Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của thân rễ một loài thuộc chi Dioscorea L. ở Sa Pa, Lào Cai

- Nghiên cứu thành phần hóa học và bán định lượng diosgenin trong thân rễ của mẫu cây thu được... Các phương pháp định lượng diosgenin i Phương pháp cân: Bột dược liệu được thủy phân bằ

DIOSCOREA L Ở SA PA, LÀO CAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019

DIOSCOREA L Ở SA PA, LÀO CAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Lời cảm ơn Đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Nghiêm Đức Trọng,

người thầy đã hướng dẫn và tạo điều kiện học tập, nghiên cứu tốt nhất, cũng như động viên em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài

Em xin cảm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu nhà trường, các phòng ban, các

bộ môn đã nhiệt tình hỗ trợ em trong suốt 5 năm học tập cũng như thời gian thực hiện khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Bộ môn Thực Vật – Trường Đại học Dược Hà Nội, cô Phạm Thị Linh Giang, thầy Lê Thiên Kim và các chị kỹ thuật viên

đã luôn tận tình giúp đỡ và chỉ cho em nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian

em làm thực nghiệm tại bộ môn

Cuối cùng, em cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những người thân trong gia đình, những người bạn đã luôn kịp thời động viên, ủng hộ em trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2019 Sinh viên

Nguyễn Thị Tuyến

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Chi Dioscorea L 2

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Dioscorea L 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Dioscorea L 2

1.1.3 Giá trị sử dụng của chi Dioscorea L 2

1.2 Tổng quan về Diosgenin 3

1.2.1 Công thức cấu tạo, tính chất lý-hóa 3

1.2.2 Tác dụng sinh học 4

1.2.3 Các loài Dioscorea dùng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất diosgenin 6

1.2.4 Ứng dụng của diosgenin 9

1.2.5 Các phương pháp định lượng diosgenin 9

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Nguyên liệu, thiết bị 11

2.1.1 Nguyên liệu 11

2.1.2 Thiết bị và hóa chất 11

2.2 Nội dung nghiên cứu 12

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 12

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 12

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật 13

2.3.2 Nghiên cứu về hóa học 13

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật 19

3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật 19

3.2 Kết quả nghiên cứu về hóa học 25

3.2.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất bằng phản ứng hóa học 25

3.2.2 Kết quả xác định hàm ẩm bột dược liệu 30

3.2.3 Kết quả định tính diosgenin - khảo sát dung môi khai triển HPTLC, lựa chọn phương pháp chiết xuất 30

3.2.4 Kết quả thẩm định phương pháp bán định lượng diosgenin bằng HPTLC 31

3.2.5 Bán định lượng diosgenin bằng HPTLC 34

3.3 Bàn luận 35

3.3.1 Đặc điểm thực vật và xác định tên khoa học 35

3.3.2 Đặc điểm vi học 36

3.3.3 Về hóa học 36

KẾT LUẬN 39

ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

16 - DPA 16 – dehydro pregnenolon acetat

HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu nâng cao

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các loài Dioscorea quan trọng để sản xuất diosgenin trong công nghiệp 7

Bảng 1.2 Hàm lượng diosgenin trong một số loài Dioscorea [14] 8

Bảng 3.1: Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong thân rễ Dioscorea collettii var hypoglauca 26

Bảng 3.2 Kết quả xác định hàm ẩm bột dược liệu 30

Bảng 3.3 : Kết quả thẩm định độ thích hợp hệ thống 32

Bảng 3.4 Kết quả thẩm định tính tuyến tính 33

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại 34

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ đúng 34

Bảng 3.8 Đặc điểm phân biệt Dioscorea collettii var hypoglauca và Dioscorea collettii var collettii 35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của diosgenin 4

Hình 3.1: Hình ảnh đặc điểm cơ quan sinh dưỡng của cây 20

Hình 3.2: Hình ảnh các đặc điểm của hoa đực 20

Hình 3.3: Hình ảnh các đặc điểm của hoa cái 21

Hình 3.4: Hình ảnh các đặc điểm của quả và hạt 21

Hình 3.5 Hình ảnh vi phẫu lá 22

Hình 3.6 Hình ảnh vi phẫu thân 23

Hình 3.7 Hình ảnh vi phẫu thân rễ 24

Hình 3.8 Hình ảnh các đặc điểm bột thân rễ 25

Hình 3.9: Hình ảnh so sánh khai triển sắc ký lớp mỏng với 2 hệ dung môi sau khi phun thuốc thử vanilin 1% trong acid sulfuric đặc 30

Hình 3.10 Hình ảnh so sánh 2 phương pháp chiết xuất diosgenin 31

Hình 3.11: Kết quả thẩm định độ đặc hiệu 32 Hình 3.12 Phương trình biểu diễn mối liên hệ giữa diện tích pic và lượng diosgenin 33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Khoảng 50-60% dẫn chất steroid dùng làm thuốc trên toàn cầu được sản xuất từ diosgenin Diosgenin được biết có mặt trong nhiều loài thực vật, như các loài thuộc chi

Trillium L (Melanthiaceae), Costus L (Costaceae), Tacca Forst & Forst f

(Taccaceae), Tuy nhiên, chỉ có các loài thuộc chi Dioscorea L mới có giá trị thực tế

trong việc chiết xuất diosgenin [49] Hàng năm ước tính ngành dược cần tới 10.000 tấn

thân rễ Dioscorea để sản xuất diosgenin [48], [50] Nhu cầu về lượng thân rễ Dioscorea

để sản xuất diosgenin ngày càng lớn trong khi nguồn nguyên liệu cung cấp ngày càng giảm do sự khai thác quá mức [48], [35], [28] Điều này đòi hỏi cần tìm thêm những nguồn nguyên liệu mới cung cấp diosgenin

Ở Việt Nam, hiện biết hơn 40 loài thuộc chi Dioscorea L [7] Trong đó, một số loài đã được nghiên cứu xác định hàm lượng diosgenin như D zingiberensis C.H.Wright., D collettii Hook f., D chingii Prain & Burkill., Dioscorea poilanei Prain

& Burk., D simulans Prain et Burkill., D dissimulans Prain et Burkill., D

membrancaea Pierre et Craib., D paradoxa Prain et Burkill., D subcalva Prain et

Burkill và còn nhiều loài chưa được nghiên cứu

Gần đây, trong quá trình điều tra tài nguyên cây thuốc chúng tôi có phát hiện một

loài Dioscorea sp mọc hoang tại Sa Pa – Lào Cai có những đặc điểm hình thái khác với các loài Dioscorea đã biết ở Việt Nam Loài này có những đặc điểm tương đồng với một

số loài Dioscorea đã được biết đến là nguồn nguyên liệu để chiết xuất diosgenin (Dioscorea deltoidea Wall ex Griseb., Dioscorea collettii Hook f.) như: thân khí sinh

quấn trái, thân rễ hình củ gừng, phát triển theo chiều ngang

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần

hóa học của thân rễ một loài thuộc chi Dioscorea L ở Sa Pa, Lào Cai” với mục tiêu:

- Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học và giám định tên khoa học của mẫu cây thu được

- Nghiên cứu thành phần hóa học và bán định lượng diosgenin trong thân rễ của mẫu cây thu được

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Chi Dioscorea L

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Dioscorea L

Vị trí phân loại của chi Dioscorea L theo hệ thống phân loại thực vật của

Takhatajan 1987 [2] như sau:

- Thân rễ của một số loài được sử dụng làm lương thực, chế biến thức ăn nhất là khi

thiếu đói: khoai mỡ (D alata L.), củ từ (D esculenta Lour.), khoai rạng (D glabra

Roxb.), củ mài (D persimilis Prain & Burk.),… do có chứa nhiều tinh bột [2], [5],

[7]

- Lá cây có chứa tanin được sử dụng để thuộc da, nhuộm vải cho màu nâu bền: củ

nâu (D cirrhosa Lour.), từ ngược mùa (D intempestiva Prain & Burk.),…[5], [7]

- Thân rễ một số loài có độc được sử dụng để diệt chấy rận, tẩm mũi tên, duốc cá

như: Củ nần trắng (D hispida Denst.), Củ mài gừng (D zingiberensis C H

Wright.),…[5], [7]

1.1.3.2 Trong y học

Một số loài dùng để chiết xuất diosgenin từ thân rễ Ngoài ra, nhiều loài Dioscorea

được sử dụng làm thuốc [7], [24]:

- Khoai trời (D bulbifera L.): dái củ dùng làm thuốc trị ho gà, thân rễ dùng điều

trị bướu giáp, lao hạch bạch huyết, loét dạ dày, chảy máu cam,…

- Củ nâu (D cirrhosa Lour.): dùng làm thuốc chữa xích bạch đới, băng huyết, ỉa

chảy và lỵ

- Khoai rạng (D glabra Roxb.): chữa ăn uống kém, gầy gò, đái tháo, di mộng tinh

- Củ nần trắng (D hispida Denst.): củ giã đắp trị nhọt độc, đòn ngã bị thương;

nước sắc thân rễ làm thuốc lợi tiểu hoặc thấp khớp mạn tính, củ ăn sống kịp thời ngay sau khi bị rắn hổ mang cắn có thể giúp ngăn ngừa các rối loạn trong cơ thể

- Củ mài (D persimilis Prain & Burk.): thuốc bổ ngũ tạng, chữa tỳ vị hư nhược,

ăn uống kém tiêu, tiêu chảy lâu ngày không khỏi, phế hư hen, tiểu đường, di tinh

Phytoestrogens trong các loài Dioscorea có tác dụng kháng độc tố, làm chậm quá

trình lão hóa, tăng cường sức khỏe toàn diện đặc biệt là phụ nữ Gần đây, thân rễ các

loài Dioscorea được xác định có tác dụng điều chỉnh đáp ứng miễn dịch, kháng viêm,

chống loãng xương Hơn nữa, tác dụng chống oxy hóa của dioscorin – một protein dự

trữ trong thân rễ các loài thuộc chi Dioscorea cũng được nghiên cứu rộng rãi Dioscin trong thân rễ Dioscorea batatas có ảnh hưởng đến chức năng dạ dày ruột trên chuột thí

nghiệm, làm giảm nồng độ glucose huyết thanh, lipid trung tính và cholesterol tổng [44]

1.2 Tổng quan về Diosgenin

1.2.1 Công thức cấu tạo, tính chất lý-hóa

Công thức cấu tạo

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của diosgenin

o Acid sulfuric đậm đặc hòa tan các saponin và cho màu thay đổi từ vàng,

đỏ, lơ xanh lá hay lơ tím (phản ứng Salkowski)

o Sapogenin hòa tan vào 1ml anhydrid acetic, thêm 1 giọt H2SO4 đặc cho màu xanh lá (phản ứng Liebermann Bouchardat)

- Làm giảm thiểu tổn thương tim mạch do thiếu máu cục bộ trong mô hình sử dụng

tế bào H9c2 có nguồn gốc từ tim chuột Tác dụng này được đánh giá thông qua cải thiện khả năng sống sót của tế bào và xét nghiệm giải phóng lactat dehydrogenase (LDH) Đặc biệt, dioscin – dạng glycosid của diosgenin được phát hiện có ảnh hưởng trên quá trình phát triển của các khối u phổi, cũng như bảo vệ tim mạch thông qua tăng khả năng thích ứng với tình trạng thiếu máu cục bộ [43] Cải thiện tình trạng nhồi máu cơ tim [37]

- Chống kết tập tiểu cầu, ngăn ngừa huyết khối, kéo dài thời gian thromboplastin (APTT), thời gian thrombin (TT), thời gian prothrombin (PTT), do đó có tác dụng trong điều trị các bệnh lý mạch vành, đau thắt ngực [36]

- Một dẫn chất của diosgenin có tác dụng ngăn ngừa huyết khối động mạch, tĩnh mạch tương đương aspirin và còn giảm tổn thương niêm mạc dạ dày, nguy cơ chảy máu trên chuột so với aspirin [60]

- Duy trì ổn định mức cholesterol máu, kiểm soát chuyển hóa lipid và cải thiện sự hấp thu glucose và cholesterol ở ruột trong mô hình thí nghiệm trên chuột [47]

- Chống viêm ở chuột, ngăn ngừa mất xương tương tự estrogen do đó được sử dụng cho phụ nữ mãn kinh để làm chậm tiến triển của loãng xương [38]

- Ngăn chăn việc sản sinh quá mức NO, PGE2, ức chế biểu hiện của iNOS,

MMP-3, MMP-13 và COX-2 nên rất có tiềm năng trong điều trị viêm khớp [56]

- Trong các tế bào ung thư vú Her2–overexpressing người ta thấy có sự tăng lên

rõ rệt của Fatty acid synthetase (FAS), diosgenin có tác dụng ngăn chặn sự xuất hiện của FAS trong các tế bào ung thư vú, ức chế sự tăng sinh và gây độc tế bào ung thư Her2–overexpressing Ngoài ra, diosgenin còn ức chế quá trình phosphoryl hóa Akt, mTOR, JNK Diosgenin có khả năng ức chế sự tồn tại ,phát triển và gia tăng của các tế bào ung thư vú [31], [46] Tác dụng ức chế ung thư vú và ưng thư vú di căn xa trên 3 dòng tế bào MDA-MB-231, T47D, MCF7 và cho thấy không có hoặc ít độc tính trên các cơ quan quan trọng của chuột [29] Kết hợp methotrexat với diosgenin có thể giúp tăng cường tác dụng ức chế khối u tăng sinh trên các tế bào ung thư kháng vận chuyển methotrexat [30]

- Làm giảm đáng kể nồng độ glucose huyết thanh, tăng nồng độ insulin và tính nhạy cảm insulin thông qua làm giảm tress lưới nội chất, tress oxy hóa gây tổn thương tuyến tụy Diosgenin có tác dụng làm giảm nồng độ acid béo tự do, TNF-α, IL-6, tăng

khối lượng mô mỡ và mức độ leptin Diosgenin hoạt động như một chất chủ vận của PPARγ – cơ quan chịu trách nhiệm sản xuất các tế bào mô mỡ nhạy cảm insulin, chất điều hòa trung tâm chuyển hóa insulin và glucose nên cải thiện tình trạng kháng insulin [54]

- Tác dụng trên các rối loạn chuyển hóa: diosgenin làm giảm đáng kể nồng độ glucose máu, ngăn chặn tích lũy, biệt hóa, mở rộng mô mỡ và tình trạng tăng nồng độ

TG, FFAs, TC trên chuột có chế độ ăn giàu chất béo [49]

1.2.3 Các loài Dioscorea dùng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất diosgenin

Khoảng 90% các dẫn chất steroid làm thuốc được sản xuất đều đi từ diosgenin

Mặc dù diosgenin có trong một số chi Trillium L (Melanthiaceae), Costus L (Costaceae), Tacca Forst & Forst f (Taccaceae), nhưng chỉ có chi Dioscorea mới có

giá trị thực tế [19]

Theo số liệu của Barua và cộng sự năm 1954, 1956 có trên 50 loài Dioscorea có

chứa diosgenin [51] Những loài Dioscorea có hàm lượng diosgenin đáng kể thường có

thân quấn ngược chiều kim đồng hồ [19] Phần lớn diosgenin được sản xuất trên thế giới

từ các loài Trung Mỹ, chủ yếu là: D floribunda M., D composita Hemsl., cả hai đều mọc hoang ở bản địa [51] Trong thân rễ của D floribunda M., D composita Hemsl

thành phần diosgenin và yamogenin chiếm gần 90% glycosid toàn phần, cả hai đều là

những tiền chất steroid có giá trị D deltoidea Wall ex Griseb chứa diosgenin ở trạng

thái tinh khiết nhất nên có giá trị cao trên thị trường steroid [55]

- D nipponica Makino và D zingiberensis C.H Wright chứa diosgenin và được

trồng nhiều ở Trung Quốc, nước sản xuất diosgenin nhiều nhất hiện nay [28]

Bảng 1.1 Các loài Dioscorea quan trọng để sản xuất diosgenin trong công nghiệp

Mexico

1 D dissimulans (hàm lượng diosgenin 2%)

2 D membranacea (hàm lượng diosgenin 2-2,3%)

3 D collettii (hàm lượng diosgenin 2,5-4,4%)

4 D zingiberensis (hàm lượng diosgenin 1,4-2,4%)

Về mối liên quan giữa hình thái thực vật và thành phần hóa học, các loài

Dioscorea có hàm lượng saponin steroid đáng kể ở Việt Nam ngoài có dây leo quấn trái

đều có những cặp gai cong ở cuống lá [12]

Cũng trong thời gian này, Viện Dược liệu đã di thực 3 loài Dioscorea vào Việt Nam: D composita Hemsl., D floribunda M., D deltoidea Wall ex Griseb.,

đã xác định điều kiện trồng và chăm sóc phù hợp với 3 loài trên [25], [26] Tuy

nhiên, sapogenin thu được từ D composita Hemsl.và D floribunda M đều có tạp pentogenin (hàm lượng pentogenin trong D composita Hemsl có thể lên tới 35%,

từ 1-5% đối với D floribunda M.) nghiên cứu xử lý loại tạp pentogenin nhưng chưa

thành công Nghiên cứu bán tổng hợp 16-DPA từ hỗn hợp diosgenin và pentogenin

chiết từ D composita Hemsl.và D floribunda M cho thấy hiệu suất chỉ bằng ½

hiệu suất khi sử dụng diosgenin hàm lượng trên 90%

Các nhà khoa học tại Viện Dược liệu đã xây dựng quy trình chiết diosgenin từ dược

liệu, áp dụng để chiết diosgenin từ D floribunda M trên quy mô phòng thí nghiệm và

quy mô công nghiệp Từ diosgenin chiết được đã tổng hợp 16-DPA và các dẫn chất steroid [26]

- Năm 1987, Nguyễn Bá Hoạt và cộng sự đã tiến hành khảo sát, đánh giá nguồn nguyên liệu cung cấp diosgenin ở Việt Nam Kết quả thu được tương tự những nghiên cứu

trước đó, một số loài thuộc chi Dioscorea L phân bố tại Việt Nam có hàm lượng diosgenin khá cao: D zingiberensis C.H Wright (1,4-2,4%), D collettii Hook f

(2,5%) [13]

- Năm1999, Nguyễn Minh Khởi, Lê Đình Bích đã xác định hàm lượng diosgenin trong

một số loài thuộc chi Dioscorea L bằng phương pháp sắc ký khí [14]

Bảng 1.2 Hàm lượng diosgenin trong một số loài Dioscorea [14]

Những năm gần đây, tiếp tục có nhiều nghiên cứu về hàm lượng diosgenin trong

các loài thuộc chi Dioscorea L.:

- Năm 2011, Đoàn Phương Hạnh đã tiến hành khảo sát hàm lượng diosgenin trong 4 mẫu nần nghệ ở Mường Tè (Lai Châu), Tân Lạc (Hòa Bình), Ngổ Luông (Hòa Bình), Mộc Châu (Sơn La) với hàm lượng diosgenin lần lượt là 2,72%; 2,55%; 2,74%; 3,07% [8]

- Năm 2012, Nguyễn Thị Tuyết đã nghiên cứu và xác định hàm lượng diosgenin

trong cây nần đũa (Dioscorea poilanei Prain & Burk.) là 0,17% bằng phương

pháp HPTLC [22]

- Năm 2014, Nguyễn Hoàng Tuấn đã xác định hàm lượng diosgenin trong mẫu nần trắng thu hái ở Mộc Châu, Sơn La vào tháng 8 năm 2012 là 0,3016 ± 0,0051, độ tin cậy 95% bằng phương pháp HPLC [20]

- Năm 2015, Vương Minh Việt đã xác định hàm lượng diosgenin trong mẫu

nần vàng (Dioscorea collettii Hook.f.) là 1,91% bằng phương pháp sử dụng

dung môi siêu tới hạn [27]

- Năm 2016, Nguyễn Thị Tươi đã xác định hàm lượng diosgenin trong mẫu

Dioscorea sp (Rận trâu) ở Đà Nẵng là 0,8% [21].

1.2.4 Ứng dụng của diosgenin

Diosgenin là nguồn nguyên liệu để tổng hợp các thuốc chống viêm corticoid (prednisolon, hydrocortison, dexamethason, betamethason,…), bán tổng hợp 16-dehydro pregnenolon acetat (16-DPA) – chất trung gian để tổng hợp các dẫn chất steroid Khoảng 50-60% các dẫn chất steroid được sử dụng làm thuốc trên toàn cầu được sản xuất từ diosgenin Ước tính hàng năm ngành dược cần khoảng 10.000 tấn thân rễ

Dioscorea để sản xuất diosgenin [35], [48]

Trong số hàng trăm saponin steroid được biết cho đến nay, thực tế cũng chỉ 10 chất có giá trị kinh tế lớn vì hai lý do:

- Có nguồn nguyên liệu tự nhiên dồi dào hoặc trồng trọt dễ có năng suất cao

- Hệ thống Spiroketal trong cấu trúc của chúng dễ dàng bị phá để cho ra hợp chất trung gian là dehydro pregnenolon acetat (DPA) là khung cơ bản để tổng hợp các thuốc steroid

Diosgenin là chất có ưu thế nhất về 2 phương diện trên [6]

1.2.5 Các phương pháp định lượng diosgenin

(i) Phương pháp cân: Bột dược liệu được thủy phân bằng acid, chiết bằng dung

môi hữu cơ sau đó bốc hơi dung môi, sấy, cân [18]

(ii) Phương pháp đo quang: Bột dược liệu được thủy phân bằng acid, chiết bằng

dung môi hữu cơ sau đó tiến hành sắc kí lớp mỏng để xác minh diosgenin Diosgenin được chiết bằng chloroform, hiện màu FeCl3 và H3PO4 (10:1), đo quang tại bước sóng

485nm [18]

(iii) Phương pháp sắc ký khí: Bột dược liệu được ủ men, thủy phân, trung tính

hóa, sấy khô, hòa tan trong dung môi với chất chuẩn nội cholesterol rồi phân tích bằng

máy sắc ký khí [14]

(iv) Phương pháp HPLC: Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi

hữu cơ, bốc hơi dung môi, hòa tan trong methanol và tiến hành phân tích trên máy HPLC

[52]

(v) Phương pháp HPTLC: Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi

hữu cơ, bốc hơi dung môi, hòa tan trong chloroform, chấm sắc kí mẫu thử và dãy diosgenin đối chiếu Sau đó đo mật độ quang của vết sắc ký bằng Densitometer [1], [31]

Trong 4 phương pháp trên, phương pháp cân đòi hỏi lượng mẫu nhiều và gặp sai

số lớn trong quá trình chiết tách mẫu Phương pháp đo quang phụ thuộc vào độ bền màu của diosgenin với hỗn hợp thuốc thử Phương pháp sắc ký khí có quá trình chuẩn bị mẫu phức tạp Phương pháp HPTLC kết hợp với máy Densitometer nhanh, dễ thực hiện và cho kết quả khá chính xác Phương pháp HPLC được sử dụng phổ biến hiện nay

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu nghiên cứu được thu vào tháng 9/2018, tháng 4, 5/2019 tại xã Tả Phìn, huyện

Sa Pa, tỉnh Lào Cai

Một phần thân, lá, thân rễ và rễ được bảo quản trong cồn 60° để nghiên cứu đặc điểm vi phẫu Tiêu bản được lưu giữ tại Phòng tiêu bản, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội với số hiệu mẫu: HNIP/18561/19 (mẫu mang quả); HNIP/18562/19 (mẫu mang hoa đực); HNIP/18563/19, HNIP/18564/19 (mẫu mang hoa cái)

Phần thân rễ còn lại được cắt bỏ rễ xơ, rửa sạch, sấy khô ở 60°C, xay thành bột, rây qua rây 700 µm; 250 µm, bảo quản nơi khô thoáng Bột có kích thước trong khoảng 250-700 µm đem tiến hành bán định lượng

2.1.2 Thiết bị và hóa chất

2.1.2.1 Thiết bị máy móc và dụng cụ thí nghiệm

- Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu nâng cao CAMAG bao gồm: bộ máy phun mẫu bán tự động (dùng cho hệ thống sắc ký bản mỏng) Camag Limonat 5; máy triển khai sắc ký bản mỏng Camag ADC 2; máy chụp ảnh bản mỏng và phân tích dữ liệu Camag TLC Visualizer, 2 phần mềm winCATS và Videoscan

- Bộ dụng cụ chiết hồi lưu

- Bình triển khai sắc ký

- Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 (Merck)

- Máy xác định hàm ẩm

- Bể siêu âm WISD

- Cân kỹ thuật Sartorius (TE3102S)

- Cân phân tích Shimadzu (AY220)

2.1.2.2 Hóa chất

- Diosgenin chuẩn được cung cấp bởi hãng Biopurify Phytochemicals Ltd độ tinh khiết99,39%

- Aid sulfuric, methanol công nghiệp, methnol Merck

- Các thuốc thử dùng trong các phản ứng định tính: thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendroff, Diazo, Ninhydrin, natri carbonat, natri hydroxyd, acid clohydric,…

- Hóa chất dùng trong làm vi phẫu: javen, cloral hydrat, acid acetic, xanh methylen, đỏ son phèn

- Dung môi: Cloroform, aceton, nước cất, methanol, hexan, ethyl acetat, butanol

n Thuốc thử hiện màu vết sắc ký: vanilin 1% trong acid sulfuric đặc

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

- Mô tả đặc điểm thực vật, so sánh với các tài liệu về thực vật, khóa phân loại, tiêu bản để xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

- Mô tả đặc điểm vi học:

o Vi phẫu: lá, thân, thân rễ, rễ

o Soi bột: thân rễ

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

- Định tính sơ bộ các nhóm chất có trong thân rễ mẫu nghiên cứu

- Chiết xuất, định tính diosgenin bằng sắc ký lớp mỏng

- Thẩm định phương pháp bán định lượng diosgenin trong bột thân rễ mẫu nghiên cứu bằng HPTLC khi áp dụng để bán định lượng diosgenin trong dịch chiết dược liệu: đánh giá độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, tính tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng của phương pháp bán định lượng diosgenin trong bột dược liệu bằng HPTLC

- Bán định lượng diosgenin sau chiết xuất bằng HPTLC theo phương pháp đã thẩm định

- Xử lý thống kê kết quả

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật:

o Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật tại thực địa và chụp ảnh theo phương pháp mô tả phân tích

o Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây khô

- Nghiên cứu đặc điểm vi học:

o Đặc điểm vi phẫu: vi phẫu được cắt, tẩy và nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép, quan sát dưới kính hiển vi, xác định đặc điểm vi phẫu và chụp ảnh dưới kính hiển vi [17]

o Đặc điểm soi bột: thân rễ được rửa sạch, thái thành lát mỏng, sấy khô ở 60°C, xay thành bột mịn, lên tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi để xác định đặc điểm bột và chụp ảnh dưới kính hiển vi

- Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu:

o Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái, so sánh với các tài liệu về thực vật, các khóa phân loại, tiêu bản [2], [7], [16], [58] cùng với sự hỗ trợ của các chuyên gia phân loại thực vật để xác định tên khoa học

2.3.2 Nghiên cứu về hóa học

2.3.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất bằng phản ứng hóa học

Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ (chất béo, caroten, sterol, flavonoid, alcaloid, glycosid tim, coumarin, tanin, anthranoid, đường khử, acid hữa cơ, acid amin, polysaccarid, saponin) trong thân rễ mẫu nghiên cứu theo phương pháp thường quy ghi trong các tài liệu [6], [15]

2.3.2.2 Định tính diosgenin bằng sắc ký lớp mỏng, lựa chọn dung môi khai triển, phương pháp chiết xuất

(i) Định tính diosgenin bằng sắc ký lớp mỏng, lựa chọn dung môi khai triển

Nghiên cứu có tham khảo quy trình chiết xuất diosgenin trong chuyên luận

“Nần nghệ” - Dược Điển Việt Nam V [4]:

- Chuẩn bị bột dược liệu: Cân chính xác khoảng 1,5g bột dược liệu, hồi lưu

cách thủy 100°C trong 5h bằng 25 ml acid sulfuric 10% Lọc, rửa tủa bằng

nước cất đến khi dịch rửa trung tính Bột dược liệu thu được sấy đến khô ở 60°C

- Dung dịch thử: bột dược liệu đã chuẩn bị ở trên được chiết Soxhlet bằng 100

ml methanol Dịch chiết thu được đem cô đến cắn, hòa tan cắn bằng methanol trong bình định mức 50 ml, ly tâm dung dịch thu được ở tốc độ 13 rpm/5 phút,

lấy dịch trong phía trên để chấm sắc ký

- Dung dịch diosgenin chuẩn nồng độ 0.989 mg/ml: cân chính xác khoảng 9,95

mg diosgenin chuẩn độ tinh khiết 99,39%, hòa tan bằng methanol trong bình

định mức 10 ml

Sắc ký lớp mỏng:

o Bản mỏng Silica gel F254: hoạt hóa ở 110°C/30 phút

o Dung dịch chuẩn diosgenin, dung dịch thử

o Dung môi khai triển: khảo sát 2 hệ dung môi (thời gian bão hòa dung môi 15 phút)

Hệ 1: cloroform – aceton (95:5)

Hệ 2: cloroform – aceton – n-hexan (90:5:5)

o Quãng đường dung môi: 8 cm

Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl dung dịch chuẩn diosgenin 0,989

mg/ml, dung dịch thử Sau khi triển khai sắc ký lớp mỏng, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng, quan sát bản mỏng ở các bước sóng 366 nm, ánh sáng trắng Phun dung dịch vanilin 1%/acid sulfuric đặc (TT), sấy bản mỏng ở 105°C trong 3,5 phút sau đó quan sát lại tại các bước sóng ánh sáng trên, nhận xét kết quả và lựa chọn hệ dung môi phù hợp

(ii) Xác định hàm ẩm

Lấy khoảng 2g bột dược liệu, bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 110°C Trải đều bột dược liệu lên đĩa cân, đậy đĩa cân, bật máy chạy tự động và hiển thị kết quả Tiến hành 3 lần, lấy giá trị trung bình

(iii) Lựa chọn phương pháp chiết xuất diosgenin

- Chuẩn bị bột dược liệu (phần (i))

- Chiết xuất diosgenin:

(2)Chiết siêu âm bằng methanol: 30 phút/lần x 3 lần, thể tích methanol lần lượt là 50; 30; 20 ml

- Gộp dịch chiết, cô đến cắn, hòa tan cắn bằng methanol trong bình định mức 50

ml

- Triển khai sắc ký lớp mỏng dịch chiết siêu âm và dịch chiết Soxhlet, thể tích chấm 3 µl với hệ dung môi đã được lựa chọn, so sánh, nhận xét kết quả, lựa chọn phương pháp chiết xuất diosgenin phù hợp

Dung dịch thử thu được từ phương pháp chiết được lựa chọn kí hiệu là (T*)

2.3.2.3 Thẩm định phương pháp bán định lượng diosgenin trong dược liệu bằng HPTLC khi áp dụng để bán định lượng diosgenin trong bột thân rễ mẫu nghiên cứu

Điều kiện triển khai HPTLC:

o Bản mỏng: bản mỏng TLC Silica gel F254: hoạt hóa ở 110°C/30 phút, kích thước 20 x 9,8 cm

o Môi trường: nhiệt độ 24°C, độ ẩm tương đối 65%

o Đưa mẫu lên bản mỏng: mẫu được phun lên bản mỏng nhờ máy chấm mẫu Limonat 5 Vị trí chấm mẫu cách mép bản mỏng 1 cm, cách mép dung môi 0,8 cm, khoảng cách giữa 2 vết liên tiếp 0,35 cm, độ dài băng chấm 0,8 cm

o Hệ dung môi: đã lựa chọn ở trên, thể tích dung môi bão hòa 25 ml, thể tích dung môi khai triển 10 ml

o Thời gian bão hòa dung môi: 15 phút

o Quãng đường di chuyển pha động: 8 cm

o Thuốc thử hiện màu: vanillin 1% trong acid sulfuric đặc (TT), sấy hiện màu

- Khái niệm: Độ đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác

định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi các chất khác

có trong mẫu thử

- Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 mẫu sau:

1) Mẫu trắng: dung dịch MeOH

2) Mẫu thử (T*)

3) Mẫu chuẩn: dung dịch diosgenin nồng độ 0,989 mg/ml

Triển khai HPTLC, xử lý kết quả [23]

Phương pháp HPTLC được coi là có tính đặc hiệu hay chọn lọc đối với chất cần phân tích nếu:

(1) Sắc ký đồ của mẫu thử cho các vết chính có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị

Rf với các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn

(2) Sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện vết tương ứng với các vết chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn

(b) Độ thích hợp hệ thống

- Khái niệm: Độ thích hợp hệ thống là khái niệm chỉ sự tương thích giữa thiết bị,

dụng cụ điện tử, sự vận hành của hệ thống và mẫu phân tích Độ thích hợp của hệ thống cho biết hiệu năng của thiết bị HPTLC và hệ thống sắc ký trong ngày tiến hành thử nghiệm [11]

- Cách tiến hành: Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn diosgenin nồng độ 0,989 mg/ml,

thể tích 2 µl/vết, triển khai HPTLC, xử lý kết quả

- Đánh giá kết quả: Tính RSD của diện tích pic, Rf Giá trị RSD của diệc tích pic,

Rf giữa các lần tiêm mẫu (n>5) nên nhỏ hơn 2% [23]

(c) Khoảng tuyến tính

- Khái niệm: Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả kết quả phân

tích thu được tỷ lệ với lượng chất phân tích (trong khoảng nhất định) có trong mẫu[11]

- Cách tiến hành: Tiêm chính xác lần lượt các thể tích 1; 2; 4; 6; 8 µl dung dịch

chuẩn diosgenin nồng độ 0,989 mg/ml, triển khai HPTLC, xử lý kết quả Xây dựng phương trình biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa lượng diosgenin chuẩn trên vết và đáp ứng pic thu được trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu [23]

- Đánh giá kết quả: Dựa vào hệ số tương quan r của đường chuẩn để đánh giá độ

tuyến tính Thông thường với giá trị r > 0,9 có thể kết luận phương pháp có tương quan tuyến tính tốt [11]

(d) Độ lặp lại

Tiến hành khảo sát hàm lượng diosgenin trong 5 mẫu thử (T*) khác nhau, thể tích chấm 4 µl/vết Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua RSD giữa các giá trị hàm lượng diosgenin thu được

(e) Độ đúng

- Khái niệm: độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá

trị thực của mẫu đã biết

- Cách tiến hành: Độ đúng của phương pháp HPTLC đối với định lượng hoạt

chất trong dược liệu được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn

Chuẩn bị mẫu thử đã xác định hàm lượng diosgenin, 3 bình định mức 10 ml, thêm vào mỗi bình 4 ml dung dịch thử (T*), dung dịch chuẩn diosgenin nồng độ 0,989 mg/ml với thể tích lần lượt là 1,5; 2,5; 4 ml, bổ sung methanol đến vạch Triển khai HPTLC với 3 dung dịch đã thêm chuẩn ở trên, thể tích chấm 5 µl/vết Xác định tỷ lệ thu hồi hoạt chất của phương pháp theo công thức sau:

Tỷ lệ thu hồi (%) = tổng lượng tìm lại được

- Đánh giá kết quả: đánh giá độ đúng của phương pháp dựa vào tỷ lệ thu hồi và

giá trị RSD của tỷ lệ thu hồi Không có giới hạn cụ thể mà độ đúng của một phương pháp phải đạt được, giới hạn độ đúng của phương pháp còn phụ thuộc vào tỷ lệ % và/hoặc khối lượng chất cần phân tích có trong mẫu thử Nói chung, đối với phương pháp định lượng hàm lượng dược chất trong dược liệu, độ đúng của phương pháp có thể được chấp nhận với khoảng sai số rộng hơn do nền mẫu lớn và quá trình chiết tách phức tạp, giới hạn RSD có thể dao động từ ± 2 đến ± 10% hoặc hơn, tuy nhiên cần có biện giải về giới hạn này [23]

(ii) Bán định lượng diosgenin bằng HPTLC

Quy trình bán định lượng diosgenin trong dược liệu bằng HPTLC bao gồm những bước sau:

Bước 1: Chuẩn bị dung dịch thử (T*) (mục 2.3.2.2)

Bước 2: Chuẩn bị dung dịch chuẩn diosgenin nồng độ 0.989 mg/ml

Bước 3: Triển khai HPTLC, xử lý kết quả

Bước 4: Xây dựng đường chuẩn bán định lượng dựa trên Spic và lượng diosgenin tương ứng Xác định lượng diosgenin trên vết mẫu thử từ đó tính ra hàm lượng diosgenin trong dược liệu theo công thức:

%𝑑𝑖𝑜𝑠𝑔𝑒𝑛𝑖𝑛 = 𝑥 𝑘 0,1

𝑉 𝑚 (100 − 𝑎)/100 100

Trong đó: x: lượng diosgenin trên vết thử (µg)

V: thể tích chấm mẫu thử (µl) k: Độ pha loãng

m : khối lượng dược liệu (g) a: hàm ẩm của bột dược liệu (%)

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật

mm Bao hoa 6, hình trứng, khi non màu xanh, khi già có màu vàng, dính nhau ở gốc, trên có 6 thùy rời nhau, xếp 2 vòng; 3 thùy vòng ngoài thường lớn hơn (1,1-1.9 mm x 1,1-1,5 mm), 3 thùy vòng trong nhỏ hơn (1,1-1,9 mm x 0,9-1,1 mm Nhị 6: ba nhị hữu thụ, chỉ nhị 0,4-0,6 mm, rời nhau, đính trên ống bao hoa, trung đới khi hoa nở choãi ra thành hình chữ T, dài 0,16-0,26 mm; bao phấn hình thuôn, 2 ô, kích thước 0,35-0,46 x 0,21-0,27 mm, đính lưng, mở bằng khe dọc; ba nhị bất thụ dạng sợi dài 0,28-0,40 mm Bầu nhụy tiêu biến; núm nhụy hình đầu Cụm hoa cái dạng bông, đơn độc, chiều dài thay đổi từ 4-13 cm Hai lá bắc ôm lấy hoa, gốc lá bắc màu tím đỏ, lá bắc ngoài hình trứng rộng, kích thước (1,9 x 1,1 mm), lá bắc trong hình trứng, kích thước nhỏ hơn (1,7

x 0,9 mm) Hoa cái: bao hoa 6 mảnh hình trứng, màu vàng, xếp thành 2 vòng, 3 mảnh vòng ngoài thường lớn hơn (1,2-1,5 x 1,1-1,3 mm), 3 mảnh vòng trong nhỏ hơn (1,1-1,5 x 1-1,2 mm); bầu dưới, 3 ô, mỗi ô chứa 2 noãn, đính noãn trung trụ; vòi nhụy 3, rời nhau ở dưới dài 0,67-0,69 mm, 3 núm nhụy xẻ 2 nông; 6 nhị lép tiêu biến ở mức độ khác nhau, 3 nhị ngoài vẫn còn bao phấn, 3 nhị trong tiêu biến thành dạng sợi, dài 0,39-0,4 mm Quả nang, kích thước 2,1-2,3 x 1,6-1,9 cm, cong gập lại, 3 cạnh dạng cánh rộng 0,8-0,9 cm, mở theo khe dọc từ đỉnh, khi non có màu xanh, khi khô có màu nâu sáng Hạt nằm gần giữa quả nang, có cánh dạng màng màu trắng bao xung quanh

Hình 3.1: Hình ảnh đặc điểm cơ quan sinh dưỡng của cây

A, B Thân khí sinh sinh mang lá, C Thân rễ nằm ngang mang rễ chùm, D Mặt trước

và mặt sau lá, E Cuống lá và gân lá mang lông, F Mép lá

Hình 3.2: Hình ảnh các đặc điểm của hoa đực

A,B Cụm hoa đực, C.Lá bắc ngoài - trong, D Hai hoa mọc cùng nhau, E.Hoa đực chụp từ trên xuống, F.Hoa đực chụp từ dưới lên, G Nhị hữu thụ, H Bao

phấn nứt dọc, I Đầu nhụy

Hình 3.3: Hình ảnh các đặc điểm của hoa cái

A,B Cụm hoa cái, C Lá bắc ngoài-trong, D, E Hoa cái chụp ngang, F Hoa cái

chụp từ trên xuống, G Bầu cắt ngang, H.Vòi nhụy, I Núm hụy

Hình 3.4: Hình ảnh các đặc điểm của quả và hạt

A Cụm hoa cái mang quả non; B.Chùm quả trưởng thành; C Chùm quả già, D

Quả trưởng thành; E Quả trưởng thành cắt dọc; F Hạt

- Giám định tên khoa học

Dựa vào các tài liệu [7], [10], [32], [34], [53], [61], [62], [63] mẫu cây nghiên

cứu được xác định có tên khoa học là Dioscorea collettii var hypoglauca (Palibin) C

T.Ting

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu

3.1.2.1.Đặc điểm vi phẫu lá

Vi phẫu lá có phần gân lá nổi hai mặt, mặt dưới nổi rõ hơn mặt trên Quan sát thấy các đặc điểm sau:

Phần gân lá: Từ dưới lên trên lần lượt là: Lông che chở (12) ngắn Biểu bì dưới (1) là

một lớp tế bào nhỏ hình chữ nhật xếp liên tục, kích thước khá đều nhau, bên ngoài phủ một lớp cutin mỏng Mô dày dưới (2) gồm 4-6 lớp tế bào tròn, thành dày, bắt màu đỏ

Mô mềm (3) là những tế bào kích thước lớn, thành mỏng, xếp lộn xộn Bó libe-gỗ gân giữa nằm trong vòng mô cứng (6) gồm những mạch gỗ to (4) xếp ở giữa, libe (5) tạo thành những đám nhỏ xếp thành vòng bao quanh các mạch gỗ Mô dày trên là 1-2 lớp

tế bào gần tròn, thành dày Trên cùng là biểu bì trên (8) gồm 1 lớp tế bào nhỏ, hình chữ nhật, kích thước khá đều nhau

Phần phiến lá: Biểu bì dưới (1) và biểu bì trên (8) giống phần gân lá Mô xốp (9) là các

tế bào kích thước lớn, xếp lộn xộn, để hở nhiều khoảng gian bào Bó gỗ (10) nằm rải rác trên mô mềm Mô mềm (3) gồm những tế bào gần tròn, xếp lộn xộn Mô giậu (11) là một hàng tế bào kích thước khá lớn nằm ngay sát và xếp vuông góc với biểu bì trên

Hình 3.5 Hình ảnh vi phẫu lá

A Phiến lá, B Gân lá

3.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu thân

Đi từ ngoài vào trong, ngoài cùng là lớp biểu bì (1) gồm một hàng tế bào hình gần tròn xếp đều đặn Mô dày (2) gồm những tế bào hình tròn, thành dày ở các góc của thân Mô mềm vỏ (3) gồm 6-8 lớp tế bào hình đa giác hoặc hình trứng dài nằm ngang xếp khá đều đặn thành từng hàng Nội bì (4) là một lớp tế bào hình trứng, kích thước không đều nhau, xếp thành vòng Trụ bì hóa vòng mô cứng (5) gồm 3-6 lớp tế bào hình trứng dài Các bó libe cấp I (6) xếp xen kẽ với bó gỗ cấp I (7) tạo thành bó libe-gỗ hình chữ V, với nhiều vòng libe-gỗ từ trong ra ngoài Phần giữa thân rỗng

Hình 3.6 Hình ảnh vi phẫu thân

1 Biểu bì, 2 Mô dày góc, 3 Mô mềm vỏ, 4 Nội bì, 5 Trụ bì hóa mô cứng, 6 Gỗ cấp

I, 7 Libe cấp I

3.1.2.3 Đặc điểm vi phẫu thân rễ

Đi từ ngoài vào trong vi phẫu thân rễ gồm có:

(1) Bần có 2 phần: phần ngoài gồm 5-7 lớp tế bào có kích thước lớn, sắp xếp một cách lộn xộn, dễ bị bong ra khỏi thân rễ, phần trong là những tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn thành vòng đồng tâm và dãy xuyên tâm

(2) Mô mềm vỏ gồm 8-10 dãy tế bào hình đa giác hoặc hình trứng dài nằm ngang, bắt màu đỏ nhạt, giữa các tế bào này có các tế bào nhày (3) mang tinh thể calci oxalat hình kim, sáng (4)

(5) Bó libe-gỗ: thường gặp các bó libe-gỗ có thiết diện tròn, đôi khi có những bó thiết diện dài, những bó này xếp lộn xộn trong mô mềm ruột

(6) Mô mềm ruột là các tế bào hình đa giác kích thước khá lớn xếp sát nhau gần như không có khoảng gian bào

Hình 3.7 Hình ảnh vi phẫu thân rễ

1 Bần, 2 Tế bào nhày, 3 Mô mềm vỏ, 4 Tinh thể calci oxalat, 5 Bó libe – gỗ, 6 Mô

mềm ruột

3.1.3 Đặc điểm bột thân rễ

Bột màu vàng, lốm đốm nâu, mùi thơm nhẹ Quan sát dưới kính hiển vi ta thấy:

rất nhiều hạt tinh bột (1) phần lớn là hình trứng, bóng, không rõ vân, ngoài ra còn có các hạt tinh bột hình tròn có rốn hình sao, hình trụ có rốn hạt chạy dọc hạt, các hạt tinh bột đứng rải rác hoặc thành đám, kích thước 5-30µm Tinh thể calci oxlat hình kim xếp thành đám (2) hoặc đứng riêng rẽ (3), bóng và sáng, dài khoảng 90-100 µm Các tế bào

mô mềm hình đa giác mang tinh bột (4) Sợi và bó sợi (5) Các mành mạch điểm (6) và

mảnh mang màu (7) (Hình 3.8)

Hình 3.8 Hình ảnh các đặc điểm bột thân rễ

1 Tinh bột, 2, 3 Tinh thể calci oxalat, 4 Mảnh mô mềm mang tinh bột, 5 Sợi, 6

Mảnh mạch điểm, 7 Mảnh mang màu

3.2 Kết quả nghiên cứu về hóa học

3.2.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất bằng phản ứng hóa học

Trong thân rễ Dioscorea collettii var hypoglauca sơ bộ có các nhóm chất sterol,

flavonoid, alcaloid, glycosid tim, coumarin, tanin, anthranoid, đường khử, acid amin, polysaccarid, saponin (Bảng 3.1)