Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của thân rễ cây nghệ trâu ( Curcuma SP.)

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THÙY DUNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN RỄ CÂY NGHỆ TRÂU CURCUMA SP... BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THÙ

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THÙY DUNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN RỄ

CÂY NGHỆ TRÂU (CURCUMA SP.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THÙY DUNG

Mã sinh viên: 1401102

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN RỄ

CÂY NGHỆ TRÂU (CURCUMA SP.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của các thầy cô, anh chị tại Bộ môn Thực Vật, gia đình và bạn bè

Đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới ThS Nghiêm Đức Trọng

- giảng viên Bộ môn Thực Vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy đã trực tiếp

hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin cảm ơn DS Phạm Thị Linh Giang, ThS Lê Thiên Kim cùng toàn thể các

thầy cô, các chị kỹ thuật viên Bộ môn Thực vật đã tạo điều kiện, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các bạn làm khóa luận, các em nghiên cứu khoa học tại Bộ môn Thực vật đã giúp đỡ, động viên tôi trong những ngày thực hiện đề tài này

Và cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình đã luôn ủng hộ,

và động viên tôi trong suốt 5 năm học đại học và suốt quãng thời gian làm khóa luận này Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

Sinh Viên

Ngô Thùy Dung

MỤC LỤC Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về họ Gừng (Zingiberaceae) 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật họ Gừng 2

1.1.3 Phân loại thực vật họ Gừng 2

1.2 Tổng quan về chi Nghệ (Curcuma L.) 5

1.2.1 Lịch sử về chi Curcuma L 5

1.2.2 Đặc điểm thực vật các loài thuộc chi Curcuma L 5

1.2.3 Thành phần hóa học có trong chi Curcuma L 7

1.2.4 Phân bố của các loài thuộc chi Curcuma L 10

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 15

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 16

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật 16

2.3.2 Phương pháp giám định tên khoa học 16

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm vi học 16

2.3.4 Phương pháp định tính bằng hóa học các nhóm chất hữu cơ 17

2.3.5 Phương pháp sắc kí lớp mỏng định tính curcumin có trong thân rễ Nghệ trâu 17

2.3.6 Phương pháp định lượng tinh dầu trong dược liệu 18

2.3.7 Xác định thành phần tinh dầu bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ 19

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Kết quả thực nghiệm 21

3.1.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây Nghệ trâu 21

3.1.2 Đặc điểm vi học của loài Nghệ trâu (Curcuma sp.) 24

3.1.3 Đặc điểm vi học bột thân rễ Nghệ trâu (Curcuma sp.) 27

3.1.4 Kết quả định tính các nhóm chất có trong thân rễ cây Nghệ trâu (Curcuma sp.) 27

3.1.5 Định tính curcumin bằng sắc kí lớp mỏng 31

3.1.6 Xác định hàm lượng tinh dầu trong thân rễ cây Nghệ trâu (Curcuma sp.)34 3.1.7 Thành phần tinh dầu thân rễ Nghệ trâu (Curcuma sp.) 34

3.2 Bàn luận 38

3.2.1 Về thực vật 38

3.2.2 Về thành phần hóa học 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên đầy đủ

VIS : Ánh sáng thường

DĐVN V : Dược điển Việt Nam V

GC-MS : Sắc ký khí kết hợp khối phổ (Gas chromatography – Mass spectrometry) SKLM : Sắc ký lớp mỏng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Hệ thống phân loại thực vật họ Gừng ở Việt Nam sắp xếp theo hệ thống

J.Kress et al (2002) 3

Bảng 1.2 Một số loài Nghệ đã được xác định cấu tử tinh dầu 9

Bảng 1.3 Các loài thuộc chi Curcuma L ở Việt Nam 10

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất có trong thân rễ cây Nghệ trâu (Curcuma sp.) 28

Bảng 3.2: Kết quả định tính curcumin các dịch chiết khác nhau bằng SKLM 32

Bảng 3.3 Kết quả hàm ẩm dược liệu 34

Bảng 3.4 Kết quả định lượng tinh dầu có trong thân rễ cây Nghệ trâu 34

Bảng 3.5 Thành phần tinh dầu thân rễ Nghệ trâu 35

Bảng 3.6 Công thức cấu tạo của các cấu tử chiếm tỷ lệ lớn trong tinh dầu thân rễ Nghệ trâu 37

Bảng 3.7 Bảng so sánh các đặc điểm thực vật của cây Nghệ trâu (Curcuma sp.)với loài Curcuma elata Roxb và Curcuma aromatica Salisb 38

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo 3 curcuminoids thường gặp 8

Hình 1.2 Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu theo DĐVN V 18

Hình 2.1 Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng của cây Nghệ trâu 22

Hình 2.2 Đặc điểm cơ quan sinh sản của cây Nghệ trâu 23

Hình 3.1 Đặc điểm vi phẫu thân rễ cây Nghệ trâu (Curcuma sp.) 25

Hình 3.2 Ảnh vi phẫu rễ của cây Nghệ trâu (Curcuma sp.) 26

Hình 3.3 Ảnh bột thân rễ cây Nghệ trâu (Curcuma sp.) 27

Hình 3.4 Hình ảnh bản mỏng sắc ký khai triển của các vết: Curcumin chuẩn (C), dịch chiết methanol (M), dịch chiết ethanol (E), dịch chiết aceton (A) quan sát ở các điều kiện khác nhau 31

Hình 3.5 Kết quả chồng phổ sắc ký của dung dịch chuẩn, 3 mẫu dịch chiết bằng 3 dung môi methanol (M), ethanol (E), aceton (A) 33

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chi Nghệ (Curcuma L.) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) là một chi lớn với hơn 120

loài Việt Nam với sự đa dạng về khí hậu và địa hình đã tạo nên sự phong phú đa dạng về tài nguyên cây thuốc, đặc biệt với nền khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm tạo điều kiện sinh

trưởng thuận lợi với đa số các loài thuộc chi Curcuma L Ở Việt Nam, hiện nay đã biết được 29 loài thuộc chi Curcuma [2], [26], [27] Trong đó, một số loài nghệ được sử dụng

làm thuốc trong các bài thuốc y học dân gian và y học hiện đại, một số loài được sử dụng

để cất tinh dầu, làm gia vị trong thực phẩm Các thành phần chính tạo nên tác dụng của đa

số các loài nghệ là nhóm chất curcuminoids và tinh dầu nghệ Ngoài nhóm chất curcuminoids đang được khai thác và có giá trị ứng dụng cao trong đời sống thì tinh dầu của các loài này cũng có giá trị cao, và được ứng dụng trong mỹ phẩm, dược phẩm, y học Hàm lượng tinh dầu ở các bộ phận dùng, các loài nghệ, khu vực thu hái, thời điểm thu hái

khác nhau là khác nhau Hiện nay, cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.) là loài được biết đến

và được nghiên cứu nhiều nhất trong dân gian Tuy nhiên, bên cạnh Nghệ vàng có nhiều loài còn chưa được nghiên cứu và khai thác sử dụng

Qua khảo sát thực địa, chúng tôi phát hiện tại huyện Hòa An tỉnh Cao Bằng, người dân trồng và sử dụng một loài Nghệ có tên thường gọi là Nghệ trâu để làm thuốc

hạ mỡ máu với đặc điểm nhận dạng là củ rất to và nặng, nổi lên trên mặt đất Nhằm bước đầu mô tả các đặc điểm thực vật để định danh và nghiên cứu các thành phần hóa học có trong thân rễ cây Nghệ trâu để định hướng khai thác, kiểm nghiệm và sử dụng dược liệu này tại Việt Nam làm gia tăng giá trị sử dụng của dược liệu, chúng tôi tiến

hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của

thân rễ cây Nghệ trâu (Curcuma sp.)” với các mục tiêu sau:

- Mô tả các đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học cây Nghệ trâu, đặc điểm

vi phẫu thân rễ, rễ và đặc điểm bột thân rễ của mẫu nghiên cứu

- Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ có trong thân rễ cây Nghệ trâu thông qua phản ứng hóa học và định tính curcumin bằng SKLM

- Xác định hàm lượng và xác định thành phần cấu tử trong tinh dầu thân rễ Nghệ trâu bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS)

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về họ Gừng (Zingiberaceae)

1.1.2 Đặc điểm thực vật họ Gừng

Cây cỏ sống lâu năm Thân rễ khỏe, nạc, có khi phồng lên như củ Thân khí sinh không có hay mọc rất cao, do các bẹ lá ôm nhau tạo thành Lá đơn nguyên, xếp thành hai dãy song song Bẹ lá kéo dài thành lưỡi nhỏ Phiến lá có gân song song Cụm hoa dạng bông, chùm, mọc từ gốc (thân rễ) hay trên ngọn (trên thân khí sinh) Hoa có màu, lớn, dễ nhàu nát, đối xứng hai bên, lưỡng tính Đài 3, dính nhau tạo thành ống, trên chia

3 thùy Tràng dính nhau tạo thành ống, trên chia 3 thùy, thùy giữa thường lớn hơn 2 thùy bên Nhị 1, bao phấn 2 ô, chỉ nhị nạc, hình lòng máng, 3 nhị thoái hóa dính nhau tạo thành cánh môi lớn, màu sặc sỡ, 2 nhị còn lại tiêu giảm ở các mức độ khác nhau, có khi lớn như cánh hoa, hay thành dạng dùi ở 2 bên gốc chỉ nhị hữu thụ, có khi tiêu giảm hoàn toàn Bộ nhụy 3 lá noãn, dính với nhau tạo thành bầu dưới, 3 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn, có khi chỉ còn 1 ô Vòi nhụy hữu thụ 1, mang núm nhụy hình phễu xuyên qua khe giữa của 2 ô phấn và thò ra ngoài, 2 vòi còn lại không sinh sản, tiêu giảm ở gốc vòi hữu thụ Quả nang, ít khi là quả mọng Hạt có cả nội nhũ và ngoại nhũ Toàn cây thường có mùi đặc trưng [5]

1.1.3 Phân loại thực vật họ Gừng

Từ ngày 7-12 tháng 7 năm 2002, tại hội nghị chuyên đề lần III về họ Zingiberaceae được tổ chức tại Thái Lan Dr.W.John Kress đã đề nghị một cách phân loại họ Gừng mới dựa vào phương pháp hình thái và phương pháp sinh học phân tử Cho đến nay đây được coi là hệ thống phân loại đầy đủ và tiên tiến nhất

Theo hệ thống phân loại này thì họ Gừng được xếp thành 4 phân họ chính là: Siphonochiloideae, Tamijoideae, Alpinioideae và Zingiberoideae với 53 chi và 6 tông [1]

Các chi trong họ Gừng ở Việt Nam được sắp xếp trong 2 phân họ và 3 tông như bảng 1.1 [1]

Bảng 1.1 Hệ thống phân loại thực vật họ Gừng ở Việt Nam sắp xếp theo hệ

thống J.Kress et al (2002)

Phân họ1: Alpinioideae Phân họ 2: Zingiberoideae

Tông 1: Alpinieae Tông 2: Zingiberoideae Tông 3: Gobbeae

2 Siliquamomum 10 Stahlianthus 19 Gagnepainia

Khóa định loài các chi của họ Gừng ở Việt Nam [1]

1A Nhị lép bên tiêu giảm hay dạng răng, dạng dùi, hiếm khi là dạng trứng hẹp (Phân

họ 1 Alpinioideae) (Tông 1 Alpinieae)

2A Cụm hoa trên ngọn thân có lá

3A Nhị lép bên tiêu giảm hay dạng răng, dạng dùi, quả hình cầu, bầu dục, hiếm

khi là hình thoi……… 1 Alpinia

3B Nhị lép bên hình trứng ngược hẹp, quả dạng quả cải 2 Siliquamomum

2B Cụm hoa mọc từ thân rễ, riêng với thân có lá

4A Hoa nhiều, xếp sít nhau trên trục cụm hoa, các lá bắc xếp lợp lên nhau

5A Lá bắc con hình trứng, mở đến gốc………3 Hornstedtia

5B Lá bắc con hình ống, không mở

6A Các hoa xếp theo vòng tròn đồng tâm……….4 Etlingera

6B Các hoa xếp dọc theo trục cụm hoa, cánh môi hình tròn, trứng hay

hình bầu dục………5 Amomum

4B Hoa ít, xếp thưa trên trục cụm hoa, các lá bắc không xếp lợp lên nhau

7A Lá bắc con hình ống, phần trên đài xẻ một bên……… 6 Geostackys

7B Lá bắc con mở đến gốc, phần trên đài xẻ thành 2-3 răng ngắn

8A Trục cụm hoa mảnh, dài, cong xuống, lá bắc bao 1 cụm nhỏ có 3-4

10A Nhị lép bên dạng cánh tràng dính với cánh môi, vòi nhụy được bao bởi

phần phụ trung đới của bao phấn kéo dài……… 9 Zingiber

10B Nhị lép bên dạng cánh tràng không dính với cánh môi, vòi nhụy không được bao bởi phần phụ trung đới của bao phấn kéo dài

11A Cụm hoa được bao bởi lá bắc hình chuông… 10 Stahlianthus

11B Cụm hoa không được bao bởi lá bắc hình chuông

12A Các lá bắc dính với nhau ở nửa dưới làm thành dạng

túi……….11 Curcuma

12B Các lá bắc không dính nhau ở nửa dưới và không thành dạng túi

13A Cụm hoa trên ngọn thân có lá

14A Lá bắc con hình ống………12 Hedyehium

14B Lá bắc con không hình ống, mở đến gốc hay tiêu giảm 15A Lá bắc hình mũi mác hẹp, bao một cụm nhỏ có 1-4 hoa, gốc 2 thùy tràng bên không dính với cánh

môi……… 13 Caulokaempferia

15B Lá bắc dạng thuyền chỉ bao 1 hoa, gốc 2 thùy tràng

dính với cánh môi……….14 Cautleya

13B Cụm hoa mọc ở bên hay giữa các lá

16A Các lá bắc xếp hai hàng 17A Cánh môi thường lõm hình túi, mép lượn song, đầu

không xẻ thùy………15 Boesenbergia

17B Cánh môi không lõm hình túi, mép thẳng, đầu xẻ

thành 2 thùy………16 Distichochlamys 16B Các lá bắc xếp xoắn………17 Kaempferia

9B Bầu 1 ô, noãn dính vách (Tông 3 Globbeae)

18A Cánh môi khía mép hay chia thùy, không có thùy giữa, cụm hoa trên

ngọn thân có lá……… 18 Globba

18B Cánh môi chia 3 thùy, thùy giữa nhỏ như chỉ, 2 thùy bên dạng cánh

hoa, cụm hoa mọc từ gốc thân……… 19 Gagnepainia

1.2 Tổng quan về chi Nghệ (Curcuma L.)

1.2.1 Lịch sử về chi Curcuma L

Chi Curcuma L được Linnaeus đưa vào khóa phân loại của mình năm 1753

[17] Tên chung có nguồn gốc từ tiếng Ả Rập là “Kurcum” có nghĩa là màu vàng, và

“Curcuma” là tên phiên dịch của Tiếng Latin Hai loài Nghệ đầu tiên được báo cáo

dưới tên là “Kua” và “Manjella Kua”, sau này được đổi tên là C zedoaria Rosc và

Bình [1], chi Curcuma L có khoảng 120 loài và phân bố khắp các vùng nhiệt đới và

cận nhiệt đới châu Á, châu Phi đặc biệt là ở Nam Á và Đông Nam Á Ở Việt Nam,

hiện nay đã thống kê được 29 loài Curcuma và phân bố khắp từ Bắc vào Nam [2],

[26], [27]

1.2.2 Đặc điểm thực vật các loài thuộc chi Curcuma L

Cây cỏ, cao từ khoảng 0,5-2m, rễ phần lớn dạng ống, thân rễ có nhánh, dày, nạc, toàn thân có mùi thơm Lá có phiến hình mác rộng hay thuôn, hiếm khi là hình dải hẹp, cuống lá thường dài, lưỡi ngắn Cụm hoa thường mọc từ thân rễ hoặc từ giữa các

bẹ lá, hoa thường xuất hiện sau khi có lá, đôi khi hoa xuất hiện cùng lá hay trước khi

có lá Các lá bắc dính với nhau nhiều hay ít ở phía dưới và làm thành dạng túi, phần

trên xòe ra, mỗi lá bắc chứa một cụm hoa nhỏ có 2-7 hoa, phía đầu các lá bắc có màu sắc khác nhau, các lá bắc con mở đến gốc Hoa có phần dưới dài hình ống hay chuông ngắn, trên xẻ sâu một bên, đầu xẻ thành 2-3 thùy dạng răng nhỏ, ống tràng dạng phễu hẹp, trên chia 3 thùy, các thùy gần bằng nhau hay thùy giữa hơi dài hơn so với 2 thùy bên , đầu dạng mũ, bộ nhị có chỉ nhị ngắn, rộng, bao phấn 2 ô, gốc ô bao phấn kéo dài xuống phía dưới thành dạng cựa hay không, phần phụ trung đới kéo dài lên thành mào hay không, cánh môi có phần giữa dày và mỏng hơn về 2 bên Bầu 3 ô

Cây ưa bóng, mọc dưới tán rừng ẩm, ven suối, ven nương rẫy, sinh trưởng tốt trên đất giàu dinh dưỡng, đất phù sa nhiều mùn ẩm, thoát nước, cây không chịu được úng [1]

Khóa định loại các loài chi Curcuma L ở Việt Nam [1]

1A Cụm hoa ở giữa các lá

2A Gốc bao phấn có cựa

3A Phiến lá dạng dài hay mũi mác hẹp, chiều dài hơn chiều rộng 10 lần hay hơn 4A Lá bắc bất thụ ở phía trên, màu hồng tím, lá bắc hữu thụ ở phía dưới màu

xanh lục, cánh môi màu tím……… C alismatifolia

4B Tất cả các lá bắc đều có màu tím hồng, cánh môi màu vàng ở giữa, không có

màu tím……….……….C sparganifolia

3B Phiến lá dạng trái xoan, bầu dục rộng hay dạng trứng, chiều dài hơn chiều rộng 1,3-3,5 lần

5A Mặt dưới phiến lá có lông

6A Cây cao đến 1m, phiến lá dài 30-60 cm, trung đới không kéo dài thành

8A Trung đới không kéo dài lên phía trên thành mào

9A Tất cả các lá bắc đều chứa hoa, màu xanh……… C harmandii

9B Có lá bắc chứa hoa, có lá bắc không chứa hoa, màu trắng-xanh hay

trắng-hồng……….……….C longa

8B Trung đới kéo dài lên phía trên tạo thành mào

10A Cây cao 0,6-1,1m, cuống cụm hoa dài đến 2cm………….C rhomba

10B Cây cao 20-40 cm

11A Cây cao đến 20 cm, cánh môi màu trắng, gân giữa màu

vàng……….C pierreana

11B Cây cao 35-40 cm, cánh môi màu vàng………….C stenochila

2B Gốc bao phấn không có cựa

12A Phiến lá dạng dải, chiều dài hơn chiều rộng 6-18 lần……… C gracillima

12B Phiến lá dạng trứng hay xoan, chiều dài hơn chiều rộng không quá 3-4

lần……… C parviflora

1B Cụm hoa mọc ở bên, riêng với thân có lá

13A Dọc hai bên gân giữa lá mặt trên có màu nâu đỏ

14A Lá không có cuống, thân rễ cắt ngang có màu xanh xám

15B Lá bắc chứa hoa dài 4-5cm, dạng trái xoan hay mũi mác, màu xanh

tái, mép màu đỏ……….C zedoaria

13B Dọc hai bên gân giữa lá mặt trên không có màu nâu đỏ

16A Cây cao đến 50cm, phiến lá dài 15-30cm

17A Cuống lá dài 12-15cm, thùy tràng dài 1,2-1,5cm, cánh môi hình bầu

dục, dài 10-11mm………C angustifolia

17B Cuống lá không có, thùy dài đến 8mm, cánh môi gần tròn, đường kính

6-8mm……….C trichosantha

16B Cây cao 1m hay hơn, phiến lá dài 30-100 cm

18A Lá bắc hữu thụ gần tròn, đường kính 5-6cm……….C elata 18B Lá bắc hữu thụ hình trái xoan, cỡ 4,5-5 x 2-2,5 cm… …C aromatica

1.2.3 Thành phần hóa học có trong chi Curcuma L

Trong khoảng 120 loài thuộc chi Curcuma L., chỉ có khoảng 43 loài đã được

nghiên cứu về thành phần hóa học Trong đó Curcuma longa L là loài được nghiên

cứu về thành phần hóa học nhiều nhất [28], [31]

Các thành phần thường có trong dịch chiết thân rễ các loài Curcuma là:

- Curcuminoids

Nhóm chất màu curcuminoids là nhóm chất tạo màu vàng trong thân rễ của các cây

thuộc chi Curcuma L mà điển hình là cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.) Curcuminoids

gồm 3 thành phần là curcumin, demetoxycurcumin và bisdemetoxycurcumin; trong đó curcumin là thành phần chính được nghiên cứu nhiều nhất [13]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo 3 curcuminoids thường gặp

- Tinh dầu

Tinh dầu nghệ có thể thu được từ lá, thân rễ bằng phương pháp cất kéo hơi

nước Thành phần các chất có trong tinh dầu các loài thuộc chi Curcuma L được xác

định bằng phương pháp sắc kí khí (GC), sắc ký khí – khối phổ (GC/MS) Cho đến nay

có 30 loài nghệ (Bảng 1.2) đã được xác định thành phần cấu tử trong tinh dầu [28]

Trong tinh dầu có một số thành phần như: aliphatic, monoterpen, sesquiterpen,

và các hợp chất chứa nhân thơm, trong đó nhóm monoterpen và sesquiterpen là 2 nhóm chất chính [31]

+) Thành phần monoterpen: 1,8-cineol, camphor, β-pinen, myrcen, camphen, pinen, isoborneol, linalool, isobornyl acetat,…

α-+) Thành phần sesquiterpen: β-elemen, germacron, caryophyllen, curcumin, curzerenon, curzeren, curdion,…

Thành phần tinh dầu khá là đa dạng và phức tạp, chủ yếu là các hợp chất sesquiterpen Các thành phần và hàm lượng trong tinh dầu là khác nhau giữa các loài, các bộ phận dùng, các dạng dùng (khô, tươi) Ngoài ra, hàm lượng tinh dầu còn khác nhau giữa các vùng trồng và thời điểm thu mẫu xử lý

Curcumin: R1 = R2= OCH3

Demethoxycurcumin: R1= H, R2= OCH3

Bisdemethoxycurcumin: R1=R2=H

Bảng 1.2 Một số loài Nghệ đã được xác định cấu tử tinh dầu

STT Tên khoa học STT Tên khoa học

1 Curcuma aeruginosa Roxb 16 Curcuma oligantha Trimen

2 Curcuma alismatifolia

Gagnep

17 Curcuma phaeocaulis

Valeton

3 Curcuma amada Roxb 18 Curcuma pierreana Gagnep

4 Curcuma angustifolia Roxb 19 Curcuma pseudomontana J

23 Curcuma rubescens Roxb

9 Curcuma haritha Mangaly &

M.Sabu

24 Curcuma sichuanensis

X.X.Chen

10 Curcuma harmandii Gagnep 25 Curcuma singulris Gagnep

11 Curcuma inodora Blatt 26 Curcuma sylvatica Valeton

N.Liu, X.B.Ye & Juan Chen

30 Curcuma zedoaria Roscoe

- Flavonoid

Trong thân rễ một số loài như C longa có quercetin, Curcuma zedoaria có naringenin, lá bắc trên của Nghệ từ cô (Curcuma alismatifolia) có anthocyamin [31]

- Alcaloid

Rễ cây Nghệ vàng (C longa) có anrantiamid, rễ của C wenyujin Y.H.Chen &

C.Ling có curcuminol [31]

- Glycosid tim

Theo đề tài khóa luận tốt nghiệp năm 2018 của DS Nguyễn Văn Hòa về loài

Curcuma zedoaroides A Chav & Tanee (Nghệ đắng) đã tìm thấy có glycosid tim

trong loài này [7]

- Các hợp chất hữu cơ khác

Ngoài ra, trong thân rễ các loài nghệ còn có chất màu, acid amin, chất béo, đường khử, glycosid và acid hữu cơ [9], [13], diphenylalkanoid, dẫn xuất phenylpropen, terpenoid, steroid,…[31]

1.2.4 Phân bố của các loài thuộc chi Curcuma L

Cho tới nay, chi Nghệ (Curcuma L.) có khoảng 120 loài phân bố ở vùng nhiệt đới

và cận nhiệt đới châu Á, đặc biệt là ở Nam và Đông Nam Á [1]

Theo tổng hợp của Lý Ngọc Sâm và cộng sự đến năm 2015: Ở Việt Nam, hiện có

27 loài, phân bố rải rác từ Bắc vào Nam [2], [10]

Tháng 3 năm 2017, tác giả Nguyễn Quốc Bình và cộng sự đã mô tả loài Curcuma singularis Gagnep bổ sung cho hệ thực vật Việt Nam [27]

Tháng 10 năm 2017, tác giả Lưu Hồng Trường cùng cộng sự đã mô tả và công bố

loài nghệ mới Curcuma cotuana Luu, Škorničk & H.Đ.Trần [26]

Như vậy cho đến nay có 29 loài thuộc chi Curcuma L đã được báo cáo tại

Việt Nam

Danh sách cụ thể 29 loài thuộc chi Curcuma L có mặt tại Việt Nam được trình

bày trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Các loài thuộc chi Curcuma L ở Việt Nam

STT Tên khoa học Tên Việt Nam Phân bố TLTK

1 C aeruginosa

Roxb

Nghệ ten đồng Mọc hoang ở Sơn

La Mộc Châu, Hà Giang, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Bình Phước, Thành phố Hồ Chí Minh

[1]

STT Tên khoa học Tên Việt Nam Phân bố TLTK

2 C angustifolia

Roxb

Nghệ lá hẹp Kon Tum (Đắk

Glei), Đắk Lắk (Ea Súp), Tây Ninh

[1], [2], [8]

Được trồng và mọc hoang nhiều nơi ở Việt Nam: Sơn La (Mộc Châu), Yên Bái (Văn Chấn), Cao Bằng (Nguyên Bình), Hà Nội (Ba

Vì, Từ Liêm), Ninh Bình (Cúc Phương), Lâm Đồng (Bảo Lộc)

[1], [2], [8]

5 C cochinchinensis

Gagnep

Nghệ Nam Bộ Lạng Sơn, Quảng

Trị (Hải Lăng), Kon Tum (Đắk Glei), Gia Lai (KBang), Đắk Lắk, Bà Rịa- Vũng Tàu

[1], [2], [8]

7 C elata Roxb Mì tinh rừng Thanh Hóa, Gia Lai

(Mang Yang), Lâm Đồng (Dran, Lang Bian)

[1], [2], [8]

8 C grasilima

Gagnep

STT Tên khoa học Tên Việt Nam Phân bố TLTK

Larsen & J Mood

Nghệ hoa vàng Kon Tum (Đắk

Glei, Sa Thầy), Lào

[1], [2]

STT Tên khoa học Tên Việt Nam Phân bố TLTK

Cai (Sa Pa), Thái Nguyên (Đại Từ), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Ninh Bình (Cúc Phương), Thanh Hóa (Bá Thước)

21 C thorelii Gagnep Nghệ thorel Sơn La (Mộc Châu),

Thừa Thiên Huế, Đắk Lắk, TP.Hồ Chí Minh

[1], [2], [8]

26 C zedoaria (Berg.)

Roscoe

Nghệ đen, nga truật, bồng nga truật, ngải tím

Mọc hoang dại và được trồng ở nhiều nơi ở Việt Nam

[24]

28 C alismatifolia

Gagnep

Nghệ lá từ cô Quảng Ninh, Kom

Tum, Tây Ninh, TP

[1], [2], [8]

STT Tên khoa học Tên Việt Nam Phân bố TLTK

Hồ Chí Minh, An Giang

29 C sparganifolia

Gagnep

Nghệ lá bắc tim lang Miền Nam Việt

Nam, Thái Lan, Campuchia

[1]

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất (lá, thân giả, cụm hoa) và phần dưới mặt đất (thân rễ) của cây Nghệ trâu được thu hái tại địa điểm lưu mẫu là xã Yên Ninh, huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên Tiêu bản thực vật được lưu giữ tại Phòng tiêu bản bộ môn Thực Vật - Trường Đại học Dược Hà Nội với mã số tiêu bản là

HNIP/18569/19 Phần mẫu trên mặt đất được thu hái vào tháng 4/2018, còn phần

thân rễ được thu hái vào tháng 3/2019 Sau khi thu hái một phần mẫu thân giả, lá, cụm hoa, thân rễ, được sấy đến khô để làm tiêu bản thực vật, một phần thân rễ, rễ được bảo quản trong ethanol 60% để làm vi phẫu Một phần thân rễ được cắt nhỏ và sấy ở 40oC đến khô, xay nhỏ thành bột thô và được bảo quản trong túi nilong kín để làm các phản ứng hóa học định tính và định lượng

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Hóa chất, dung môi

- Hóa chất cho vi phẫu: Nước javen, cloralhydrat 75%, acid acetic 5%, đỏ son phèn, xanh methylen 1%, glycerin, nước làm tiêu bản

- Định tính bằng phản ứng hóa học: nước cất, ethanol, các thuốc thử định tính

- Sắc kí lớp mỏng: methanol, ethanol, aceton, n-hexan, ethylacetat, cloroform, diclomethan, toluen, acid formic, bản mỏng silicagel đã được hoạt hóa, H2SO4 đặc, cồn

- Tất cả các hóa chất đạt tiêu chuẩn của DĐVN V

2.1.2.2 Dụng cụ, thiết bị, máy móc

- Dụng cụ:

+ Dụng cụ bằng thủy tinh: cốc có mỏ, phễu, bình gạn 250ml, pipet các loại, ống nghiệm, đũa thủy tinh, bình nón, bình khai triển sắc ký, bình phun thuốc thử hiện màu,…

+ Dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay microtome, dao lam, để làm vi phẫu

+ Các dụng cụ khác trong phòng thí nghiêm: cối, chày, bát sứ, máy xay,…

+ Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu theo DĐVN V

- Máy móc thiết bị:

+ Tủ sấy, bếp hồng ngoại, đèn cồn, máy siêu âm, máy ly tâm lạnh

+ Cân kĩ thuật, cân phân tích

+ Hệ thống chạy sắc ký: máy chấm sắc ký, máy sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) GCMS-QP2020 Shimadzu

+ Kính hiển vi Nikon Eclipse Ci kết nối camera Nikon DS-Fi2 và máy tính

+ Máy xác định hàm ẩm theo phương pháp sấy OHAUS MB25

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

- Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu và xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

- Mô tả các đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

- Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ có trong thân rễ cây Nghệ trâu bằng các phản ứng hóa học

- Định tính curcumin có trong dịch chiết thân rễ bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng

- Định lượng hàm lượng tinh dầu thân rễ bằng phương pháp cất kéo hơi nước và xác định thành phần cấu tử của tinh dầu có trong thân rễ cây Nghệ trâu bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật

Quan sát và mô tả mẫu cây thu được các đặc điểm về thực vật, hình dạng, kích thước, màu sắc và chụp ảnh trong điều kiện có ánh sáng tự nhiên

2.3.2 Phương pháp giám định tên khoa học

Giám định tên khoa học của cây dựa trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái, đặc điểm của bộ phận sinh sản, so sánh với các loài có đặc điểm hình thái gần giống nhất và đối chiếu với khóa phân loại thực vật, cùng với sự trợ giúp của các chuyên gia phân loại thực vật để xác định tên khoa học của loài

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm vi học

- Đặc điểm vi phẫu: mẫu dược liệu (thân rễ, rễ) được cắt, tẩy bằng nước javen, trung hòa nước javen bằng acid acetic, tẩy tinh bột bằng cloralhydrat 75%, nhuộm kép (xanh methylene và đỏ son phèn), lên tiêu bản và chụp ảnh bằng máy tính kết nối với kính hiển vi

- Thân rễ được cắt lát mỏng, phơi khô, xay nhỏ thành bột mịn Lên tiêu bản bột mịn để tìm các đặc điểm có trong bột thân rễ Nghệ trâu

2.3.4 Phương pháp định tính bằng hóa học các nhóm chất hữu cơ

Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ (tinh dầu, acid amin, acid hữu cơ, flavonoid, anthranoid, caroten, chất béo, courmarin, đường khử, alcaloid, glycosid tim, polysaccharid, saponin, sterol, tanin) có mặt trong thân rễ cây Nghệ trâu theo phương pháp thường quy ước ghi trong tài liệu “Thực tập dược liệu” [3], [4]

2.3.5 Phương pháp sắc kí lớp mỏng định tính curcumin có trong thân rễ Nghệ trâu

- Bản mỏng silicagel GF254 hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút ngay trước khi triển khai sắc ký

- Dung môi khai triển: tiến hành khảo sát với các hệ dung môi khai triển sau:

Hệ 7: Toluen : methanol : aceton : acid formic (9 : 0,4 : 0,6 : 0,1)

Sau khi khảo sát các hệ dung môi, chọn hệ dung môi tách được nhiều vết và các vết tách tốt nhất

Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp, tiến hành chấm dung dịch chuẩn và 3 dung dịch thử trên cùng một bản mỏng

Dung dịch thử: dịch chiết thân rễ trong methanol (kí hiệu là M), ethanol (kí hiệu

là E), aceton (kí hiệu là A)

Chiều dài đường đi của dung môi: 7cm

Thuốc thử hiện màu là dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol pha theo DĐVN V (sấy ở 110oC trong 5 phút)

- Phát hiện vết: Quan sát ở điều kiện VIS, UV254nm, UV366nm khi không phun thuốc thử

và VIS, UV366nm sau khi phun thuốc thử Chụp bản mỏng, phân tích sắc ký đồ và hình ảnh chồng phổ

2.3.6 Phương pháp định lượng tinh dầu trong dược liệu

- Định lượng tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước

Sử dụng bộ dụng cụ theo Dược điển Việt Nam V (hình 1.2)

Hình 1.2 Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu theo DĐVN V

- Lắp đặt dụng cụ và tiến hành bão hòa xylen đến khi thể tích xylen không thay đổi (thường là 60 phút)

- Cân chính xác khoảng 30 g dược liệu khô đã được xay thành bột thô

Sau khi bão hòa xylen trong 60 phút thì cho dược liệu khô vào và thêm nước đến ngập bột dược liệu khoảng 3cm

- Tiến hành cất tinh dầu đến khi lượng xylen và tinh dầu thu được ở bộ phận hứng không tăng lên nữa (thường là 3 giờ), dừng cất, đọc thể tích tinh dầu và xylen

- Tính toán hàm lượng tinh dầu (% thể tích/khối lượng) so với dược liệu khô tuyệt đối theo công thức: [4]

H: hàm lượng phần trăm tinh dầu (TT/KL)

a: thể tích tinh dầu sau khi cất được (ml)

c: thể tích xylen sau khi bão hòa (ml)

b: khối lượng dược liệu sau khi đã trừ độ ẩm (g)

Tiến hành cất tinh dầu 3 lần, lấy kết quả trung bình

- Xác định hàm ẩm dược liệu:

Tiến hành định lượng tinh dầu song song với xác định hàm ẩm trong dược liệu Dược liệu được xác định hàm ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi tại 1100C Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình

2.3.7 Xác định thành phần tinh dầu bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ

Sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) gồm có thiết bị sắc ký khí kết nối với detector khối phổ Mẫu tinh dầu của cây sau khi được tách trên cột phân tích của thiết

bị sắc ký khí sẽ được detector khối phổ nhận biết thông qua thư viện khối phổ Hiện nay, phương pháp này được áp dụng phổ biến để định tính (dựa vào thời gian lưu tR) hay định lượng (dựa vào chiều cao hay diện tích peak) của tinh dầu

Hệ thống máy chạy sắc ký GC-MS: máy chạy sắc ký GCMS-QP2020 Shimadzu, cột sắc ký Rtx-5MS, với chiều cao cột 30m, đường kính cột 0,25 mm,, đường kính hạt 0,25 µm Khí mang là khí Heli, tiêm chia dòng 1:50, cài đặt thông số nhiệt độ thích hợp

Điều kiện khối phổ:

- Chuẩn bị dung dịch thử: Lấy 10 µl tinh dầu vào lọ vial, thêm 10 mg Na2SO4 Thêm

1000 µl n-hexan hòa tan Ly tâm, thu lấy phần dịch nổi chạy sắc ký

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả thực nghiệm

3.1.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây Nghệ trâu

Mẫu nghiên cứu được mô tả như sau:

Cây thảo sống lâu năm, cao tới 2m (A) Thân giả mọc thẳng từ thân rễ chính,

có màu xanh lá cây, do các bẹ lá ôm vào nhau tạo thành, dài khoảng 1m Thân rễ chính mọc thẳng, nổi lên phía trên mặt đất, phình to, chắc, lúc trưởng thành bên ngoài có các vẩy màu nâu sẫm do các lá tiêu biến tạo thành vẩy, có hình nón rộng có kích thước 6-12,5cm (D) Thân rễ bên trong có màu trắng, có hai vòng tròn đồng tâm, có chứa các chấm màu vàng sẫm nằm rải rác (E) Thân rễ lúc non có màu xanh

lá cây ở ngoài, mọc nổi lên trên mặt đất (C) Thân rễ thứ cấp hình trụ, đường kính khoảng 3cm, phát triển từ nách bên của thân rễ chính, nhô ra cong lên (D) Toàn thân

rễ có mùi thơm dịu đặc trưng Mọc từ nách của thân rễ có nhiều rễ thật hình trụ dạng sợi, dài đến 20cm mang các rễ củ Rễ củ hình thuôn dài, bên trong có màu trắng trong, kích thước 2,1 x 4,1cm (F)

Lá đơn, mọc so le, có từ 5-7 lá Bẹ lá hình lòng máng, nhẵn, màu xanh, dài

20-42 cm Phiến lá hình thuôn dài, mép lá màu trắng trong suốt, đầu lá hình mũi nhọn (B), kích thước 21-25 x 70-85 cm, bề mặt trên có màu xanh lá cây, nhẵn; mặt dưới có màu xanh lá cây nhạt hơn, có lông ngắn, mọc khá dày, mịn như nhung Gân chính nằm ở giữa, màu trắng, phồng lồi ở mặt dưới, lõm ở mặt trên, cứng chắc Gân phụ tỏa song song từ gân chính theo hướng dốc lên tạo với gân chính một góc 300, có màu vàng-xanh, phồng lồi ở mặt trên của lá