Trong đó hai thành phần là curcuminoid các chất màu phenolic và terpenoid có trong tinh dầu được nghiên cứu nhiều nhất và là các thành phần chính đã được chứng minh có vai trò quyết định
Trang 1NGHỆ VÀNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2019
Trang 2NGHỆ VÀNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình hoàn thành khóa luận em đã nhận được sự hỗ trợ giúp đỡ từ nhiều thầy cô, bạn bè và gia đình Với tình cảm chân thành cho phép em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tất cả cá nhân, tập thể đã tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài
Trước hết, với lòng kính trọng và biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Quỳnh Chi, ThS Phạm Tuấn Anh đã định hướng, chỉ bảo, giải đáp những thắc mắc
và dìu dắt em trong quá trình học tập, nghiên cứu
Xin trân trọng cảm ơn ThS Lê Thanh Bình, ThS Nguyễn Khắc Tiệp đã giúp
đỡ, hỗ trợ em hoàn thành khóa luận
Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội nói chung, các thầy cô và anh chị kỹ thuật viên thuộc bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội nói riêng đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình nghiên cứu
Xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể sinh viên nghiên cứu tại bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội đã đồng hành, giúp đỡ, động viên tinh thần và đưa ra nhiều góp ý trong quá trình thực hiện đề tài
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn tin tưởng, là chỗ dựa tinh thần và nguồn động viên to lớn đối với em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu tại trường
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên Nguyễn Thị Linh
Trang 4MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2
1.1 Tổng quan về Nghệ vàng Curcuma longa L 2
1.1.1 Vị trí, phân loại 2
1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố Nghệ vàng Curcuma longa L 2
1.1.3 Thành phần hóa học thân rễ Nghệ vàng Curcuma longa L 3
1.1.4 Một số loài Curcuma L khác ở Việt Nam dễ nhầm lẫn với Nghệ vàng Curcuma longa L 5
1.2 Tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng 6
1.3 Vài nét về dấu vân tay hóa học 8
1.3.1 Khái niệm về dấu vân tay hóa học 8
1.3.2 Ứng dụng của dấu vân tay hóa học 8
1.3.3 Một số nghiên cứu thiết lập dấu vân tay hóa học 9
1.3.4 Tình hình tiêu chuẩn hóa Nghệ vàng và tinh dầu Nghệ vàng 10
CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu 12
2.1.1 Nguyên liệu 12
2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 13
2.1.2.1 Dung môi, hóa chất: 13
2.1.2.2 Trang thiết bị, máy móc: 13
2.2 Nội dung nghiên cứu 14
2.2.1 Thu mẫu Nghệ vàng và xác định hàm lượng tinh dầu các mẫu nghiên cứu 14
2.2.2 Xác định dấu vân tay hóa học tinh dầu Nghệ vàng 14
2.2.3 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn tinh dầu Nghệ vàng 14
Trang 52.3 Phương pháp nghiên cứu 14
2.3.1 Thu mẫu nghiên cứu và xác định hàm lượng tinh dầu các mẫu nghiên cứu 14
2.3.2 Xác định dấu vân tay hóa học tinh dầu Nghệ vàng 15
2.3.2.1 Xác định dấu vân tay sắc ký lớp mỏng tinh dầu Nghệ vàng 15
2.3.2.2 Xác định dấu vân tay sắc ký khí tinh dầu Nghệ vàng 16
2.3.3 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng 17
2.3.3.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 17
2.3.3.2 Đánh giá tác dụng hiệp đồng của tinh dầu Nghệ vàng và kháng sinh 18
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21
3.1 Thu mẫu Nghệ vàng và xác định hàm lượng tinh dầu các mẫu nghiên cứu 21
3.2 Xác định dấu vân tay hóa học tinh dầu Nghệ vàng 22
3.2.1 Dấu vân tay sắc ký lớp mỏng tinh dầu Nghệ vàng 22
3.2.2 Dấu vân tay sắc ký khí tinh dầu Nghệ vàng 24
3.2.2.1 Phân tích các mẫu tinh dầu Nghệ vàng bằng GC/MS 24
3.2.2.2 Xác định dấu vân tay sắc ký khí tinh dầu Nghệ vàng 27
3.3 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng 32
3.3.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của tinh dầu Nghệ vàng 32
3.3.2 Đánh giá tác dụng hiệp đồng của tinh dầu Nghệ vàng và kháng sinh 32
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 35
KẾT LUẬN 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1: HÌNH ẢNH THÂN RỄ 20 MẪU NGHỆ VÀNG
PHỤ LỤC 2: THÀNH PHẦN 19 MẪU TINH DẦU NGHỆ VÀNG TRONG
NGHIÊN CỨU CỦA PHẠM THỊ KIỀU DUNG
PHỤ LỤC 3: HÌNH ẢNH SẮC KÝ ĐỒ 20 MẪU TINH DẦU NGHỆ VÀNG
Trang 6DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
GC/MS Gas chromatography – mass spectrometry
MSSA Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus
MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
MHB-Ca Cation-adjusted Muller Hinton Broth 2 FIC Fractional inhibitory concentration
Trang 7DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/ml) của tinh dầu Nghệ vàng đối với một
số chủng vi khuẩn 7
Bảng 2.1: Thông tin 20 mẫu thân rễ Nghệ vàng 12
Bảng 3.1: Hàm lượng tinh dầu tính theo dược liệu tươi 21
Bảng 3.2: Kết quả phân tích thành phần tinh dầu các mẫu: 25
Bảng 3.3: Kết quả phân tích thành phần tinh dầu các mẫu: 26
Bảng 3.4: Giá trị MIC (nl/ml) của 7 mẫu tinh dầu Nghệ vàng : BN01, HN11, HN12, NA03, VP01, NT01, CM01 32
Bảng 3.5: Giá trị MIC tinh dầu Nghệ vàng và kháng sinh 33
Bảng 3.6: Kết quả đánh giá tác dụng làm giảm MIC cefoxitin trên hai chủng vi khuẩn MRSA 33
Trang 8thường xuất hiện trong tinh dầu 28 Hình 3.6: Kết quả phân cụm 39 mẫu tinh dầu với biến đầu vào các thành phần có trong tinh dầu 29 Hình 3.7: Kết quả phân cụm 39 mẫu tinh dầu với biến đầu vào là các thành phần
thường xuất hiện trong tinh dầu 30 Hình 3.8: Hình ảnh dấu vân tay sắc ký tinh dầu Nghệ vàng 30 Hình 3.9: Sắc ký đồ 20 mẫu tinh dầu Nghệ vàng 31
Trang 9ĐẶT VẤN ĐỀ
Nghệ vàng là cây trồng phổ biến quen thuộc ở nhiều tỉnh thành trên khắp cả nước
và được biết đến từ lâu như là một loại gia vị hay một vị thuốc sử dụng trong y học cổ truyền Ngày nay Nghệ vàng là một mặt hàng nông sản rất được chú trọng canh tác và
là nguồn nguyên liệu chủ yếu để khai thác curcuminoid – thành phần hoạt chất chính trong thân rễ Nghệ vàng được sử dụng và lưu hành phổ biến trên thị trường
Bên cạnh curcuminoid là thành phần đã được nghiên cứu nhiều, những năm gần đây tinh dầu Nghệ vàng cũng đang được quan tâm Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tinh dầu từ thân rễ Nghệ vàng có nhiều hoạt tính sinh học nổi bật như tác dụng xua đuổi muỗi, đặc biệt trên các chủng muỗi là vector gây bệnh nghiêm trọng trên người như sốt xuất huyết, sốt rét [14]; tác dụng ức chế và diệt một số chủng vi nấm gây bệnh trên da [1] cũng như một số chủng nấm gây bệnh cho cây trồng [22], [36] Một số nghiên cứu
đã công bố tinh dầu Nghệ vàng Curcuma longa L còn có khả năng ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt với vi khuẩn Streptococcus mutans là vi khuẩn
tạo mảng bám trên răng và gây sâu răng [28] Ngoài ra tinh dầu Nghệ còn cho kết quả tốt trong nghiên cứu sử dụng để bảo quản hoa tươi [5]
Với nhiều hoat tính sinh học đáng chú ý, tinh dầu Nghệ vàng đang dần trở thành đối tượng tiềm năng để khai thác và đưa ra sản phẩm trên thị trường Tuy nhiên, thành phần các loại tinh dầu nói chung và tinh dầu Nghệ nói riêng thay đổi phụ thuộc vào nhiều yếu tố như môi trường, thổ nhưỡng, điều kiện canh tác, giống, kiểu gen, điều kiện thu hoạch và bảo quản đặt ra yêu cầu cần phải có các tiêu chuẩn về tinh dầu Nghệ Hiện nay, DĐVN V đã bổ sung thêm chuyên luận tinh dầu Nghệ vàng tuy nhiên các chỉ tiêu kiểm nghiệm đặc biệt là chỉ tiêu định tính bằng sắc ký lớp mỏng còn nhiều hạn chế Để góp phần bổ sung tiêu chuẩn chất lượng cũng như nâng cao giá trị tiềm năng của tinh
dầu Nghệ vàng Curcuma longa L đề tài: “Xây dựng dấu vân tay hóa học và đánh giá
tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng” được thực hiện với 2 mục tiêu sau:
1 Xác định dấu vân tay sắc ký lớp mỏng và sắc ký khí tinh dầu Nghệ vàng
2 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng
Trang 10
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về Nghệ vàng Curcuma longa L
1.1.1 Vị trí, phân loại
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987) [39], Nghệ vàng Curcuma longa
L có vị trí phân loại như sau:
1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố Nghệ vàng Curcuma longa L
Đặc điểm hình thái: Cây thảo sống nhiều năm, cao 0,6-1m Thân rễ phát triển
thành củ hình trụ hoặc hơi dẹt, khi bẻ hoặc cắt ngang có màu vàng, vàng sẫm, vàng cam đến vàng đỏ, mùi thơm Lá mọc thẳng từ thân rễ, phiến lá màu lục nhạt có hình bầu dục hoặc trái xoan, thuôn nhọn ở hai đầu, kích thước 40-45 x 15-18cm, hai mặt nhẵn, mép nguyên, uốn lượn; cuống lá có bẹ, bẹ lá rộng và dài ôm vào nhau tạo thành thân Cụm hoa hình trụ, mọc từ giữa các lá lên; lá bắc rời, màu rất nhạt, lá bắc hữu thụ ở phía dưới đầu tròn, màu lục hoặc trắng nhạt, lá bắc bất thụ ở trên hẹp hơn và pha màu hồng hoặc tím nhạt ở đầu lá Đài hoa dạng chuông, đầu xẻ 3 răng không đều; tràng màu trắng, các thùy hình tam giác đều; cánh môi gần tròn, màu vàng, phía trên chia thùy không rõ; nhị
có bao phấn có cựa do một phần lồi ra của trung đới ở dưới các ô, nhị lép bên dạng trái xoan rộng, dài hơn bao phấn Bầu có lông [3], [4], [8]
Sinh thái: Cây ưa ẩm, ưa sáng, có thể hơi chịu bóng; cây có biên độ sinh thái
rộng, thích nghi được với nhiều vùng khí hậu khác nhau, từ khí hậu cận nhiệt đới đến khí hậu nhiệt đới điển hình Toàn bộ phần trên mặt đất tàn lụi vào mùa đông ở các tỉnh phía bắc và mùa khô ở các tỉnh phía nam Cây mọc lại vào giữa mùa xuân, có hoa sau
Trang 11khi đã ra lá Mùa hoa tháng 7-8 Thân rễ thường được thu hái vào tháng 8-9, cắt bỏ hết
rễ để riêng [3], [12]
Phân bố: Nghệ có nguồn gốc nguyên thủy có lẽ từ Ấn Độ Từ xa xưa, cây đã
được trồng ở nhiều nơi về sau trở nên hoang dại, trước hết là ở Trung Quốc Ngày nay Nghệ là một cây trồng quen thuộc ở khắp các nước vùng nhiệt đới, từ Nam Á đến Đông Nam Á và Đông Á Tại Việt Nam, Nghệ được phân bố ở khắp các địa phương từ vùng đồng bằng ven biển đến vùng núi cao trên 1500m [3], [12]
1.1.3 Thành phần hóa học thân rễ Nghệ vàng Curcuma longa L
Cho đến nay có ít nhất 235 hợp chất đã được xác định là thành phần của thân rễ
Nghệ vàng Curcuma longa L bao gồm các hợp chất diarylheptanoid (thường được gọi
là curcuminoid), diarylpentanoid, monoterpen, sesquiterpen, diterpen, triterpenoid và sterol [30] Trong đó hai thành phần là curcuminoid (các chất màu phenolic) và terpenoid có trong tinh dầu được nghiên cứu nhiều nhất và là các thành phần chính đã được chứng minh có vai trò quyết định đến tác dụng dược lý của thân rễ Nghệ vàng Curcuminoid được biết đến là thành phần đem lại màu vàng và được sử dụng như một chất phụ gia tạo màu cho thực phẩm còn tinh dầu mang lại mùi thơm và hương vị cho thân rễ Nghệ vàng [30], [38]
Curcuminoid
Curcuminoid thuộc nhóm diarylheptanoid thông thường có hàm lượng khoảng
3-15% với thành phần chính là curcumin (diferuloyl methan hoặc
(1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)1,6-heptadien-3,5-dion) [30] Ngoài curcumin còn có thêm hai loại curcuminoid khác là demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin [38]
“Curcumin” trên thị trường là hỗn hợp của curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin Ba curcuminoid chính này cũng được tìm thấy ở một số loài
Curcuma L khác nhưng có hàm lượng thấp hơn như: C amada Roxb., C aeruginosa
Roxb., C aromatica, C chuanyujin Roxb., C xanthorrhiza Roxb., C zedoaria (Berg.) Rosc., C heyneana Val.& Zijp., C mangga Val.& Zijp., C soloensis Val [30]
Tinh dầu
Tinh dầu Nghệ vàng có thể thu được từ các bộ phận khác nhau như lá, hoa, thân
rễ trong đó tinh dầu thân rễ cho hàm lượng lớn hơn so với các bộ phận khác Các nghiên cứu cho thấy các terpenoid bao gồm monoterpen và sesquiterpen là các hợp chất thường
Trang 12chiết xuất từ hoa và lá trong khi thành phần chính của tinh dầu thân rễ là các sesquiterpen [30], [38]
Các monoterpen chính trong các mẫu tinh dầu thân rễ Nghệ vàng đã được công
bố bao gồm: p-cymen, α-terpinen, β-terpinen, α-phellandren, β-phellandren, terpinolen, α-pinen, β-pinen, 1,8-cineol, myrcen, linalool, isoborneol, α-terpineol [29], [30]
Nhóm sesquiterpen thường chiếm tỷ lệ cao trong tinh dầu Các sesquiterpen chính thường gặp trong thân rễ Nghệ vàng bao gồm: ar-turmeron, α-turmeron, β-turmeron, ar-curcumen, ar-tumerol, bisabolon, α-zingiberen, (Z)-α-atlanton, β-bisabolen, α-curcumen, β-curcumen, β-sesquiphellandren, (Z)-γ-atlanton, (E)-γ-atlanton, germacron, β-farnesen, curzerenon Trong đó ar-turmeron, α-turmeron và β-turmeron là các thành phần chính đặc trưng có thể chiếm ít nhất 40% tinh dầu thân rễ Nghệ vàng [30]
Tuy nhiên sự có mặt và hàm lượng của các thành phần có trong tinh dầu có sự biến đổi giữa các vùng địa lý, điều kiện sinh trưởng, giống, nguồn, điều kiện canh tác, mùa vụ, giai đoạn trưởng thành, phương pháp thu hoạch, chiết xuất và bảo quản [20], [21], [30] Theo báo cáo ar-turmeron là thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất của tinh dầu Nghệ vàng ở Paskistan (25,3%) [33], Ấn Độ (51,7% [37]; 31,7% [16]), Malaysia (45,3%) [24], Iran (68,9%) [15], Bangladesh (27,78%) [18] Trong khi đó một vài nghiên cứu về thành phần tinh dầu Nghệ vàng khác ở vùng hạ Hymalaya phía Bắc Ấn
Độ [36] và Hàn Quốc [28] lại cho kết quả là thành phần α-turmeron (lần lượt là 44,1%
và 35,59%) chiếm tỷ lệ cao nhất Nghiên cứu về thành phần tinh dầu tại Nepan [20] lại cho thấy β-turmeron chiếm tỷ lệ lớn nhất (17,74%) Một vài nghiên cứu khác lại cho kết quả monoterpen là thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất như bisabolen (13,9%) trong tinh dầu Nghệ vàng thu tại Nigeria [40], hay α-phellandren (18,2%) trong tinh dầu Nghệ vàng tại Sri Lanka [23]
Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu về thành phần tinh dầu thân rễ Nghệ vàng cũng
đã được thực hiện Một nhóm nghiên cứu do Nguyễn Thị Kim Cúc và các cộng sự đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng thu tại Hưng Yên đã phân tích thành phần tinh dầu và xác định được 13 cấu tử bao gồm các monoterpen và sesquiterpen trong
đó ar-turmeron là thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất (30,3%) [19] Ar-turmeron cũng là thành phần chính chiếm tỷ lệ cao nhất trong tinh dầu thân rễ Nghệ vàng được thu tại Kontum (chiếm 22,34%) [7] Trong khi đó, α-turmeron lại là thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất trong các mẫu tinh dầu thu tại Bình Dương, Đồng Nai, Quảng Nam, Nghệ An (lần
Trang 13lượt là 38,91%; 31,96%; 43,07%; 41,38%) [1] Các thành phần còn lại có sự thay đổi về
sự có mặt và hàm lượng giữa các mẫu
1.1.4 Một số loài Curcuma L khác ở Việt Nam dễ nhầm lẫn với Nghệ vàng Curcuma longa L
Curcuma xanthorrhiza Roxb – Nghệ rễ vàng
Đặc điểm thực vật có nhiều điểm tương đồng với Nghệ vàng Curcuma longa L
như thân rễ cắt ngang có màu cam hoặc đỏ cam ở giữa; phiến lá hình bầu dục kích thước lớn cỡ 40-80 x 15-20 cm, hai mặt nhẵn, cuống lá dài Cụm hoa dạng chùy, các lá bắc hữu thụ ở phía dưới, màu xanh tái; lá bắc bất thụ ở phía trên màu hồng Ống đài chia làm 3 răng, cánh môi màu vàng nhạt, chia thùy; bao phấn trắng có cựa hình dùi, cong; nhị lép vàng, hình bầu dục Hai vòi nhụy lép [3], [4], [8], [42]
Tuy nhiên có thể phân biệt với loài Curcuma longa L ở điểm: mặt trên lá có dải
màu nâu đỏ dọc theo gân giữa nhưng không dài đến gốc phiến lá; cụm hoa mọc từ thân
rễ [3], [4], [8], [42]
Về thành phần tinh dầu: sự xuất hiện và hàm lượng các thành trong tinh dầu thân
rễ Curcuma xanthorrhiza Roxb cũng thay đổi và phụ thuộc vào nhiều yếu tố như địa lý,
giống, môi trường, khí hậu, điều kiện canh tác… Các thành phần thường gặp trong tinh
dầu Curcuma xanthorrhiza Roxb cũng bao gồm các monoterpen và sesquiterpen trong
đó các cấu tử bao gồm 1,8-cineol, camphor, ar-curcumen, xanthorrizol, curzenenon là các thành phần thường xuyên xuất hiện Theo báo cáo xanthorrizol là thành phần chiếm
tỷ lệ cao nhất trong tinh dầu thân rễ Nghệ rễ vàng ở Malaysia [25], [24] (31,9%; 44,5% ) Một số nghiên cứu khác lại chỉ ra ar-curcumen là thành phần chiếm hàm lượng cao nhất
trong tinh dầu Curcuma xanthorriza Roxb thu tại Indonesia (64,8%; 41,4%) [45], [49]
Tại Thái Lan các nghiên cứu về thành phần tinh dầu Nghệ rễ vàng lại cho kết quả các monoterpen tỷ lệ cao nhất như α-terpinolen (24,86%) [13], 1,8-cineol (37,58%) [26]
Như vậy khác với tinh dầu Nghệ vàng Curcuma longa L tinh dầu Nghệ rễ vàng
Curcuma xanthorrhiza Roxb không chứa các turmeron mà có chứa thành phần đặc
trưng là xanthorrhizol
Curcuma elata Roxb – Mì tinh rừng
Giống như Curcuma longa L., Curcuma elata Roxb có phần thân rễ cắt ngang
có màu vàng sậm ở giữa, vàng nhạt ở ngoài Cụm hoa: các lá bắc hữu thụ ở phía dưới,
Trang 14có 3 răng tù; cánh hoa trắng hơi hồng; cánh môi hình bầu dục, phía đầu có màu vàng, đầu rách mép; bao phấn có cựa ở gốc Bầu có lông [3], [8]
Điếm khác nhau cơ bản giữa Curcuma elata Roxb và Curcuma longa L là cụm hoa ở bên, mọc riêng với thân có lá Bên cạnh đó lá của loài Curcuma elata Roxb cũng
có hình bầu dục tuy nhiên kích thước lớn hơn 1m x 30 cm (Curcuma longa L có kích
thước 40-45 x 15-18 cm) và hai mặt lá có lông [3], [8]
Về thành phần tinh dầu: Cho tới nay chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa
học thân rễ loài Curcuma elata Roxb Trong đó 2 nghiên cứu tại Trung Quốc đã công
bố thành phần chính của tinh dầu Nghệ Curcuma elata Roxb là
8,9-dehydro-9-formyl-cycloisolongifolen (14,76% – 52,19%) và germacron (4,12% – 14,02%) [43], [48] có sự
khác biệt rõ rệt so với loài Curcuma longa L
1.2 Tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng
Năm 2007, Krittika Norajit cùng các cộng sự nghiên cứu đánh giá tác dụng kháng
khuẩn của tinh dầu 5 loài thuộc họ Gừng trong đó có Curcuma longa L Kết quả cho
thấy tinh dầu Nghệ vàng với thành phần chính là α-turmeron không thể hiện tác dụng
ức chế đối với vi khuẩn E coli (đường kính vòng vô khuẩn = 0 và MIC > 50mg/ml) và
tốt nhất trên Listeria monocytogenes với đường kính vòng vô khuẩn = 16mm, MIC = 25mg/ml Trên 2 chủng còn lại: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, tác dụng ức
chế của tinh dầu Nghệ vàng không thể hiện rõ ràng (đường kính vòng vô khuẩn 9 - 10mm, MIC > 50mg/ml) [35]
Một nghiên cứu khác do Shragufta Naz và các cộng sự đã đánh giá tác dụng của
tinh dầu Nghệ vàng thu tại Pakistan trên các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus
macerans, Bacillus licheniformis và vi khuẩn Azotobacter Kết quả nghiên cứu cho thấy
ở nồng độ dao động từ 4 – 28 mg/ml các mẫu tinh dầu đều có khả năng ức chế các vi
khuẩn Trong đó vi khuẩn B subtilis cho đường kính vòng vô khuẩn lớn hơn các vi
khuẩn khác vì vậy được cho là nhạy cảm nhất đối với các mẫu tinh dầu Nghệ vàng [34]
Năm 2015 Jelena S Stanojević tiến hành nghiên cứu tinh dầu Nghệ vàng tại Serbia đã xác định được 8 thành phần có trong tinh dầu trong đó các sesquiterpen (ar-turmeron, α-turmeron, β-turmeron) chiếm tỷ lệ lớn (65,4%) Nghiên cứu cũng đánh giá tác dụng kháng khuẩn cho kết quả hoạt của tính tinh dầu Nghệ vàng tốt hơn so với
cefalexin trên chủng Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 và ampicilin trên chủng
Proteus vulgaris ATCC 8427 tuy nhiên không có tác dụng trên chủng Staphylococcus
Trang 15aureus ATCC 25923 (MSSA), Escherichia coli ATCC 25922 và Listeria monocitogenes
ATCC 19166 Tinh dầu Nghệ cũng cho tác dụng kháng khuẩn yếu trên các chủng
Bacillus cereus ATCC, Bacillus subtilis ATCC 6633 (đường kính vòng vô khuẩn lần
lượt là 17; 24 mm) [38]
Tại Colombia, năm 2016 Álvarez Nelson Méndez cùng các cộng sự thực hiện nghiên cứu đánh giá tác dụng của tinh dầu Nghệ trên các chủng vi khuẩn bệnh viện Kết quả nghiên cứu cho thấy chỉ ở nồng độ 1000ppm tinh dầu Nghệ mới ức chế được trên
50% sự phát triển của vi khuẩn Bacillus sp Cũng ở nồng độ này tỷ lệ ức chế sinh trưởng của Staphylococcus aureus ATCC 25923 (MSSA), Klebsiella pneumoniae, và
Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) tương ứng là 43%, 43%, 39% và 33%
[50]
Tại Việt Nam, năm 2010 Nguyễn Thị Kim Cúc cùng các cộng sự đã nghiên cứu xác định được 13 cấu tử có trong tinh dầu thân rễ Nghệ vàng trong đó ar-turmeron và α-turmeron chiếm tỷ lệ cao nhất (28,25% và 29,11%) Đồng thời nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng, kết quả chỉ ra rằng các vi
khuẩn Gram (+) nhạy cảm với tinh dầu hơn so với vi khuẩn Gram (-) Bacillus cereus
bị ức chế ở nồng độ 1% trong khi Listonella damsela phát triển tốt ở nồng độ này và chỉ
bị ức chế ở nồng độ 3% [19]
Một nghiên cứu khác do Phan Thị Hoàng Anh cũng cho kết quả các sesquiterpen bao gồm ar-turmeron, α-turmeron, β-turmeron là thành phần chiếm tỷ lệ lớn nhất trong tinh dầu của 4 mẫu Nghệ vàng thu tại Bình Dương, Đồng Nai, Quảng Nam và Nghệ An MIC của các mẫu Nghệ vàng trên các chủng vi khuẩn được đánh giá bằng phương pháp pha loãng trên thạch cho kết quả trong bảng 1.1
Bảng 1.1: Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/ml) của tinh dầu Nghệ vàng đối với
một số chủng vi khuẩn [1]
MIC (µg/ml)
Bình Dương
Trang 16Như vậy từ các kết quả trên cho thấy tinh dầu Nghệ vàng Curcuma longa L có
tác dụng ức chế yếu trên hầu hết các chủng vi khuẩn nghiên cứu trong đó vi khuẩn Gram
(+) (tốt nhất là Bacillus sp.) nhạy cảm hơn so với vi khuẩn Gram (-)
1.3 Vài nét về dấu vân tay hóa học
1.3.1 Khái niệm về dấu vân tay hóa học
Ngày nay, xu hướng sử dụng thuốc dược liệu tại các nước đang phát triển để điều trị bệnh ngày một phổ biến Trong tình hình sử dụng dược liệu ngày càng tăng, hướng dẫn của WHO đưa ra về việc đánh giá hiệu lực và an toàn của thuốc có nguồn gốc từ thảo dược đã quy định chỉ tiêu đánh giá chất lượng dược liệu về mặt hóa học như sau:
“Phải mô tả các phép thử vật lý và hóa học được tiến hành để xác định các thành phần hóa học của cây và mô tả sắc ký đồ của phân đoạn hoạt chất hoặc chất đặc trưng Nếu không phải xác định một hỗn hợp các chất đặc trưng (dấu vân tay) của cây thuốc” [41]
Khái niệm dấu vân tay hóa học được đề cập trong phụ lục 12.23 Dược điển Việt Nam V như sau: dấu vân tay hóa học là các thông tin hóa học của dược liệu được biểu thị dưới dạng sắc ký đồ, các phổ và các đồ thị… được ghi bằng các kỹ thuật phân tích (kỹ thuật sắc ký) hay còn được gọi là sắc ký đồ dấu vân tay Trong sắc ký đồ dấu vân tay được thiết lập, có pic của một hoặc nhiều chất đánh dấu hóa học hay các chất đặc trưng [9]
Theo một số tài liệu, dấu vân tay hóa học hay dấu vân tay sắc ký còn được định nghĩa: dấu vân tay sắc ký của một mẫu dược liệu là một bản sắc ký đồ của dịch chiết các thành phần hóa học có hoạt tính dược lý và/ hoặc các thành phần hóa học đặc trưng của dược liệu [27]
Tổ chức Y tế Thế giới WHO đưa ra định nghĩa về chất đặc trưng như sau: “ Một thành phần chất tự nhiên có trong một bộ phận của cây có thể được dùng để đảm bảo cho sự nhận biết hoặc đảm bảo chất lượng chế phẩm của cây thuốc đó, không nhất thiết
là hoạt chất” [41]
Như vậy dấu vân tay hóa học của một mẫu dược liệu có thể hiểu là các thông tin hóa học của dược liệu được ghi dưới dạng sắc ký đồ được dùng để đảm bảo cho sự nhận biết hoặc đảm bảo chất lượng chế phẩm của cây thuốc đó
1.3.2 Ứng dụng của dấu vân tay hóa học
Dược liệu thường chứa rất nhiều thành phần và có khả năng biến đổi phức tạp tùy thuộc nhiều vào địa lý, môi trường, điều kiện canh tác, mùa vụ, giống, điều kiện bảo
Trang 17quản và phương pháp chế biến Do đó việc xác định dấu vân tay hóa học của dược liệu
có vai trò quan trọng trong việc thiết lập tiêu chuẩn chất lượng cho dược liệu nhằm đánh giá hiệu lực và đảm bảo tính an toàn của dược liệu
Bên cạnh đó, xây dựng dấu vân tay hóa học còn góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu cho việc định tính thành phần các chất trong dược liệu, dịch chiết dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu Trong các chuyên luận về dược liệu và chế phẩm thuốc ghi trong Dược điển Việt Nam V, các kỹ thuật sắc ký (TLC, HPLC) được áp dụng trong các phép thử định tính định lượng Tuy nhiên đối với các tiêu chuẩn của tinh dầu, Dược điển Việt Nam V vẫn chưa có các chỉ tiêu định tính, định lượng bằng sắc ký khí trong khi chỉ tiêu này được quy định trong tất cả các chuyên luận tinh dầu trong Dược điển Châu Âu cũng như phần lớn chuyên luận tinh dầu trong Dược điển Trung Quốc
Ngoài ra việc xác định dấu vân tay hóa học đặc trưng cho dược liệu còn được sử dụng để phân biệt, nhận biết dược liệu và phát hiện các tạp chất, các chất giả mạo pha trộn trong dược liệu hay các thành phẩm từ dược liệu
Như vậy, dấu vân tay hóa học có vai trò quan trọng trong việc định tính, xác định các thành phần có trong dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu; phát hiện tạp chất, các chất giả mạo pha trộn trong dược liệu và thiết lập tiêu chuẩn chất lượng cho dược liệu nhằm đảm bảo hiệu lực và an toàn cho dược liệu và các chế phẩm thuốc có nguồn gốc
từ dược liệu
1.3.3 Một số nghiên cứu thiết lập dấu vân tay hóa học
Đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới tập trung vào việc xây dựng dấu vân tay sắc
ký dược liệu, thuốc có nguồn gốc thảo dược và áp dụng kỹ thuật sắc ký dấu vân tay để đánh giá, kiểm soát chất lượng dược liệu Peishan Xie cùng các cộng sự đã ứng dụng kỹ thuật sắc ký dấu vân tay (HPTLC và HPLC) để đánh giá chất lượng bao gồm việc xác định, kiểm tra tính ổn định và nhất quán cũng như việc phát hiện các chất giả mạo của một số thuốc cổ truyền Trung Quốc [44] Năm 2008 Jian Hong Zeng cùng các cộng sự
đã sử dụng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ (GC/MS) để kiểm soát chất lượng tinh dầu
Curcuma kwangsiensis thu tại Quảng Tây, Trung Quốc [46] Năm 2018 Hui Zhang cùng
các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ứng dụng sắc ký dấu vân tay để đánh giá chất lượng
và kiểm soát quá trình bào chế chế phẩm thuốc cổ truyền [47] Trong một nghiên cứu khác, chất lượng các mẫu trà Phổ Nhĩ thu thập tại 12 cơ sở sản xuất tại Phổ Nhĩ, Vân
Trang 18Hồ Bắc và Giang Tô cũng đã được đánh giá bằng kỹ thuật dấu vân tay sắc ký GC/MS [32]
Tại Việt Nam, Nguyễn Kim Bích đã tiến hành “Phân tích và xác định các đặc điểm hóa học đặc trưng của dược liệu phục vụ công tác chuẩn hóa” cho 20 loài dược liệu dựa trên cơ sở xác định các đặc điểm đặc trưng của nhóm chất dược liệu nhờ kỹ thuật sắc ký lớp mỏng Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao và kỹ thuật sắc ký khí khối phổ cũng được sử dụng cho nhóm lignan của Đỗ trọng, alcaloid bay hơi của Xuyên khung và thành phần bay hơi của Ô dược [2] Trong năm 2016, Nguyễn Thị Bích Thu
đã tiến hành “Nghiên cứu chuẩn hóa dược liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp kết hợp kỹ thuật chỉ điểm vân tay” cho 10 loại dược liệu bao gồm: Cúc hoa, Hạ khô thảo, Hoàng cầm, Sinh địa, Ngũ gia bì, Ngũ gia bì hương, Sài hồ, Ô đầu, Tam thất và Mật gấu [10] Một nghiên cứu khác do Nguyễn Văn Tựu thực hiện “Nghiên cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn của một số dược liệu thường dùng phục vụ công tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược” trên 30 loại dược liệu Đề tài đã xây dựng được bộ dữ liệu chuẩn bao gồm 30 mẫu dược liệu đã được định danh đúng tên khoa học,
mô tả đặc điểm về hình thái, bột, vi phẫu và các đặc điểm hóa học đặc trưng thông qua các sắc ký dấu vân tay [11]
1.3.4 Tình hình tiêu chuẩn hóa Nghệ vàng và tinh dầu Nghệ vàng
Tiêu chuẩn về thân rễ Nghệ vàng được trình bày đầy đủ về đặc điểm hình thái,
mô tả vi học, đặc điểm bột, dấu vân tay sắc ký lớp mỏng nhận dạng curcuminoid có trong Nghệ vàng, xác định hàm lượng các thành phần chính (tinh dầu, curcuminoid) và các chỉ tiêu khác về chất lượng trong Dược điển Châu Âu (EP 8.0), Dược điển Trung Quốc (2015) và Dược điển Hồng Kông
Trong Dược điển Việt Nam V, chuyên luận về Nghệ vàng cũng quy định các chỉ tiêu chất lượng bao gồm mô tả đặc điểm hình thái; mô tả đặc điểm vi học; định tính bằng sắc ký lớp mỏng với chất đối chiếu curcumin; chỉ tiêu định lượng hàm lượng tinh dầu, curcuminoid và các chỉ tiêu khác về độ ẩm và tạp chất
Về công tác tiêu chuẩn hóa tinh dầu Nghệ vàng: hiện nay Dược điển Châu Âu (EP 8.0), Dược điển Trung Quốc (2015), Dược điển Hồng Kông đều chưa có chuyên luận về tinh dầu Nghệ vàng Tại Việt Nam, Dược điển Việt Nam V đã có thêm chuyên luận về tinh dầu Nghệ vàng quy định một số chỉ tiêu chất lượng của tinh dầu Nghệ vàng như cảm quan màu sắc, mùi vị; các chỉ số vật lý (tỷ trọng, chỉ số khúc xạ và góc quay
Trang 19cực riêng); định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, tuy nhiên các chỉ tiêu còn hạn chế, hình ảnh sắc ký lớp mỏng chưa được mô tả cũng như thành phần hóa học đặc trưng chưa được nhắc đến, đồng thời chưa có chỉ tiêu định tính, định lượng bằng sắc ký khí.
Trang 20CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu
Mẫu thân rễ Nghệ vàng (Curcuma longa L.) được thu tại các địa phương thuộc
một số tỉnh miền bắc, miền trung và miền nam Việt Nam Các mẫu Nghệ vàng được kiểm tra về mặt hình thái đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V Hình ảnh các mẫu nghiên cứu được trình bày ở phần Phụ lục 1
Thông tin và ký hiệu của 20 mẫu thu được được trình bày trong bảng 2.1
Bảng 2.1: Thông tin 20 mẫu thân rễ Nghệ vàng
mẫu
3 HN13 Trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế
biến cây thuốc Hà Nội Viện Dược Liệu 12/03/2019
Trang 212.1.2 Phương tiện nghiên cứu
2.1.2.1 Dung môi, hóa chất:
❖ Dùng cho xác định dấu vân tay hóa học tinh dầu Nghệ:
₋ Các dung môi: n-hexan, ethyl acetat, toluen đạt tiêu chuẩn phân tích (Trung Quốc); cloroform, n-hexan đạt tiêu chuẩn HPLC (Merck);
₋ Thuốc thử hiện màu trong SKLM: dung dịch vanillin-acid sulfuric được pha mới bằng cách phối hợp đồng thể tích vanillin 1% trong ethanol và dung dịch H2SO4
10% trong ethanol;
₋ Natri sulfat khan (Trung Quốc);
₋ Dãy đồng đẳng ankan C8-C20 (Sigma Aldrich);
❖ Dùng cho đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ:
₋ Môi trường nuôi cấy: môi trường MHB (Sigma);
₋ Dung môi: DMSO, nước cất, đệm phosphat PSB;
₋ Resazurin;
₋ Kháng sinh cefoxitin
2.1.2.2 Trang thiết bị, máy móc:
❖ Dùng cho định lượng tinh dầu:
₋ Cân kỹ thuật Sartorius TE412;
₋ Bếp điện;
₋ Bộ dụng cụ cất tinh dầu theo Dược điển Mỹ (USP38)
❖ Dùng cho xây dựng dấu vân tay hóa học tinh dầu:
₋ Cột sắc ký (chiều dài 50 cm, đường kính trong 2 cm), chất nhồi cột: silicagel 0,04-0,063 mm (Merck);
₋ Bản mỏng silicagel 60F254 (Merck);
₋ Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao CAMAG (máy chấm sắc ký tự động Linomat 5, buồng chụp bản mỏng TLC Visualiser có kết nối máy tính với phần mềm VisionCATs, bình khai triển sắc ký);
₋ Hệ thống sắc ký khí Agilent 7890A, detector khối phổ 5975C, cột DB-5MS (30
m x 0,25 mm x 0,25 µm), khí mang heli;
₋ Micropipet Nichipet EX plus II;
₋ Máy ảnh kỹ thuật số;
Trang 22₋ Các dụng cụ thí nghiệm khác trong phòng thí nghiệm: bình nón, pipet, ống nghiệm
❖ Dùng cho đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu:
₋ Đĩa petri;
₋ Đĩa 96 giếng vô trùng;
₋ Thiết bị đo độ đục Mc Farland (McF);
₋ Máy quang phổ SPECTRAmax;
₋ Micropipet
❖ Chủng vi khuẩn thí nghiệm:
₋ Staphylococcus aureus ATCC 25923: tụ cầu vàng nhạy cảm với methicillin
(MSSA);
₋ Staphylococcus aureus ATCC 33591: tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA);
₋ Staphylococcus aureus 69486: tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA) phân lập
từ bệnh viện Bạch Mai
2.2 Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Thu mẫu Nghệ vàng và xác định hàm lượng tinh dầu các mẫu nghiên cứu
₋ Thu các mẫu thân rễ Nghệ vàng tại một số tỉnh thành;
₋ Xác định hàm lượng tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước
2.2.2 Xác định dấu vân tay hóa học tinh dầu Nghệ vàng
₋ Xác định dấu vân tay sắc ký lớp mỏng tinh dầu Nghệ vàng;
₋ Xác định dấu vân tay sắc ký khí tinh dầu Nghệ vàng
2.2.3 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn tinh dầu Nghệ vàng
- Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của 7 mẫu tinh dầu Nghệ vàng trên 2 chủng vi
khuẩn S aureus ATCC 25923 và S aureus ATCC 33591
- Đánh giá tác dụng phối hợp của tinh dầu Nghệ vàng với kháng sinh trên 3 chủng
tụ cầu vàng ATCC 25923, ATCC 33591 và chủng 69486
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Thu mẫu nghiên cứu và xác định hàm lượng tinh dầu các mẫu nghiên cứu
Mẫu thân rễ Nghệ vàng sau khi thu mua tại các tỉnh thành được kiểm tra theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V [9] bằng phương pháp cảm quan (chụp ảnh các mẫu thu được, lát cắt ngang, lát cắt dọc và màu sắc) đồng thời so sánh với mô tả trong luận án
Trang 23“Nghiên cứu phân loại họ Gừng (Zingiberaceae Lindl) ở Việt Nam” của Nguyễn Quốc
Bình [3], thực vật chí Trung Quốc (Flora of China) [42]
Hàm lượng tinh dầu được xác định bằng phương pháp cất kéo hơi nước, sử dụng
bộ dụng cụ cất tinh dầu theo mô tả của Dược điển Mỹ (USP38) Mẫu được rửa sạch, cân
và chia nhỏ Thêm lượng nước vừa đủ ngập lượng dược liệu, cất trong 7h, tắt bếp, để nguội, đọc thể tích tinh dầu Tinh dầu được loại nước bằng Na2SO4 khan, bảo quản trong
lọ kín, sẫm màu Hàm lượng tinh dầu (thể tích/khối lượng) tính trên dược liệu tươi theo công thức:
𝑋 = 𝑉 x 100
𝑚Trong đó:
₋ X là hàm lượng tinh dầu tính theo dược liệu tươi (%);
₋ V là thể tích tinh dầu thu được (ml);
₋ m là khối lượng dược liệu đem cất (g)
2.3.2 Xác định dấu vân tay hóa học tinh dầu Nghệ vàng
2.3.2.1 Xác định dấu vân tay sắc ký lớp mỏng tinh dầu Nghệ vàng
20 mẫu tinh dầu được phân tích bằng sắc ký lớp mỏng với các điều kiện như sau:
₋ Bản mỏng: silicagel 60F254 được hoạt hóa ở 110oC trong 1h, để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm
₋ Chất đối chiếu: được phân lập từ tinh dầu Nghệ vàng bằng phương pháp sắc ký cột và xác định thành phần bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ GC/MS [6]
₋ Dịch chấm sắc ký: tinh dầu được pha loãng trong cloroform theo tỉ lệ 1:30
₋ Dung môi: toluen-ethylacetat (97:3)
₋ Cách tiến hành: Chấm lên bản mỏng 2µl mỗi dung dịch trên dải dài 5,0mm, các vết cách mép dưới bản mỏng 10,0mm, cách mép ngoài bản mỏng 8,5mm; khoảng cách giữa 2 vết liền nhau là 4,0mm Thao tác được tiến hành trên hệ thống máy chấm tự động Linomat 5 Sau khi triển khai sắc ký dung môi đi được 8cm, lấy bản mỏng ra, để khô ở điều kiện thường và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm và 366nm sau đó hiện màu bằng dung dịch vanillin/acid sulfuric, sấy ở 110oC trong 5 phút, quan sát dưới ánh sáng thường Hình ảnh sắc ký được chụp lại bằng hệ thống chụp ảnh CAMAG TLC Visualiser
Trang 24₋ Kết hợp hình ảnh sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng các mẫu Nghệ vàng trong nghiên cứu trước của Phạm Thị Kiều Dung [6] để đưa ra được hình ảnh dấu vân tay sắc
ký lớp mỏng của tinh dầu Nghệ vàng
2.3.2.2 Xác định dấu vân tay sắc ký khí tinh dầu Nghệ vàng
❖ Phân tích thành phần tinh dầu Nghệ vàng bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS)
Mẫu phân tích: tinh dầu Nghệ vàng pha loãng trong cloroform với nồng độ 1% (tt/tt)
Tiến hành phân tích tinh dầu bằng hệ thống sắc ký khí, detector khối phổ; cột DB-5MS (30m x 0,25mm x 0,25µm); khí mang heli, tốc độ dòng 1ml/phút; chương trình nhiệt độ: 45oC giữ trong 5 phút, tăng 3oC đến 225oC, tăng 10oC đến 275oC; thể tích tiêm mẫu 1µl, chia dòng 1:50
Các thành phần trong tinh dầu được xác định dựa trên so sánh độ trùng lặp về phổ khối các chất có sẵn trong thư viện và dựa trên giá trị RI được so sánh với các dữ liệu có trong thư viện NIST và cơ sở dữ liệu đã được công bố [17] Chỉ số RI được tính toán dựa trên thời gian lưu thực tế các pic trong mẫu phân tích và thời gian lưu các alkan trong dãy đồng đẳng alkan C8-C20 được tiến hành ở cùng điều kiện sắc ký theo công thức:
RI = 100 x( Tx− Tn
Tn+1− Tx + n) Trong đó:
₋ T x : Thời gian lưu của chất phân tích;
₋ T n : Thời gian lưu của alkan liền trước pic phân tích;
₋ T n+1 : Thời gian lưu của alkan liền sau pic phân tich;
₋ n: Số nguyên tử carbon của alkan liền trước pic phân tích
❖ Xác định dấu vân tay hóa học tinh dầu Nghệ vàng
Phân nhóm tinh dầu Nghệ vàng bằng kỹ thuật phân tích chùm theo cụm thứ bậc HCA sử dụng phần mềm thống kê R 3.5.3 dựa trên dữ liệu là kết quả phân tích các thành phần có mặt trong tinh dầu bằng GC/MS
Phân nhóm 20 mẫu tinh dầu Nghệ vàng với 19 biến bao gồm tỷ lệ % của 18 cấu
tử có trong tinh dầu và tổng hàm lượng của 3 thành phần (ar-turmeron, α-turmeron, turmeron)
Trang 25β-Phân nhóm 20 mẫu tinh dầu Nghệ vàng dựa trên biến là tỷ lệ % của các thành phần chính chiếm hàm lượng lớn trong tinh dầu
Đối chiếu kết quả phân nhóm kết hợp với các kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Kiều Dung và cộng sự [6] đưa ra dấu vân tay sắc ký khí cho tinh dầu Nghệ vàng
2.3.3 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng
Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nghệ vàng được thực hiện tại phòng thí nghiệm trường Đại học công giáo Louvain (Université catholique de
Louvain) – Vương quốc Bỉ
2.3.3.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Tác dụng kháng khuẩn của 7 mẫu tinh dầu Nghệ vàng được đánh giá trên hai
chủng vi khuẩn: tụ cầu vàng nhạy cảm với methicillin MSSA (Staphylococcus aureus ATCC 25923) và tụ cầu vàng kháng methicillin MRSA (Staphylococcus aureus ATCC
33591) Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được xác định bằng kỹ thuật vi pha loãng sử dụng đĩa 96 giếng được tiến hành theo các bước sau:
₋ Chuẩn bị dung dịch tinh dầu: Hòa tan tinh dầu trong DMSO để được nồng độ 50µl/ml, bảo quản ở 4oC Pha loãng dung dịch này với môi trường nuôi cấy để được nồng độ 8192nl/ml, sử dụng trong ngày
₋ Chuẩn bị vi sinh vật: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường thạch TSA ủ qua đêm ở 37oC Lấy 2-3 khuẩn lạc thêm vào 3ml PSB trong ống Mc Farland, lắc cho phân tán đều Đo độ đục và điều chỉnh độ đục đạt 0,5 McF (tương ứng 108vk/ml) Pha loãng 100 lần trong môi trường nuôi cấy để được lượng vi khuẩn ban đầu là 106 vk/ml
₋ Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy được sử dụng là môi trường MHB-Ca
₋ Tiến hành: thêm 100µl MHB-Ca vào giếng số 1-11, 200µl vào giếng 12 làm mẫu đối chứng âm (không có vi khuẩn và tinh dầu giúp đánh giá độ vô khuẩn của môi trường) Thêm vào 100µl tinh dầu (nồng độ 8192nl/ml) vào giếng 1, trộn đều Lấy 100 µl dung dịch từ giếng 1 thêm vào giếng 2, tiếp tục như vậy cho đến giếng
10 để được các nồng độ 4096, 2048, 1024, 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8nl/ml (ở cột 10 loại bỏ 100µl) Bổ sung 100µl vi khuẩn vào cột 1-11 (cột 11 đóng vai trò mẫu chứng dương để kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn) Ủ ở 37oC trong 20h
Trang 26Resazurin (không huỳnh quang) sẽ được vi sinh vật sống chuyển thành Resozufin (có huỳnh quang)
₋ Đánh giá sự phát triển của vi sinh vật bằng máy đọc đĩa huỳnh quang SPECTRAmax ở bước sóng λexc = 560nm; λem = 590nm
₋ Đọc kết quả: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của tinh dầu là nồng độ thấp nhất môi trường sau nuôi cấy không phát huỳnh quang
2.3.3.2 Đánh giá tác dụng hiệp đồng của tinh dầu Nghệ vàng và kháng sinh
Đánh giá tác dụng hiệp đồng của mẫu tinh dầu Nghệ vàng mẫu NT01 và kháng
sinh cefoxitin sử dụng phương pháp checkerboard trên chủng vi khuẩn S aureus ATCC
25923 (MSSA), S aureus ATCC 33591 (MRSA) và chủng S aureus 69486 (MRSA
phân lập từ bệnh viên Bạch Mai) Phương pháp checkerboard với cefoxitin được thực hiện trên đĩa 96 giếng theo các bước sau:
₋ Xác định MIC của tinh dầu Nghệ vàng và kháng sinh cefoxitin trên các chủng vi khuẩn nghiên cứu
₋ Thêm vào các giếng 50µl môi trường
₋ Với tinh dầu Nghệ vàng: 50µl tinh dầu Nghệ vàng bổ sung vào các giếng 1-10 với nồng độ giảm dần từ 2MIC-1/256MIC (nl/ml), cột 12 chỉ chứa môi trường nuôi cấy làm mẫu đối chứng âm
₋ Với kháng sinh cefoxitin: 50µl kháng sinh bổ sung vào các giếng H-B với nồng
độ giảm dần từ 2MIC – 1/32MIC (µg/ml) (trừ cột 12)
₋ Cột 12 chỉ chứa 100µl môi trường nuôi cấy, hàng A (1-11) chỉ chứa tinh dầu Nghệ vàng với các nồng độ khác nhau, cột 11 (B-H) chỉ chứa kháng sinh cefoxitin với các nồng độ khác nhau, các giếng 1B-10H chứa hỗn hợp kháng sinh và tinh dầu Nghệ vàng (Hình 2.1)
₋ Thêm 100µl vi khuẩn (106 vk/ml, tiến hành chuẩn bị tương tự phần xác định MIC) vào mỗi giếng từ cột 1 đến cột 11, ủ ở 37oC trong 24 giờ Cột 12 làm mẫu đối chứng âm (không có tinh dầu, không có vi khuẩn: đánh giá độ vô trùng của môi trường), giếng 11A là mẫu đối chứng dương (không có tinh dầu, kháng sinh,
có vi khuẩn: đánh giá sự phát triển của vi khuẩn)
₋ Xác định MIC của tinh dầu Nghệ và kháng sinh trong hỗn hợp
₋ Tính chỉ số FIC theo công thức:
Trang 27MIC Xhỗn hợpMIC X +
MIC Yhỗn hợpMIC Y = FIC X + FIC Y = FIC
₋ MIC X: Nồng độ ức chế tối thiểu của tinh dầu Nghệ vàng đơn độc
₋ MIC Y: Nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh cefoxitin đơn độc
₋ FIC: Chỉ số đánh giá tác dụng hiệp đồng của tinh dầu Nghệ vàng và kháng
sinh cefoxitin [31]:
+ FIC >4: tác dụng đối kháng
+ 0,5< FIC <4: không hoặc chỉ có tác dụng cộng
+ FIC <0,5: tác dụng hiệp đồng
Trang 28- A
1/32 2
1/32
01/32
- H
Nồng độ tinh dầu Nghệ vàng (tính theo MIC)
Hình 2.1: Mô tả bố trí checkerboard trên đĩa 96 giếng
Trang 29CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Thu mẫu Nghệ vàng và xác định hàm lượng tinh dầu các mẫu nghiên cứu
Sau khi quan sát và đối chiếu đặc điểm thân rễ của 20 mẫu Nghệ vàng cho thấy
đặc điểm thân rễ các mẫu phù hợp với mô tả loài Curcuma longa L trong Dược điển
Việt Nam V: thân rễ hình trụ, thẳng hoặc hơi cong, đôi khi phân nhánh dạng chữ Y, dài 2cm đến 5cm, đường kính 1cm đến 3cm Mặt ngoài màu xám nâu, nhăn nheo, có những đường vòng ngang sít nhau, đôi khi còn vết tích của các nhánh và rễ Mặt cắt ngang thấy
rõ 2 vùng vỏ và trụ giữa; trụ giữa chiếm 2/3 đường kính Mặt bẻ bóng, có màu vàng cam Hình ảnh các mẫu Nghệ vàng, lát cắt ngang, cắt dọc được trình bày ở phụ lục 1
Hàm lượng tinh dầu tính trên dược liệu tươi dao động từ 0,4 dến 1,5%, thấp nhất
ở mẫu NA03 (0,4%) và cao nhất ở mẫu LC01 (1,5%) Các mẫu tinh dầu thu được có dạng lỏng, nhẹ hơn nước, mùi thơm đặc trưng, màu sắc từ không màu tới vàng nhạt Hàm lượng tinh dầu tính theo dược liệu tươi của các mẫu nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1: Hàm lượng tinh dầu tính theo dược liệu tươi
TT Kí hiệu mẫu Khối lượng thân rễ đem cất
(g)
Thể tích tinh dầu thu được (ml)
Hàm lượng tinh dầu (%, V/m)
Trang 303.2 Xác định dấu vân tay hóa học tinh dầu Nghệ vàng
3.2.1 Dấu vân tay sắc ký lớp mỏng tinh dầu Nghệ vàng
Sau khi triển khai sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi toluen-ethyl acetat (97:3), hình ảnh sắc ký đồ SKLM 20 mẫu tinh dầu Nghệ vàng sau khi phun thuốc thử hiện màu vanillin/H2SO4 được thể hiện ở hình 3.1
Hình 3.1: Sắc ký đồ của các mẫu tinh dầu Nghệ sau khi hiện màu bằng vanillin/
H 2 SO 4 , quan sát dưới ánh sáng thường
Trong đó: - X1: ar-curcumen, α-zingiberen, α-bisabolen, β-sesquiphellandren
- X2: hỗn hợp của β-turmeron, ar-turmeron, α-turmeron
Mẫu đối chiếu X1 và X2 được phân lập từ tinh dầu Nghệ vàng cho hình ảnh trên sắc ký đồ lần lượt là vết đậm màu xanh tím (Rf = 0,88) và vết đậm màu tím (Rf= 0,65)
Hình ảnh sắc ký đồ SKLM 20 mẫu tinh dầu cho thấy nhiều vết chất có màu sắc khác nhau tách nhau khá rõ ràng, các vết chất có giá trị Rf nằm trong khoảng 3 vùng Rf
= 0,2-0,5 (nhiều vết chất nhỏ); Rf = 0,5-0,8 (có vết đậm nhất màu tím Rf = 0,65); Rf = 0,8-0,9 (có vết đậm màu xanh tím Rf = 0,88) tuy nhiên có sự khác nhau về cường độ vết giữa các vết (Hình 3.2) Các mẫu tinh dầu đều có hai vết tương ứng với mẫu đối chiếu X1, X2, đặc biệt vết chất X2 có cường độ vết mạnh nhất chứng tỏ đây là thành phần
chính của tinh dầu Nghệ vàng Curcuma longa L X2 là các sesquiterpen có oxy bao
gồm hỗn hợp 3 thành phần β-turmeron, ar-turmeron, α-turmeron
Trang 31So sánh hình ảnh sắc ký đồ của mẫu nghiên cứu với đại diện mẫu tinh dầu Nghệ trong nghiên cứu trước của Phạm Thị Kiều Dung và cộng sự [6] được thể hiện ở hình 3.2
Hình 3.2: Sắc ký đồ của các mẫu BN01, NA03, HB01, HB02, HT01
Trong đó :
₋ BN01, NA03 là 2 mẫu đại diện cho 20 mẫu tinh dầu Nghệ vàng trong
nghiên cứu;
₋ 3 mẫu HB01, HB02, HT01 là 3 mẫu tinh dầu đại diện cho 2 nhóm Nghệ
vàng C longa trong nghiên cứu của Phạm Thị Kiều Dung
Kết quả cho hình ảnh sắc ký đồ các mẫu tinh dầu so sánh và mẫu nghiên cứu có điểm tương đồng về sự xuất hiện của các cụm chất chính nằm ở 3 vùng giá trị Rf Các mẫu đều có mặt X1, X2 nhưng khác nhau về tỷ lệ hàm lượng giữa 2 thành phần này
Mẫu BN01 tương ứng với nhóm HB01, HB02 (phân nhóm Nghệ C longa có màu vàng cam sẫm ); mẫu NA03 tương ứng với nhóm HT01 (phân nhóm Nghệ C longa có màu
vàng sáng)
Kết hợp kết quả phân tích 20 mẫu tinh dầu trong nghiên cứu cùng kết quả phân tích 19 mẫu Nghệ trong nghiên cứu của Phạm Thị Kiều Dung có thể đưa ra hình ảnh dấu vân tay sắc ký tinh dầu Nghệ vàng với hai vết chất đặc trưng X1 (Rf = 0,88) và X2
Trang 323.2.2 Dấu vân tay sắc ký khí tinh dầu Nghệ vàng
3.2.2.1 Phân tích các mẫu tinh dầu Nghệ vàng bằng GC/MS
Kết phân tích thành phần các chất có trong 20 mẫu tinh dầu Nghệ bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ được trình bày trong bảng 3.2 và 3.3 Trong đó hàm lượng mỗi thành phần là % tính theo diện tích của pic phân tích so với tổng diện tích của tất cả các pic có trên sắc ký đồ
Trang 33Bảng 3.2: Kết quả phân tích thành phần tinh dầu các mẫu:
Trang 34Bảng 3.3: Kết quả phân tích thành phần tinh dầu các mẫu:
Trang 35Các tín hiệu thu được trên sắc ký đồ nằm trong khoảng thời gian lưu từ 9-57 phút
Đã xác định được sự có mặt của 21 cấu tử thuộc 2 nhóm monoterpen và sesquiterpen (tổng hàm lượng các cấu tử phân tích được ở mẫu NT01 thấp nhất là 51,5% và cao nhất
ở mẫu LC01 là 91,2 % so với tổng hàm lượng các cấu tử có trong sắc ký đồ)
Hình ảnh trên sắc ký đồ của tất cả các mẫu xuất hiện 3 cụm pic có thời gian lưu trong khoảng từ 10-20 phút (các monoterpen), từ 33-40 phút (các sesquiterpen không có oxy) và từ 43-46 phút (các sesquiterpen có oxy) (Hình 3.3)
Hình 3.3: Sắc ký đồ tinh dầu Nghệ vàng mẫu BN01
Kết quả phân tích các mẫu tinh dầu cho thấy thành phần chính trong 20 mẫu tinh dầu là các sesquiterpen Trong đó các sesquiterpen có oxy chiếm tỷ lệ cao nhất (tổng hàm lượng 3 thành phần ar-turmeron, β-turmeron, α-turmeron thấp nhất ở mẫu H01 là 34,2% và cao nhất là 79,4% ở mẫu HCM01)
3.2.2.2 Xác định dấu vân tay sắc ký khí tinh dầu Nghệ vàng
Kết quả phân cụm 20 mẫu tinh dầu Nghệ vàng được thể hiện trong hình 3.4, 3.5
Trang 36Hình 3.4: Kết quả phân cụm 20 mẫu tinh dầu với biến đầu vào là các thành phần
có trong tinh dầu
Hình 3.5: Kết quả phân cụm 20 mẫu tinh dầu với biến đầu vào là các thành phần
thường xuất hiện trong tinh dầu
Hình 3.4 cho thấy kết quả phân cụm các mẫu tinh dầu với 19 biến đầu vào là tỷ
lệ 18 thành phần tinh dầu và tổng hàm lượng các turmeron (ar-turmeron, α-turmeron, turmeron) có trong tinh dầu 20 mẫu được chia thành 2 cụm (ở khoảng cách 40)
β-₋ Nhóm 1 gồm 15 mẫu: BN01, TQ01, CM01, VT01, TN01, BG02, HN13, LC01, TH02, HN11, HD01, HN12, NB0, HCM01, VP02
₋ Nhóm 2 gồm 5 mẫu:VP01, HN14, NA03, NT01, H01
Trang 37Để so sánh tìm ra những mẫu tinh dầu có đặc điểm giống nhau và phân nhóm các mẫu này, biến số đưa vào phép phân tích là hàm lượng của các thành phần ở mỗi mẫu Các biến số dao động càng lớn cho thấy sự khác nhau càng nhiều và khoảng cách giữa các mẫu sẽ càng lớn Như vậy các thành phần có hàm lượng cao và thường xuyên xuất hiện trong tất cả các mẫu (1,8-cineol, terpinolen, ar-curcumen, α-zingiberen, α-bisabolen, β-sesquiphellandren, ar-turmeron, α-turmeron, β-turmeron) sẽ quyết định chủ yếu đến kết quả phân nhóm
Kết quả phân nhóm các mẫu tinh dầu (ở khoảng cách 40) với 7 biến bao gồm tỷ
lệ % của 6 thành phần và tổng hàm lượng các turmeron là các thành phần chính thường xuyên xuất hiện trong tinh dầu Nghệ vàng cũng cho số lượng và thành phần các cụm là tương tự (Hình 3.5)
Thực hiện trên lượng mẫu lớn hơn, kết hợp kết quả nghiên cứu do Phạm Thị Kiều Dung cùng cộng sự thực hiện [6] cho kết quả phân nhóm của 39 mẫu tinh dầu Nghệ vàng thể hiện trong hình 3.6, 3.7
Hình 3.6: Kết quả phân cụm 39 mẫu tinh dầu với biến đầu vào các thành phần có
trong tinh dầu
Trang 38Hình 3.7: Kết quả phân cụm 39 mẫu tinh dầu với biến đầu vào là các thành phần
thường xuất hiện trong tinh dầu
Kết quả phân nhóm 39 mẫu tinh dầu theo 7 biến là các thành phần chính xuất hiện thường xuyên (Hình 3.7) cho kết quả tương tự khi phân nhóm theo 19 biến là các thành phần có mặt trong tinh dầu Nghệ vàng (Hình 3.6)
Do đó 9 thành phần thường xuất hiện trong tinh dầu Nghệ vàng bao gồm: cineol, terpinolen, ar-curcumen, α-zingiberen, α-bisabolen, β-sesquiphellandren, ar-turmeron, α-turmeron, β-turmeron trên sắc ký đồ GC/MS là đặc điểm để nhận biết tinh dầu Nghệ vàng (Hình 3.8; Hình 3.9)
1,8-Hình 3.8: 1,8-Hình ảnh dấu vân tay sắc ký tinh dầu Nghệ vàng
Trang 39Hình 3.9: Sắc ký đồ 20 mẫu tinh dầu Nghệ vàng