất được phân lập

6/2011

1/2011-N T Minh Hằng

Ng Văn Hùng Phạm Văn Cường

Đ T Mai Hương

N T Tú Oanh

Hà Thị Thoa Bùi Kim Nga Bùi Phước Hòa

3 Nội dung 2: Nghiên cứu quy

trình công nghệ chiết xuất tổng

tritecpen có trong cây Hoàn

Ngọc

7/2011-8/2011

8/2011

Đ T Mai Hương

N T Tú Oanh

- Nghiên cứu qui trình chiết

xuất tổng tritecpen

- Nghiên cứu qui trình tinh chế

tổng tritecpen

4 Nội dung 3: Xây dựng quy trình

chiết xuất tổng tritecpen từ cây

Hoàn Ngọc ở quy mô 0,5 kg sản

7/2011-8/2011

8/2011

Đ T Mai Hương

N T Tú Oanh

Trang 10

- Hoàn thiện quy trình đã

nghiên cứu ở nội dung trên

11/2011

Đ T Mai Hương

N T Tú Oanh

- Phân lập các chất có trong

sản phẩm tổng tritecpen

- Ghi phổ và xác định cấu trúc

của các chất được phân lập

6 Nội dung 5 Nghiên cứu tính an

toàn tiền lâm sàng của mẫu sản

02/2012

8/2011-Đỗ Thị Thảo Nguyễn Thị Thu

02/2012

8/2011-Đỗ Thị Thảo Nguyễn Thị Thu

Hà

8 Nội dung 7: Xây dựng tiêu

chuẩn cơ sở cho sản phẩm

01/2012

03/2012

08/2011-Thuê khoán chuyên môn tại Viện kiểm nghiệm thuốc TW

9 Tập hợp kết quả và viết báo cáo

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

a) Sản phẩm Dạng I:

Trang 11

Thực tế đạt được

1 Báo cáo về tình hình thu

hái cây Hoàn Ngọc theo

các độ tuổi từng năm

Đúng, đầy đủ các

dữ liệu về diện tích trồng, cách thức chăm sóc và thu hái cây Hoàn Ngọc theo độ tuổi từng năm

Đúng, đầy đủ các dữ liệu về diện tích trồng, cách thức chăm sóc và thu hái cây Hoàn Ngọc theo độ tuổi từng năm

Đúng, chi tiết

và đầy đủ về phương pháp phân lập và cấu trúc của các chất tritecpen

3 Quy trình chiết xuất tổng

tritecpen từ cây Hoàn

Ngọc ở quy mô phòng thí

nghiệm

Quy trình chi tiết, ổn định, đầy

đủ các thông số

kỹ thuật, dễ thực hiện, an toàn,

Quy trình chi tiết, ổn định, đầy đủ các thông số kỹ thuật, dễ thực

Trang 12

hiệu suất cao để chiết xuất tổng tritecpen từ mẫu cây Hoàn Ngọc

hiện, an toàn, hiệu suất cao

để chiết xuất tổng tritecpen

từ mẫu cây Hoàn Ngọc

4 Quy trình chiết xuất tổng

tritecpen từ cây Hoàn

Ngọc hoàn thiện scale-up

lên quy mô 0,5 kg sản

phẩm/mẻ theo con đường

tối ưu nhất

Quy trình chi tiết, ổn định, đầy

đủ các thông số

kỹ thuật đã được tối ưu hóa, dễ thực hiện, an toàn, hiệu suất cao, có thể áp dụng ở quy mô pilot

Quy trình chi tiết, ổn định, đầy đủ các thông số kỹ thuật đã được tối ưu hóa, dễ thực hiện, an toàn, hiệu suất cao, có thể áp dụng ở quy mô pilot

6 Báo cáo về tính an toàn

tiền lâm sàng của sản

phẩm tổng tritecpen

Báo cáo chi tiết, đầy đủ về phương pháp và kết quả nghiên cứu độc tính cấp

và độc tính bán trường diễn của sản phẩm

Báo cáo chi tiết, đầy đủ về phương pháp

và kết quả nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của sản phẩm

7 Báo cáo về hoạt tính

chống khối u của sản

phẩm

Báo cáo chi tiết, đầy đủ về phương pháp và kết quả nghiên cứu hoạt tính chống khối u của sản phẩm

Báo cáo chi tiết, đầy đủ về phương pháp

và kết quả nghiên cứu hoạt tính chống khối u của sản phẩm

c) Sản phẩm Dạng III:

Trang 13

1 01 bài báo đăng trên các

tạp chí chuyên ngành

Nội dung bài báo đáp ứng yêu cầu của các tạp chí gửi đăng

01 bài Planta medica

2 01 bằng sáng chế hoặc

giải pháp hữu ích

01 Cục sở hữu trí

tuệ Việt Nam

d) Kết quả đào tạo:

Theo kế hoạch

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây trồng:

Theo

kế hoạch

2

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

Trang 14

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ

so với khu vực và thế giới…)

Quy trình công nghệ chiết xuất sản phẩm tổng tritecpen từ rễ cây Hoàn Ngọc chưa được công bố trước đây

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…)

Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của đề tài, cây Hoàn Ngọc sẽ được trồng rộng rãi và trở thành cây kinh tế của tỉnh Tây Ninh Bên cạnh đó, sản phẩm dự kiến sẽ có chất lượng tốt, giá thành hợp lý, có khả năng cạnh tranh trong nước

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)

II Kiểm tra định kỳ

Lần 1 11/08/2011 Người chủ trì: Đ/c Phùng

Hà Nhóm thực hiện đề tài về

cơ bản đã thực hiện được các nội dung theo đăng ký, cần đẩy nhanh tiến độ thanh quyết toán tài chính

để xin cấp tiếp kinh phí Lần 2 08/12/2011 Người chủ trì: Đ/c Phùng

Hà Nhóm thực hiện đề tài về

cơ bản đã thực hiện được

Trang 15

các nội dung theo đăng ký theo tiến độ tuy nhiên cần đẩy nhanh tiến độ thanh quyết toán tài chính để kết thúc đề tài đúng hạn III Nghiệm thu cơ sở 21/4/2012 Chủ tịch Hội đồng: TS

Nguyễn Hoài Nam

Các thành viên hội đồng đã cho ý kiến đánh giá nhận xét về kết quả thực hiện đề tài Kết thúc phiên họp, cả

7 thành viên hội đồng đều nhất trí nghiệm thu cấp cơ

Trang 16

ĐẾN NĂM 2020

Mã số: CNHD ĐT 030/11-12

Cơ quan chủ trì đề tài: DNTN Trà Hoàn Ngọc

HÀ NỘI - 2012

Trang 17

MỤC LỤC

I MỞ ĐẦU 1

II TRÍCH DẪN NỘI DUNG THUYẾT MINH CỦA ĐỀ TÀI 8 2.1 Giới thiệu về cơ quan chủ trì đề tài và chủ nhiệm đề tài……… 8

2.2 Mục tiêu của đề tài ……… 9

2.3 Các nội dung nghiên cứu của đề tài ……… 9

2.4 Yêu cầu kỹ thuật, chỉ tiêu chất lượng đối với sản phẩm đạt được 9

2.5 Các điểm sửa đổi so với thuyết minh đề cương nghiên cứu và hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ

10 2.6 Kinh phí thực hiện đề tài theo các khoản chi 11

III CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 12 3.1 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu cây Hoàn Ngọc 12

3.1.1 Quy hoạch và chăm sóc các vùng nguyên liệu cây Hoàn Ngọc theo độ tuổi 12 3.1.2 Chế độ chăm sóc 12

3.1.3 Thu hái và xử lý nguyên liệu 13

3.2 Nghiên cứu thành phần tritecpen của cây Hoàn ngọc theo từng độ tuổi 13

3.2.1 Phương pháp nghiên cứu……… 14

3.2.2 Kết quả và thảo luận……… 15

3.3 Nghiên cứu quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc 32

3.3.1 Nghiên cứu quy trình chiết xuất……… 32

3.3.2 Nghiên cứu quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc với quy mô 0,5 kg sản phẩm/mẻ……… 35

3.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của sản phẩm tổng tritecpen thu được 35

3.4 Nghiên cứu tính an toàn tiền lâm sàng của sản phẩm tổng tritecpen từ rễ cây Hoàn Ngọc……… 36

3.4.1 Nghiên cứu độc tính cấp của sản phẩm………

3.4.1.1 Vật liệu và phương pháp………

36

Trang 18

3.4.1.2 Kết quả và thảo luận 37

3.4.1.3 Kết luận……… 38

3.4.2 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn của sản phẩm……… 38

3.4.2.1 Vật liệu và phương pháp……… 39

3.4.2.2 Kết quả và thảo luận 40

3.4.2.3 Kết luận……… 43

3.5 Nghiên cứu khả năng kháng u của sản phẩm tritecpen từ rễ cây Hoàn Ngọc 44 3.5.1 Vật liệu và phương pháp……… 44

3.5.2 Kết quả và thảo luận 47

3.5.2.1 Kết quả xác định khả năng ức chế khối u của Tritecpen-HN trên chuột gây u thực nghiệm bằng dòng tế bào LLC 47

3.5.2.2 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa máu chuột bị gây u và được uống hoạt chất Tritecpen-HN……… 51

3.5.2.3 Kết quả kiểm tra giải phẫu các cơ quan nội tạng 52

3.5.3 Kết luận……… 53

3.6 Nghiên cứu khả năng kháng u của cao dịch chiết nước từ rễ cây Hoàn Ngọc ………

53 3.6.1 Điều chế cao dịch chiết nước từ rễ cây Hoàn Ngọc……… 53

3.6.2 Nghiên cứu khả năng kháng u của cao dịch chiết nước từ rễ cây Hoàn Ngọc……… 54

3.6.2.1 Vật liệu và phương pháp……… 54

3.6.2.2 Kết quả và thảo luận……… 54

3.6.2.3 Kết quả kiểm tra giải phẫu các cơ quan nội tạng 58

3.6.3 Kết luận……… 59

3.7 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm tổng tritecpen và nghiên cứu độ ổn định của sản phẩm………

3.7.1 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm tổng tritecpen……

60 60 3.7.1.1 Yêu cầu kỹ thuật……… 60

Trang 19

3.7.1.2 Phương pháp thử……… 61

3.7.1 3 Đóng gói, ghi nhãn và bảo quản……… 65

3.7.2 Kiểm nghiệm chất lượng sản phẩm theo tiêu chuẩn cơ sở……… 65

3.7.3 Nghiên cứu độ ổn định của sản phẩm Tritecpen-HN……… 66

3.7.3.1 Đánh giá độ ổn định bằng phương pháp lão hóa cấp tốc… 67

3.7.3.2 Phương pháp phân tích……… 68

3.7.3.3 Kết quả và thảo luận……… 68

3.8 Nghiên cứu độc tính và khả năng kháng u của Trà vàng Hoàn Ngọc 69

3.8.1 Điều chế cao chiết etanol 96% từ trà vàng Hoàn Ngọc……… 69

3.8.2 Độc tính cấp của cao chiết trà vàng Hoàn Ngọc……… 70

3.8.2.1 Động vật thí nghiệm……… 70

3.8.2.2 Mẫu thử……… 70

3.8.2.3 Tiến hành……… 71

3.8.2.4 Theo dõi……… 72

3.8.2.5 Kết quả……… 73

3.8.2.6 Kết luận……… 75

3.8.3 Nghiên cứu khả năng kháng u của cao chiết etanol Trà vàng Hoàn Ngọc 75 3.8.3.1 Kết quả và thảo luận……… 76

3.8.3.2 Kết luận……… 82

3.9 Các kết quả khác……… 83

IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 83

4.1 Kết luận……… 83

4.2 Kiến nghị……… 85

Tài liệu tham khảo……… 86 PHỤ LỤC

Trang 20

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NMR: Nucleur Magnetic Resonance, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

H NMR: Phổ cộng hưởng từ proton

13

C NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C

COSY: Correlated Spectroscopy, phổ COSY

DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer, phổ DEPT HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation, phổ HMBC

HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence, phổ HMQC

HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence, phổ HSQC

NOE: Nuclear Overhauser Effect, hiệu ứng NOE

NOESY: Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy, phổ NOESY

b: broad dd: double doublet dt: double triplet dq: double quartet

H, C: Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon

ppm: parts per million, phần triệu

EIMS: Electron Impact Mass Spectroscopy, Phổ khối va chạm electron HRMS: High Resolution Mass Spectrscopy, Phổ khối phân giải cao DMSO: Dimethylsulfoxide

đnc Điểm nóng chảy

TLC: Thin Layer Chromatography, Sắc kí bản mỏng

CC: Column Chromatography, Sắc kí cột thường

Trang 21

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Độc tính cấp của Tritecpen-HN trên chuột thí nghiệm 38

Bảng 3.2: Khối lượng chuột thí nghiệm khi cho uống Tritecpen-HN

bán trường diễn 1 tháng……… 41

Bảng 3.3: Sự thay đổi các chỉ tiêu hoá sinh máu sau khi cho uống Tritecpen-HN bán trường diễn 1 tháng so với trước khi thí nghiệm

43 Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu khả năng ức chế khối u sơ cấp phát triển………… 48

Bảng 3.5: Khối lượng u sơ cấp tại thời điểm kết thúc thí nghiệm……… 50

Bảng 3.6: Sự thay đổi các chỉ tiêu hoá sinh máu chuột bị gây u sau khi

cho uống Tritecpen-HN……… 51

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của Tritecpen-HN lên mô bệnh học của gan, thận, lách, phổi chuột thí nghiệm 52

Bảng 3.8: Kết quả nghiên cứu khả năng ức chế khối u sơ cấp phát triển……… 55

Bảng 3.9: Khối lượng u sơ cấp tại thời điểm kết thúc thí nghiệm 57

Bảng 3.10: Sự thay đổi các chỉ tiêu hoá sinh máu chuột bị gây u sau khi cho uống Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc

58 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc trên mô bệnh học của gan, thận, lách, phổi chuột thí nghiệm 59

Bảng 3.12: Kết quả nghiên cứu khả năng ức chế khối u sơ cấp phát triển 77

Bảng 3.13: Khối lượng u sơ cấp tại thời điểm kết thúc thí nghiệm……… 79

Bảng 3.14: Sự thay đổi các chỉ tiêu hoá sinh máu chuột bị gây u sau khi cho uống Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc 81

Bảng 3.15: Ảnh hưởng của Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc trên mô bệnh học của gan, thận, lách, phổi chuột thí nghiệm 82

Trang 22

I MỞ ĐẦU:

Cây Hoàn Ngọc có tên khoa học là Pseuderanthemum palatiferum (Nees)

Raldk thuộc họ Ôrô (Acanthaceae) là cây bản địa của Việt Nam Cây này được GS TSKH Trần Công Khánh (Đại học Dược Hà Nội) tìm thấy tại vườn quốc gia Cúc Phương và xác định được tên khoa học của nó là

Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk vào những năm 90 của thế kỉ 20

[1] Trong dân gian, cây Hoàn Ngọc có nhiều tên gọi khác nhau như Xuân hoa, Con khỉ, Nhật Nguyệt, Trạc Mã, Thần Tượng Linh

Trong thời kì kháng chiến chống Mỹ cứu nước, cây Hoàn Ngọc đã được dược sĩ Phạm Khuê sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để chữa vết thương với tên cây Con khỉ gọi theo tiếng địa phương là Tú Lình, tuy nhiên lúc này tên La tinh của cây còn chưa được biết đến Vào đầu những năm 90 của thế kỉ

20, trong tài liệu viết tay của mình, dược sỹ Phạm Khuê đã giới thiệu về tác dụng của lá cây Hoàn Ngọc như sau: lá cây có tác dụng khôi phục sức khỏe cho người ốm yếu, mệt mỏi, người già, suy nhược thần kinh, làm việc quá sức, khủng hoảng về tinh thần và thể lực; chữa cảm cúm nhiệt độ cao, rối loạn tiêu hóa; chấn thương chảy máu, dập gãy cơ thể, dùng như nước uống và thuốc đắp; đặc biệt hiệu nghiệm với vết thương sọ não; đau dạ dầy, chảy máu đường ruột, lở loét hành tá tràng, viêm loét đại tràng, trĩ nội; đau gan xơ cổ trướng, viêm thận, viêm đường tiết niệu, đái ra máu, đái buốt, đái đục, đái rắt, bìu đau nhức; đau mắt đỏ, mắt trắng, đau ứ máu, đau bên trong không rõ nguyên nhân Có thể dùng khi bị nhiều bệnh một lúc như bệnh đường ruột, cảm cúm, gan, thận

Trong cuốn sách “Cây cỏ Việt Nam” [2], tác giả Phạm Hoàng Hộ đã mô tả đặc điểm thực vật của cây Hoàn Ngọc như sau: Tiểu mộc cao 1-2 m Lá có phiến thon, to đến 20x4,5 cm, đáy tà hay nhọn, mặt dưới có đốm đen, gân phụ 8-9 cặp; cuống dài 5,5 cm Phát hoa không chia nhánh, cao 30 cm; lá đài như kim, dài 5-6 mm; vành có ống dài 2-4 cm, tai tím xanh hay trắng, môi trên

Trang 23

lõm, môi dưới 3 thùy to; tiểu nhụy thụ 2 Nang có lông mịn, cao 3,5 cm, phần lép 2,2 cm; hột 4

Từ năm 2000 đến nay đã có một số công trình nghiên cứu về thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học của cây Hoàn Ngọc (P palatiferum)

Về mặt hoạt tính sinh học:

Năm 2005, TS Phan Minh Giang và cộng sự đã cho biết lá cây Xuân Hoa

có tác dụng chống oxi hóa, kháng khuẩn và kháng nấm [3]

Năm 2006, trường Đại học Cần Thơ, Đại học Nông nghiệp & Công nghệ Tokyo kết hợp với Trung tâm nghiên cứu quốc tế về khoa học nông nghiệp Nhật Bản đã công bố về tác dụng phòng chống 25 loại bệnh: huyết áp cao, tiêu chảy, đau dạ dày, thiếu máu cơ tim, thần kinh xương, u do ung thư, bị thương chảy máu, táo bón, cúm, chảy máu, liệt cơ mặt, nhũn não, bệnh lị, táo bón, bệnh phụ khoa, ung thư ruột, sâu răng, bệnh trĩ, viêm mũi, viêm thận, viêm khớp, viêm họng, viêm vú, viêm gan, viêm ruột kết, của lá cây Hoàn Ngọc [4,5]

Năm 2009, dịch chiết 80% etanol của lá Hoàn Ngọc khô đã được nghiên cứu sơ bộ về độc tính Kết quả cho thấy dịch chiết này không thể hiện độc tính cấp và bán cấp trên chuột thực nghiệm ở các liều 1000 mg/kg chuộtvà

2000 mg/kg chuột qua đường uống và không thể hiện độc tính đối với các tế bào lành tính ở nồng độ 50 µg/mL [6]

Năm 2010, P Padee và cộng sự ở trường Đại học Mahasarakham, Thái Lan đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cao dịch chiết 80% etanol lá

cây Hoàn ngọc (P palatiferum) trên chuột bị bệnh tiểu đường bình thường và

chuột bị bệnh tiểu đường do streptozotocin gây ra Kết quả cho thấy, dịch chiết đã thể hiện tác dụng hạ đường huyết trên chuột bị tiểu đường ở mức liều

250 mg/kg chuột Dịch chiết cũng có tác dụng ngăn chặn các biến chứng do bệnh tiểu đường gây ra và tăng cường chức năng của gan và thận [7]

Trang 24

Gần đây nhất, vào năm 2011, nhóm nghiên cứu của P Khonsung ở Đại học Chiềng Mai, Thái Lan đã cho biết dịch chiết nước của lá cây Hoàn Ngọc tươi có tác dụng hạ huyết áp và làm giảm nhịp tim Tác dụng làm giảm áp lực mạch của dịch chiết phụ thuộc một phần vào nội mô mạch mà không phụ thuộc vào quá trình tổng hợp oxit nitric và không hoạt động thông qua quá trình kích hoạt các thụ thể muscarinic [8]

Về mặt thành phần hóa học:

Năm 2003, Võ Hoài Bắc và Lê Thị Lan Oanh đã cho biết lá cây Hoàn

Ngọc (P palatiferum) có hàm lượng cao các axit amin và nguyên tố khoáng

chất, đặc biệt là canxi, kali và sắt [9]

Thành phần hóa học của cây Hoàn Ngọc đã được nhóm của PGS TS Nguyễn Văn Hùng bước đầu nghiên cứu và thu được một số kết quả đáng chú

0,56% và betulin chiếm 0,36% so với lượng nguyên liệu khô ban đầu Rễ cây cũng chứa một số tritecpen khác là epifriedelanol và axit pomolic với hàm lượng nhỏ Ngoài ra, nó còn chứa một số chất thuộc các lớp chất khác như -sitosterol, -sitosterol glucoside Trong hỗn hợp tổng tritecpen từ rễ cây Hoàn Ngọc thì lupeol chiếm 60,6% và betulin chiếm 39,0%, hàm lượng các chất khác chỉ chiếm 1% Hai thành phần chính của rễ cây cũng đã bước đầu

Trang 25

được chúng tôi nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào đối với ba dòng tế bào ung thư vú MCF-7, ung thư gan Hep-G2 và ung thư biểu mô KB Betulin có hoạt tính trên cả ba dòng tế bào được thử MCF-7 (IC50 6,65 µg/ml), Hep-G2 (IC50 32 µg/ml) và KB (IC50 26 µg/ml), còn lupeol có tác dụng đối với dòng tế bào ung thư vú MFC-7 với IC50 là 18,29 µg/ml [12]

Lupeol và Betulin là 2 chất tritecpen phổ biến ở trong các loài thực vật và

có phổ hoạt tính sinh học rất rộng Cho đến năm 2009, đã có trên 50 công trình công bố về hoạt tính phòng chống và chữa bệnh của lupeol và betulin Các kết quả này khẳng định khả năng sử dụng lupeol và betulin như thành phần chính cho chế phẩm, thực phẩm thuốc phòng chống khối u

Betulin là một trong các hợp chất tự nhiên được phân lập sớm nhất, nó

được phân lập lần đầu tiên từ vỏ cây bạch dương (Betula) vào năm 1788

Betulin có nhiều trong vỏ cây bạch dương và đã được chứng minh là có hoạt tính chống ung thư, kháng nấm và chống virus [13,14] Betulin và cao chiết

vỏ cây bạch dương đã được dùng làm thức ăn bổ sung (BeturalR) để bảo vệ gan, ngăn ngừa và điều trị sự trúng độc cấp do các ancol [15] và làm chất phụ gia cho các đồ uống chứa cồn [16] Szuster-Ciesielska và cộng sự đã thông báo về tác dụng bảo vệ gan của betulin và axit betulinic chống lại độc tính do etanol gây ra cho các tế bào gan HepG2 [17] Một điều rất quan trọng là cao

chiết vỏ cây bạch dương B verucosa (70% betulin, 6% axit betulinic và 5%

lupeol) không thể hiện độc tính trong các phép thử lâm sàng cũng như là trong vòng ba năm từ khi nó trở thành sản phẩm thương mại [18] Betulin và sản

Trang 26

phẩm chiết vỏ cây bạch dương đã được dùng trong mỹ phẩm để làm phụ gia cho dầu gội đầu [19], sản phẩm chăm sóc da [20], răng [21] và tóc [22] Hiện nay, betulin và cao chiết vỏ cây bạch dương đã được cấp bằng phát minh làm thuốc adaptogenic [23], chất tạo interferon (loại protein do tế bào cơ thể sinh

ra khi bị vi rút tấn công, nhằm ngăn không cho vi rút phát triển) [24], sản phẩm chống giảm oxy trong máu [25], ngăn chặn và điều trị viêm gan C [26], chống cúm [27], thuốc phòng lao [28]

Giống như axit betulinic, betulin cũng đã được nghiên cứu kĩ lưỡng về khả năng gây độc tế bào và nó thể hiện khả năng ức chế đối với một số dòng

tế bào ung thư người nhưng lại không độc đối với các tế bào lành [29] Tiềm năng chống ung thư của betulin đã được Wojciech Rzeski và các cộng sự [29]

ở trường đại học Maria Curie-Sklodowska Ba Lan nghiên cứu trên các dòng ung thư thần kinh người là u nguyên bào thần kinh, u nguyên bào cơ vân, u nguyên bào tủy, u thần kinh đệm và một nhóm bệnh ung thư ngoại vi như tuyến giáp, vú, phổi, tuyến tụy, bạch cầu và đa u tủy, cũng như trên các dòng ung thư nuôi cấy sơ cấp được tách từ bệnh nhân như ung thư biểu mô buồng trứng, ung thư biểu mô cổ và u tế bào thần kinh đệm Betulin đã thể hiện khả năng ức chế sự sinh sản của tất cả các dòng tế bào nuôi cấy được thử (IC50trong khoảng 2,5-10,3 µM), nhưng nó nhạy nhất đối với u nguyên bào thần kinh (SK-N-AS, IC50-2,5 µM) và ung thư biểu mô tuyến tụy (HT-29, IC50-4,3 µM) Betulin đã làm thay đổi hình thái học của các tế bào, làm giảm sự hoạt động của chúng dẫn đến sự chết theo chương trình của các tế bào ung thư Amjad và các cộng sự đã thông báo về sự ức chế các vi rút Herpe và Epstein-Barr của betulin và các dẫn xuất [30] Hoạt tính chống vi rút Herpe của betulin cũng đã được đề cập đến trong một số patent [31-33] Các patent này cũng đã cho biết các tính chất chống vi rút và điều hòa miễn dịch của betulin Betulin có thể dùng trong điều trị vi rút viêm gan C [34,35] Dẫn xuất

3-O,28-O-dinicotinoylbetulin có tác dụng bảo vệ gan, chống mụn nhọt, kháng

Trang 27

viêm, chống ung thư và điều hoà miễn dịch [36] Các dẫn xuất do biến đối cấu trúc của betulin ở các vị trí C-3 và C-28 đã được đánh giá hoạt tính kháng vi

rút in vitro Sự biến đổi đơn giản cấu trúc gốc của khung lupane đã tạo ra các

chất có tác dụng chống vi rút cúm A và các vi rút gây bệnh herpe đơn nhân týp-1 Baltina cùng các cộng sự [37] đã cho biết một số 3,28-este của betulin

có tác dụng bảo vệ gan và chống cúm Ngoài ra betulin còn được biết là có một số hoạt tính thú vị khác Emzym ADN topoisomerases đóng vai trò quan trọng trong quá trình tái tạo, phiên mã, tích hợp và phân tách chromosome của quá trình phân bào Betulin có khả năng ức chế xúc tác chọn lọc enzym ADN topoisomerases người với IC50 là 38,6 µM [38] Năm 1999, Nobuhino Miura

và các cộng sự ở trường đại học Tohoku, Densai, Nhật Bản, đã cho biết betulin có thể làm giảm độc tính của cadmi bằng cách thúc đẩy sự tổng hợp một số protein nội bào có tác dụng bảo vệ các tế bào chống lại khả năng gây độc của cadmi vì khi xâm nhập vào cơ thể động vật dưới dạng CdCl2 thì hầu hết cadmi sẽ tập trung ở gan và gây độc cho gan [39]

Lupeol là hợp chất tritecpen có mặt trong nhiều loài thực vật như o lưu,

sung, xoài, các loại quả và các loại thuốc thảo mộc Lupeol đã được chứng

minh là hoạt chất của nhiều cây thuốc dân gian như: Cây Bún (Crateva

nurvala) [40], vỏ cây gạo (Bombax ceiba) [41]… Lupeol có phổ hoạt tính

sinh học rất rộng Hoạt tính kháng viêm và chống viêm khớp của lupeol được

đề cập đến thường xuyên hơn cả axit betulinic và betulin Lupeol có khả năng

ức chế không cao (ở mức độ vừa phải) nhưng rất đặc trưng (đặc hiệu) đối với các dòng tế bào ung thư Đối với tế bào ung thư tuyến tiền liệt nhạy với androgen [42], nó ức chế sự sinh sản của các tế bào ung thư bằng cách tấn công vào các đích tín hiệu β-catenin [43] Lupeol ức chế quá trình thu nhận tín hiệu của các tế bào ung thư tuyến tụy [44] Nó còn có tác dụng chống lại

sự phát triển của khối u trên mẫu sinh khối u ở da chuột nên có thể dùng để điều trị và ngăn ngừa các rối loạn về da và ung thư da [45,46] Lupeol đã được chứng minh là có tác dụng gây ra sự biệt hóa (differentiation) và ức chế

Trang 28

sự phát triển của khối u ác tính ở chuột và các tế bào bạch cầu ở người [47,48] Lupeol cũng có tác dụng bảo vệ tế bào chống lại sự gây độc của các gốc tự do [49-52]

Ngoài ra, Lupeol còn có tác dụng chống viêm Fernandez và cộng sự [53]

đã cho biết rằng trong dịch chiết của Pimenta racemosa var osua chứa lupeol

có hoạt tính cao chống lại hai mô hình viêm cấp thực nghiệm (phù chân và phù tai ở chuột) Sự giảm hoạt tính của enzyme chuyển oxy từ peroxide tủy (myeloperoxidase) cho biết cơ chế liên quan đến quá trình xâm nhập của neutrophil Một bằng phát minh có tính ứng dụng [54] đã chỉ ra rằng lupeol và các este axit béo của nó là các tác nhân kháng viêm và chống viêm khớp Tác dụng chống cholesterol cao cũng là một khả năng ứng dụng khác của lupeol Sudhahar và cộng sự [55] đã cho biết khi điều trị bằng lupeol và lupeol linoleate làm giảm mức LPO và làm tăng các chất chống oxi hóa theo cơ chế enzyme và không enzyme Lupeol trong các nguồn tự nhiên đã được ứng dụng rộng rãi trong các sản phẩm làm thực phẩm cho người đặc biệt là làm chất phụ gia thực phẩm và mỹ phẩm như là chất kích thích quá trình tổng hợp các protein gây căng thẳng [56], các thành phần thúc đẩy quá trình tạo melanin [57], các chất điều hòa sự hình thành sắc tố cho các sản phẩm chăm sóc tóc [58], các mỹ phẩm ít bị dị ứng [59] và các mỹ phẩm chứa lupeol có tác dụng ngăn chặn sự lão hóa của da [60]

Từ năm 2001, Doanh nghiệp tư nhân Trà Hoàn Ngọc 7 Nga Tây Ninh đã

sử dụng rễ và lá cây tạo chế phẩm Trà Hoàn Ngọc 7 Nga Tây Ninh Sản phẩm này có tác dụng giải nhiệt, kháng khuẩn, giải độc, tăng cường thể lực, hỗ trợ tiêu hóa cùng với một số tác dụng chữa bệnh khác đang được bán rộng rãi trên thị trường và đã có hiệu quả rõ rệt trong việc tăng cường sức khỏe cộng đồng, nhất là tại miền Nam và đã đạt được các giải thưởng: Cầu vàng; huy chương vàng; quyền sử dụng con dấu hàng Việt Nam chất lượng cao phù hợp tiêu chuẩn năm 2005 và 2006 Cúp vàng; huy chương vàng; quyền sử dụng

Trang 29

con dấu sản phẩm an toàn vì sức khỏe cộng đồng năm 2005 và 2006 Cúp vàng thương hiệu Việt do cục sở hữu trí tuệ Việt Nam cấp năm 2005 Cúp vàng sản phẩm an toàn an sinh xã hội năm 2008 Cúp vàng thương hiệu cạnh tranh nổi tiếng quốc gia năm 2008 Danh hiệu Rồng vàng Doanh nhân hiền tài

- UNESCO VN và sản phẩm tiêu biểu vùng miền, vùng Đông - Tây Nam Bộ năm 2010

Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh

học của cây Hoàn Ngọc (P palatiferum) như đã trình bày ở trên. Để tăng cường giá trị sử dụng và phát triển cây Hoàn Ngọc thành cây thuốc quý đóng góp vào công cuộc bảo vệ sức khỏe cộng đồng Được sự ủng hộ của UBND

Tỉnh Tây Ninh, chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ tạo chế phẩm phòng chống khối u từ cây Hoàn Ngọc Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Raldk.” nhằm mục tiêu tạo ra sản phẩm phòng chống và

hỗ trợ điều trị khối u từ cây Hoàn Ngọc - Một cây thuốc quý cần được đầu tư nghiên cứu để tìm ra khả năng sử dụng cây này có hiệu quả nhất

II TRÍCH DẪN NỘI DUNG THUYẾT MINH CỦA ĐỀ TÀI

2.1 Giới thiệu về cơ quan chủ trì đề tài và chủ nhiệm đề tài

Tên đề tài: Nghiên cứu quy trình công nghệ tạo chế phẩm phòng chống khối

u từ cây Hoàn Ngọc Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk

Mã số: CNHD.ĐT.030/11-12

Thời gian thực hiện: 02/2011 - 02/2012

Kinh phí: 880 triệu đồng

Thuộc chương trình: Nghiên cứu KHCN trọng điểm quốc gia phát triển

công nghiệp Hóa dược đến năm 2020

Địa chỉ: Viện Hóa sinh biển - 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu

Giấy, Hà Nội Điện thoại 37916337 Fax:

04-37917054

Trang 30

Mobile: 0947216182; E-mail: minhhang@imbc.vast.vn

Cơ quan chủ trì: Doanh nghiệp Tư nhân Trà Hoàn Ngọc

Địa chỉ: 37 Nguyễn Trọng Cát, phường Hiệp Ninh, thị xã

Tây Ninh

Điện thoại: 066 3621121 ; Fax: 066 3621121

E-mail: hoanngoc7nga@yahoo.com

Website: www.hoanngoctea.com

2.2 Mục tiêu của đề tài :

Xây dựng quy trình tạo chế phẩm tổng tritecpen chứa hoạt chất phòng

chống khối u có trong cây Hoàn Ngọc Pseuderanthemum palatiferum (Nees)

Radlk

2.3 Các nội dung nghiên cứu của đề tài :

Nội dung 1 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu: Nghiên cứu thời gian thu hái

nguyên liệu và hàm lượng tritecpen theo tuổi nguyên liệu

Nội dung 2 Nghiên cứu quy trình công nghệ chiết xuất tổng tritecpen có

trong cây Hoàn Ngọc

Nội dung 3 Xây dựng quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc ở

 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn

Nội dung 6 Nghiên cứu hoạt tính chống khối u của sản phẩm tổng tritecpen Nội dung 7 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của sản phẩm:

2.4 Yêu cầu kỹ thuật, chỉ tiêu chất lượng đối với sản phẩm đạt được:

Trang 31

Stt Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học

2 Báo cáo về tình hình thu hái cây

Hoàn Ngọc theo các độ tuổi từng

năm

Đúng, đầy đủ các dữ liệu về diện tích trồng, cách thức chăm sóc và thu hái cây Hoàn Ngọc theo độ tuổi

3 Báo cáo về thành phần tritecpen của

cây Hoàn Ngọc theo độ tuổi từng

năm

Đúng, chi tiết và đầy đủ về phương pháp phân lập và cấu trúc của các chất tritecpen

4 Quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ

cây Hoàn Ngọc ở quy mô phòng thí

5 Quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ

cây Hoàn Ngọc hoàn thiện scale-up

lên quy mô 0,5 kg sản phẩm/mẻ theo

con đường tối ưu nhất

Quy trình chi tiết, ổn định, đầy đủ các thông số kỹ thuật đã được tối

ưu hóa, dễ thực hiện, an toàn, hiệu suất cao, có thể áp dụng ở quy mô pilot

6 Bộ phổ chứng minh cấu trúc của các

8 Báo cáo về hoạt tính chống khối u

của sản phẩm

Báo cáo chi tiết, đầy đủ về phương pháp và kết quả nghiên cứu hoạt tính chống khối u của sản phẩm

9 Báo cáo về độ ổn định của sản phẩm Hạn dùng  2 năm

2.5 Các điểm sửa đổi so với thuyết minh đề cương nghiên cứu và hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ:

- Sửa đổi nội dung nghiên cứu: Trong quá trình thực hiện, chúng tôi thấy

rằng 1kg sản phẩm là đủ cho các quá trình nghiên cứu dược học tiếp theo

Trang 32

trước khi đưa sản phẩm ra đời sống nên việc sản xuất đủ 10 kg sản phẩm

là chưa cần thiết có thể gây lãng phí nguyên liệu Do đó, nhóm nghiên cứu đã kiến nghị và đã được sự đồng ý của Ban điều hành Chương trình Hóa dược cho phép giảm khối lượng sản phẩm xuống còn 1 kg và chuyển kinh phí dành cho phần này (30 triệu đồng) sang thực hiện một nội dung mới là Nghiên cứu hoạt tính kháng u của dịch chiết nước rễ cây Hoàn Ngọc

- Sửa đổi thời gian thực hiện so với hợp đồng nghiên cứu khoa học: Do có

một sửa đổi về nội dung nghiên cứu và nhóm nghiên cứu có tiến hành thêm một số nội dung nghiên cứu khác ngoài các nội dung đã đăng ký trong thuyết minh đề cương, đề tài đã kiến nghị và được Ban điều hành Chương trình Hóa dược cho phép gia hạn thực hiện đến hết tháng

lao động

(khoa học,

phổ thông)

Nguyên, vật liệu, năng lượng

Thiết

bị, máy móc

Xây dựng, sửa chữa nhỏ

Chi khác

Trang 33

III CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

3.1 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu cây Hoàn Ngọc:

Hiện nay, DNTN Trà Hoàn Ngọc đã có 20 ha cây trồng ở độ tuổi từ 1 năm đến nhiều hơn 7 năm Chăm sóc cây Hoàn Ngọc theo độ tuổi từng năm

và thu hái nguyên liệu theo độ tuổi từng năm

3.1.1 Quy hoạch và chăm sóc các vùng nguyên liệu cây Hoàn Ngọc theo

độ tuổi:

 Quy hoạch và chăm sóc vùng nguyên liệu cây Hoàn Ngọc 1-2 năm tuổi:

- Tổng diện tích: 2 ha

- Số lượng nhân công phụ trách chăm sóc suốt năm: 15

- Tổng diện tích: 5ha

 Quy hoạch và chăm sóc vùng nguyên liệu cây Hoàn Ngọc trên 7 năm tuổi:

3.1.2 Chế độ chăm sóc:

 Phân bón: xơ dừa lót giữ nước, tro trấu, vỏ lụa đậu phộng, tro mía, bánh

dầu đậu vào trước khi trồng và bón bổ sung hàng tháng

 Chăm sóc: hoàn thành tốt, giữ cho cây không bị thiếu nước mùa khô và

ngập ún mùa mưa do đã quy hoạch nguồn nước tưới, nguồn điện cho các máy tưới, và hệ thống kênh, thủy lợi phục vụ xả nước Luôn làm sạch cỏ trên các luống cây

Trang 34

3.1.3 Thu hái và xử lý nguyên liệu:

 Lá cây Hoàn Ngọc: thu hái lá già vào khoảng tháng 1-2 hằng năm lúc trời lập xuân, cây sắp ra hoa, lá phát triển, phiến lá dày, màu ngã vàng

 Rễ cây Hoàn Ngọc: thu hoạch toàn bộ phần rễ, trừ thân Vào khoảng

tháng 7-8 hằng năm lúc cuối thu sang đông, lá ngả màu vàng và đã rụng bớt, rễ phát triển

 Xử lí mẫu:

Làm sạch:

- Lá: rửa sạch, nhanh, không ngâm lâu trong nước

- Rễ: rửa sạch, nhanh, sàng sẩy để loại bỏ tạp chất và đất cát

Phơi sấy: Lá và rễ được sấy đến độ thủy phần an toàn, độ ẩm khoảng

10% (lá), 12% (rễ) Quá trình sấy được chia làm 3 giai đoạn:

- Giai đoạn đầu sấy ở 40 - 50 oC

- Giai đoạn giữa sấy ở 50 - 60 oC

- Giai đoạn cuối sấy ở 60 - 70 oC

Xay nhuyễn: lá và rễ đều được nghiền nhỏ bằng máy nghiền bánh răng

Thu được dạng bột thô khoảng 1400/355 (rễ), bột nửa thô khoảng 710/250 (lá)

3.2 Nghiên cứu thành phần tritecpen của cây Hoàn ngọc theo từng độ tuổi:

Dựa trên các kết quả nghiên cứu đã công bố trước đây về cây Hoàn Ngọc

và theo kết quả khảo sát ban đầu bằng cách ngâm chiết một lượng nhỏ mẫu (50 g) từng bộ phận của cây (lá, thân và rễ cây) bằng diclometan, sau đó cất loại dung môi rồi khảo sát bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng trên bản silica gel tráng sẵn (TLC Silica gel 60 F254) với hệ dung môi n-hexan/etyl axetat (4:1) cho thấy rằng rễ cây là bộ phận chứa nhiều chất nhất của cây và có hàm lượng tritecpen cao nhất trong cây còn lá cây là bộ phận chứa rất ít tritecpen Dựa trên kết quả khảo sát ban đầu này chúng tôi đã quyết định lựa chọn rễ

Trang 35

cây Hoàn Ngọc làm nguyên liệu để chiết xuất tổng tritecpen xuyên suốt các nội dung nghiên cứu sau

3.2.1 Phương pháp nghiên cứu:

Rễ cây Hoàn Ngọc được xử lí dưới dạng bột khô Bột nguyên liệu khô được ngâm chiết với etanol 96% (3 lần, 24 giờ/lần) Các dịch chiết etanol được gộp lai và cất loại dung môi ở áp suất giảm xuống còn 1/10 thể tích ban đầu Pha loãng cặn dịch EtOH bằng nước cất theo tỉ lệ 2:1 rồi phân bố lần lượt với n-hexan và etyl axetat Làm khô dịch chiết n-hexan và etyl axetat bằng Na2SO4 rồi cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu các cặn chiết tương ứng Các cặn chiết được phân tách bằng phương pháp sắc kí cột trên chất hấp phụ silica gel, rửa giải bằng các hệ dung môi khác nhau để thu được các chất sạch

Các chất sạch được đo phổ NMR, MS và IR để xác định cấu trúc

Sơ đồ nghiên cứu thành phần tritecpen của cây Hoàn Ngọc như sau:

Ngâm chiết bằng etanol 96%

(3 lần, 24 giờ/lần)

Dịch chiết etanol

1 Cất loại dung môi xuống còn 1/10 V ban đầu

2 Pha loãng với nước cất

dạng bột khô

Trang 36

3.2.2 Kết quả và thảo luận:

Theo phương pháp chiết xuất đã trình bày ở trên Khi chiết nguyên liệu rễ Hoàn Ngọc theo độ tuổi, chúng tôi thu được kết quả cho 1 kg nguyên liệu khô như trong bảng sau:

Độ tuổi Cặn chiết

1-2 năm 3-4 năm 5-7 năm

Như vậy, khối lượng các cặn chiết thu được từ các nguồn nguyên liệu

có độ tuổi khác nhau là tương tự nhau

 Phân tách các cặn chiết và phân lập các chất của rễ cây 5-7 năm:

Phân tách cặn chiết n-hexan:

Cặn n-hexan (8,5 g) được phân tách trên cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan/etyl axetat theo phương pháp gradient nồng độ etyl axetat

từ 0%-100% để thu được 7 nhóm phân đoạn chính ký hiệu F1-F8 Các nhóm phân đoạn này tiếp tục được tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột và kết tinh

phân đoạn để thu được các chất: lupeol (1; 4,5 g), betulin (2; 2,5 g), sitosterol (3; 0,5 g), lupenone (4; 15 mg), epifriedelanol (5; 5 mg), palatiferin

-A (6; 9 mg), palatiferin B (7; 7mg), asperglaucide (8; 6 mg) và -sitosterol glucoside (10, 15 mg)

Quá trình phân tách cụ thể các cặn chiết để phân lập các chất được trình bày cụ thể trong sơ đồ sau:

Trang 37

Phân tách cặn chiết etyl axetat:

Cặn chiết etyl axetat được phân tách bằng phương pháp sắc ký cột trên chất hấp phụ silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan/etyl axetat theo tỷ

lệ tăng dần lượng etyl axetat từ 95:5 đến 0:100 để thu được 6 nhóm phân đoạn chính ký hiệu FA1-FA6 Các nhóm phân đoạn này tiếp tục được kết tinh và

tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột để thu được các chất lupeol (1; 1,2 g),

(7)

7 mg

Kt.CH 2 Cl 2 / MeOH (4/1)

(8)

6 mg

CC, SiO 2 , n-hexan/

Kt CH 2 Cl 2 / MeOH (9:1)

Trang 38

betulin (2; 1,0 g), -sitosterol (3; 0,2 g), axit pomolic (9, 5 mg) và -sitosterol glucoside (10, 100 mg)

Quá trình chi tiết được trình bày trong sơ đồ sau:

Qua quá trình phân tách trên từ 1,0 kg rễ cây Hoàn Ngọc khô đã thu được các chất lupeol (5,7 g), betulin (3,5 g), -sitosterol (0,7 g), lupenone (15 mg), epifriedelanol (5 mg), palatiferin A (9 mg), palatiferin B (7mg), asperglaucide (6 mg), axit pomolic (5 mg) và -sitosterol glucoside (15 mg)

Như vậy thành phần chính của rễ cây Hoàn Ngọc 5-7 năm tuổi là lupeol (0,57% so với nguyên liệu khô), betulin (~0,35%), -sitosterol (~0,07%) và

F12 F13 F14

Kt MeOH

(9)

6 mg

Trang 39

-sitosterol glucoside (~0,0115%) Ngoài ra còn có một số tritecpen như epifriedelanol, lupenone , asperglaucide, palatiferin A, palatiferin B và axit pomolic nhưng với hàm lượng không đáng kể

15 11

Chất 1 được phân lập dưới dạng tinh thể màu trắng, điểm nóng chảy

210-2110C Phổ 13C-NMR và DEPT cho tín hiệu cộng hưởng của 30 cacbon trong

đó có 2 cacbon sp2 và 28 cacbon sp3 tương ứng với 7 nhóm metyl, 11 nhóm metylen, 6 nhóm metin và 6 cacbon bậc bốn Trên phổ khối lượng EIMS pic

ion phân tử xuất hiện ở m/z 426 Các dữ kiện phổ 13C- NMR và EI-MS cho phép xác định công thức phân tử của chất này là C30H50O và cho biết đây là một tritecpen có năm vòng cùng với một liên kết đôi và một nhóm hydroxy trong phân tử Trên phổ 1H-NMR ở vùng trường thấp có tín hiệu cộng hưởng của hai proton olefinic (H 4,56 và 4,68, H-29a và H-29b) Các tương tác trên phổ HSQC cho biết hai proton này thuộc về một nhóm metylen olefinic, nhóm metylen này rất đặc trưng cho các tritecpen khung lupan Ở trường cao hơn có tín hiệu cộng hưởng của một proton của nhóm hydroxymetin (H 3,18, H-3) Proton này bị tách dưới dạng quintet với hằng số tương tác trung bình

(J=5,5 Hz) cho biết cấu hình  của nó Một proton của nhóm metin nữa xuất

hiện dưới dạng double triplet (H 2,37, J=5,5; 11,0 Hz, H-19) Proton của 7 nhóm metyl đều xuất hiện dưới dạng singlet ở vùng trường cao (H 0,76-

Trang 40

1,68) Các tín hiệu cộng hưởng của các proton thuộc các nhóm metylen còn lại đều xuất hiện ở vùng trường cao dưới dạng multiplet Trên phổ 13C-NMR

dễ dàng nhận thấy tín hiệu cộng hưởng của một liên kết đôi (C 109,33 và 150,98, C-29 và C-22), một nhóm hydroxymetin (C 79,04, C-3) Kết hợp các

dữ kiện phổ và tham khảo tài liệu [61] cho phép xác định cấu trúc của chất này là lupeol, một tritecpen khung lupan Hợp chất này có hoạt tính gây độc

tế bào đối với dòng tế bào Hep-G2, A-431, H-4IIE [62], ngoài ra lupeol còn là chất chống oxy hoá và kháng viêm [63]

Betulin (2):

H H

12

14

16 18

19 2021 22

15

Chất 2 được phân lập dưới dạng tinh thể màu trắng, điểm nóng chảy

248-2490C Phổ 13C-NMR và DEPT cho tín hiệu cộng hưởng của 30 cacbon trong

đó có 2 cacbon sp2 và 28 cacbon sp3 tương ứng với 6 nhóm metyl, 12 nhóm metylen trong đó có một nhóm hydroxymetylen, 6 nhóm metin trong đó có một nhóm hydroxymetin và 6 cacbon bậc bốn Trên phổ khối lượng EI-MS

pic ion phân tử xuất hiện ở m/z 442 Các dữ kiện phổ 13C-NMR và EI-MS cho phép xác định công thức phân tử của chất này là C30H50O2 và cho biết đây là một tritecpen có năm vòng cùng với một liên kết đôi và hai nhóm hydroxy

trong phân tử Các dữ kiện phổ của 2 rất gần với các dữ kiện của 1 Giống như hợp chất 1, trên phổ 1H-NMR thấy có tín hiệu cộng hưởng của hai proton olefinic thuộc một nhóm metylen olefinic (H 4,56 và 4,68, H-29a và H-29b), một proton của nhóm hydroxymetin (H 3,18, H-3) Một proton của

Định dạng
Số trang	112
Dung lượng	1,69 MB