Phân tích hàm lượng và cấu trúc của hoạt chất bortezomib tổng hợp được làm nguyên liệu thuốc điều trị bệnh đa u tủy xương

Ở nước ta hiện nay, trong quá trình tìm hiểu chưa có nghiên cứu nào về việc tổng hợp và phân tích định lượng của bortezomib được công bố, chính vì vậy đề tài đã nghiên cứu cải tiến quy t

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

NGUYỄN TUẤN ANH

PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ CẤU TRÚC CỦA HOẠT CHẤT BORTEZOMIB TỔNG HỢP ĐƯỢC LÀM NGUYÊN LIỆU THUỐC

ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐA U TUỶ XƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ : HOÁ HỌC

Hà Nội 2019

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

NGUYỄN TUẤN ANH

PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ CẤU TRÚC CỦA HOẠT CHẤT BORTEZOMIB TỔNG HỢP ĐƯỢC LÀM NGUYÊN LIỆU THUỐC

ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐA U TUỶ XƯƠNG

CHUYÊN NGÀNH: HOÁ HỌC

MÃ SỐ: 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ : HOÁ HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS ĐẶNG THỊ TUYẾT ANH

Hà Nội 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ: “Phân tích hàm lượng và cấu

trúc của hoạt chất Boterzomib tổng hợp được làm nguyên liệu điều trị bệnh đa u

tuỷ xương” là do tôi thực hiện với sự hướng dẫn của TS.Đặng Thị Tuyết Anh

Đây không phải là bản sao chép của bất kỳ một cá nhân, tổ chức nào Các kết

quả thực nghiệm, số liệu, nguồn thông tin trong luận văn là do tôi tiến hành,

trích dẫn, tính toán và đánh giá.Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những nội

dung mà tôi đã trình bày trong luận văn này

Hà Nội, Ngày tháng năm 2019

HỌC VIÊN

Nguyễn Tuấn Anh

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS.Đặng Thị Tuyết Anh Phó phòng Hóa Dược - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã dành rất nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn các anh, chị và đồng nghiệp phòng Hóa dược - Viện hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện để em học tập và hoàn thành tốt luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Hoá Học ,tập thể các thầy

cô, anh chị và các bạn tại Viện Hoá Học đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn Học Viện Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam

đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn đến đề tài chương trình Hoá Dược Mã số: CNHD.ĐT.076/17-19 để em có thể tham gia và thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Học viên

Nguyễn Tuấn Anh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1.1 TỔNG QUAN VỀ BORTEZOMIB 2

1.1.1 Cấu trúc hoá học 2

1.1.2 Hoạt tính của Bortezomib 2

1.2TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HOÁ LÝ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI 3

1.2.1 Phương pháp sắc ký cột 3

1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 6

1.2.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 8

1.2.5 Phương pháp phổ khối lượng (MS) 9

1.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 10

1.3.1 Tính đặc hiệu 10

1.3.2 Độ chính xác 10

1.3.3 Độ đúng 11

1.4.4 khoảng tuyến tính 11

1.4.5 Miền giá trị 12

1.4.6 Giới hạn phát hiện 13

1.4.7 Giới hạn định lượng 13

CHƯƠNG II 15

THỰC NGHIỆM 15

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 15

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.2.1Chuẩn bị mẫu Bortezomib tổng hợp 15

2.2.2 Phương pháp phân tích cấu trúc 18

2.2.2.1 Phương pháp đo phổ hồng ngoại 18

2.2.2.2 Phương pháp phổ MS 19

2.2.2.3 Phương pháp phổ NMR 19

2.2.3 Phương pháp phân tích định lượng bằng HPLC 19

2.2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 19

2.2.3.2 Chuẩn bị mẫu 19

2.2.3.3 Tính thích hợp của hệ thống 20

2.2.3.4 Khoảng tuyến tính và miền giá trị 20

2.2.3.5 Độ đúng và khoảng xác định của phương pháp 20

2.2.3.6 Giới hạn phát hiện và Giới hạn định lượng 21

2.2.3.7 Độ chính xác 21

2.2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 22

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC BORTEZOMIB 23

3.1.1 Xác định cấu trúc của hợp chất 2 23

3.1.2 Xác định cấu trúc hợp chất 3 24

3.1.3 Xác định cấu trúc hợp chất 4 25

3.1.4 Xác định cấu trúc hợp chất Bortezomib 5 26

3.2 PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BORTEZOMIB 29

3.2.1 Tính thích hợp của hệ thống 29

3.2.2 Khoảng tuyến tính 30

3.2.3 Độ đúng và khoảng xác định của phương pháp 31

3.4.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 32

3.4.5 Độ chính xác 33

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHỤ LỤC 39

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

IR Infrared Spectrometry

MS Mass Spectrometry

NMR Nuclear Magnetic Resonance

1H-NMR 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectrocopy

13C-NMR 13C-Nuclear Magnetic Resonance Spectrocoy

HPLC High-performance Liquid Chromatography

LDA lithium diisopropylamide

HOBt Hydroxybenzotriazole

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Quy trình phân tách các chất trên sắc ký cột 4

Hình 2: Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng 5

Hình 3: Cách tính giá trị Rf 6

Hình 4: Sơ đồ hệ thống HPLC 7

Hình 5: Sơ đồ cải tiến tổng hợp Bortezomib 16

Hình 6: 1H-NMR của hợp chất 2 23

Hình 7: Phổ 13C- NMR của chất 2 24

Hình 8: Phổ 1H-NMR của hợp chất 3 24

Hình 9: Phổ IR của hợp chất 4 25

Hình 10: Phổ 1H-NMR của hợp chất 4 26

Hình 11: Phổ FTIR của hợp chất 5 26

Hình 12: Phổ 1H-NMR của hợp chất 5 27

Hình 13: Phổ 13C NMR của hợp chất 5 28

Hình 14: Phổ HRMS của hợp chất Bortezomib 28

Hình 15: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ Bortezomib và diện tích pic 31

Hình 16: Sắc ký đồ HPLC của Bortezomib tại điều kiện tối ưu chất chuẩn 34

Hình 17: Sắc ký HPLC của Bortezomib mẫu tổng hợp 34

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống 29

Bảng 2: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của Bortezomib 30

Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của Bortezomib 31

Bảng 4: Kết quả khảo sát độ lặp lại tạo LOD 32

Bảng 5: Kết quả khảo sát độ lặp lại của Bortezomib 33

MỞ ĐẦU

Bortezomib có tên thương mại là velcade là thuốc kháng ung thư thế hệ mới được dùng trong điều trị bệnh đa u tuỷ xương, đa u tuỷ là bệnh ung thư của tương bào trong tuỷ xương Bệnh chiếm khoảng 10% tổng số các ca bệnh máu

ác tính trên toàn thế giới, với khoảng 15.200 trường hợp mắc mới mỗi năm, đứng hàng thứ 2 trong số các bệnh máu ác tính, chi phí điều trị bệnh đa u tuỷ xương ở Việt Nam bằng thuốc bortezomib(velcade) nhập ngoại là rất đắt giá của

1 lọ Velcade 3,5 mg xuất xứ từ Bỉ có giá khoảng 25 triệu đồng / lọ (3,5 mg), từ Pháp - khoảng 22 triệu đồng / lọ 3,5 mg và từ Ấn Độ - khoảng 14 triệu đồng

Ở nước ta hiện nay, trong quá trình tìm hiểu chưa có nghiên cứu nào về việc tổng hợp và phân tích định lượng của bortezomib được công bố, chính vì vậy đề tài đã nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp sản phẩm bortezomib dựa vào các ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp tổng hợp công bố trên thế giới nhằm mục đích tạo điều kiện cho bệnh nhân sử dụng thuốc với giá thành rẻ hơn Tuy nhiên, để đánh giá độ tinh khiết và hàm lượng sản phẩm bortezomib tổng hợp được chúng tôi đã xây dựng phương pháp định lượng bằng HPLC ghép

đầu dò UV Theo hướng nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện đề tài “ phân tích

hàm lượng và cấu trúc của hoạt chất Bortezomib tổng hợp được làm nguyên liệu điều trị bệnh đa u tuỷ xương” với mục tiêu như sau:

1 Cải tiến quy trình tổng hợp Bortezomib làm nguyên liệu thuốc điều trị bênh đa U tuỷ xương

2 Xây dựng phương pháp xác định cấu trúc Bortezomib

3 Xác định hàm lượng của bortezomib bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép detector UV

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ BORTEZOMIB

1.1.1 Cấu trúc hoá học

Tên IUPAC: (R)-3-methyl-1-((S)-3-phenyl-2-(pyrazine-2-carboxamido) propanamido) butylboronic acid

Công thức phân tử: C19H25BN4O4

Khối lượng phân tử: 238.237g.mol-1

1.1.2 Hoạt tính của Bortezomib

Bortezomib là chất ức chế thuận nghịch hoạt động giống chymotrypsin

có thể ức chế các proteasome 25S của tế bào động vật có vú bortezomib ngăn chặn sự phân giải protein ảnh hưởng đến dòng thác tín hiệu bên trong tế bào, dẫn đến chết tế bào [1-4]

Kết quả thử nghiệm lâm sàng cho thấy rằng bortezomib là thuốc độc tính tế bào đối với nhiều loại tế bào ung thư khác nhau Các nghiên cứu lâm sàng bao gồm nhiều bệnh nhân trên toàn thế giới đã xác nhận hiệu quả và tính năng của Bortezomib trong điều trị cho bệnh đa u tủy Bortezomib giúp đẩy lùi bệnh một phần hoặc hoàn toàn trong 30-50% các trường hợp 20% Các

trường hợp không đáp ứng bortezomib đơn thuần có thể đáp ứng với điều trị

phối hợp bortezomib với dexamethason hoặc melphalan và prednisone

Ngoài ra, Bortezomib (Velcade) cũng được dùng để điều trị cho bệnh nhân u lympho tế bào mantle đã nhận được ít nhất 1 đợt điều trị trước đó Nghiên cứu mới đây của các nhà nghiên cứu Hy Lạp công bố trên tạp chí Arthritis & Rheumatism của Trường ĐH Thấp khớp học Hoa Kỳ (ACR) [5] cho thấy thuốc sinh học bortezomib (Velcade) có thể trở thành thuốc điều trị viêm khớp dạng thấp có triển vọng

1.2 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HOÁ LÝ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

1.2.1 Phương pháp sắc ký cột

Sắc ký cột là một dạng của sắc ký bản mỏng Trong sắc ký cột, chất hấp phụ pha tĩnh được nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột” Nhờ vậy mà có thể triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh

Giống như sắc ký lớp mỏng, phương pháp này cũng dựa vào độ phân cực của các chất, những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi cột chậm hơn và những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong quá trình sắc ký Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc phân bố tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột

Chuẩn bị chất hấp phụ và cột: Silicagel phải được hoạt hóa ở 120°C trong

4 giờ trước khi đưa lên cột Cột sắc ký phải là một khối đồng nhất, phải thật khô

và lắp thẳng đứng trên một giá cố định vững chắc

Nhồi cột: Chất hấp phụ phải được phân tán đồng đều trong cột Có 2 cách

nhồi cột: nhồi khô và nhồi ướt với dung môi Sau khi đưa chất hấp phụ lên cột, rót dung môi vào cột và để chạy liên tục một thời gian để ổn định cột và không được để khô dung môi trong cột

Đưa chất cần phân tách lên cột: Phải đưa chất lên cột sao cho chất phân

tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng Có nhiều cách đưa chất lên cột: phương pháp dùng đĩa giấy, cho thẳng dung dịch chất cần phân tách lên cột, trộn chất cần phân tách với một lượng chất hấp phụ…

Rửa cột: Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà

áp dụng cách rửa cột bằng áp suất thường hoặc áp xuất nén Hứng dịch chảy ra ở đáy cột theo phân đoạn, theo thời gian hoặc bằng ống nghiệm cùng thể tích

Hình 1: Quy trình phân tách các chất trên sắc ký cột

1.2.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Các bước trong kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (Hình ):

Chuẩn bị bản mỏng:Bản mỏng được bảo quản trong bình hút ẩm Dùng

bút chì mềm kẻ bản mỏng Vạch đường chấm chất phân tích (cách mép dưới của bản mỏng 1,2 cm), đường giới hạn di chuyển của dung môi (cách mép trên của bản mỏng 0,8 cm) và đánh dấu vị trí chấm chất (các vết chấm cách nhau 0,5 cm

và cách hai bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm)

Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Dùng ống mao quản hoặc micropipet

chấm chất lên các vị trí đã đánh dấu Các vết chấm phải nhỏ, lượng chất phải

đồng đều, không quá lớn dễ kéo vết hoặc chồng vết, cũng không quá nhỏ khó hiện vết bằng thuốc thử

Triển khai sắc ký: Bình triển khai thường là bình thủy tinh, có nắp đậy kín và

đáy phải bằng Lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình Pha hệ dung môi với

tỷ lệ thích hợp và vừa đủ, rót vào bình triển khai Lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi Đặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi triển khai Đậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi Khi dung môi chạy đến đường giới hạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình và sấy khô bản mỏng rồi hiện vết

Hiện vết trên bản mỏng: Có thể hiện vết bằng cách soi UV (bước sóng

254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử (thuốc thử dùng trong đồ án là Ce(SO4)2)

Hình 2: Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng

Hiện nay, chủ yếu sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254, kích thước 20×20 cm, dày 0,2 mm Sắc ký lớp mỏng là công cụ đắc lực trong nghiên cứu dược liệu vì đơn giản, ít tốn thiết bị và dung môi mà lại đạt hiệu quả cao

Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đã đặt sẵn hỗn hợp chất cần phân tích Pha tĩnh là chất hấp phụ được lựa chọn tùy theo yêu cầu phân tích, được trải mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc kim loại Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định tùy theo mục đích cụ thể Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử

trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Kết quả, thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi (Hình 3) Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến giá trị Rf

Hình 3: Cách tính giá trị Rf

1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao: (High-performance liquid chromatography); viết tắt: HPLC) là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để đẩy dung môi lỏng dưới áp suất cao, trong dung môi có chứa hỗn hợp mẫu, qua một cột sắc ký Cột sắc ký được đổ bằng vật liệu hấp phụ rắn Mỗi thành phần trong mẫu tương tác tương đối khác nhau với vật liệu hấp phụ, nên tốc độ dòng của mỗi thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn tới sự phân tách các thành phần khì mà chúng chảy ra khỏi cột

Hình 4: Sơ đồ hệ thống HPLC HPLC đã và đang được sử dụng cho những mục đích sản xuất, nghiên cứu, pháp lý và y dược [6]

Sắc ký có thể được mô tả là một quá trình dịch chuyển khối lượng liên quan tới hấp phụ HPLC dựa trên hệ thống bơm để đẩy chất lỏng đã bị nén và hỗn hợp mẫu qua một cột đổ bằng một chất hấp phụ, dẫn tới sự phân tách của các thành phần trong mẫu Những thành phần của hỗn hợp mẫu được tách ra khỏi nhau bởi mức độ tương tác khác nhau với các hạt hấp phụ Chất lỏng bị nén

là hỗn hợp dung môi ví dụ nước, acetonitrile hay methanol và được gọi là "pha động" Thành phần và nhiệt độ của pha động đóng vai trò chính trong quá trình phân tách bằng cách tác động lên nhưng tương tác xảy ra giữa những thành phần trong mẫu và chất hấp phụ ở cột

Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả và có khả năng dò tìm lượng mẫu nhỏ đến 200pg, tách những hỗn hợp phức tạp với độ phân giải cao Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường Chính vì thế mà các thuốc không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký Những cơ hội áp dụng HPLC hầu như

không giới hạn, do đó HPLC đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong khoa học và công nghiệp [7-11]

1.2.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) là phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ Phương pháp phổ biến được sử dụng là phổ 1H-NMR và 13C-NMR Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13C có momen từ Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường Đó là spin hạt nhân

có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 [12]

Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt

nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau Đặc trưng cho các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân 1H thì:

) ( 10 6 ppm

o

x TMS







nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ

Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học được định nghĩa một các tổng quát như sau:

) ( 10

o

x chuan







mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ

Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học

của mỗi hạt nhân khác nhau Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường yếu hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn [13]

Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có mặt trong chất được khảo sát Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên

mà được tính bằng phần triệu (ppm) Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12 ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm

Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân không

tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần Nguyên nhân gây nên sự tách tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có từ tính ở

cạnh nhau Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết Giá trị J phụ thuộc

vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên kết ngăn giữa các tương tác [13]

Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa các hợp

phần của một vân phổ Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có thể rút ra kết

luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau [12]

1.2.5 Phương pháp phổ khối lượng (MS)

Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vỡ phân tử trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối z = m/e Sau đó phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận được phổ khối lượng Dựa vào phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên

cứu [10,14]

Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng phân

tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định được cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh Đây là một trong những thông số

quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau

1.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

1.3.1 Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác (tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất,…)

có trong mẫu thử

Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu: Sắc

ký đồ của mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn Sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn [15-18]

1.3.2 Độ chính xác

Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng biệt so với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện Độ chính xác cũng còn được coi là mức độ dao động của các kết quả đo lường riêng biệt so với giá trị trung bình [15-18]

Phương pháp xác định

Độ lặp lại: tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử trong miền giá trị của quy trình phân tích (3 lần phân tích/ nồng độ × 3 nồng độ) hoặc định lượng tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%

Yêu cầu Tiêu chuẩn cho giá trị RSD phụ thuộc nhiều vào loại phân tích mẫu phân tích Đối với các quy trình định lượng thường quy, RSD dễ dàng đạt trên dưới 2% Đối với phân tích các mẫu sinh học, độ chính xác ở khoảng 20% ở

giới hạn định lượng dưới và 15% ở các nồng độ khác cao hơn Giá trị RSD càng nhỏ, quy trình càng có độ chính xác cao [19]

1.3.3 Độ đúng

Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần giữa giá trị tìm thấy so với giá trị thực thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện [15-18] Độ đúng bị ảnh hưởng bởi sai số hệ thống

Phương pháp xác định Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ của miền giá trị trong quy trình phân tích (3 lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau) Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi được xác định theo công thức sau:

Độ đúng hay tỉ lệ thu hồi (%) = Lượng hoạt chất thu hồi x 100 %

Lượng hoạt chất thêm vào

Trong đó: 𝑋 là giá trị mẫu đo được

µ là giá trị mẫu theo lý thuyết

Yêu cầu Tỷ lệ phục hồi được chấp thuận dựa vào mẫu phân tích, quy trình

xử lý mẫu và nồng độ phân tích Trong các định lượng thường quy, tỷ lệ phục hồi thường được chấp thuận với giá trị 100 ± 2% [15,16] Tỷ lệ phục hồi càng gần giá trị 100% quy trình có độ đúng càng cao

1.4.4 khoảng tuyến tính

Khoảng tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x)

Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, khoảng tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R

Đánh giá khoảng tuyến tính bằng các phương pháp thống kê thích hợp: trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa các hệ số a, b; trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình

Yêu cầu Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,90 ≤ R2 ≤ 1 [16]

1.4.5 Miền giá trị

Miền giá trị của một quy trình phân tích là khoảng giữa nồng độ cao và nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử với bất kì nồng độ nào trong khoảng này đều phải đáp ứng về độ chính xác lẫn độ đúng và tính chất tuyến tính của phương pháp [15-18] Miền giá trị thường được biểu thị bằng khoảng nồng độ mà ở khoảng nồng độ này vẫn còn sự phụ thuộc tuyến tính giữa giá trị đo được và nồng độ [15-18]

1.4.6 Giới hạn phát hiện

Giới hạn phát hiện (LOD) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần phải xác định chính xác hàm lượng [15-18]

Phương pháp xác định

- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu nhỏ nhất: LOD được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình phân tích đang thẩm định vẫn phát hiện được

- Phương pháp lập tỷ số tín hiệu phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp dụng với quy trình có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S LOD

là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 – 3

- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc: LOD = 3,3 × SD

aTrong đó: a là độ dốc của đường chuẩn định lượng

SD: độ lệch chuẩn của độ đáp ứng SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào đường chuẩn định lượng

1.4.7 Giới hạn định lượng

Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ chính xác phù hợp [15-18]

Phương pháp xác định

- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác: LOQ được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình phân tích đang thẩm định

- Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp dụng cho phương pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S LOQ là nồng độ

mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị khoảng 10

Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc: LOD = 10 x SD

aTrong đó: a là độ dốc của đường chuẩn độ

SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng SD được tính bằng hai cách: dựa vào

độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào đường cong chuẩn độ

CHƯƠNG II THỰC NGHIỆM 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

Các hóa chất phục vụ cho việc tổng hợp hữu cơ và dung môi được mua của hãng Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ).Bột silicagel cho sắc ký cột 100 - 200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký silicagel đế nhôm Art 5554 DC - Alufolien Kiesel 60 F254 (Merck).Chất chuẩn bortezomib, các dung môi ACN, Axit formic

để chạy sắc ký HPLC đều của hãng Merch, độ tinh khiết trên 99%

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

Để xác nhận cấu trúc chúng tôi tiến hành bằng các phương pháp được sử dụng trên các thiết bị sau: Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp được đo trên máy Gallenkamp của Anh, Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz, Phổ khối của các chất nghiên cứu được ghi trên máy Hewlett Packard Mass Spectrometer 5989 MS hoặc LC- MSD- Trap- SL, Hệ thống HPLC - DAD

3000 (Thermo Scientific, Hoa Kỳ) trang bị bốn bơm cao áp và bộ tiêm mẫu tự động Cột sắc ký RP-C18( kích thước cột 4,6 x 250 nm, kích thước hạt 3m)

thiết bị xử lý tín hiệu là hệ thống máy vi tính với hệ điều hành Microsoft Windows 7 trang bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1.2.1478

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Chuẩn bị mẫu Bortezomib tổng hợp

Mẫu bortezomib tổng hợp được chuẩn bị bằng cách tiến hành tìm hiểu những ưu và nhược điểm các phương pháp nghiên cứu của một số tác giả và phương pháp tổng hợp sau:

- Tổng hợp bortezomib đi từ pinanediol boronic este[20]

- Tổng hợp bortezomib từ N-pyrazinoyl-L-phenylalanine[21]

- Tổng hợp bortezomib bằng phương pháp Ellman[22]

- Tổng hợp bortezomib anhydride từ pinacol boronate[23]

2-methylpropane-1-Từ các kết quả nghiên cứu bước đầu của nhóm tác giả, nhận thấy rằng mỗi phương pháp tổng hợp bortezomib đều có ưu điểm và nhược điểm nhất định Các phương pháp tổng hợp bortezomib đã được công bố cho thấy, để tổng hợp bortezomib phải thực hiện qua phản ứng Matteson tổng hợp muối ammoni chlorid trong điều kiện nhiệt độ rất thấp (dưới -20oC) Đây là vấn đề khó khăn khi thực hiện để nâng quy mô, hiệu suất Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi đề xuất quy trình đơn giản qua 4 bước phản ứng phù hợp với quy mô nghiên cứu tại phòng thí nghiệm và điều kiện tại Việt Nam như hinh 5.Từ đó mẫu bortezomib tổng hợp được dùng làm nguyên liệu để phân tích xác định cấu trúc và xây dựng phương pháp xác định hàm lượng

Hình 5: Sơ đồ cải tiến tổng hợp Bortezomib

Quy trình tổng hợp chất 2: (1R)-(S)-pinanediol 1-ammonium

trifluoroacetate-3-methylbutane-l-boronate 1 (100mg, 1mmol) được hòa tan

trong 5ml CH2Cl2, sau đó cho lần lượt tác nhân EDC.HCl (60mg, 1,2 mmol), HOBt (42mg, 1,2 mmol) và diisopropyletylamin DIPEA (0,1ml, 2,5mmol) và

Boc-L-phenylalanine (70 mg, 1 mmol) vào bình phản ứng Hỗn hợp phản ứng

được khuấy ở nhiệt độ 0oC 12 giờ Sau đó, loại bỏ diclometan ở áp suất thấp, thêm vào hỗn hợp phản ứng 60 ml etyl axetat Pha hữu cơ được rửa lần lượt với nước DI (2 x 40 mL), dung dịch acid phosphoric 1% (2 x 40 mL), dung dịch

K2CO3 2% (2 x 40 mL), và nước muối (2 x 40 mL) Mỗi pha nước được chiết lại

2 lần bằng etyl axetat Pha hữu cơ sau đó được gộp lại, làm khan bằng muối

natri sulfat, lọc và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được hợp chất 2 dưới

dạng chất bọt màu trắng Sau khi tinh chế bằng cột silica gel, thu được sản phẩm

2 sạch với hiệu suất phản ứng là 80%

Quy trình tổng hợp chất 3: hợp chất 2 (200mg, 1mmol) được hòa tan

trong 5ml CH2Cl2 ở nhiệt độ 0oC, sau đó TFA (3mmol) được nhỏ giọt từ từ vào bình phản ứng Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ 0oC trong 3h Sau đó, loại bỏ diclometan ở áp suất thấp, thêm dung môi toluen, cô quay phản ứng để

loại bỏ dung môi triệt để Sản phẩm sau khi cô quay có dạng bột trắng là muối 3

(hiệu suất 90%) được sử dụng cho phản ứng tiếp theo mà không cần tinh chế

Quy trình tổng hợp chất 4: Muối ammonium chloride 3 (100mg, 1mmol)

được hòa tan trong 5ml CH2Cl2, sau đó cho lần lượt tác nhân EDC.HCl (51mg, 1,2 mmol), HOBt (36mg, 1,2 mmol) và diisopropyletylamin DIPEA (0,1ml, 2,5 mmol) và pyrazine-2-carboxylic acid (27 mg, 1 mmol) vào bình phản ứng Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ 0oC 12 giờ Sau đó, loại bỏ diclometan ở

áp suất thấp, thêm vào hỗn hợp phản ứng 60 ml etyl axetat Pha hữu cơ được rửa lần lượt với nước DI (2 x 40 mL), dung dịch acid phosphoric 1% (2 x 40 mL),

dung dịch K2CO3 2% (2 x 40 mL), và nước muối (2 x 40 mL) Mỗi pha nước được chiết lại 2 lần bằng etyl axetat Pha hữu cơ sau đó được gộp lại, làm khan bằng muối natri sulfat, lọc và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được hợp chất

4 dưới dạng chất bọt màu trắng Sau khi tinh chế bằng cột silica gel, thu được sản phẩm 4 sạch với hiệu suất phản ứng là 85%

Quy trình tổng hợp hợp chất Bortezomib 5: phenylalanine-L-leucine borate 4 (100 mg, 1 mmol) được hòa tan bằng

N-(2-pyrazinecarbonyl)-L-MeOH (0,4ml) trong bình cầu đáy tròn Sau đó thêm isobutyl boronic acid (35 mg, 1,8 mmol) trong hexan (0,4ml), acid HCl 1N (0,3 ml) được nhỏ giọt

từ từ vào và hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 4h Hỗn hợp phản ứng được chia làm 2 lớp riêng biệt, sau phản ứng được chiết với hexan (30ml x 3 lần) Phân lớp MeOH cô quay loại dung môi, thêm NaOH 2N để trung hòa đến pH = 6-6,5 và được chiết bằng EtOAc (30ml x 3 lần) Pha hữu cơ sau đó được gộp lại, làm khan bằng muối natri sulfat, lọc và loại

bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được hợp chất bortezomib 5 dưới dạng chất

bọt màu trắng Sau khi tinh chế bằng cột silica gel, thu được sản phẩm

bortezomib 5 (44 mg) sạch với hiệu suất phản ứng là 60%

2.2.2 Phương pháp phân tích cấu trúc

2.2.2.1 Phương pháp đo phổ hồng ngoại

Mẫu sau khi được tiến hành kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng TLC là đã sạch

ta tiến hành đem đo phổ hồng ngoại bằng cách trộn mẫu Bortezomib thật đồng đều với KBr theo tỉ lệ 1:10 hoặc 1:100 rồi ép thành viên mỏng hầu như trong suốt bằng máy ép thuỷ lực sau đó tiền hành đo phổ trên thiết bị FT-IR spectrum TWO DTGS tại phòng Hoá Dược – Viện Hoá Học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam