Phân tích dụng cụ Chương 3: Sắc ký lỏng hiệu nâng cao

MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC CƠ SỞ LÝ THUYẾT SẮC KÝ 3.1.. Sắc ký pha thuận normal phase mode Cơ chế lưu giữ: sắc kí hấp phụ Cơ

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Chương 3

SẮC KÝ LỎNG HIỆU

NĂNG CAO

Trang 2

High High High Perfomance Pressure Price Liquid Chromatography Liquid Chromatography Liquid Chromatography

F: flow rate (mL/min) T: time (min)

1.7 MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG

CƠ SỞ LÝ THUYẾT SẮC KÝ

3.1.1 Sắc ký pha thuận (normal phase mode)

1903, Tswett

Михаи́л Семёно-вич Цвет

- Sắc ký pha thuận có pha tĩnh phân cực hơn pha động

a Russian-Italianbotanist

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Trang 3

Silic dioxyd (silica)

CƠ SỞ LÝ THUYẾT SẮC KÝ 1.7 MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG

3.1.1 Sắc ký pha thuận (normal phase mode) Pha tĩnh

cyano (-CH2 – (CH2)2 – CN);

Silica trên nền mạch Cacbon

3.1.1 Sắc ký pha thuận (normal phase mode) Pha tĩnh

Trang 4

3.1.1 Sắc ký pha thuận (normal phase mode) Pha động

Thành

phần

Dung môi chủ yếu

Các dung môi thường không hấp thu trong vùng UV

3.1.1 Sắc ký pha thuận (normal phase mode)

Cơ chế lưu giữ: sắc kí hấp phụ

Cơ chế lưu giữ: Chất phân tích cạnh tranh với

các phân tử của pha động được hấp phụ ở các

tâm hoạt động của pha tĩnh Lực liên kết giữa

pha tĩnh và chất phân tích chủ yếu là lực tương

tác lưỡng cực – lưỡng cực, liên kết hidrogen.

Trang 5

3.1.1 Sắc ký pha đảo (Reverse phase mode)

Sắc ký pha đảo có pha tĩnh kém phân cực hơn pha động Áp dụng

cho các chất ít phân cực (háo dầu) Chất tan càng kỵ nước càng bị

giữ lại mạnh

Pha tĩnh Chế tạo từ silica, tác dụng với clorosilan tạo ra dẫn xuất

siloxan như cột ở pha thuận nhưng điều khác biệt là R

là các gốc HC no không phân cực, hoặc gốc phenyl

- CH2 – (CH2)16- CH3 : gốc octadecyl Cột C18 (ODS)

- CH2 – (CH2) 6- CH3 : gốc ocyl Cột C8

- CH2 – (CH2) 2- CH3 : gốc butyl Cột C4

- CH2 – (CH2) 2- C6H5 : gốc phenyl propyl Cột phenyl

3.1.1 Sắc ký pha đảo (Reverse phase mode)

Pha động Dung môi hữu cơ, dung mội hữu cơ và nước, hoặc

dung môi hưu cơ và đệm

Các dung môi hữu cơ thường sử dụng là Methanol (MeOH),

acetonitrile (ACN) hay THF (Tetrahydrofuran (CH2)4O ) Thành phân

nước trong pha động tăng thì lực rửa giải giảm

Khi sử dụng dung dịch đệm, những thông số quan trọng: nồng độ

Trang 6

3.1.1 Sắc ký pha đảo (Reverse phase mode) Cơ chế lưu giữ

Pha tĩnh không phân cực , Liên kết giữa pha tĩnh và chất tan là

liên kết kị nước: phần ít phân cực của chất phân tích được gắn trên

pha tĩnh

Nếu phân tử chất tan cónhiều dây Cacbon, nhómthơm tính kỵ nước mạnhhơn, Chất tan sẽ bi lưu giữ mạnh trong cột

Nếu mẫu có nhiểu nhóm cacboxyl, nhóm amino, nhóm hydroxyl

tính kỵ nước yếu hơn Chất tan sẽ ít bị lưu giữ và ra nhanh hơn

3.1.3 Sắc ký trao đổi ion a.Khái niệm

Dựa vào lực hút trái dấu của ion chất tan và vị trí mang điện tích trên

pha tĩnh

Chất trao đổi cation và chất traođổi anion là polymer không tan trong nước mang các nhóm trao đổiion được gọi là chất trao đổi ion (ion exchangers) hoặc nhựa trao đổi(ion exchange resins)

Tương tác giữa nhựa trao đổi

ion và ion tích điện trái dấu

Trang 7

3.1.3 Sắc ký trao đổi ion b Pha tĩnh và pha động

Nhựa trao đổi anion

Base

Trang 8

Nhựa trao đổi Anion có nhóm base amin liên kết

với phân tử polymer

Chất trao đổi base mạnh có nhóm amin

bậc bốn [RN(CH3)3+ OH- ]

Dạng base yếu có nhóm amin bậc hai

hoặc bậc ba

R có thể là nền silica hay nền Polimer hữu cơ

Nhựa trao đổi cation trên

nền polymer

Trang 9

Pha động là Dung dịch có ion rửa giải pha trong nước hoặc đệm

Ion rửa giải là ion có thể đẩy các ion bị giữ trên pha tĩnh ra

Dung dịch đệm giữ cho PH của dung dịch rửa giải có giá trị ổn định

để cho chất phân tích tồn tại dạng ion và nếu là cột yếu thì cột hoạt

động được (tồn tại nhóm chức mang điện tích)

1.7.3 Sắc ký trao đổi ion c Cơ chế lưu giữ

Bản chất lực tương tác : Lực tĩnh điện

Đầu tiên các ion trong pha động tương tác với pha tĩnh bị giữ lại trên pha

tĩnh

Sau đó khi cho chất phân tích qua cột, các ion cần phân tích có lực tương

tác tĩnh điện mạnh hơn sẽ đẩy các ion pha động ra khỏi pha tĩnh

Trang 10

1.7.4 Sắc ký trao đổi ion c Cơ chế lưu giữ

Sắc ký đồ phân tích nước bằng sắc ký trao đổi ion

1.7.4 Sắc ký ghép cặp ion (Reversed phase ion pairing)

a Khái niệm

Điều khác biệt trong sắc ký ghép cặp ion phải tạo điều kiện để chất

phân tích phải ở dạng ion hóa hoàn toàn (bằng cách điều chỉnh pH)

Nếu chất phân tích là acid yếu HA thì HA phải phân ly hoàn toàn thành

H+ và A- Nếu chất phân tích là baz yếu B thì B phải tác dụng với H+

để tạo thành BH+

.

Thêm 1 chất đối ion Q+, A- + Q+  [A-,Q+ ]

hay Q- BH+ + Q-  [BH+, Q- ]

là một biến thể của sắc ký pha đảo

Cặp ion có tính kỵ nước cao bị pha tĩnh giữ lại giống như một phân

tử không điện tích

Đuôi kỵ nước 3.1 MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG

Trang 11

b Cơ chế lưu giữ.

Cặp ion [ A-,Q+], [ BH+,Q-] đượchình thành trongpha động nhưmột hợp chấttrung hòa đượclưu giữ theo cơchế như sắc kípha đảo

c Pha tĩnh và pha động

Pha động : Pha động cũng là những dung môi như

trong sắc ký pha đảo

CÁC THÔNG SỐ QUAN TRỌNG

-Loại chất ghép cặp

Trang 12

Sắc ký loại kớch thước (SEC)

23

1 Phân tách các cấu tử dựa trên kích thớc phân tử

2 Bao gồm 2 loại:

– SEC trong dung dịch kỵ nước: Sắc ký thấm gel (GPC)

– SEC trong dung dịch nước : Sắc ký lọc gel (GFC)

3 Không có tương tác sắc ký giữa các cấu tử phân tích và pha

tĩnh của cột

– Các phân tử mẫu khuyếch tán vào các lỗ xốp của hạt nhồi

– Các phân tử được tách loại dựa vào sự khác biệt kích

thư-ớc của chúng tương đối so với kích thưthư-ớc các lỗ xốp : các

5 Được sử dụng chủ yếu trong phân tích polymer và các protein

Cơ chế tách trong sắc ký loại kích thước

24

Trang 13

S¾c ký HILIC

(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)

25

1 Pha nh rất phân cực : Silica , NH2, Diol (tương tự NP-LC), nhưng pha

động vẫn sử dụng nước trong thành phần Bởi vậy HILIC còn được gọi là:

‘sắc ký lỏng pha thường trong dung dịch nước (aqueous normal phase

HPLC)’.

2 Pha động thường bao gồm thành phần nước (đệm) chiếm từ 2 – 40 %

Dung môi hữu cơ thường là acetonitrile.

3 Thứ tự rửa giải : ngược với RP-LC: càng phân cực, càng lưu giữ

4 Cơ chế:

§ Dựa trên phân bố giữa lớp nước hấp phụ trên bề mặt pha nh với

pha động

§ Dựa trên tương tác của các chất phân ch phân cực với các nhóm

phân cực của pha nh

5 Tăng hàm lượng nước trong pha động à giảm khả năng lưu giữ

6 Ứng dụng với các chất rất phân cực, là một kỹ thuật bổ sung cho RP-LC

Kết hợp tốt với LC/MS.

Trong HILIC, nước là một dung môi mạnh !

Trang 14

Cỏc chế độ phân tích HPLC và các dạng mẫu

t-ương ứng

28

Trang 15

B.) Low- and High-performance Liquid Chromatography :

Many types of liquid chromatography are available, based on different stationary

phase and mobile phase combinations.

- each type may be further characterized based on its overall efficiency or

Trang 16

Trung tính; Các Acid (base) yếu

cơ; Hóa chất ghép cặp

Các Ion, base, acid

Cyano Diol

Hữu cơ kém phân cực

Các chất ko tan trong nước;

các đồng phân hữu cơ

Cation; Anion

Nước/Đệm; Ion trái dấu

Ion; các Ion vô cơ

3.2.1 SƠ ĐỒ KHỐI MÁY HPLC 3.2 HỆ THỐNG MÁY HPLC

Trang 17

Chương 2 HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.2 HỆ THỐNG CẤP PHA ĐỘNG

2.2.1 Khái niệm

Là hệ thống chứa pha động để cung cấp cho hệ thống HPLC

Hệ thống này có thể có từ 1 đến 4 kênh (tương ứng với 1 đến 4 bình

chứa thủy tinh )

Pha động trong sắc ký lỏng thường là 2 dung môi hòa tan vào nhau

để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp

Trang 18

Chương 2 HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.2.1 Khái niệm

- Pha động phải tan lẫn vào nhau tốt

- Phải lọc qua màng lọc 0.45 μm để không làm nghẹt cột

- Phải được khử khí hòa tan trong pha động Khí hòa tan có thể

làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền, có thể

loại khí hòa tan bằng cách đánh siêu âm

Điều kiện pha động

Chương 2 HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.2.1 Khái niệm Điều kiện pha động

Bộ phận lọc đầu vào bằng thủy tinh hoặc thép không rỉ

có lỗ xốp 10 μm,

Trang 19

3.2.2 Cách dùng pha động rửa giải

Những nhược điểm của của kỹ thuật

đẳng dòng (isocratic)

Độ phân giải thấp đối với những peak có hệ

• Độ phân giải thấp đối với những peak có hệ

số lưu giữ k nhỏ (rửa giải sớm)

• Độ phân giải thấp đối với những peak ra

muộn: do peak bành rộng.

• Với những dung dịch mẫu có nhiều cấu tử có k

khác nhau, thời gian phân tích bị kéo dài

• Cột hay bị ô nhiễm bởi những cấu tử có độ

lưu giữ cao

Trang 20

Những ưu điểm của kỹ thuật

gradient dung môi

• Tăng cường độ phân giải

• Tăng độ nhậy với những peak ra muộn (k lớn)

• Có khả năng phân tích những mẫu phức tạp (các hệ số k khác

biệt lớn)

• Cải thiện dạng peak sắc ký

• Giảm được thời gian phân tích, nhất là những mẫu có nhiều

cấu tử có độ phân cực khác nhau

• Tăng độ bền của cột do loại bỏ được các cấu tử có độ lưu giữ

mạnh

39

… và những nhược điểm

• Thiết bị HPLC phức tạp hơn, giá thành cao hơn

• Thời gian phân tích thực tế tăng thêm do phải cộng thêm thời

gian cân bằng cột Với chế độ cặp đôi ion, thời gian cân bằng

cột có thể kéo dài

• Các hệ thiết bị LC khác nhau có thể tích trễ khác nhau làm ảnh

hưởng tới sự chuyển giao phương pháp giữa các thiết bị

• Một số detector hoặc ứng dụng không thể áp dụng gradient

dung môi

• Nếu sử dụng van tỷ lệ, khả năng bị kết tủa muối ở van cao (cần

gia tăng quá trình rửa)

40

Trang 21

So sánh isocratic và gradient

41

Trường hợp A, isocratic: dạng peak không cân xứng, nhất là các peak rửa giải sau

khoảng10 phút.

Trường hợp B, gradient, Các peak tách đồng đều và có dạng peak hẹp, cân đối

Chú ý: các cặp peak tại các điểm 1 và 2 trong trường hợp isocratic không tách đựơc

như trong trường hợp rửa giải gradient.

Biểu đồ thay đổi thành phần dung môi hữu cơ trong kỹ

thuật gradient (%B)

• Isocratic hold time: thời gian chờ ban đầu

• Gradient time tG: thời gian gradient diễn ra

• Purging: giai đoạn đuổi các cấu tử có độ lưu giữ cao

• Conditioning: ổn định lại cột, trở về thành phần ban đầu

Trang 22

Hệ số lưu giữ tương đối trong

kỹ thuật gradient

43

Do bản chất pha động thay đổi liên tục trong quá trình phân tích, do đó hệ số lưu giữ của các

cấu tử cũng thay đổi, bỏi vậy ta không thể sử dụng hệ số lưu giữ k như trong rửa giải isocratics.

Thay vào đó, ta sử dụng hệ số lưu giữ tương đối k* được xác định theo phương trình dưới

đây:

Trong đó:

tG: thời gian gradient (phút)

F: tốc độ dòng (ml/ph)

S: lấy bằng 4 (đại lượng này phụ thuộc vào bản chất các cấu

tử phân tích, với các phân tử nhỏ, S có giá trị khoảng từ 4-6 Với protein hay

Trang 23

Độ dốc gradient ảnh hưởng lên

khả năng tách

45

Tăng thời gian gradient từ 10 phút lên 60 phút làm giảm độ dốc gradient Kết quả hai cặp

peak 1,2 và 6,7 đã tách được hoàn toàn.

Tính hệ số lưu giữ k* trongsắc ký lỏng gradient

Với các giá trị đã cho, ta tính được hệ só lưu giữ tương đối k* :

Trang 24

2.3 BỘ KHỬ KHÍ ON LINE

Mục đích : nhằm loại trừ các bọt khí nhỏ còn sót lại trong dung môi

pha động ngay trong quá trình chạy máy sắc ký

Hoạt động : cho hai dung môi

A và B Dung môi đi vào ốngpolymer bên trong máy hútchân không, chân không sẽkéo khí hòa tan đi xuyên qua thành ống , chất lỏng ở lạibên trong thành ống

Läc dung m«i vµ b¶o vÖ cét

48

Trang 25

Chương 2 HỆ THỐNG MÁY HPLC 2.4 HỆ THỐNG BƠM

Mục đíchđể bơm pha động vào cột thực hiện

Pump phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at

đến - 500 at ( 1at =0.98 Bar)

pump phải tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến

9.999 ml/phúTương hợp với các loại dung môi

hữu cơ thông dụng, đệm, muối Vận hành ổn định,

lặp lại

Khả năng cấp và trộn dung môi

chính xác trong gradien (với pump

đa kênh)

Dễ bảo trì và sửa chữa

Chương 2 HỆ THỐNG MÁY HPLC 2.4 HỆ THỐNG BƠM

- Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã

được cài đặt Trong quá trình chạy sắc ký áp suất

hiển thị là thông số vô cùng quan trọng biểu thị

sự ổn định của hệ thống

Trang 26

Các loại bơm:

• Bơm piston dạng song song

• Bơm piston dạng nối tiếp

Trang 27

B¬m piston d¹ng nèi tiÕp

Trang 28

Chương 2 HỆ THỐNG MÁY HPLC 2.5 HỆ TIÊM MẪU

Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở

đầu cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm 6 cổng có vòng

chứa mẩu (sample loop) Vòng chứa mẫu có dung tích khác nhau :

56

Bộ phận tiêm mẫu bằng tay

Thao tác xoay van một cách dứt khoát

Đường ống thải phải bố trí thấp hơn vòng loop và

luôn hướng xuống dưới

Trang 29

Thiết bị bơm mẫu tự động

Trang 30

Chương 2 HỆ THỐNG MÁY HPLC 2.6 CỘT

Cột là nơi thực hiện quá trình tách sắc ký

Vật liệu : Trước đây cột được làm bằng thủy tinh , nhưng do nhu cầu hoạt động

ở áp suất cao nên hiện nay đa số sử dụng cột làm bằng kim loại

Kích cỡ :Với thời gian cột trở nên ngắn hơn và hạt nhồi nhỏ hơn Chiều dài cột thường

sử dụng hiện nay 30 ÷ 250mm, với hạt nhồi đường kính 1.5 ÷ 5 μm

Trang 31

Cột trong HPLC

61

 Phù hợp với chế độ phân tích

 Khoảng pH làm việc

 Khoảng nhiệt độ làm việc

 Áp suất làm việc (có thể tới 1000

bar hoặc hơn).

Những hạt này hầu hết được làm bằng silica xốp, có những pore (khoảng trống ) riêng rẽ hình trụ có đường kính khoảng chừng 10nm phù hợp với những mẫu có phân tử nhỏ (M

< 1000Da) Bên trong mỗi pore được bao phủ bởi lớp pha tĩnh, nhóm C18

được gắn vào các tiểu phân silica (Nếu là cột C18)

Trang 32

Chương 2 HỆ THỐNG MÁY HPLC 2.6 CỘT

Hạt được hình thành bằng cách kết tụ (aggregating) các tiểu phân hình cầu Hạt tạo thành có kích thước lớn hơn và đường kính đều nhau

Các pore được hình thành do các khoảng trống giữa các tiểu phân

Bề mặt bên trong pore chiếm hơn 99%

tổng diện tích bề mặt của hạt,

Pha động bao quanh mỗi hạt khi nó chảy xuyên qua cột và các

phân tử mẫu đi vào các pore bởi sự khuếch tán

Chương 2 HỆ THỐNG MÁY HPLC 2.6 CỘT

Để tăng tuổi thọ của cột người ta dùng cột bảo vệ (guard

columns) Cột bảo vệ được lắp phía trước cột phân tích để lọc các

tạp chất, không cho các tạp chất qua cột phân tích, tránh nhiễm

bẩn cột , kéo dài thời gian sống của cột phân tích.Cột bảo vệ ngắn

hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại

Trong sắc ký lỏng thường vận hành thiết bị ở nhiệt độ phòng

không cần điều nhiệt cột Tuy nhiên các máy sắc ký lỏng hiện đại

thường được trang bị thêm hệ thống điều nhiệt cột có thể đến

1500C chính xác đến ± 0.10C

581325-U Ascentis ® C18 HPLC Column

25 cm × 4.6 mm , 5 μm 1,240.85 SGD

(1 SGD = 0.8021 USD)

Trang 33

Cột silica có đặc điểm chịu áp suất cao tốt, dễ gắn các

ligand để tạo thành các pha tĩnh khác nhau

Cột HPLC polymer có đặc điểm chịu pH tốt, áp dụng nhiều

trong sắc ký trao đổi ion, HILIC và GPC

Trang 34

Kích thước và hình dạng hạt nhồi

67

Với các ứng dụng HPLC thông thường, ta thường sử dụng

cột có hạt nhồi từ 3 – 5m Các pha tĩnh có kích thước hạt

nhỏ hơn thường áp dụng cho UHPLC

Cột polymer thường có kích thước hạt lớn do khả năng

chịu áp suất kém

Kích thước hạt nhồi càng nhỏ, hiệu năng tách hay số đĩa lý

thuyết của cột càng cao Tuy nhiên áp suất cột cũng tăng

theo

Ảnh hưởng kích thước hạt nhồi lên

hiệu quả tách của cột

68

Trang 35

Ảnh hưởng của hình dạng hạt nhồi

và kỹ thuật nhồi cột

69

hơn

hay cột bị nhiễm tạp, hiện tượng dòng chảy rối cũng làm giảm

hiệu quả tách.

1

2 3 4

5 6

Thể tích ngoài cột

ống dây mao quản và ốc nối

Định dạng
Số trang	70
Dung lượng	3,16 MB