Xác định hàm lượng vitamin d3 trong một số sản phẩm thực phẩm và vitamin b2 trong nấm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1. Lý do chọn đề tài. Trong cuộc sống hiện đại cơ thể chúng ta luôn cần được cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng, nguồn cung cấp các chất này có nhiều trong thực phẩm ăn hàng ngày. Các chất dinh dưỡng chính là các nhóm cung cấp năng lượng cho cơ thể như glucid, protein, lipid, nhóm cung cấp muối khoáng, nhóm cung cấp vitamin và nước. Một trong số các loại vi chất quan trọng đã được bổ sung vào thực phẩm đó là các loại vitamin. Vitamin là một nhóm các hợp chất hóa học khác nhau nhưng có một điểm chung duy nhất là một lượng nhỏ chúng cần thiết cho các hoạt động bình thường và duy trì sự trao đổi chất của cơ thể 24. Vitamin D hay còn gọi là vitamin mặt trời là một loại vitamin khá đặc biệt so với những loại khác. Vitamin D có vai trò quan trọng với đời sống của con người, như nó đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, hoàn thiện, duy trì sự ổn định của xương, răng, nó tham gia vào điều hòa chức năng của một số gen, ngoài ra còn tham gia một số chức năng như: bài tiết của insulin, hormon cận giáp, hệ miễn dịch, phát triển hệ sinh sản và da ở nữ giới. Một số nghiên cứu mới cho thấy thiếu vitamin D, thai phụ có thể sinh con nhẹ cân, cùng sự tăng trưởng chậm của trẻ chào đời đủ tháng. Tình trạng thiếu vitamin D trên thế giới cũng như các nước nhiệt đới rất nghiêm trọng.Để nhận đủ vitamin D thì ngoài việc cho cơ thể tiếp xúc với ánh nắng có lợi cho cơ thể thường xuyên thì cần thiết phải bổ sung thêm nguồn vitamin D từ nguồn thực phẩm ăn uống hàng ngày. Trong đó trứng và các loại sữa là các sản phẩm chứa hàm lượng vitamin D3 dồi dào. Vitamin B2 có nhiều vai trò quan trọng đối với cơ thể. Nó là thành phần quan trọng của các men oxidase, trực tiếp tham gia vào các phản ứng oxy hóa hoàn nguyên, khống chế các phản ứng hô hấp chuyển hoá của tế bào, chuyển hoá các chất đường, đạm, béo ra năng lượng để cung cấp cho các tế bào hoạt động, tác động đến việc hấp thu, tồn trữ và sử dụng sắt trong cơ thể (rất quan trọng trong việc phòng chống thiếu máu do thiếu sắt). Có thể bổ sung vitamin B2 từngũ cốc, rau xanh, đậu các loại, thịt, trứng, sữa, tim, thận, gan, lách, nấm, cá...Tuy nhiên nấm là một nguồn thực phẩm dinh dưỡng lớn nhất thế giới chưa được khai thác đầy đủ. Nấm rất giàu protein, khoáng chất, vitamin, chất xơ và các axit amin thiết yếu và là một trong những nguồn giàu vitamin đặc biệt là vitamin B. Nấm có chứa một lượng lớn các vitamin như Thiamin 1,42,2mg (%), Riboflavin 6,79,0mg (%), Niacin 60,673,3mg (%), Biotin, axit ascorbic 92144mg (%), axit plantothenic 21,1 – 33,3mg (%) và axit folic 1,2 – 1,4mg 100g trọng lượng khô26. Có nhiều phương pháp, kĩ thuật đánh giá hàm lượng vitamin D3, B2 trong thực phẩm, trong đó phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho phép phân tích với độ nhạy và độ chọn lọc cao. Vì vậy chúng tôi lựa chọn đề tài nghiên cứu “Xác định hàm lượng vitamin D3 trong một số sản phẩm thực phẩm và vitamin B2 trong nấm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)”. 2. Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình phân tích vitamin D3, B2 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, từ đó xác định hàm lượng của chúng trong một số đối tượng: trứng, sữa, nấm. 3. Mục tiêu nghiên cứu + Thiết lập được phương pháp phân tích đảm bảo độ chính xác, độ hội tụ, độ nhạy cao. + Áp dụng phương pháp để khảo sát, xác định hàm lượng vitamin D3, B2 trong một số loại trứng, sữa, nấm. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Các mẫu thực phẩm được thu thập ở các chợ trên địa bàn thành phố Vinh. Mẫu sau khi thu thập được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C (đối với mẫu trứng, sữa). Các mẫu nấm ở vùng Bắc Trung Bộ và được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm vi sinh của trường Đại học Vinh.

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài.

Trong cuộc sống hiện đại cơ thể chúng ta luôn cần được cung cấp đầy đủ các chất dinhdưỡng, nguồn cung cấp các chất này có nhiều trong thực phẩm ăn hàng ngày Các chất dinhdưỡng chính là các nhóm cung cấp năng lượng cho cơ thể như glucid, protein, lipid, nhómcung cấp muối khoáng, nhóm cung cấp vitamin và nước Một trong số các loại vi chất quantrọng đã được bổ sung vào thực phẩm đó là các loại vitamin

Vitamin là một nhóm các hợp chất hóa học khác nhau nhưng có một điểm chung duynhất là một lượng nhỏ chúng cần thiết cho các hoạt động bình thường và duy trì sự trao đổichất của cơ thể [24]

Vitamin D hay còn gọi là vitamin mặt trời là một loại vitamin khá đặc biệt so với nhữngloại khác Vitamin D có vai trò quan trọng với đời sống của con người, như nó đóng vai tròquan trọng trong sự phát triển, hoàn thiện, duy trì sự ổn định của xương, răng, nó tham giavào điều hòa chức năng của một số gen, ngoài ra còn tham gia một số chức năng như: bài tiếtcủa insulin, hormon cận giáp, hệ miễn dịch, phát triển hệ sinh sản và da ở nữ giới Một sốnghiên cứu mới cho thấy thiếu vitamin D, thai phụ có thể sinh con nhẹ cân, cùng sự tăngtrưởng chậm của trẻ chào đời đủ tháng Tình trạng thiếu vitamin D trên thế giới cũng như cácnước nhiệt đới rất nghiêm trọng.Để nhận đủ vitamin D thì ngoài việc cho cơ thể tiếp xúc vớiánh nắng có lợi cho cơ thể thường xuyên thì cần thiết phải bổ sung thêm nguồn vitamin D từnguồn thực phẩm ăn uống hàng ngày Trong đó trứng và các loại sữa là các sản phẩm chứahàm lượng vitamin D3 dồi dào

Vitamin B2 có nhiều vai trò quan trọng đối với cơ thể Nó là thành phần quan trọng củacác men oxidase, trực tiếp tham gia vào các phản ứng oxy hóa hoàn nguyên, khống chế cácphản ứng hô hấp chuyển hoá của tế bào, chuyển hoá các chất đường, đạm, béo ra năng lượng

để cung cấp cho các tế bào hoạt động, tác động đến việc hấp thu, tồn trữ và sử dụng sắt trong

cơ thể (rất quan trọng trong việc phòng chống thiếu máu do thiếu sắt) Có thể bổ sung vitamin

B2 từngũ cốc, rau xanh, đậu các loại, thịt, trứng, sữa, tim, thận, gan, lách, nấm, cá Tuy nhiênnấm là một nguồn thực phẩm dinh dưỡng lớn nhất thế giới chưa được khai thác đầy đủ Nấmrất giàu protein, khoáng chất, vitamin, chất xơ và các axit amin thiết yếu và là một trongnhững nguồn giàu vitamin đặc biệt là vitamin B Nấm có chứa một lượng lớn các vitamin nhưThiamin 1,4-2,2mg (%), Riboflavin 6,7-9,0mg (%), Niacin 60,6-73,3mg (%), Biotin, axitascorbic 92-144mg (%), axit plantothenic 21,1 – 33,3mg (%) và axit folic 1,2 – 1,4mg /100gtrọng lượng khô[26]

Có nhiều phương pháp, kĩ thuật đánh giá hàm lượng vitamin D3, B2 trong thực phẩm,trong đó phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho phép phân tích với độ nhạy và

độ chọn lọc cao

Vì vậy chúng tôi lựa chọn đề tài nghiên cứu “Xác định hàm lượng vitamin D 3 trong một số sản phẩm thực phẩm và vitamin B2 trong nấm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)”.

2 Mục đích nghiên cứu

Xây dựng quy trình phân tích vitamin D3, B2 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năngcao HPLC, từ đó xác định hàm lượng của chúng trong một số đối tượng: trứng, sữa, nấm

3 Mục tiêu nghiên cứu

+ Thiết lập được phương pháp phân tích đảm bảo độ chính xác, độ hội tụ, độ nhạy cao.+ Áp dụng phương pháp để khảo sát, xác định hàm lượng vitamin D3, B2 trong một sốloại trứng, sữa, nấm

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Các mẫu thực phẩm được thu thập ở các chợ trên địa bàn thành phố Vinh Mẫu sau khithu thập được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C (đối với mẫu trứng, sữa)

Các mẫu nấm ở vùng Bắc Trung Bộ và được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm vi sinh củatrường Đại học Vinh

Hình 1.1 Hình ảnh một số mẫu sữa bột

Hình 1.10 Nấm HKG 406 (Amauroderma schmburgkii)

Chương 1: TỔNG QUAN

1 Tổng quan về vitamin

1.1 Giới thiệu về vitamin

Mười ba vitamin được ghi nhận trong chế độ dinh dưỡng ở người và chúng có thểđược sắp xếp thành hai nhóm theo độ tan của chúng Các vitamin tan trong chất béo được đạidiện bởi vitamin A, D, E và K; và cũng bao gồm khoảng 50 carotenoid mà có mức độ hoạtđộng khác nhau của vitamin A Các vitamin tan trong nước bao gồm vitamin C và các thànhviên nhóm vitamin B, cụ thể là thiamin (vitamin B1), riboflavin (vitamin B2), niacin, vitamin

B6, axit pantothenic, folate và vitamin B12 Đây là cách phân loại đơn giản phản ánh hoạt tínhsinh học của các vitamin, như độ hòa tan ảnh hưởng đến phương thức hấp thu đường ruột củachúng và hấp thu bởi các tế bào Các đặc tính về độ tan cũng liên quan đến việc phân bố cácvitamin trong nhóm thực phẩm khác nhau và ảnh hưởng trực tiếp đến sử dụng phương phápphân tích [19]

1.1.3 Hoạt tính của vitamin

Thuật ngữ “hoạt tính sinh học” áp dụng cho thực phẩm có các loại vitamin trong chế

độ dinh dưỡng ở người, dùng để chỉ tỷ lệ số lượng vitamin trải qua sự hấp thụ của đường ruột

và đi vào cơ thể Bao gồm cả sự vận chuyển vitamin hấp thu đến các mô và tế bào Cuối cùngcác vitamin có thể được chuyển hóa thành một dạng có thể thực hiện một số chức năng sinhhóa hoặc sinh lý, chuyển hóa sang một dạng không có chức năng cho sự bài tiết và giự trữ.Thành phần chính của hoạt tính sinh học và các yếu tố về tỷ lệ giới hạn là sự hấp thụ Hoạttính sinh học tương đối thường được thể hiện dưới dạng tỷ lệ phần trăm của các phản ứng thuđược với chất chuẩn có hoạt tính sinh học cao [19]

Trong sự hấp thu đường ruột, hoạt tính sinh học của một vitamin phụ thuộc vào dạnghóa học và trạng thái vật lý trong đó vitamin tồn tại ở trong thực phẩm Các tính chất này cóthể bị ảnh hưởng bởi những tác động trong chế biến thực phẩm và nấu ăn, đặc biệt là trườnghợp tiền vitamin A của carotenoid, niacin, vitamin B6 và folate

Thành phần trong chế độ ăn có thể làm chậm hoặc tăng cường sự hấp thụ của vitamin,

do đó các thành phần trong chế độ ăn uống là một yếu tố quan trọng trong hoạt tính sinh học

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến vitamin

Các yếu tố chính làm giảm lượng vitamin là quá trình oxi hóa, nhiệt (nhiệt độ và thờigian), bị ảnh hưởng do sự xúc tác của kim loại, độ pH, ảnh hưởng của enzym, độ ẩm, bức xạ(ánh sáng hoặc bức xạ ion hóa) và sự kết hợp đa dạng của các yếu tố Các vitamin tan trongnước dễ bị mất mát trong quá trình rửa, nhúng và nấu trong nước Vitamin C rất dễ bị oxi hóabởi hóa chất trong quá trình xử lý, bảo quản và nấu ăn.Thiamin nhạy với thực phẩm có tínhtrung hòa hoặc tính kiềm và không bền trong không khí Riboflavin rất dễ bị phân hủy bởi ánhsáng Niacin và vitamin B6 ổn định với nhiều môi trường xử lý Vitamin A và vitamin E bịphá hủy trong điều kiện đẩy nhanh quá trình oxi hóa trong chất béo chưa bão hòa, ví dụ như:không khí, nhiệt độ, ánh sáng, ion kim loại vết và thời gian bảo quản Vitamin K ổn định vớinhiệt, nhưng cực kỳ nhạy cảm với cả ánh sáng huỳnh quang và ánh sáng mặt trời Vitamin D

ít bị ảnh hưởng khi xử lý và bảo quản [19]

1.2 Vitamin D

1.2.1 Giới thiệu, cấu tạo, phân loại và tên gọi

Vitamin D là chất tinh thể hình kim không màu, không mùi, không tan trong nước, hòatan trong dầu mỡ, trong dung môi hữu cơ như etanol, metanol Tên gọi khác của vitamin D làcalciferol Vitamin D là một nhóm gồm từ D2 đến D7 song có hai hoạt tính mạnh nhất làvitamin D2 còn gọi là Ergocalciferol và vitamin D3 còn gọi là Cholecalciferol

Đối với người các hợp chất quan trọng nhất trong nhóm vitamin D là vitamin D3 vàvitamin D2 được đưa vào cơ thể qua đường tiêu hóa và các biện pháp y tế khác Cơ thể cũng

có thể tổng hợp vitamin D ở da từ cholesterol, khi da được tiếp xúc với tia UV (có trong ánhnắng mặt trời) vì thế nó còn được mệnh danh là "vitamin ánh nắng" [18]

Mặc dù vitamin D thường được gọi là một vitamin, nhưng theo nghĩa hẹp thì nó khôngphải là một vitamin thiết yếu trong chế độ ăn, bởi vì hầu hết động vật có vú trong tự nhiên đều

có thể tự tổng hợp đủ cho cơ thể khi tiếp xúc hợp lý với tia nắng mặt trời

Hình 1.11 Khái quát về cấu trúc và sự chuyển hóa các dạng vitamin D

1.2.2 Vai trò của vitamin D đối với cơ thể

Vitamin D đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của xương Vitamin D có vai tròquan trọng với sự hấp thụ canxi ở ruột mà canxi rất cần thiết cho hoạt động của tim, cơ bắp

và thần kinh, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên xương và răng, đồng thời cũng không thểthiếu để tham gia vào quá trình đông máu Trẻ em khi thiếu canxi sẽ chậm lớn, lùn, còixương, xương biến dạng, răng không đều, răng dị hình, chất lượng răng kém và bị sâu[20][17] Người lớn thiếu vitamin D có thể dẫn đến bệnh loãng xương[17]

Vitamin D tham gia vào quá trình điều hòa calci trong máu, ức chế tế bào ung thư Mộtlượng nhỏ vitamin D mỗi ngày làm giảm nguy cơ mắc bệnh cao huyết áp, giúp làm tăng khảnăng miễn dịch, ngừa một số bệnh ung thư phổ biến, làm chậm quá trình phát triển ung thưđặc biệt là ung thư gan, ung thư đại trực tràng[30]

Thiếu vitamin D trong thai kì có thể sinh con nhẹ cân, đặc biệt nếu thiếuvitamin D trong

3 tháng đầu thai kì, con sinh ra bị hạn chế tăng trưởng gấp đôi, sự thiếu vitamin D trong thai

kì gây ra những tổn thương não không thể phục hồi[30]

Trẻ em nếu không được cung cấp đủ vitamin D sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển củaxương, do chất xương và sụn không được vôi hóa đầy đủ, sụn phát triển không bình thường,

Vitamin D cũng có ảnh hưởng đến nồng độ serotonin trong não, gây ảnh hưởng đến tâmtrạng con người Serotonin còn có tên gọi là hoóc môn hạnh phúc, suy giảm serotonin khiếntâm trạng buồn chán hoặc dễ cáu giận, không thể kiểm soát được cơn bốc đồng, do đó thiếuvitamin D kéo dài dễ dẫn tới trầm cảm[17] Do ít tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, chúng ta dễ

bị thiếu hụt vitamin quan trọng này, dù có ăn chế độ lành mạnh và tập thể dục đều đặn

Tuy nhiên dung vitamin D quá liều cũng gây ra chứng tăng calci máu, tăng calci niệu,đau nhức xương khớp, tạo sỏi thận, tăng huyết áp, có thể gây suy nhược mệt mỏi…

Năm 1989 theo khuyến cáo của ủy ban dinh dưỡng Hoa Kỳ (RDA) vitamin D cần bổsung là 10mcg/ ngày ở tuổi từ 51-70 và 15mcg/ ngày ở tuổi cao hơn

1.2.3 Nguồn cung cấp vitamin D cho cơ thể

Cơ thể người có thể nhận được vitamin D trong 3 cách: qua da, chế độ ăn uống và bổsung bằng thuốc

Hầu hết chế độ ăn uống tự nhiên con người có chứa ít vitamin D, trừ khi những chế độ

ăn giàu nguồn gốc hoang dã, cá béo Một lượng nhỏ vitamin D có trong thực phẩm tăngcường, bổ sung như sữa, nước cam và các loại ngũ cốc tại Mỹ, và bơ thực vật ở châu Âu,nhưng các nguồn cung như vậy thường là những nguồn đóng góp nhỏ cho nguồn vitamin D

cơ thể Theo truyền thống, nguồn vitamin D con người bắt đầu từ da, không phải bắt nguồn từmiệng

Sự tổng hợp vitamin D của da xảy rất nhanh chóng và mạnh mẽ, quá trình tổng hợp diễn

ra dễ dàng chỉ sau một vài phút được tiếp xúc với ánh nắng mặt trời Tiếp xúc với ánh nắngmặt trời chứ không phải chế độ ăn uống là nguồn cung cấp chính vitamin D cho cơ thểcho dựtrữ và tuần hoàn, có thể xem đây là một chức năng của phần bề mặt da hở

Nguồn cung cấp vitamin D qua da giúp cung cấp 80-85% nhu cầu vitamin D của cơ thể.Dưới tác dụng của tia cực tím các tiền chất vitamin D có ở tuyến bã và lớp Malpighi của biểu

bì sẽ được chuyển thành vitamin D Nếu được phơi nắng đầy đủ, sau 3 giờ, 1cm2 da có thể sảnxuất ra 18IU vitamin D3[21]

Nguồn cung cấp tự nhiên vitamin D khác là qua thức ăn Vitamin D có trong nguồn thựcphẩm từ động vật (D3 )và thực vật (D2), có nhiều trong các thực phẩm như dầu gan cá thu, dầudừa, lòng đỏ trứng, sữa động vật

1.2.4 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

Cùng với sự phát triển của nền khoa học kỹ thuật tiên tiến, với sự bùng nổ của ngànhcông nghệ thông tin, hiện nay hàng loạt các hệ thống máy phân tích hóa học đã được cải tiếnnâng cấp nhằm xác định nhiều loại chất hóa học Trên thế giới nhiều nhà phân tích hóa học đã

có nhiều công trình nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin D trong thực phẩm như thịt,cá,sữa và trong máu Một số nghiên cứu đã đưa ra hàm lượng vitamin D trong cá thu là15mcg/100g, trong trứng gà 2mcg/100g

Còn ở Việt Nam chúng tôi nhận thấy việc nghiên cứu vitamin D trong thực phẩm cũngchưa được làm nhiều.

1.3 Vitamin B 2

1.3.1 Giới thiệu, cấu tạo, phân loại và tên gọi

Vitamin B2 là một tinh thể nhỏ, hình kim, có màu vàng da cam, nhiệt độ nóng chảy là

2920C, phát huỳnh quang xanh khi chiếu tia tử ngoại vào

Vitamin B2 có vị đắng, hòa tan tốt trong nước và rượu, không hòa tan trong

các dung môi hữu cơ: benzen, ete…

Bền với nhiệt, dung dịch axit, chất chống oxy hóa nhưng không bền với ánh sáng Khitiếp xúc với ánh sáng thì vitamin B2 thường bị mất đi hoạt tính của nó Do đó người ta thườngdùng lọ màu nâu để bảo quản vitamin B2

Tên thông thường: vitamin B2, riboflavin, lactoflavin,ovoflavin

- Công thức phân tử: C17H20N4O6

- Khối lượng phân tử: 376,36 g/mol

- Công thức cấu tạo

Dưới tác dụng của tia cực tím và môi trường kiềm Riboflavin chuyển hóa thànhlumiflavin, còn trong môi trường axit thì chuyển thành lumichrome

Lumiflavin (môi trường kiềm) Lumichrome (môi trường axit)

Trong cơ thể người riboflavin dễ bị phosphoryl hóa tạo nên nhóm hoạt động của cácenzim xúc tác cho các quá trình oxy hóa-khử Các coenzim thường gặp: Riboflavinmononucleotit (FMN) hoặc riboflavin- adenin- dinucleotit (FAD)

1.3.2 Vai trò của vitamin B 2 đối với cơ thể

- Cân bằng dinh dưỡng: Vitamin B2 tham gia vào sự chuyển hoá thức ăn thành năng lượngthông qua việc tham gia sự chuyển hoá glucid, lipid và protein bằng các enzyme để cung cấpcho các tế bào hoạt động

- Tăng khả năng hấp thu: Vitamin B2 là nguyên liệu cần thiết giúp hấp thu vitamin và cáckhoáng chất khác vào cơ thể như B3, B6 … rất quan trọng trong việc phòng chống thiếu máu

- Đối với phụ nữ mang thai: Vitamin B2 ảnh hưởng trực tiếp tới sự phát triển của bào thai

Vì thế, cần phải bổ sung hàm lượng B2 cần thiết để thai nhi phát triển bình thường

- Vitamin B2 còn cần thiết để khử glutathion, chất khử độc quan trọng của cơ thể.

1.3.3 Nguồn cung cấp vitamin B 2 cho cơ thể

Vitamin B2 có nhiều trong các loại thực phẩm ta dùng hằng ngày như: ngũ cốc, rauxanh, đậu các loại, thịt, trứng, sữa, tim, thận, gan, lách, nấm men,cá

Bảng 1.1: Hàm lượng vitamin B 2 trong một số thực phẩm [19]

Thực phẩm Hàm lượng vitamin B 2 (mg/100g)

Kết quả quá trình xay xát ngũ cốc làm giảm đáng kể lượng vitamin B2 (tới 60%), việclàm giàu vitamin B2 ở bánh mì và ngũ cốc ăn liền vào bữa sáng góp phần đáng kể cho việccung cấp vitamin B2 từ chế độ ăn Hầu hết hàm lượng flavin của gạo lứt được giữ nguyên, nếugạo được hấp trước khi xát Sữa bò chủ yếu chứa các vitamin B2 tự do, với một lượng nhỏFMN và FAD Trong sữa nguyên chất, 14% flavin có liên kết không hóa trị với protein Lòngtrắng và lòng đỏ trứng có chứ loại protein đặc biệt là vitamin B2, cần thiết cho việc dự trữvitamin B2 khi sử dụng phôi của trứng[19].

2 Tổng quan về các mẫu thực phẩm và nấm

2.1 Tổng quan về sữa

2.1.1 Giới thiệu về sữa

Trong tự nhiên không có sản phẩm thực phẩm nào mà thành phần dinh dưỡng lại kếthợp một cách hài hòa như sữa Chính vì thế mà sữa và các sản phẩm từ sữa có một ý nghĩađặc biệt đối với dinh dưỡng của con người, nhất là với trẻ em, người già và người bệnh

Sau sữa mẹ, sữa bò là thực phẩm chứa các chất dinh dưỡng đầy đủ và cân đối nhất.Các sữa từ trâu, dê, ngựa có các chất dinh dưỡng khác nhau do điều kiện về giống, điều kiện

tự nhiên hay điều kiện chăn nuôi Mặc dù ở nước ta chăn nuôi trâu sữa, dê sữa đã có từ khálâu nhưng cho sản lượng thấp Vì vậy cho đến nay nguyên liệu chủ yếu cho ngành sữa ViệtNam vẫn là sữa bò

Các sản phẩm sữa có thể ở dạng rắn như các phomat, dạng hạt đơn điệu như trong sữabột, dạng đặc mịn màng có thêm hương sắc của hoa trái như trong sữa chua, dạng lỏng nhưtrong sữa cô đặc với đường, các loại sữa tươi có đường… Từ nguyên liệu sữa bò người ta đãchế tác ra vô vàn các sản phẩm có cấu trúc, hương vị và trạng thái khác nhau

2.1.2 Giá trị dinh dưỡng.

Sữa là một trong những sản phẩm thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao nhất Trong sữa có đầy

đủ tất cả các chất dinh dưỡng cần thiết và dễ được cơ thể hấp thụ Ngoài các thành phần chính

là protein, lactoza, lipit, muối khoáng còn có tất cả các loại vitamin chủ yếu, các enzim, cácnguyên tố vi lượng không thể thay thế[2]

2.1.2.1 Protein

Protein của sữa rất đặc biệt, có chứa nhiều và hài hòa các axit amin cần thiết Hàngngày mỗi người chỉ cần dùng 100g protein sữa đã có thể thỏa mãn hoàn toàn nhu cầu về axitamin Cơ thể người sử dụng protein sữa để tạo thành hemoglobin dễ dàng hơn bất cứ proteincủa thực phẩm nào khác Độ tiêu hóa của protein sữa 96 – 98% Có hai loại protein trong sữa

là casein và whey:

Các protein casein trong sữa kết hợp với một số khoáng chất trong sữa và hình thành các

mixen Ánh sáng phản xạ từ các mixen làm cho sữa có màu trắng Protein casein sẽ đông lại,

tách khỏi nước khi có axit.Casein trong sữa “túm tụm” lại với nhau và hoạt động như những

bọt biển nhỏ để giữ nước Chúng có thể chứa và giữ tới 70% nước cho mỗi mảnh cợn sữa

Axit, muối hay nhiệt độ cao có thể khiến các casein đông này bị mất nước

Đạm whey cũng bị đông lại dưới sức nóng, chứ không phải là axit và muối Đây chính

là bí quyết cơ bản để tạo ra sữa chua và phô-mai

2.1.2.2 Lipit

Lipit của sữa giữ vai trò quan trọng trong dinh dưỡng Khác với các loại mỡ động vật

và thực vật khác, mỡ sữa chứa nhiều nhóm axit béo khác nhau, chứa nhiều vitamin và có độ

tiêu hóa cao do có nhiệt độ nóng chảy thấp và chất béo ở dưới dạng các cầu mỡ có kích thước

nhỏ

Ở sữa tươi, những hạt chất béo sẽ gắn kết với nhau, lớn đến mức nổi lên bề mặt sữa,

tạo ra 2 lớp khác nhau Để ngăn chặn điều này xảy ra, hầu hết sữa đóng hộp đều phải được xử

lý chia nhỏ các phân tử chất béo để tạo sự đồng nhất

2.1.2.3 Đường lactose

Giá trị dinh dưỡng của đường sữa (lactoza) không thua kém sacaroza

Lactose tạo vị hơi ngọt cho sữa Lactose chỉ có thể được tiêu hóa bởi một enzyme đặc

biệt do cơ thể sản xuất

Một số người không thể uống sữa tươi vì họ không thể tiêu hóa lactose trong sữa Cơ

thể họ thiếu enzym lactase trong hệ tiêu hóa Không có lactase, lactose không thể phân chia

thành glucose và galactose để có thể hấp thụ và đốt cháy thành năng lượng Khi lactose lên

men trong hệ tiêu hóa, nó sẽ sinh ra khí và 1 số axit (những người bất dung nạp lactose sẽ

không thể chuyển hóa năng lượng từ lactose) Lactose sẽ bị caramen hóa khi sữa được làm

nóng và biến sữa thành màu xỉn

2.1.2.4 Vitamin và khoáng chất

Hàm lượng muối canxi và phospho trong sữa cao, giúp cho quá trình tạo thành xương,

các hoạt động của não Hai nguyên tố này ở dạng dễ hấp thụ, đồng thời lại ở tỉ lệ rất hài hòa

Cơ thể có thể hấp thụ được hoàn toàn Đối với trẻ em, canxi của sữa là nguồn canxi không thể

thay thế

Sữa là nguồn cung cấp tất cả các vitamin Nhiều sản phẩm sữa được bổ sung vitamin

D Sữa cũng rất giàu riboflavin, một vitamin có thể bị phá hủy bởi ánh sáng, vì vậy cần bảo

quản sữa trong những hộp ngăn ánh sáng

2.1.3 Phân loại sữa

13 c

t, b

ơ

2.1.3.1 Sữa bột công thức

Sữa bột công thức là sản phẩm sữa bột trẻ em được pha chế theo công thức đặc biệt

thay thế sữa mẹ hoặc được bổ sung những vi chất đặc biệt dành cho các đối tượng đặc biệt

thường là trẻ em dưới 3 tuổi

Các loại sữa bột công thức được chia theo lứa tuổi trẻ em, phổ biến là các lứa tuổi: 0-6

tháng, 6-12 tháng, 1-2-3 tuổi, vàlớn hơn 3 tuổi Sữa bột công thức được phân cấp rõ ràng giữa

các sản phẩm cao cấp và cấp thấp hơn

2.1.3.2 Sữa uống

Các sản phẩm sữa uống bao gồm: sữa nước, sữa bột khác (không bao gồm sữa bột

công thức trẻ em) và sữa đậu nành

 Sữa nước: bao gồm sữa tươi nguyên chất (được làm từ 100% sữa tươi) và sữa tiệt

trùng (đượcchế biến từ sữa bột nhập khẩu)

 Sữa bột khác: là các loại sữa bột dành riêng cho từng đối tượng, thường là người lớn

(phụ nữ mang thai, người có nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt)

 Sữa đậu nành: là một trong những thức uống khá phổ biến làm từ đậu tương Sữa đậu

nành có lượng protein cao gần bằng sữa bò, nhưng ít canxi hơn sữa bò

2.2 Tổng quan về trứng

2.2.1 Giới thiệu về trứng

Trứng thường được sử dụng làm nguồn thức ăn cung cấp protein cho người Các loại

trứng phổ biến nhất là trứng gà, trứng vịt và trứng cút

Cấu tạo của trứng, về cơ bản được chia làm 4 bộ phận, lòng đỏ, lòng trắng, màng vỏ và

vỏ trứng Đối với gà, lòng đỏ chiếm khoảng 31,9% khối lượng, lòng trắng là 55,8%, vỏ cứng

là 11,9% và màng vỏ là 0,4%

Trứng là loại thức ăn có giá trị dinh dưỡng đặc biệt cao Trong trứng có đủ chất đạm,

chất béo, vitamin, chất khoáng, các men và hormone Hơn nữa, tỷ lệ các chất dinh dưỡng

trong trứng tương quan với nhau rất thích hợp và cân đối

2.2.2 Thành phần dinh dưỡng và công dụng của trứng

14 c

t, b

ơ

Trứng gồm lòng đỏ và lòng trắng Lòng đỏ tập trung chủ yếu các chất dinh dưỡng.Lòng đỏ trứng gà có 13,6% đạm, 29,8% béo và 1,6% chất khoáng Chất đạm trong lòng đỏtrứng có thành phần các acid amin tốt nhất và toàn diện nhất Thành phần của lòng trắng trứng

đa số là nước, có 10,3% chất đạm, chất béo và rất ít chất khoáng

Chất đạm của lòng đỏ trứng chủ yếu thuộc loại đơn giản và ở trạng thái hòa tan Còn chấtđạm của lòng trắng chủ yếu là Albumin và cũng có thành phần các acid amin tương đối toàndiện Chất đạm của trứng là nguồn cung cấp rất tốt các acid amin cần thiết có vai trò quantrọng cho cơ thể, đặc biệt cần cho sự phát triển cả về cân nặng và chiều cao của trẻ Riênglòng trắng trứng có tác dụng chống lão hóa, tăng cường lực và độ dẻo dai cho cơ bắp

Trứng có nguồn chất béo rất quí, đó là Lecithin vì Lecithin thường có ít ở các thựcphẩm khác Lecithin tham gia vào thành phần các tế bào và dịch thể của tổ chức, đặc biệt là tổchức não Nhiều nghiên cứu cho thấy Lecithin có tác dụng điều hòa lượng chgolesterol, ngănngừa tích lũy cholesterol, thúc đẩy quá trình phân tách cholesterol và bài xuất các thành phầnthu được ra khỏi cơ thể Chất lecithin trong trứng có tác dụng trong quá trình tiêu hóa, hỗ trợhoạt động của gan Trứng cũng chứa lượng cholesterol đáng kể (600mg cholesterol/100gtrứng gà), nhưng lại có tương quan thuận lợi giữa Lecithin và cholesterol do vậy Lecithin sẽphát huy vai trò điều hòa cholesterol, ngăn ngừa quá trình xơ vữa động mạch và đào thảicholesterol ra khỏi cơ thể

Trứng cũng là nguồn cung cấp vitamin và chất khoáng rất tốt Các chất khoáng nhưsắt, kẽm, đồng, mangan, iod tập trung hầu hết trong lòng đỏ Lòng đỏ trứng có cả cácvitamin tan trong nước (B1, B6) và vitamin tan trong dầu (Vitamin A, D, K) Trong lòngtrắng trứng chỉ có một ít vitamin tan trong nước (B2, B6) Vitamin D là vi chất thiết yếu đểcon người tiêu thụ canxi và duy trì sức khỏe cho xương Do vậy có thể nói trứng cùng các sảnphẩm từ sữa đóng vai trò quan trọngtrongviệc ngăn ngừa loãng xương Cả trong lòng đỏ vàlòng trắng trứng đều có chất Biotin Biotin là vitamin B8 tham gia vào chu trình sản xuất nănglượng để đáp ứng nhu cầu của cơ thể

Mặc khác trứng còn có tác dụng cải thiện sức khỏe cho tóc và móng vì trứng rất giàuchất sunfur, các vitamin, khoáng chất

Đối với người hoạt động tri óc thì trứng là một loại thực phẩm tuyệt vời bởi vì tronglòng đỏ trứng cũng rất giàu axetylcholin, chất dẫn truyền thần kinh quan trọng tham gia vàonhiều chức năng của não bộ Vì vậy, ăn trứng giúp tăng cường trí nhớ, rất cần thiết cho sựphát triển của não bộ, nhất là sự phát triển của thai nhi và trẻ nhỏ

2.3 Tổng quan về nấm

2.3.1 Giới thiệu về nấm

Thuật ngữ “Nấm” đã được sử dụng với nhiều cách khác nhau tại những thời điểm khácnhau và ở các nước khác nhau Thuật ngữ nấm được sử dụng rộng rãi bao trùm tất cả các loạinấm lớn, hoặc tất cả các loại nấm với thân và mũ, hoặc tất cả nấm thịt lớn Một cách sử dụnghạn chế hơn chỉ bao gồm những loại nấm lớn đó là có thể ăn được hoặc có giá trị chữa bệnh.Nấm được định nghĩa theo nghĩa rộng như sau: “Nấm là nấm lớn với quả thể phân biệt rõ mà

có thể là mọc trên mặt đất hoặc dưới đất và đủ lớn để thấy được bằng mắt thường và được thuhoạch bằng tay” (Chang và Miles, 1992) Theo định nghĩa này, nấm không cần phải là lớpnấm đảm, hoặc trên không, hoặc có thịt, hoặc ăn được Nấm có thể là lớp nấm túi hay nấmnang, mọc từ dưới lên, có một kết cấu không nhiều thịt và không nhất thiết ăn được Địnhnghĩa này không phải là hoàn hảo nhưng có thể chấp nhận được, nhưng có thể dùng để đánhgiá số lượng nấm trên trái đất (Hawksworth,2001) [22]

2.3.2 Phân loại nấm

Nấm là một giới riêng biệt khoảng 1,5 triệu loài, trong đó đã mô tả được 69.000 loài(theo Hawksworth, 1991), sống khắp nơi trên trái đất từ hốc tường đến thực vật, động vật vàcon người: bao gồm nấm men, nấm mốc và các loài nấm lớn Nấm là các sinh vật có nhânthực (được xếp vào nhóm eukaryote) có vách tế bào bao bọc bên ngoài thường chứa chitinpolysaccharide, chất béo và protein Nấm không có chất diệp lục và do đó không thể thựchiện quá trình quang hợp Do đó, nấm phải hấp thu chất dinh dưỡng từ các nguồn khác nhau.Nấm sinh sản hữu tính hoặc vô tính và có bộ máy sinh dưỡng thường là dạng sợi có cấu trúcphân nhánh gọi là sợi nấm [23]

Năm 1969 nhà khoa học người Mỹ R.H Whittaker đã đưa ra hệ thống phân loại sinhvật thành năm giới sau đây [8]:

- Giới khởi sinh: Bao gồm vi khuẩn và tảo lam

- Giới nguyên sinh: Bao gồm một số loài đơn bào, một số nấm đơn bào có roi và nhómcác động vật nguyên sinh

Nấm là một nguồn thực phẩm dinh dưỡng lớn nhất thế giới chưa được khai thác đầyđủ.Nấm rất giàu protein, khoáng chất, vitamin, chất xơ và các axit amin thiết yếu Nấm là mộttrong những nguồn giàu vitamin đặc biệt là vitamin B Nấm có chứa một lượng lớn cácvitamin như Thiamin 1,4-2,2mg (%), Riboflavin 6,7-9,0mg (%), Niacin 60,6-73,3mg (%),Biotin, axit ascorbic 92-144mg (%), axit plantothenic 21,1 – 33,3mg (%) và axit folic 1,2 –1,4mg /100g trọng lượng khô [34] Ví dụ, về hàm lượng của thiamin, niacin, riboflavin củamột số nấm ăn trong mg/100g trọng lượng nấm khô Hàm lượng thiamin dao động từ 0,35mgtrong nấm rơm, 1,14mg trong nấm mỡ, đến 1,16 đến 4,80 trong nấm sò, đến 7,8g trong nấmhương Hàm lượng niacin thay đổi từ 54,9mg trong nấm hương, đến 55,7mg trong nấm mỡ,đến 64,88mg trong nấm rơm, từ 46,0 đến 108,7mg trong nấm sò Hàm lượng riboflavin caohơn trong nấm mỡ (5,0mg) và nấm hương (4,9mg) hơn là nấm rơm (1,63 đến 2,98mg) [23].

Bảng 1.2 Vitamin và khoáng chất chính

Vitamin và khoáng chất chính Nhu cầu hàng ngày Hàm lượng nấm

2.3.4 Tầm quan trọng của nấm

Nấm rất đóng vai trò quan trọng đối với cuộc sống của con người bao gồm y học, thựcphẩm, nông nghiệp

Nấm là một loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao Nấm ăn có hàm lượng proteinrất cao chỉ sau cá, thịt Tổng lượng axit amin của nấm tới 15 - 40% là các axit amin không thểthay thế, 25 - 35% là các axit amin tự do Lượng chất béo trong nấm rất thấp, khoảng 15 –20% [10] Đặc biệt trong nấm rất giàu các khoáng chất, vitamin (A, B, C, D, E…) Nấm ănkhông có các độc tố nên có thể coi nấm ăn như một loại “rau sạch” và “thịt sạch” giàu chấtdinh dưỡng rất tốt cho sức khỏe Nấm ăn còn là nguồn nguyên liệu để chế biến các món ănchay, ăn kiêng [1]

Một ý nghĩa hết sức quan trọng của nấm là làm thuốc chữa bệnh Trong số 14.000 đến15.000 loài nấm trên thế giới, có khoảng 700 loài nấm có tính chất y dược, nhưng dự kiến cókhoảng 1800 loài nấm dược liệu có tiềm năng [23] Hầu hết tất cả nấm có chứa polysaccarittrong màng tế bào của chúng, một số loài nấm được phát hiện có chứa polysaccarit đặc biệt cóhiệu quả trong việc làm chậm sự tiến triển của bệnh ung thư, một số bệnh khác và làm giảmtác dụng phụ của việc điều trị hóa trị và xạ trị [22] Nấm có hiệu quả trong việc chống lạibệnh ung thư, giảm cholesterol, căng thẳng, mất ngủ, hen suyễn, dị ứng và bệnh tiểu đường(1983) [21]

Nấm đóng vai trò quan trọng đối với nghề trồng rừng Nấm giúp cho thực vật lấy đượcnước và muối khoáng còn thực vật cung cấp cho nấm thức ăn hữu cơ Nhiều loài nấm có khảnăng tạo rễ nấm được liệt vào loại nấm ăn quý giá (nấm vua và nấm Tuber melanosporum)

Phát triển nghề trồng nấm là góp phần tích cực giải quyết các phế thải trong nôngnghiệp, lâm nghiệp và công nghiệp trên cơ sở đó góp phần bảo vệ môi trường và xác lập cânbằng sinh thái cho môi trường sống của con người

2.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.4.1 Cơ sở lí thuyết

HPLC là viết tắc của 4 chữ cái đầu bằng tiếng anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao (high performance liquid chromatography).

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chấtlỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc mộtchất lỏng phủ lên một chất mang rắgn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóahọc với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, traođổi Ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử)

Ưu điểm của phương pháp HPLC là tốc độ tách nhanh, độ phân giải tốt, độ nhạy cao,

độ lặp lại tốt và có thể phân tích đồng thời nhiều chất

2.4.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc

ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo Nếu pha tĩnh

là chất trao đổi ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân

bố hay sắc ký chiết Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có sắc ký Gel hay Rây phân tử Cùng với phatĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột chúng ta cần có một pha động Như vậy nếu chúng

ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C Vào cột phân tích, kết quả cácchất A, B, C sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự táchsắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác F1, F2 và F3

Chất phân tích A + B + C F1 F2

2.4.3 Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLCthành 4 loại:

 Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography)

 Sắc ký phân bố (partition chromatography)

 Sắc ký ion (ion chromatography)

 Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography)

Nhưng thực tế hiên nay chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ vào phân tíchmẫu Sắc ký hấp phụ: quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của phatĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo chất tan rakhỏi cột Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ Trongloại này có 02 kiểu hấp phụ:

- Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực

- Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC): Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực

Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng rãi, thành công để tách các hỗn hợp các chất cótính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu hay trung bình nhưcác Vitamin, các thuốc hạ hiệt giảm đau Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấpphụ pha đảo (RP).

2.4.4 Cấu tạo của hệ thống HPLC

Hình 1.12 Hệ thống máy sắc ký HPLC Agilent 1100 series

Thiết bị HPLC có thể hình dung gồm 3 phần chính:

 Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích

 Phần tách: phần trung gian của hệ sắc ký, gốm cột tách, đôi khi có cột phụ trợ

 Phần phát hiện và xử lý số liệu: phần này bao gồm các detecter, phần khuếch tán, computer vàphần mềm xử lý số liệu, bộ phận ghi tín hiệu

4 Bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay autosample)

5 Cột sắc ký (pha tĩnh) (để ngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt)

tỷ lệ dung môi của 4 đường là 100%

Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng mộtlúc mà chúng ta chi sử dụng tối đa là 3 và 2 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộnđồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định

Hiện 4 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải Gradial dung môi theo thờigian và công tác xây dựng tiêu chuẩn

- Bộ khử khí Degasse

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi phađộng

- Bơm (Pump)

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký Pump phải tạođược áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến 500 at (1at =0.98 Bar) và pump phảitạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999 ml/phút (hiện nay đã có nhiều loại Pump

có áp suất rất cao lên đến 1200 bar)

Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa 412 Bar Tốc độ dòng:0.1-9.999 ml/phút

Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt Hiện tại bơm có 2 pistone đểthay phiên nhau đẩy dung môi liên tục

- Bộ phận tiêm mẫu (injection)

Dùng để đưa mẫu vào cột phân tích.Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột: Bằng tiêm mẫuthủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động(Autosample)

- Cột sắc ký

Có rất nhiều nhãn hiệu cột khác nhau hiện bán trên thị trường Chúng được chia làmnhiều loại theo mục đích sử dụng, trong đó chủ yếu là: cột pha đảo RP C18 (ODS), cột phathường C8, các loại cột chuyên dụng cho từng nhóm chất Cột C18 và C8 được sử dụng chophần lớn các hợp chất thông thường

Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10-30cm,đường kính trong 1-10mm

Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận)hoặc là Silicagel đã được Silan hóahoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khácnhư: nhôm oxit, polyme xốp, chất trao đổi ion

Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độphòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven column)

- Đầu dò (Detector)

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký

đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người

ta sử dụng loại Detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhấtđịnh của chất phân tích

A = k.C

Trong đó : A là tín hiệu đo được

C là nồng độ chất phân tích

k là hằng số thực nghiệm của Detector đã chọn

Tín hiệu này có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫnđiện, độ dẫn nhiệt, chiết suất …

Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai Detector sau:

- Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV

- Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS): 190 - 900 nm để phát hiện cácchất hấp thụ quang và đây là loại thông dụng nhất

- Detector huỳnh quang dễ phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũngnhư các dẫn chất có huỳnh quang và là loại Detector có độ chọn lọc cao nhất

- Loại hiện đại hơn có Detector Diod Array, ELSD (Detector tán xạ bay hơi) cácDetector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại củacác chất

Ngoài ra còn có một số loại Detector khác là:

- Detector điện hóa: Đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng…

- Detector chiết suất vi sai: Detector khúc xạ (thông thường dùng cho đo các chấtđường)

- Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt…

- Bộ phận ghi tín hiệu

Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang

Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gianlưu, diện tích của Peak, chiều cao…

Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả cácthông số của Peak như tính đối xứng, hệ số phân giải trong quá trình phân tíchđồng thời xử

lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD

- In kết quả

Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy đểhoàn thiện

2.4.5 Chọn điều kiện sắc ký

Muốn có một kết quả tách tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc ký tốt nhất chomột hỗn hợp mẫu

2.4.5.1 Lựa chọn pha tĩnh

Dựa vào các tài liệu Dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫuphân tích ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thuận, cột pha đảo hay các loại cộtkhác nhau Chúng ta thông thường dùng 2 loại cột pha thuận (NP) và cột pha đảo (RP).Ngoài ra ta có thể dùng một số loại cột khác như cột CN, cột NH2

 Cột pha đảo (RP): ( Silicagel đã Alkyl hóa)

Pha tĩnh : Dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực có thể tạo

cặp ion Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bị Alkyl hóa tức là thay thế nguyên tử Hbằng các mạch cacbon thẳng (C8 hay C18 tương đương RP 8 hay RP 18) hay các mạchcacbon vòng (Phenyl- tương đương cột Phenyl) vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất ít

Pha động: Pha động dùng trong loại này là các dung môi có phân cực như : Methanol,

Acetonitril, nước hay các loại dung dịch đệm, hỗn hợp của các dung môi-đệm

Sự tách của chất nhồi loại cột này có độ lặp lại cao và nó được ứng dụng chủ yếu trongphân tích dược phẩm.Hiện nay chúng ta chỉ sử dụng loại này là chủ yếu

Hiện nay pha tĩnh trên nền Silicagel đã có hàng trăm chất khác nhau tùy thuộc vàonhóm thế của nguyên tử H, ngoài ra còn có các lọai pha tĩnh trên nền oxit nhôm, trên nền chấthữu cơ cao phân tử, trên nền mạch cacbon

2.4.5.2 Lựa chọn pha động

Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫuphân tích ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất cótrong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của Peak đã trình bày đồng thời phải có thời gianphân tích phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi hóa chất, thời gian phân tích mẫu, giảmthiểu sự hoạt động của thiết bị

Pha động có thể làm thay đổi: Độ chọn lọc, thời gian lưu, hiệu năng tách của cột, độphân giải, tính đối xứng của Peak Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được phađộng có thành phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp cácchất cần phân tích Chính vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau:

- Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóahọc

- Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng (đặc biệtphải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm kết tủacác chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột ví dụ: đệm phosphat rửa ngay bằng ACNhay MeOH sẽ bị kết tủa trên cột).

- Pha động phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là chúng

là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gia phân tích mẫu

- Phải có độ tinh khiết cao: hoá chất tinh khiết dùng cho phân tích, HPLC

- Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

- Phải phù hợp với loại Detector: ví dụ UV - VIS thì dung môi không được hấp thụquang (ví dụ acid acetic ở bước sóng thấp < 220 nm) Detector huỳnh quang thì dung môikhông được phát quang

- Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt

Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC) pha động là dung môi phân cực Do sựthêm nước vào dung môi hữu cơ tạo thành một pha động phân cực hơn chất hữu cơ nguyênmột mình nó

Ngoài các dung môi chính thì trong thành phần pha động trong rất nhiều trường hợptách RP-HPLC còn có thêm hỗn hợp đệm pH để ổn định pH, chất tạo phức, tạo cặp ion để tạo

ra sự rửa giải tốt nhất

Việc lựa chọn điều kiện sắc ký là công việc hết sức cần thiết trong quá trình xây dựngchương trình sắc ký.Chỉ khi lựa chọn điều kiện sắc ký tốt, phù hợp thì chúng ta mới có thểđịnh tính, định lượng được các lọai thuốc đa thành phần một cách nhanh chóng và hiệu quảcao

2.4.5.3 Detector

Các chất tách ra khỏi nhau được pha động đẩy đến detector để đo, tín hiệu phát hiệnđược chỉ thị sang bộ phận ghi nhận kết quả và được biểu diễn dưới dạng pic sắc ký Bộ phậnphát hiện (detector) để phát hiện các chất trong HPLC có nhiều loại Tùy theo tính chất hóa lýcủa các chất cần phân tích mà người ta sử dụng các loại detector khác nhau Nhưng dù theotính chất nào thì nó cũng phải thỏa mãn biểu thức mối quan hệ:

A = kCTrong đó:

 A là tín hiệu đo được

 C là nồng độ chất phân tích

 k là hằng số thực nghiệm của Detector đã chọn

Detector là bộ phận theo dõi phát hiện các chất tan trong pha động từ cột sắc ký chảy

ra một cách liên tục Nó là bộ phận thu nhận và phát hiện các chất hay hợp chất dựa theo tínhchất nào đó của chất phân tích Detector là một trong những bộ phận quan trọng của HPLC.Một detector lí tưởng phải đạt được những yêu cầu sau: có độ nhạy phân tích cao, đáp ứngđược các chất cần phân tích hoặc đặc trưng của chúng, không phá hủy mẫu, không nhạy cảmvới các thay đổi nhiệt độ và tốc độ dòng của pha động, có thể vận hành liên tục, cho độ lặp lạitốt và dễ sử dụng Vì vậy, việc lựa chọn detector quyết định sự thành công của mỗi phươngpháp HPLC riêng biệt Trong số các detector được sử dụng bao gồm detector UV, điện hóa,

độ dẫn điện khúc xạ, huỳnh quang, tán xạ bay hơi và mỗi loại detector lại có ưu điểm vànhược điểm riêng Hầu hết các chất hay hợp chất phân tích đều có tính chất hấp phụ quangtrong vùng UV-Vis vì vậy detector UV-Vis hay detector PDA được sử dụng thông dụng trongphân tích Detector huỳnh quang có hạn chế hơn so với UV-Vis do tính chất phát quang củacác chất hay nhóm hợp chất không phải là thông dụng mà chỉ một số ít các chất và hợp chất

có phát quang Nhưng hạn chế đó cũng là ưu điểm của detector huỳnh quang đối với chất hayhợp chất có tính chất phát quang, nên sử dụng detector huỳnh quang cho độ nhạy và độ chọnlọc cao hơn rất nhiều so với detector UV-Vis, đối với các chất có huỳnh quang [15]

Ngày nay, các detector hiện đại ngày càng được cải tiến và mở rộng, như detectormảng diot, detector khối phổ (MS), detector điện hóa đo dòng, detector đo độ dẫn điện,detector đo thế, detector hấp thụ nhiệt, detector mảng diot phát quang và nhiều detector khácnhư đo độ siêu, đo độ cảm ứng, đo độ linh động của chất… giúp người phân tích phát hiệnchính xác chất phân tích theo đúng bản chất và tính chất đặc trưng của nó

2.4.6 Tiến hành sắc ký

Chuẩn bị dụng cụ và máy móc

Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy hoạt động tốt cho kết quả phân tích

có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc đô dòng, năng lượng đèn đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra

Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách, và rửa đúng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký

Chuẩn bị dung môi pha động

Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết HPLC.

Các hóa chất dùng phải là loại PA

Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ đã nêu, để ổn định dung môi đúng thời gian theo chuyên luận đã yêu cầu Lọc dung môi qua màng lọc 0.2 - 0.45 μm, siêu âm đuổi bọt khí.m, siêu âm đuổi bọt khí

2.3 Thực nghiệm

2.3.1 Vitamin D 3

2.3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn vitamin D 3 cho phép đo HPLC

Pha chuẩn gốc có nồng độ 1000ppm, lưu giữ trong ngăn đá tủ lạnh

Pha loãng dung dịch chuẩn gốc sử dụng các bình định mức khác nhau, pha thành các

nồng độ mong muốn (0,5; 1; 5; 10; 25; 50; 100) bằng metanol

2.3.1.2 Sơ đồ xử lý mẫu vitamin D 3

2.

3.1.3 Cách tiến hành

Hỗn hợp gồm 1 – 5 g mẫu thêm 4ml natri ascobat (17,5 g ascobic+100 ml NaOH) + 50

ml etanol + 3 g KOH, cho vào bình cầu đáy tròn và votex trong 30 phút Tiến hành đun hồi

lưu ở 750C trong vòng 1 giờ sau đó được làm lạnh ở nhiệt độ phòng, thêm vào 50 ml nước và

được chiết 3 lần với 50 ml hỗn hợp dietyl ete : n-hexan = 1:3 Dịch chiết thu được chiết lại

t e x

3 0

p h u

h ô

i

l ư u

7 Đ

n h ,

+

5 0 m l

n ư ơ

c Làm

l nư

ơ

h i

ê

t 3

l â

n

v ơ

i

5 0 m l

Chiết 3 lần vơ

m ư

c

t r o n g

5 m l

M e

O H

Đ

ịnh m ư

bằng dung dịch KOH 3% pha trong etanol 5% sau đó rửa bằng nước đề ion cho đến khi trung

tính

Dịch chiết đem vào cô quay chân không sau đó tái hòa tan trong dung môi pha động

MeOH Dung dịch thu được được lọc qua đầu lọc cỡ 45μm, siêu âm đuổi bọt khí.m sau đó đem đi phân tích

- Chạy sắc ký với detector UV bước sóng kích thích: 265nm

- Thể tích tiêm mẫu tự động: 10 μm, siêu âm đuổi bọt khí.l

am ilaze, ủ

m C

h

m áy

H

P

L

C

Cân chính xác 10gmẫu cho vào bình nón 250ml Thêm vào mỗi bình 30ml HCl 0,1N.Sau đó đem thủy phân trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 100oC trong 1 giờ Lấy ra để nguội vàđiều chỉnh pH của dung dịch thủy phân đến pH=4,5 bằng dung dịch natri axetat 2,5M Thêmvào mỗi bình 0,1g men amilase Rồi đặt vào tủ ủ ấm ở 37oC trong 18 giờ Định mức dungdịch đến 200ml bằng nước cất và lọc Dịch lọc mẫu và chuẩn được bơm vào máy HPLC.

2.3.2.4 Điều kiện sắc kí

- Chạy sắc ký với detector FLD bước sóng kích thích 422nm và bước sóng phát xạ 522nm

- Dung môi pha động: CH3COONa 0,05M: MeOH = 70:30(V/V)

3.1.1 Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của Vitamin D 3

Dãy chuẩn vitamin D3 được khảo sát có nồng độ như sau: 0,5ppm; 1ppm; 5 ppm;10ppm; 25ppm; 50ppm; 100ppm Tiến hành đo trên máy HPLC kết quả thu được ở bảng 3

Bảng 3.1 Diện tích peak của vitamin D 3 tương ứng với nồng độ chuẩn

100 2582,10376 2582,0759 2582,1329