Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát triển của vi khuẩn sinh enzyme cellulase trong ruột mối

MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN iv TÓM TẮT ĐỒ ÁN v MỤC LỤC vi DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VẼ xi MỞ ĐẦU 12 1. Lí do chọn đề tài 12 2. Nhiệm vụ nghiên cứu 13 3. Vật liệu, phạm vi và nội dung nghiên cứu 13 4.Ý nghĩa khoa học của đề tài 14 PHẦN I 15 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15 1.1. Giới thiệu về cellulose 15 1.2. Giới thiệu về enzyme cellulase 17 1.2.1. Cấu trúc của cellulase 17 1.2.2. Nguồn gốc của enzyme cellulase 18 1.2.3. Cơ chất của enzyme cellulase 19 1.2.4. Phân loại enzyme cellulase 19 1.2.5. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase 19 1.2.6. Hoạt lực của enzyme cellulase (cơ chế thủy phân cellulose) 22 1.2.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực của enzyme cellulase 23 1.2.7.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ 23 1.2.7.2. Ảnh hưởng của pH 23 1.2.7.3. Ảnh hưởng của ion kim loại 24 1.2.7.4.Ảnh hưởng của nồng độ enzyme 24 1.2.7..5. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất S 24 1.3. Tổng quan về mối 27 1.3.1. Tìm hiểu về loài mối 27 1.3.2. Loại hình không sinh sản: 29 1.3.3. Thời kỳ bay giao hoan phân đàn: 29 1.3.4. Tổ mối 30 1.3.5. Thức ăn của mối 30 1.3.6. VSV sinh tổng hợp cellulase trong ruột mối 31 1.4. Tình hình nghiên cứu về enzyme cellulase 32 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 32 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 33 1.5. Ứng dụng của nhóm cellulase 34 1.5.1. Sơ lược về ứng dụng của cellulase 34 1.5.2. Các ứng dụng của nhóm enzyme cellulase 35 1.5.3.Trong công nghiệp giấy 35 1.5.4. Trong công nghiệp dệt 36 1.5.5. Trong xử lý môi trường 37 1.5.6. Trong sản xuất thức ăn gia súc 37 1.5.7. Trong kỹ thuật di truyền 38 1.5.8. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm 38 1.5.9. Trong sản xuất cồn 40 1.5.10. Trong sản xuất bột giặt và chất tẩy rửa 41 1.5.11. Trong sản xuất nhiên liệu sinh học 41 1.5.12. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ 42 1.5.13. Ứng dụng trong nuôi cấy tế bào và tái tổ hợp gen 42 1.5.14. Trong công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh 42 1.5.15. Trong sản xuất agaragar 42 PHẦN II 44 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.1. Vật liệu 44 2.2. Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật 44 2.2.1. Môi trường hoạt hóa D2 44 2.2.2. Môi trường giữ giống D5 44 2.2.3 Môi trường thử hoạt tính M2 45 2.2.4. Môi trường sinh tổng hợp D8 45 2.2.5 Môi trường BHM 46 2.3 Hóa chất và dụng cụ 46 2.3.1. Hóa chất 46 2.3.2. Dụng cụ và thiết bị 47 2.4. Phương pháp nghiên cứu 48 2.4.1 Điều kiện nuôi cấy 49 2.4.2 Kỹ thuật cấy chuyền giữ giống 49 2.4.3 Phương pháp tuyển chọn chủng VSV sinh cellulase mạnh nhất 49 2.4.4 Làm sạch 50 2.4.5 Xác định hoạt tính của enzyme cellulase bằng phương pháp đục lỗ và thử lugol trên môi trường M2 51 2.4.6 . Xác định lượng tế bào trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn sinh cellulase bằng phương pháp đo độ đục 52 2.4.7 Nghiên cứu lựa chọn môi trường hoạt hóa thích hợp 53 2.4.8. Nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 53 2.4.9. Nghiên cứu khả năng phát triển và sinh tổng hợp của chủng F2.2 trong môi trường D8 theo thời gian. 54 2.4.10. Nghiên cứu các yếu tối ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh tổng hợp của chủng F2.2 55 2.4.10.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH 55 2.4.10.2 Nghiên cứu xác định nhiệt độ 56 2.4.10.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 56 2.4.10.4 Nghiên cứu lựa chọn nguồn dinh dưỡng thích hợp 57 PHẦN III 58 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58 3.1. Tuyển chọn vi khuẩn sinh cellulase trên tập hợp chủng F 58 3.1.1. Tuyển chọn chủng 58 3.1.2 Nghiên cứu tuyển chọn các chủng có hoạt tính mạnh 59 3.2. Nghiên cứu làm sạch và đặc điểm chủa chủng F2.2 62 3.3. Nghiên cứu lựa chọn môi trường phù hợp cho enzyme cellulase 63 3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trường hoạt hóa enzyme cellulase 63 3.3.2. Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của chủng F 2.2 trên các môi trường nuôi cấy 64 3.4. Nghiên cứu khả năng phát triển và sinh tổng hợp cellulase của chủng F2.2 trên môi trường D8 65 3.4.1. Xây dựng đường chuẩn giữa độ đục và mật độ tế bào theo thời gian 65 Bảng 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên sự phát triển của vi khuẩn chủng F2.2 65 3.4.2. Nghiên cứu sự phát triển của vi khuẩn sinh cellulase theo thời gian 66 3.4.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát triển và sinh tổng hợp của chủng F2.2 67 3.4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng F 2.2 67 3.4.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng phát triển của chủng F2.2 69 3.4.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới sự phát triển của chủng F2.2 70 3.4.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Carbon và Nito đến sự phát triển của chủng F2.2 71 Bảng 3.10 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Carbon lên hoạt tính của cellulase chủng F2.2 72 PHẦN IV 76 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

2 Nội dung nghiên cứu đồ án tốt nghiệp:

- Nghiên cứu lựa chọn các chủng F có hoạt độ enzyme cellulase

- Nghiên cứu lựa chủng F2.2 trong ruột mối có hoạt tính cao

- Nghiên cứu lựa chọn môi trường hoạt hóa và nuôi cấy phù hợp cho chủng F2.2

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp celluase củachủng F2.2 trong ruột mối:

• Nghiên cứu thời gian tốt nhất cho quá trình phát triển và sinh tổng hợpcellulase của chủng F2.2

• Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sự phát triển củachủng F2.2

• Nghiên cứu ảnh hưởng của sự thay đổi nhiệt độ đến sự phát triển của chủng F2.2

• Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến sự phát triển của chủng F2.2

• Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng hữu cơ khác nhau đến sựphát triển của chủng F2.2

Giáo viên hướng dẫn : ThS Đào Thị Thanh Xuân

Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày tháng năm 2014

Ngày hoàn thành đồ án : Ngày tháng năm 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập- Tự do- Hạnh phúc

BẢN NHẬN XÉT TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên : Nguyễn Thị Ân

Cán bộ hướng dẫn : ThS Đào Thị Thanh Xuân

Cán bộ duyệt :

1 Nội dung nghiên cứu thiết kế:

2 Nhận xét của cán bộ hướng dẫn:

Ngày tháng 0 1 năm 2015

Cán bộ hướng dẫn

(Ký, ghi rõ họ tên)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập- Tự do- Hạnh phúc

BẢN NHẬN XÉT TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên : Nguyễn Thị Ân

Cán bộ hướng dẫn : ThS Đào Thị Thanh Xuân

Cán bộ duyệt :

1.Nội dung nghiên cứu thiết kế:

2.Nhận xét của cán bộ duyệt:

Ngày tháng 01 năm 2015

Cán bộ duyệt

(Ký, ghi rõ họ tên)

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Đào Thị Thanh Xuân,giảng viên

khoa Hóa học, trường Đại học Vinh đã tận tình, tâm huyết hướng dẫn em trong suốtquá trình nghiên cứu và hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Em xin cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, toàn bộ cán bộ kỹ thuật viên phòng thínghiệm khoa Hóa học đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian nghiên cứu vàhoàn thành đồ án tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả các bạn cùng nhóm đồ án, các bạnsinh viên khóa 51K Công nghệ thực phẩm đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện chotôi hoàn thành đồ án tốt nghiệp này

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và toàn thể bạn

bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đồ án tốtnghiệp

Vinh, ngày tháng 01 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Ân

TÓM TẮT ĐỒ ÁN Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát triển và sinh tổng hợp enzyme cellulase của vi khuẩn trong ruột mối.

Nội dung nghiên cứu:

- Tuyển chọn ra những chủng vi khuẩn ruột mối có hoạt tính cao để tiến hànhnhững nghiên cứu tiếp theo

- Nghiên cứu lựa chọn môi trường hoạt hóa thích hợp

- Nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp

- Nghiên cứu thời gian nuôi cấy chủng cho hoạt tính cao nhất

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát triển, sinh tổng hợpcellulase của chủng F2.2

Kết quả thu được:

• Những chủng vi khuẩn ruột mối cho hoạt tính cao nhất là: F2.2, F4.3, F1.1.1Tôi đã sử dụng chủng F2.2 để thực hiên các nghiên cứu tiếp theo

• Nghiên cứu thời gian nuôi cấy vi khuẩn ruột mối chủng F2.2 cho hoạt tínhcao Thời điểm sau 1 ngày nuôi cấy thì chủng F 2.2 cho hoạt tính cao nhất

• Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của chủng F2.2 tách ra từ vikhuẩn ruột mối :

- Môi trường hoạt hóa tối ưu: D8

- Môi trường nuôi cấy thích hợp : D8

- Thời gian nuôi cấy cho sự phát triển tối đa và hoạt tính cao: 24h

- Nhiệt độ tối ưu : 350 C

- pH tối ưu : pH 7

- Nồng độ cơ chất tối ưu trong môi trường dinh dưỡng : CMC 1%

- Nguồn dinh dưỡng Carbon tốt nhất: Tinh bột

- Nguồn dinh dưỡng Nito tốt nhất : Cao thịt bò

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN iv

TÓM TẮT ĐỒ ÁN v

MỤC LỤC vi

DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VẼ xi

MỞ ĐẦU 12

1 Lí do chọn đề tài 12

2 Nhiệm vụ nghiên cứu 13

3 Vật liệu, phạm vi và nội dung nghiên cứu 13

4.Ý nghĩa khoa học của đề tài 14

PHẦN I 15

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15

1.1 Giới thiệu về cellulose 15

1.2 Giới thiệu về enzyme cellulase 17

1.2.1 Cấu trúc của cellulase 17

1.2.2 Nguồn gốc của enzyme cellulase 18

1.2.3 Cơ chất của enzyme cellulase 19

1.2.4 Phân loại enzyme cellulase 19

1.2.5 Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase 19

1.2.6 Hoạt lực của enzyme cellulase (cơ chế thủy phân cellulose) 22

1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực của enzyme cellulase 23

1.2.7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 23

1.2.7.2 Ảnh hưởng của pH 23

1.2.7.3 Ảnh hưởng của ion kim loại 24

1.2.7.4.Ảnh hưởng của nồng độ enzyme 24

1.2.7 5 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [S] 24

1.3 Tổng quan về mối 27

1.3.1 Tìm hiểu về loài mối 27

1.3.2 Loại hình không sinh sản: 29

1.3.3 Thời kỳ bay giao hoan phân đàn: 29

1.3.4 Tổ mối 30

1.3.5 Thức ăn của mối 30

1.3.6 VSV sinh tổng hợp cellulase trong ruột mối 31

1.4 Tình hình nghiên cứu về enzyme cellulase 32

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 32

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 33

1.5 Ứng dụng của nhóm cellulase 34

1.5.1 Sơ lược về ứng dụng của cellulase 34

1.5.2 Các ứng dụng của nhóm enzyme cellulase 35

1.5.3.Trong công nghiệp giấy 35

1.5.4 Trong công nghiệp dệt 36

1.5.5 Trong xử lý môi trường 37

1.5.6 Trong sản xuất thức ăn gia súc 37

1.5.7 Trong kỹ thuật di truyền 38

1.5.8 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm 38

1.5.9 Trong sản xuất cồn 40

1.5.10 Trong sản xuất bột giặt và chất tẩy rửa 41

1.5.11 Trong sản xuất nhiên liệu sinh học 41

1.5.12 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ 42

1.5.13 Ứng dụng trong nuôi cấy tế bào và tái tổ hợp gen 42

1.5.14 Trong công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh 42

1.5.15 Trong sản xuất agar-agar 42

PHẦN II 44

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44

2.1 Vật liệu 44

2.2 Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật 44

2.2.1 Môi trường hoạt hóa D2 44

2.2.2 Môi trường giữ giống D5 44

2.2.3 Môi trường thử hoạt tính M2 45

2.2.4 Môi trường sinh tổng hợp D8 45

2.2.5 Môi trường BHM 46

2.3 Hóa chất và dụng cụ 46

2.3.1 Hóa chất 46

2.3.2 Dụng cụ và thiết bị 47

2.4 Phương pháp nghiên cứu 48

2.4.1 Điều kiện nuôi cấy 49

2.4.2 Kỹ thuật cấy chuyền giữ giống 49

2.4.3 Phương pháp tuyển chọn chủng VSV sinh cellulase mạnh nhất 49

2.4.4 Làm sạch 50

2.4.5 Xác định hoạt tính của enzyme cellulase bằng phương pháp đục lỗ và thử lugol trên môi trường M2 51

2.4.6 Xác định lượng tế bào trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn sinh cellulase bằng phương pháp đo độ đục 52

2.4.7 Nghiên cứu lựa chọn môi trường hoạt hóa thích hợp 53

2.4.8 Nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 53

2.4.9 Nghiên cứu khả năng phát triển và sinh tổng hợp của chủng F2.2 trong môi trường D8 theo thời gian 54

2.4.10 Nghiên cứu các yếu tối ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh tổng hợp của chủng F2.2 55

2.4.10.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH 55

2.4.10.2 Nghiên cứu xác định nhiệt độ 56

2.4.10.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 56

2.4.10.4 Nghiên cứu lựa chọn nguồn dinh dưỡng thích hợp 57

PHẦN III 58

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58

3.1 Tuyển chọn vi khuẩn sinh cellulase trên tập hợp chủng F 58

3.1.1 Tuyển chọn chủng 58

3.1.2 Nghiên cứu tuyển chọn các chủng có hoạt tính mạnh 59

3.2 Nghiên cứu làm sạch và đặc điểm chủa chủng F2.2 62

3.3 Nghiên cứu lựa chọn môi trường phù hợp cho enzyme cellulase 63

3.3.1 Nghiên cứu lựa chọn môi trường hoạt hóa enzyme cellulase 63

3.3.2 Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của chủng F 2.2 trên các môi trường nuôi cấy 64

3.4 Nghiên cứu khả năng phát triển và sinh tổng hợp cellulase của chủng F2.2 trên môi trường D8 65

3.4.1 Xây dựng đường chuẩn giữa độ đục và mật độ tế bào theo thời gian 65

Bảng 3.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên sự phát triển của vi khuẩn chủng F2.2 65

3.4.2 Nghiên cứu sự phát triển của vi khuẩn sinh cellulase theo thời gian 66

3.4.3 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát triển và sinh tổng hợp của chủng F2.2 67

3.4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng F 2.2 67

3.4.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng phát triển của chủng F2.2 69

3.4.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới sự phát triển của chủng F2.2 70

3.4.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Carbon và Nito đến sự phát triển của chủng F2.2 71

Bảng 3.10 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Carbon lên hoạt tính của cellulase chủng F2.2 72

PHẦN IV 76

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Trang

Bảng 1.1 Một số VSV sản xuất cellulase 32

Bảng 3.1 Kết quả phân lập và hình thái của các chủng F 58

Bảng 3.2 Hoạt tính cellulase của một số chủng VSV phân lập 59

Bảng 3.3 Hoạt tính của chủng F 2.2 trong các môi trường hoạt hóa 63

Bảng 3.4 Hoạt tính chủng F 2.2 trong các môi trường nuôi cấy 64

Bảng 3.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên sự phát triển của vi khuẩn chủng F2.2 65

Bảng 3.6 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên sự phát triển của tế bào chủng F2.2 66

Bảng 3.7 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme cellulase của chủng F2.2 68

Bảng 3.8 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme cellulase của chủng F2.2 69

Bảng 3.9 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ co chất lên hoạt tính cellulase của chủng F2.2 70

Bảng 3.10 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Carbon lên hoạt tính của cellulase chủng F2.2 72

Bảng 3.11 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Nito lên hoạt tính cellulase chủng F 2.2 73

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của phân tử cellulose 15

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử celulose 15

Hình1.3 Enzymecellulase 18

Hì n h 1 4 Cơ chế 1,4- ß -D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) 20

Hình 1.5 Cơ chế hoạt động của endoglucanase 20

Hình 1.6 Quá trình phân giải cellulose của cellulase 21

Hình 1.7 Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất 26

Hình 1.8 Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất 27

Hình 1.9 Loài mối sử dụng cellulose làm thức ăn 28

Hình 1.10 Sợi giấy được tái chế 36

Hình 1.11 Cơ chế thủy phân phân tử cellulose(A) và phức hệ cellulose(B) của các Enzyme thuộc hệ phức cellulase 40

Hình 1.12 Quá trình sản xuất ethanol từ phế thải 41

Hình 2.1 Một số thiết bị thường dùng trong phòng thí nghiệm 48

Hình 3.1 Hoạt tính cellulase của một số chủng F 60

Hình 3.2.Hoạt tính cellulase của một số chủngtrên môi trường M2 61

Hình 3.3 Hoạt tính của F 2.2 trên các môi trường hoạt hóa 63

Hình 3.4 Nghiên cứu môi trường nuôi cấy cho sự phát triển tối ưu của chủng F 2.2 64

Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian lên sự phát triển tế bào chủng F2.2 66

Hình 3.6 Ảnh hưởng của thời gian lên sự phát triển chủng F2.2 67

Hình 3.7 Ảnh của của pH đến hoạt tính enzyme cellulase của chủng F2.2 68

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính cellulase của chủng F2.2 69

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính cellulase của chủng F2.2 70

Hình 3.10 Thử hoạt tính trên môi trường M2 71

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưng Carbon lên hoạt tính cellulase chủng F2.2 72

Hình 3.12 Thử hoạt tính các nguồn dinh dưỡng Carbon trên M2 73

Hình 3.13 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Nito lên hoạt tính cellulase chủng F2.2 74

Hình 3.14 Thử hoạt tính nguồn dinh dưỡng Nito trên M2 74

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Enzyme là loại protein xuc tác quá đỗi quen thuộc cho mọi phản ứng sinh họctrong mọi tế bào của sinh vật Enzyme đóng vai trò quan trọng đối với cơ thể conngười, nếu không có enzyme thì mọi quá trình chuyển hóa, sinh tổng hợp trong cơ thể

bị đình trệ và con người không thể tồn tại được Bên cạnh đó, chúng còn đóng vai tròquan trọng trong nhiều ngành công nghiệp: Chế biến thực phẩm, trong y học, dượcphẩm, kỹ thuật phân tích, và bảo vệ môi trường

Hiện nay nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy công nghiệp chế biến thựcphẩm thải ra rất lớn : rơm rạ, bã trấu, bã mía, cám gạo, phế thải ngành công nghiệpgiấy, gỗ Các phế thải này hầu hết cố thành phần chính là cellulose có thể bị thủyphân trong môi trường kiềm hoặc hoặc axit Tuy nhiên việc phân hủy cenllulose bằngcác phương pháp vật lý và hóa học phức tạp, tốn kém, có thể độc hại và kém an toàn.Trong khi đó, việc xử lý chất thải bằng khả năng phân giải của các vi sinh vật vừa antoàn lại rất có tính kinh tế và là nguồn lợi tiềm năng đáng quan tâm.Cellulase là mộttrong số các enzyme được úng dụng phổ biến trong các ngành công nghiệp Đặc biệthiện nay cellulase được toàn thế giới quan tâm nghiên cứu và phát triển nhằm ứngdụng trong công nghệ chế tạo nhiên liệu sinh học Đây là nguồn nhiên liệu thân thiệnvới môi trường và có thể giải quyết được vấn đề thiếu nhiên liệu khi các nguồn nhiênliệu truyền thống đang ngày càng cạn kiệt

Tuy vậy, hiện nay enzyme cellulase được sử dụng trong các ngành côngnghiệp ở Việt Nam chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao Nước ta

là một nước sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzymecellulase là rất phong phú Vì thế, việc nghiên cứu sản xuất ra các enzyme từ vi sinhvật phân lập từ tự nhiên tại Việt Nam hiện nay đang là một đòi hỏi cấp thiết Việctuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sản xuất enzyme nhất là cellulase từ tự nhiênkhông những giúp tận dụng các nguồn gen quý hiếm có sẵn từ tự nhiên mà còn gópphần bảo tồn gen, cải tạo các chủng vi sinh vật công nghiệp đã bị thoái hóa giống saumột thời gian sử dụng Xuất phát từ lý do trên và tình hình nghiên cứu tại Việt nam

cùng những lợi tích to lớn, thiết thực nhất ,tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: " Nghiên

cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát triển và sinh tổng hợp enzyme cellulase của VSV ttrong ruột mối"

2 Nhiệm vụ nghiên cứu

Trong đồ án này tôi có các nhiệm vụ:

- Tuyển chọn các chủng có hoạt tính sinh tổng hợp cellulase cao

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme cellulase

3 Vật liệu, phạm vi và nội dung nghiên cứu

3.3 Nội dung nghiên cứu

Đề tài được tiến hành với các nội dung chính sau:

- Tuyển chọn chủng vi khuẩn ruột mối có khả năng sinh cellulase trong tậphợp phạm vi chủng F phân lập được

- Tuyển chọn ra chủng có hoạt tính mạnh nhất để tiến hành làm sạch, bảoquản và sử dụng nghiên cứu

- Nghiên cứu thời gian nuôi chủng để chúng phát triển và sinh cellulase đạthoạt tính cao nhất

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và hoạt tính củacellulase chủng có hoạt tính cao nhất

4.Ý nghĩa khoa học của đề tài

Đề tài mang một ý nghĩa thực tiền quan trọng cho những nghiên cứ chuyên sâu

và có tính ứng dụng hơn và là cơ sỏ cho những nghiên cứu tiếp theo về thu nhận sửdụng cellulase vào đời sống sản xuất, sinh năng lượng hoặc làm sạch môi trường

Kết quả nghiên cứu có tính mới và là nguồn tham khảo tốt cho việc giải quyếtvấn đề về nguồn năng lượng sinh học an toàn vào sản xuất khi sử dụng nguồn enzymenày

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cellulose

Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật Ngoài ra, người ta còn thấy chúng

có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (VSV) Ở tế bào thực vật và một số tế bào visinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của phân tử cellulose

Cellulose không có trong tế bào động vật Chúng là một homopolimer mạchthẳng, được cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose Các thành phần này liên kết vớinhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết α-1,4glucoside Các gốc glucose trong cellulose thường lệch nhau một góc 180o và có dạngnhư một chiếc ghế bành Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được cấutạo như hình 1.1 và hình 1.2

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử celulose

Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy Người và hầu hết động vật không cókhả năng phân hủy cellulose Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sảnphẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu

cơ Tuy nhiên nhiều chủng VSV bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn có khả năngphân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase [3]

Giá trị của Cellulose giống như một nguồn tài sinh năng lượng được tạo ra từthủy phân là đối tượng của NC cường độ cao và mối quan tâm công nghiệp Nó là mộtsản phẩm ban đầu của quang hợp ở môi trường trên cạn, và là nguồn sản xuất vi sinhvật tái sinh đa dạng nhất trong sinh quyển(100 tỉ tấn khô/1 năm) Khoảng gần 70%sinh khối của cây được chứa trong đường 5 và 6C(D- xylose, D-arabinose, D-glucose,D-galaclose, D- mannose).[23,24,25]

Thành phần chính được tìm thấy trong lignocellulosic sinh khô, bao gồm chủyếu là Cellulose, ít hơn nữa là hemicelluloses và ít nhất của tất cả ligrin Chúng có thểchuyển đổi các Pdime sinh học này thành Glucose phân tử bằng cả ý nghĩa hóa học vàsinh học Cellulose là thành phần rộng lớn nhất của phần dư thực và hệ sinh thái trêncạn và do đó đại diện cho một nguồn năng lượng rất lớn cho vi sinh vật, tác nhân chínhchịu trách nhiệm cho phức chất hữu cơ rắn Các vi sinh vật bao gồm: vi khuẩn, nấm,

và xạ khuẩn có thể thực hiện chuyển đổi sinh học Cellulose Cellulose, một dạngpolime tinh thể của dư lượng D-glucose đã kết nối với liên kết   1, 4 Glucosidic,thuộc về nguyên liệu cấu trúc ban đầu của tế bào cây, là nguồn cacbonhdrat phổ biếnnhất trong tự nhiên Do đó, nó trở thành một quá trình phát triển nguồn lợi kinh tếđáng kể cho sự xử lý có hiệu quả và sự sử dụng của phế thải từ gỗ giống như mộtnguồn cacbon không đắt Cellulose là một Enzyme sử dụng cho sự chuyển đổi sinhhọc của Cellulosic và lignocellulosic dư Hoạt động của Cellulolytic là một hệ thốngEnzym đa cấu tử và hoàn thành quá trình thủy phân Hdrolysic của hoạt động Enzymhợp tử của 3 Enzymes hoạt động liên tục trong hệ thống Synergistc và sau đó chuyểnhóa Cellulose một nguồn năng lượng có thế dùng được và do đó Cellulases cung cấpmột vai trò chính trong sự sử dụng sinh khối Ảnh hưởng hiệu quả chính nhất của hoạtđộng Cellulase được quan sát trong nấm nhưng có một sự tăng đáng quan tâm trong sựsản xuất Cellulase bằng vi khuẩn bởi vi khuẩn phát triển cao giồng như nấm và co tiềmnăng tốt để được sử dụng trong Cellulase Nghiên cứu cho phát triển nòi giống vi sinhvật năng suất Cellulase hoạt động cao hơn với nhiều hoạt động hơn và tính ổn định vớinhiệt độ cao, PH và dưới điều kiện không vô trùng có thể tạo nên quá trình có tính tiếtkiệm hơn vi khuẩn và nấm được tìm để sản xuất và tiết ra các Enzyme tự do trongdung dịch; Tuy nhiên, một số sinh vật Cũng được tìm thấy để sản xuất cá tế bàogiới hạn và Protein-đa cấu tử thể hiện.Các cellulosome lần đầu tiên được phát hiện lần

đầu tiên vào năm 1983 từ các thể kị khí, bào tử chịu nhiệt của Clostridiumthermocellum Quá trình sản xuất của cellulase nhìn chung phụ thuộc vào tham số tăngtrưởng bao gồm quy mô cấy, độ pH, nhiệt độ, sự có mặt của chất gây xúc tác, chất bổsung vào môi trường, sự thoát khí, và thời gian và cũng như hoạt dộng của cellulasexuất hiện sự phụ thuộc vào sự có mặt ion kim loại khác nhau giống như những chấthoạt hóa hoặc ức chế [26,27]

Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo thành các phân tử đườngβ-glucose Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân hủy dưới tácdụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-β-(1,4)-glucanansehay enzyme C1, Endo-β- glucananse hay endocellulase còn gọi là enzyme CMC-asehay Cx và β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase

1.2 Giới thiệu về enzyme cellulase

1.2.1 Cấu trúc của cellulase

Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là axit amin, cácaxit amin được nối với nhau bởi lien kết peptid –CO-NH- Ngoài ra, trong cấu trúccòn có những phần phụ khác, Cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhómendoglucanase (EG) và exoglucanase (CBH) giống nhau trong hệ cellulase củanấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát

từ trung tâm xác tác và được gắn them vùng glycosil hóa, cuối đuôi là vùng gắn kếtvới cellulose (CBD: cellulose binding domain) Vùng này có vai trò tạo liên kếtvới cellulose tinh thể Trong quá trình phân hủy cellulose có sự tương quan mạnhgiữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực của enzyme nàyđối với cellulose Hơn nửa, hoạt tính của cellulase dựa vào tinh thể cellulose và khảnăng kết hợp của CBD với cellulose Điều này chứng tỏ CBD làm gia tăng hoạt tínhcellulase đối với tinh thể cellulose Sự có mặt của CBD sẽ hỗ trợ cho enzymecellulase thực hiện việc cắt đứt nhiều liên kết trong cellulose tinh thể Vùng gắn kếtvới cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổichiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme.[2,6]

Hình1.3 Enzymecellulase

Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethylcellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC) Cellulase cắt liên kết β-1,4-glucosid trong cellulose, lichenin và các β-D-glucan của ngũ cốc [2]

Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau Cellulase hoạt động

ở pH từ 3-7, nhưng pH tối thích trong khoảng 4-5 Nhiệt độ tối ưu từ 40-50 độ C.Hoạt tính cellulose bị phá hủy hoàn toàn ở 80 độ C trong 10 đến 15 phút

Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose,cellobiose và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg Ngoài ra, cellulose còn bị ức chế bởi cácion kim loại khác như Mn, Ag, Zn nhưng ở mức độ nhẹ

Trọng lượng của enzyme cellulose thay đổi từ 30 -110 [12]

1.2.2 Nguồn gốc của enzyme cellulase

• Được thu nhận từ các nguồn khác nhau:

– Động vật: dịch tiết dạ dày bò, các nhóm thân mềm…

– Thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mìmạch đen…

– Vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men…

• Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật.Các chủng vi sinh vật thường sử dụng:

– Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus… – Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli…

– Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis…

1.2.3 Cơ chất của enzyme cellulase

Cellulose là cơ chất của enzyme cellulase.Cellulose là một polysaccharidephong phú nhất trong tự nhiên Việc phân hủy sinh học cellulose bởi vi sinh vật làmột trong những bước chính của chu trình carbon trên trái đất [7]

1.2.4 Phân loại enzyme cellulase

Về phương diện hóa học, cellulose là một polyme được cấu tạo từ các đơn

vị ß -glucose nối với nhau bằng liên kết ß -1,4-glucoside Cellulose là thành

phần polysaccharide chủ yếu của vách tế bào thực vật

Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzyme cellulase được chiathành ba loại:

- 1,4- ß -D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)

- 1,4- ß -D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)

- ß -D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)

Các enzyme này được tìm thấy trong vi khuẩn sống trong dạ dày cỏ bò và

mối và trong một số nấm như Trichoderma, Aspergillus, [9,11]

1.2.5 Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase

Cơ chế 1,4- ß-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)

Enzyme này còn có tên gọi khác như: exoglucanase, exo- ß glucanase, cellobiohydrolase, exo – cellobiohydrolase, exo- ß -1,4-glucan cellobiohydrolase, 1,4-ß -D-glucan cellobiosidase, cellobiosidase, CBH 1, C1

-1,4-cellulase, avicelase

Enzyme này thủy phân liên kết 1,4- ß -D-glucoside từ đầu không khử của

chuỗi cellulose để tạo thành celllobiose

Hì n h 1 4 Cơ chế 1,4- ß -D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)

Enzyme này còn có tên gọi khác như: Endoglucanase, Endo-1,4- ß glucanase, Endo-1,4 glucanase, ß -1,4-endoglucan hydrolase, Carboxymethyl

-D-cellulase, Celludextrinase, Cellulase A, Cellulosin AP, Alkali Cellulase, Cellulase A3,9,5 Cellulase, Avicelase, Pancellase SS

Enzyme này thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4- ß -D-glucoside giữa mạch của chuỗi cellulose, lichenin và các ß -D-glucan của ngũ cốc.

Hình 1.5 Cơ chế hoạt động của endoglucanase

Cơ chế-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)

Enzyme này thủy phân gốc ß -D-glucoside không khử ở đầu tận cùng để phóng thích ra ß -D-glucose.

Bảng Cơ chế hoạt động ß -glucosidase

Hình 1.6 Quá trình phân giải cellulose của cellulase

1.2.6 Hoạt lực của enzyme cellulase (cơ chế thủy phân cellulose)

Thủy phân cellulose phải có sự tham gia của cả ba loại enzyme cellulose nhưendoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase Thiếu một trong ba loại enzyme trênthì không thể thủy phân phân tử cellulose đến cùng.[9]

Từ những nghiên cứu riêng lẽ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu tácđộng tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulose, nhiều nhà khoa học đều đưa rakết luận chung là các loại enzyme cellulose sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose đểtạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose Có nhiều cách giải thích khác nhau về cơchế tác động của cellulose, trong đó cách giải thích do Erikson đưa ra được nhiềungười công nhận hơn cả

Theo Erikson và cộng tác viên (1980), cơ chế tác động hiệp đồng của 3 loạicellulose như sau: đầu tiên endoglucanase tác động vào vùng vô định hình trên bề mặtcellulose, cắt liên kết β-1,4-glucosid và tạo ra các đầu mạch tự do Tiếp đóexoglucanase tấn công cắt ra từng đoạn cellobiose từ đầu mạch được tạo thành.Kết quả tác động của endoglucanase và exoglucanase tạo ra các celloligosaccharitmạch ngắn, cellobiose, glucose β-glucosidase thủy phân tiếp và tạo thành glucose

Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulose trong điều kiện tựnhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên cóloài phát triển rất mạnh, có loài lại phát triển yếu Chính vì thế, việc phân hủycellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm

Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủycellulose bằng enzyme, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độm pH, nồng độ cơ chất,lượng enzyme…, một yếu tố hết sức quan trọng là tính đồng bộ của hệenzyme cellulose từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau Quá trình thủy phân cellulosechỉ có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ ba loạienzyme cellulose

Mỗi loại vi sinh vật chỉ có khả năng sinh tồng hợp ưu việt một loại enzyme.Chính vì thế cần phải khai thác enzyme cellulose từ nhiều nguồn vi sinh vật [5,7]

1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực của enzyme cellulase

1.2.7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của visinh vật cũng như tính chất của enzyme được tồng hợp Sinh trưởng và sinh tổng hợpenzyme thường bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp

Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong mộtgiới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme Hoạt tính enzyme đạtcực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vàokhoảng 40 – 500C Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặcmất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới 00C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưnglại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp

Cellulase từ A niger NRRL – 363 hoạt động mạnh nhất ở 500C, trong khi đó cellulase từ A niger Z10 là 400C, còn hoạt tính xúc tác của endoglucanase III từ Trichoderma reesei đạt tối đa ở 550C Theo kết quả nghiên cứu của Kiamoto và cs (1996), các endoglucanase từ chủng A oryzae KBN616 hoạt động tốt nhất torng dải

nhiệt độ 45 – 550C

1.2.7.2 Ảnh hưởng của pH

Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pH môi trường phản ứng.Tủy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp để enzyme hoạt động cóthể trung tính, kiềm hoặc acid Theo nghiên cứu trước đây cho thấy, pH tối thích cho

hoạt động của cellulase từ A niger NRRL – 363 là 5,5; của cellulase từ A niger Z10

là 4,5 và 7,5; của endoglucanase III từ Trichoderma reesei là 4,0 – 5,0; của endoglucanase từ A oryzae KBN616 là 4,0 – 5,0 Khi nghiên cứu ảnh hưởng của

pH lên hoạt tínhendoglucanase từ chủng nấm ưa acid A terreus M11, Gao và cộng

sự (2008) cho rằng enzyme này có khả năng hoạt động trong dải pH 2 – 5, trong đó

pH 2 là tốt nhất.[2,4]

1.2.7.3 Ảnh hưởng của ion kim loại

Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme.Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãmkhông thuận nghịch enzyme Sharma và cs (1995) nhận thấy, ion Ca2+ làm tăng hoạt

tính của enzyme cellulase của Baccillus sp D04 lên 40% so với đối chứng, còn Mg2+

làm giảm nhẹ (hoạt tính còn lại 92%) và Zn2+ ức chế mạnh hoạt tính của enzymenày (hoạt tính còn lại bằng 37% so với đối chứng) Theo nghiên cứu của Gao và

cộng sự (2008), endoglucanase từ A terreus M11 bị giảm 77% hoạt tính khi ủ với

Hg2+ (2mM), 59% khi ủ với Cu2+ (2mM)

Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rữa cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đếnhoạt tính của enzyme Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bản chất củaenzyme mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme là khác nhau

Nghiên cứu trên chủng Penicillium sp DTQ – HK1 cho thấy, các dung môi hữu cơ

methnol, ethanol, isopropanol và aceton đều ức chế hoạt động của cellulase đặc biệt là

n – butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn

33 – 63% Các chất tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS và triton X – 100 đều làmgiảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau, trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tínhcellulase chỉ còn 18 – 34%.[3]

1.2.7.4.Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện dư thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>[E] thì tốc độ phản ứng phụthuộc vào [E], v= K[E] có dạng y=ax Nhờ đó người ta đã đo [E] bằng cách đo vận tốcphản ứng do enzyme đó xúc tác

Có nhiều trường hợp trong môi trường có chứa chất kìm hãm hay hoạt hóa thìvận tốc phản ứng do enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] đó.[1]

1.2.7 5 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [S]

Ta khảo sát trường hợp đơn giản nhất: chỉ một cơ chất

k1 k2

k-1

Gọi v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES

Gọi v-1 là vận tốc của phản ứng phân ly phức chất ES tạo thành E và SGọi v2 là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P (sản phẩm)

Ta có: [ES]=Km[Eo][[S S]]

Mặt khác vận tốc phản ứng tạo thành sản phẩm P là: V= k2[ES]

Thay [ES] bằng giá trị ở trên ta thu được:V= k Km2[Eo][[S S]] (4)

Qua đây ta thấy nồng độ enzyme càng cao thì vận tốc phản ứng enzyme cànglớn Vận tốc đạt cực đại khi toàn bộ enzyme liên kết với cơ chất, nghĩa là :

Vmax = k2 [E0]

Thay vào phương trình (4) ta được:

v= Vmax [ ]

] [

S Km

S

Phương trình (5) được gọi là phương trình Michelis Menten

Km gọi là hằng số Michelis Menten đặc trưng cho mỗi enzyme Km đặc trưngcho ái lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơchất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn

Ý nghĩa thực tiễn của hằng số Michelis là ở chỗ nó chính là giá trị của nồng độ

cơ chất khi tốc đọ phản ứng bằng ½ tốc độ tối đa Thay V và v bằng các con số tươngứng là 1 và 0,5 vào phương trình trên, ta sẽ thấy rõ điều đó Như vậy, Km được đo bằngđơn vị nồng độ, tức là mol/l

Hằng số Michelis là một hằng số rất quan trọng nó xác định ái lực của enzymevới cơ chất Km càng nhỏ thì ái lực này càng lớn, tốc độ phản ứng càng cao vì tốc độ tối

đa V đạt gía trị nồng độ cơ chất càng thấp

Trên cơ sở phương trình Michelis Menten, bằng cách xây dựng đường biểu diễn

sự phụ thuộc của v vào [S] và bằng đồ thị đó xác định tốc độ tối đa V ta có thể tìmthấy giá trị của [S], ở đó v=V/2 tức giá trị của Km (hình )

Hình 1.7 Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất

Khi tăng [S] thì vận tốc phản ứng tăng, tăng [S] đến một giá trị nào đó thì v đạtđến giá trị vmax và sẽ không tăng nữa nếu ta tiếp tục tăng [S].

Khi Km = [S] thì v0=

2

1Vmax

Năm 1934 Lineweaver và Burk, trên cơ sở của phương trình (5) đã

Nghịch đảo để biến thành dạng đường thẳng y = ax+b, nó có ý nghĩa lớn đốivới việc nghiên cứu kìm hãm enzyme

Hình 1.8 Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất.

Trong nhiều phản ứng do enzyme xúc tác có hai hay nhiều cơ chất hexokinasexúc tác phản ứng:

ATP + glucose hexokinase ADP + glucose 6 phosphate

1.3 Tổng quan về mối

1.3.1 Tìm hiểu về loài mối

Mối là côn trùng đa hình thái, chúng có đời sống xã hội chặt chẽ, sống kín đáotrong đất và trong các giá thể bằng gỗ, mối gây thiệt hại lớn Mối không những pháhại những nhà tranh tre nứa là, nhà cấp 4 mà chúng còn xâm nhập gây hại những cấukiện bằng gỗ trong cao ốc nhiều tầng, chúng còn phá hoại cây trồng… các sản phẩm

có nguồn gốc từ xenlulô, len dạ… ở Việt Nam theo thống kê chưa đầy đủ mỗi nămmối gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng [7]

Hình 1.9 Loài mối sử dụng cellulose làm thức ăn

Loại hình sinh sản hay còn gọi là mối sinh sản:

Đối với loại hình này thân hình tương đối lớn, nhất là mối chúa có phần bụngcực kỳ to, cơ thể chúng có cơ quan sinh sản phát dục hoàn chỉnh, nên trong quần thểmối chúa có chức năng giao phối và đẻ trứng, về nguồn gốc và hình thái trong loạihình này không giống nhau có thể chia thành 3 đẳng cấp như sau:

- Mối vua và mối chúa nguyên thuỷ:

+ Mối cánh trưởng thành sau khi bay giao hoan, rụng cánh ghép đôi giao phối

và sinh sản gọi là mối vua mối chúa nguyên thuỷ (đầu tiên) Về hình thái có màu thẫmhơn, rắn chắc hơn, có mắt kép và mắt đơn phát triển một đặc điểm để nhận biết là mặtlưng của ngực giữa và ngực sau còn giữ lại hai đôi vảy cánh chúng có sức sinh sảnlớn, mối vua có chức năng thụ tinh, mối chúa sinh sản

+ Mối vua mối chúa bổ xung cánh ngắn: Loại hình này có thể không phải làđẳng cấp phổ biến tồn tại Về hình thái thì màu sắc của thân hơi nhạt và mềm hơn, cómắt kép và có đặc điểm để nhận biết là ngực giữa và ngực sau có hai đôi cánh nhỏ,ngắn giống như cánh con cào cào còn non, sức sinh sản yếu hơn mối vua, mối chúanguyên thuỷ Mối vua mối chúa cánh ngắn thường xuất hiện khi mối vua và mối chúanguyên thuỷ chết, nhưng cũng có khi tồn tại đồng thời

+ Mối vua và mối chúa không cánh: Loại hình này tồn tại không phổ biến, ítthấy, về hình thái thì màu mắc thân thể nhạt thường là màu vàng có khi là màu trắng,

cơ thể mềm, không có cánh và mắt kép Một đặc điểm nổi bật của mối vua và mối

chúa không cánh là không bao giờ bay ra khỏi tổ vì không có cánh đầy đủ và không

có cánh để bay giao hoan phân đàn Loại hình này thường xuất hiện khi mối vua vàmối chúa nguyên thuỷ chết

Lượng trứng do mối chúa đẻ ngày càng tăng theo tuổi của chúng Khi mối chúađạt đến tuổi sinh sản khoảng từ năm thứ 10 trở đi thì lượng trứng đẻ mỗi vụ trở lên kỷlục, khiến người ta có thể ví mối chúa như cái “máy sản xuất trứng” Chẳng hạn nhưmối chúa Nasutitermes Surinamensis kích thước 24x8mm đẻ 2983 trứng trong 18 giờ.Mối chúa Bellicostitermes đẻ 3.600 trứng trong 24 giờ

1.3.2 Loại hình không sinh sản:

- Mối lính: hầu hết chủng loại mối đều có mối lính Mối lính có chức năng bảo

vệ quần thể mối Do chuyển hoá bộ phận miệng hàm trên rất phát triển dùng để bảo

vệ nên mối lính mất đi chức năng tự lấy thức ăn cho mình, để tồn tại mối thợ phảimớm thức ăn cho mối lính

- Mối thợ: Mối thợ là đẳng cấp chiếm đông nhất trong loại hình không sinh sảncủa quần thể mối Mối thợ chia ra làm mối đực và mối cái nhưng cơ quan sinh sảnphát dục không hoàn chỉnh, do vậy chúng không đẻ được Mối thợ đảm nhận nhiệm

vụ kiếm thức ăn, xây tổ, làm đường mui, mớn thức ăn cho mối vua, mối chúa, mốilính, chăm sóc mối non, vận chuyển trứng mối để duy trì sinh sống của quần thể mối

1.3.3 Thời kỳ bay giao hoan phân đàn:

Hiện tượng bay giao hoan phân đàn (vũ hoá) là một đặc tính sinh học của mối,qua đó mà mối duy trì được nòi giống và phát triển Mối bay giao hoan phân đàn từtháng 4 đến tháng 8 hàng năm, thời gian bay giao hoan sớm hay muộn tuỳ thuộc từngloài mối và khí hậu cụ thể hàng năm mà thay đổi, nhưng thời gian bay giao hoan phânđàn tập trung vào tháng 4,5,6 và 7

Mối non cánh ngắn và mối cánh ngắn sau khi hoàn thành lần lột xác cuốicùng thì thành mối cánh trưởng thành Mối cánh trưởng thành còn lưu lại trong quầnthể nó đang sống một thời gian đợi đến khi ngoại cảnh thích nghi nó mới bay rangoài Hiện tượng này gọi là phân đàn, bay giao hoan

Sau một tuần lễ ghép đôi, giao phối rồi đẻ trứng, năng lực đẻ trứng tuỳ theoloài, nhưng nói chung lúc đầu đẻ ít sau đẻ nhiều Lúc này mối cánh trưởng thành rụngcánh đực gọi là mối vua, còn mối cánh trưởng thành cái đuợc gọi là mối chúa, phầnbụng dài ra và to ra.

Tuổi thọ của các cá thể mối và quần thể mối cho đến nay vẫn chưa rõ ràng,mối thợ tuổi thọ trung bình 2-3 năm Còn mối vua mối chúa có loài sống đến 25năm [7]

1.3.4 Tổ mối

- Mối sống trong gỗ: Loại tổ mối này thường làm trong gỗ hoặc trong cành câykhô không liên hệ với đất

- Mối sống trong đất: Chúng thường dựa vào đất để làm tổ, thường ở gần phần

rễ của cây hoặc trong cột gỗ chôn trong đất, tổ của nhóm mối này thường chìm trongđất hoặc nửa nổi nửa chìm trong đất

- Mối sống trong gỗ và đất: Tổ được xây dựng trong gỗ nhưng vẫn có đườnggiao thông nối với đất để lấy nước.[27]

1.3.5 Thức ăn của mối

Thức ăn của mối chủ yếu có nguồn gốc từ thực vật, các loại nấm được cấytrong tổ Quá trình dinh dưỡng của mối diễn ra như sau: Thức ăn do mối thợ nuốt vàotrong cơ thể sau đó mối thợ đem thể dịch thức ăn đã được tiêu hoá hoặc tiêu hoá mộtphần trong cơ thể ựa ra đường miệng hoặc bài tiết ra đường hậu môn để bón cho mốivua, mối lính, mối non, mà bản thân chúng cũng không lấy được thức ăn giữa nhứngmối thợ cũng bón cho nhau bằng miệng Quá trình tiêu hoá thức ăn diễn ra như vậy lànhờ trong ruột mối có những vi sinh vật cộng sinh và những vi sinh vật này có khảnăng phân huỷ Xenlulo thành monoacarit là sản phẩm mà mối có thể hấp thụ được.Tập quán của chúng là liếm và ăn phân lẫn nhau nên vi sinh vật cộng sinh cũngchuyển từ ruột con mối này sang ruột con mối khác Trong trường hợp những con mốithợ nuốt phải chất độc chúng lại ựa ra bón cho nhau và liếm, ăn phân của nhau chúng

sẽ bị chúng độc lây truyền mà chết Nghiên cứu này đã được vận dụng để diệt mốinhà phá hoại công trình xây dựng đã đem lại kết quả rất tốt [27]

Mối mọt sẽ không còn là nỗi phiền hà của con người nữa nếu các nhà khoa họcthành công trong việc tìm ra nguồn năng lượng mới từ những sinh vật này Một loại vikhuẩn trong ruột mối có khả năng chuyển hóa gỗ thành chất đường, có thể được sửdụng để chạy các ứng dụng, như ô tô

Hiện nay, một số các nguồn năng lượng thay thế như ethanol chỉ có thể sảnxuất từ một số loại hoa màu nhất định, ví dụ như ngô Nhưng trong quá trình sản xuất,chỉ có phần hạt là được sử dụng; còn các bộ phận khác như thân, cuống, lá người tacần phá vỡ cấu trúc của cellulose - một loại phân tử rất phức tạp, thành chất đườngtrước khi chuyển hóa thành năng lượng

Vi khuẩn có thể giúp biến khả năng trên thành hiện thực vì chúng tiết ra mộtloại enzyme phá vỡ cấu trúc của cellulose và các phức hợp khác Các nhà khoa họcthuộc Viện Nghiên cứu Năng lượng sinh học Mỹ (JDI) đang tiến hành thử nghiệmtrên 100 mẫu vi khuẩn khác nhau trong ruột mối để hiện thực hóa khả năng trên.Các nhà nghiên cứu đã xác định được hai loại vi khuẩn tiết ra enzyme phân hủy gỗ.Theo Phil Hugenholtz, đồng tác giả của bài viết về công trình này trên tạp chí Nature,một trong hai loài vi khuẩn trên, loài fibrobacters có họ hàng với một loại vi khuẩnkhác có khả năng phân hủy cellulose tìm thấy trong ruột bò Loại vi khuẩn này cũngđang được nghiên cứu để ứng dụng vào quá trình sản xuất năng lượng có nguồn gốc

Tuy nhiên, theo Eddy Rubin - Giám đốc của JGI: “Ứng dụng quy trình trên vào sảnxuất trên quy mô công nghiệp không hề dễ dàng Mối có thể chuyển hóa mi-li-gramchất lignocelluloses thành đường lên men nhưng quy mô hóa quá trình này để phục vụcho việc sản xuất năng lượng sinh học lại là chuyện khác Muốn thực hiện được điều

đó, các nhà nghiên cứu cần tiến hành nhiều công trình khác để xác định nhóm gien cókhả năng phá vỡ các cấu trúc cellulose.[9]

1.3.6 VSV sinh tổng hợp cellulase trong ruột mối

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi VSV cả trong điều kiệnhiếu khí và yếm khí Các loài VSV thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩmcuối cùng là glucose Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp enzyme có trongđiều kiện tự nhiên rất phong phú Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong

một số trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia quá trìnhphân giải này Bảng 1.1 dưới đây là một số loại VSV được các nhà khoa học nghiêncứu kỹ nhất [9]

Act.diastaticus Act roseus Act.griseus Act.melamocylas Act.coelicolor Act.candidus Act.chromogenes Act hygroscopicus Act.griseofulvin Act.ochroleucus Act.thermofulcus Act.xanthostrums Thermonospora curvata

Preudomonas Fluorescens B.megaterium B.mensenteroides Clostridium sp.

Acetobacter xylinum

Vi khuẩn dạ cỏ Ruminoccus albus Ruminobacter parum Bacteroides

Amylophillus sp.

Clos.butiricum Clos.locheheadil Cellulosemonas

1.4 Tình hình nghiên cứu về enzyme cellulase

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nghiên cứu và ứng dụng của cellulase bắt đầu từ những năm 1950 Cuối thế kỷXIX đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ các loại vi

sinh vật Một số nghiên cứu về cellulase từ nấm của một sồ tác giả như : Trichoderma reseii (Ogawa và cộng sự, 1991), Aspergillus sp (Lusta và cộng sự, 1999),

Schizophillum commune (Wilick & Seligy, 1985), Fusarium lini, Penicillium funiculosum (Fogarty & Kelly, 1990) Năm 2000, Mawadza và cộng sự đã nghiên cứu

về khả năng tổng hợp cellulase từ các loại nấm có tính đặc hiệu cao bao gồm phức hệ

3 enzyme: endoglucanase, cellobihydrolase và β-glucosidase thủy phân hoàn toàncellulose

Trong số những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của vi khuẩn thì Bacillus

là chủng có khả năng sản sinh cellulase ngoại bào với số lượng lớn, và được quan tâm

nghiên cứu nhiều hơn cả đặc biệt là: B.subtilis (Park và cộng sự, 1991), B.polymxa, B.cereus (Robson & Chambliss, 1989), B.pumilus (Christakopoulos và cộng sự, 1999), Bacillus sp KMS-330 (Ozaki & Ito, 1991) và KMS-635 (Ito và cộng sự, 1989)

Do cellulase có nhiều ứng dụng, cho nên rất nhiều nghiên cứu về enzymecellulase như: nghiên cứu về các tính chất hóa lý của chúng như xác định khối lượngphân tử của Macarrón và cộng sự (1993); Sang và cộng sự (1995); Henriksson và cộng

sự (1999); Karisson và cộng sự (2001); Coral và cộng sự (2002); Hiroshi và cộng sự(2005), xác định nhiệt độ tối ưu của Isabel và cộng sự (1992); Macarrón và cộng sự(1993); Coral và cộng sự (2002), xác định pH tối ưu (Macarrón và cộng sự, 1993;Coral và cộng sự, 2002), xác định ảnh hưởng của ion kim loại (Sang và cộng sự,1995)

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong những năm gần đây ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về vi sinh vậtphân hủy cellulose và cellulase (Đặng Minh Hằng, 1999; Hoàng Quốc Khánh và cộng

sự, 2003; Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007; Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, 2006).Những nghiên cứu này chủ yếu đề cập vấn đề phân lập các chủng vi sinh vật và đánhgiá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulasenhư: tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinhtổng hợp cellulase và tinh sạch, đánh giá tính chất hóa lý của cellulase từ chủng

penicillium sp DTQ - HK1 (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007) Nghiên cứu phân loại

và xác định hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt XKS2 (Nghiêm NgọcMinh và cộng sự, 2006) Ngoài ra còn có nghiên cứu và tuyển chọn các chủng vi sinhvật sinh cellulase cao từ rong giấy

Từ các kết quả nghiên cứu chưa có đề tài nghiên cứu nào trong nước nghiêncứu về tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh cellulase trong ruột mối và các yếu tố ảnhhưởng đến hoạt lực của chúng, nhằm tìm ra được các chủng có hoạt lực cao để ứngdụng cho làm sạch môi trường và tạo nguyên liệu sinh học an toàn, có giá trị kinh tế.Đây sẽ là nghiên cứu mở ra hướng đi mới cho những nghiên cứu quy mô sâu hơn tiếptheo có khả năng màng lại hiệu quả và kinh tế cao.

1.5 Ứng dụng của nhóm cellulase

1.5.1 Sơ lược về ứng dụng của cellulase

Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng nó đểtăng độ hấp thụ, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật.Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ con và nói chung chất lượng thực phẩm được tănglên Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà rốt,khoai tây, táo và lương thực gạo Người ta còn xử lý cả chè, các loại táo biển.[4]

Trong sản xuất bánh mì từ lúa mạch đen, việc sử dụng enzyme này sẽ làmtăngchất lượng bánh, nhờ vào việc thủy phân một phần pentosan có trong bột

Việc ngâm trong dung dịch enzyme sẽ thúc đẩy quá trình hòa tan các thànhphần của thực vật Hỗn hợp sau thường được sử dụng: exo- và endo-cellulase,  và

 - mannosidase và pectolytic enzyme Ví dụ ứng dụng trong sản xuất quả nghiền,hoặc rau nghiền (puree), quá trình phân giải lá chè, quá trình sản xuất bột khoai tây,

Glycosidase (cellulase và amylase từ Aspergillus Niger) khi sử dụng chung với

proteinase sẽ loại bỏ được vỏ từ tôm Vỏ tôm được làm lỏng và tuột ra dễ dàngdưới vòi nước

Cellulase thường được sản xuất bằng phương pháp lên men các loại nấm mốchoặc vi khuẩn Tại châu Âu, có ít nhất năm loại cellulase được sản xuất từ các vi sinh

vật biến đổi gene như Aspergillus, Bacillus, Trichoderma, nhưng chỉ có cellulase sản xuất Trichoderma là được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm [10].

Bên cạnh enzyme cellulase còn có hemicellulase, enzyme này thường được sửdụng chung với amylase, glucanase, cellulase, xylanase Thường ứng dụng trong côngnghiệp sản xuất bánh, sản xuất cồn, sản xuất rựu vang, sản xuất nước giải khát từ quả

Hemicellulase thường được sản xuất bằng phương pháp lên men các loại nấm

vi khuẩn Tại Châu Âu chỉ có một loại Hemicellulase được sản xuất từ Bacillus biến

đổi gene Để sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, người ta thường dùng

hemicellulase sản xuất từ nấm mốc như Aspergillus Niger [4]

1.5.2 Các ứng dụng của nhóm enzyme cellulase

1.5.3.Trong công nghiệp giấy

Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme trongkhâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng Nguyên liệu ban đầuchứa hàm lượng cao các chất khó tan là lignin và một phần hemicellulose, nên trongquá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặp nhiều khó khăn.Trong công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấuhình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng choquá trình nghiền cơ học Trước khi nghiền hóa học, gỗ được xử lý với endoglucanase

và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tánhóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin

Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trước khisản xuất các loại giấy in, giấy viết Endoglucanase và hemicellulase đã được dùng đểtẩy trắng mực in trên giấy

Enzyme cellulase được bổ sung vào nhiều giai đoạn khác nhau trong quá trìnhsản xuất giấy:

 Trong giai đoạn nghiền bột giấy cơ học: Người ta bổ sung enzymecellobiohydrolase nhằm làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, từ đó làm tăngkhả năng nghiền và tiết kiệm 20% năng lượng

 Trong giai đoạn nghiền bột giấy hóa học: Ngoài enzyme cellulase, người

ta còn bổ sung thêm enzyme hemicellulase và peptinase nhằm phá vỡ lớp vỏ ngoài của

gỗ, giúp tăng cường khả năng khuyếch tán của hóa chất vào bên trong gỗ, nhằm làmtăng hiệu quả khử ligin

 Trong giai đoạn tẩy trắng giấy: Đây là giai đoạn rất quan trọng trong sảnxuất giấy Trước đây, người ta thường sử dụng acid HCl để tẩy trắng giấy; tuy nhiên,HCl thải ra trong quá trình sản xuất làm ô nhiễm môi trường và gây hại đối với sứckhỏe con người Ngày nay, người ta thường sử dụng enzyme cellulase trong giai đoạntẩy trắng giấy cũng như trong quá trình tái chế giấy Ưu điểm của phương pháp này

là giữ cho sợi giấy không bị ăn mòn nhiều và không ảnh hưởng đến môi trường

Hình 1.10 Sợi giấy được tái chế

1.5.4 Trong công nghiệp dệt

Trong công nghiệp dệt, người ta sử dụng enzyme cellulase để giữ màu vảisáng, bền và không bị sờn cũ

Đối với vải jean, cellulase được dùng để làm mềm vải jean và tạo ra các vệt

“stone washed” Trước đây các vệt “stone washed” được làm thủ công bằng cáchdùng đá bọt chà lên vải jean, làm mất lớp kiềm trên bề mặt vải và tạo ra những sợi chỉtrắng Hiện nay người ta sử dụng enzyme cellulase trong giai đoạn giặt vải jean thaycho việc sử dụng đá bọt Enzyme cellulase chỉ phân hủy theo các vết kiềm trên vảijean đã nhuộm màu để tạo ra các vệt “stone washed” Các vệt “stone washed” đượctạo ra bằng phương pháp này bền hơn bằng cách dùng đá bọt Ngoài ra, người ta cóthể tăng độ đậm nhạt của các vệt này bằng cách tăng hay giảm hàm lượng cellulase

sử dụng trong giai đoạn giặt [2]

1.5.5 Trong xử lý môi trường

Các chất thải hữu cơ chiếm một khối lượng rất lớn trong tổng số chất thảihữu cơ hiện nay ở các đô thị và các khu công nghiệp Trong các chất thải hữu cơ cónguồn gốc thực vật, cellulose chiếm khoảng 50% Các chất thải hữu cơ chứa cellulosethường là những chất rất khó phân hủy trong điều kiện tự nhiên Nếu để các chất hữu

cơ phân hủy trong điều kiện tự nhiên thì thời gian phân hủy rất lâu (khoảng hơn támtháng ở điều kiện khí hậu nhiệt đới); tuy nhiên nếu bổ sung vi sinh vật giàu cellulasethì thời gian phân hủy sẽ rút ngắn chỉ còn khoảng một tháng Điều này rất có ý nghĩatrong việc bảo vệ môi trường (hạn chế sự ô nhiễm nước, không khí và đất) đồng thờithúc đẩy quá trình chuyển hóa vật chất trong tự nhiên.[1,2]

Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải thì việc tạo racác chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được nghiên cứu vàsản xuất

Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lý nguồn nước thải do các nhà máy giấythải ra Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao) Sinh khối nàychứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trọng quyếtđịnh tới chất lượng, số lượng giấy là cellulose Vì vậy, nước thải của các nhà máygiấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệcellulase đem lại hiệu quả cao

1.5.6 Trong sản xuất thức ăn gia súc

Nguồn phế liệu giàu cellulose trong tự nhiên rất đa dạng, phong phú như:rơm rạ, bã mía, cùi bắp, Tuy nhiên, phần lớn các chế phẩm này bị vứt bỏ, hoặc được

ủ làm phân bón, hoặc được sử dụng làm chất đốt, Trong khi đó, nguồn nguyên liệu

rẻ tiền dùng trong chế biến thức ăn gia súc lại thiếu Vì vậy, việc ứng dụng enzymecellulase để phân hủy nguồn phế phẩm chứa cellulose vừa dùng hoặc làm nguồn thức

ăn cho gia súc, vừa góp phần bảo vệ môi trường là một vấn đề rất đáng quan tâm

Hiện nay người ta đã dùng vi sinh vật để lên men bã mía của nhà máy đường

La Ngà để bổ sung vào thức ăn gia súc

1.5.7 Trong kỹ thuật di truyền

Chế phẩm enzyme cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền

vì enzyme cellulase phá vỡ tế bào thực vật mà không làm tổn thương các cơ quan bêntrong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn của các nhân tố di truyền Do đó, phương phápnày đã nhanh chóng thay thế các phương pháp cơ học và hóa học

1.5.8 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm

Trong công nghiệp sản xuất bia

Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease vàglucanase đã được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó giảm lượngdiacetyl được tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia

Trong dịch lên men có chứa một lượng β-glucan, chất này ảnh hưởng tới khảnăng lọc và gây đục cho bia

Trong công nghiệp sản xuất cà phê

Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu được sản xuấtbằng phương pháp khô, phương pháp này cho chất lượng cà phê không cao Để tiếnhành nâng cao chất lượng cà phê, phương pháp lên men đã được áp dụng Đó là quátrình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê và làmtăng khả năng ly trích dịch quả Trong khâu bóc vỏ, cellulose gây hiện tượng thẫmmầu, làm giảm chất lượng sau khi sấy, đồng thời cản trở cho việc bóc vỏ Khi sử dụngchế phẩm.[4]

A niger có tên thương mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cellulase

cho thấy số lượng cà phê được bóc vỏ tăng, hạt cà phê được bóc vỏ bằng chế phẩmkhông còn nhớt như hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc vỏ khácao Trong quá trình ly trích dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các chất hòatan trong tế bào ra ngoài tế bào Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất trích lycao hơn mẫu không sử dụng là 46% [10]

Trong sản xuất các loại nước quả

Trong sản xuất nước hoa quả không cồn ta, cellulase được thêm vào giai đoạndịch hóa, hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả của chế phẩm, làm cho độ đồng hóa củanước quả có thịt tốt hơn Dịch quả sau khi ép chiết thường chứa các thành phần tếbào thịt quả và các chất xơ có bản chất polysaccharide làm cho dịch có độ nhớt cao

và có màu đục Glucanase thường được sử dụng để phá vỡ thành tế bào, thủy phâncác polysaccharide làm giảm độ nhớt của dịch quả tạo thuận lợi cho quá trình táchchiết và làm trong Glucanase kết hợp với các hemicellulase, pectinase trong chếphẩm enzyme Viscozyme 120L được sử dụng chủ yếu để phá vỡ màng tế bào đậutương

Mỗi dạng enzyme trong phức cellulase tham gia thủy phân phân tử cơ chấttheo một cơ chế riêng Tuy nhiên, những enzyme này thường phối hợp để thủy phânhoàn toàn phân tử cơ chất thành sản phẩm đơn giản là glucose [10]

Dịch này thường chứa các thành phần tế bào thịt quả và các thành phần củapolysaccharide làm cho dịch quả có độ nhớt cao Để tăng hiệu suất trích li dịch quả,giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nước quả và giảm bớt một số công đoạn, việc

bổ sung endoglucanase rất quan trọng Enzyme này là điểm mấu chốt cải thiện hiệusuất dịch hóa Sự kết hợp của glucanase và pectinase sẽ phá hủy hoàn toàn màng tếbào Trong quá trình sản xuất, ở giai đoạn dịch hóa bổ sung hỗn hợp các enzymecellulase, hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả của chế phẩm, làm cho độ đồng thể củanước quả có thịt sẽ tốt hơn [9]

Endo-β-1,4-glucanase tham gia thủy phân các liên kết β-1,4 glucoside ở bêntrong các phân tử cellulose và một số loại polysaccaride tương tự khác Sản phẩmphân cách là các oligosaccaride Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử

và đầu không khử của phân tử cơ chất, giải phóng các oligosccaride, cellobiose vàglucose β- glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose và glucose β-Glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose tạo thành các phân tửglucose [9]