ĐáNH GIá kết QUả bảo QUảN LạNH TINH TRùNG NGƯờI BằNG 3 PHƯƠNG PHáP hạ NHIệT sử DụNG máy NICOOL LM10, hơi NITƠ LỏNG và tủ LạNH âm sâu

Nhiều nghiên cứu đượcthực hiện để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên chất lượng của tinh trùng saubảo quản lạnh như: chất lượng tinh trùng trước bảo quản, lọc rửa tinh trùngtrước bảo quản

-*** -PHẠM HỒNG MINH

§¸NH GI¸ KÕT QU¶ B¶O QU¶N L¹NH TINH TRïNG NG¦êI B»NG 3 PH¦¥NG PH¸P H¹ NHIÖT Sö DôNG M¸Y NICOOL LM10, H¥I NIT¥ LáNG Vµ Tñ L¹NH

¢M S¢U

Chuyên ngành : Mô - Phôi thai học

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học

TS Đào Thị Thúy Phượng

HÀ NỘI - 2019

TT : Tinh trùng

BQL : Bảo quản lạnh

WHO : World Health Organization / Tổ chức y tế thế giới

DNA : Deoxyribonucleic acid

CSF : Cryosurvival factor / Chỉ số sống sót sau bảo quản lạnh

IUI : Intra Uterine Insemination / Bơm tinh trùng vào buồng tử cungIVF : In Vitro Fertilization / Thụ tinh trong ống nghiệm

ICSI : Intra - cytoplasmmic Sperm Injection / Bơm tinh trùng vào bào

tương noãn

CPA : Cryoprotectant Agent / Chất bảo vệ lạnh

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tinh trùng và một số chỉ định đông lạnh tinh trùng 3

1.1.1 Tinh trùng 3

1.1.2 Một số chỉ định đông lạnh tinh trùng 4

1.2 Những nghiên cứu về bảo quản lạnh sâu tinh trùng người 5

1.2.1 Lịch sử phát triển 5

1.2.2 Những nghiên cứu về phương pháp bảo quản lạnh sâu tinh trùng người 7 1.2.3 Kết quả hỗ trợ sinh sản khi sử dụng tinh trùng bảo quản lạnh 20

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 23

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 23

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu và phương pháp chọn mẫu 23

2.2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

2.2.4 Kỹ thuật và công cụ thu thập số liệu 24

2.2.5 Kỹ thuật khống chế sai số 24

2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 24

2.2.7 Quy trình nghiên cứu 25

2.2.8 Phương tiện nghiên cứu 26

2.3 Kỹ thuật và chỉ tiêu nghiên cứu 26

2.3.1 Kỹ thuật nghiên cứu 26

2.3.2 Các chỉ tiêu nghiên cứu 31

2.4 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 32

3.1.1 Phân bố mẫu nghiên cứu theo lứa tuổi 33

3.1.2 Đặc điểm chung về đại thể 33

3.1.3 Đặc điểm chung về vi thể 34

3.2 Ảnh hưởng của phương pháp hạ nhiệt độ bằng máy Nicool LM10 đối với chất lượng tinh trùng 34

3.2.1 Về khả năng sống của tinh trùng 34

3.2.2 Về khả năng di động của tinh trùng 35

3.2.3 Về tỷ lệ tinh trùng có hình thái bình thường 35

3.3 Ảnh hưởng của phương pháp hạ nhiệt độ bằng hơi nitơ lỏng đối với chất lượng tinh trùng 36

3.3.1 Về khả năng sống của tinh trùng 36

3.3.2 Về khả năng di động của tinh trùng 36

3.3.3 Về tỷ lệ tinh trùng có hình thái bình thường 37

3.4 Ảnh hưởng của phương pháp hạ nhiệt độ bằng tủ lạnh âm sâu đối với chất lượng tinh trùng 37

3.4.1 Về khả năng sống của tinh trùng 37

3.4.2 Về khả năng di động của tinh trùng 38

3.4.3 Về tỷ lệ tinh trùng có hình thái bình thường 38

3.5 Đánh giá chất lượng của các phương pháp bảo quản lạnh 39

3.5.1 Sau bảo quản lạnh 10 ngày 39

3.5.2 Sau bảo quản lạnh 30 ngày 39

CHƯƠNG 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 40

DỰ KIẾN KẾT LUẬN 41

DỰ TRÙ KINH PHÍ 42

DỰ TRÙ TIẾN ĐỘ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 3.1 Chất lượng tinh dịch của mẫu nghiên cứu 34Bảng 3.2 Tỷ lệ tinh trùng sống trước và sau BQL theo phương pháp hạ nhiệt

độ bằng máy Nicool LM10 34Bảng 3.3 Khả năng di động của tinh trùng trước và sau BQL theo phương

pháp hạ nhiệt độ bằng máy Nicool LM10 35Bảng 3.4 Tỷ lệ tinh trùng có hình thái bình thường trước và sau BQL theo

phương pháp hạ nhiệt độ bằng máy Nicool LM10 35Bảng 3.5 Tỷ lệ tinh trùng sống trước và sau BQL theo phương pháp hạ nhiệt

độ bằng hơi nitơ lỏng 36Bảng 3.6 Khả năng di động của tinh trùng trước và sau BQL theo phương

pháp hạ nhiệt độ bằng hơi nitơ lỏng 36Bảng 3.7 Tỷ lệ tinh trùng có hình thái bình thường trước và sau BQL theo

phương pháp hạ nhiệt độ bằng hơi nitơ lỏng 37Bảng 3.8 Tỷ lệ tinh trùng sống trước và sau BQL theo phương pháp hạ nhiệt

độ bằng tủ lạnh âm sâu 37Bảng 3.9 Khả năng di động của tinh trùng trước và sau BQL theo phương

pháp hạ nhiệt độ bằng tủ lạnh âm sâu 38Bảng 3.10 Tỷ lệ tinh trùng có hình thái bình thường trước và sau BQL theo

phương pháp hạ nhiệt độ bằng tủ lạnh âm sâu 38Bảng 3.11 Chất lượng tinh trùng 10 ngày sau BQL theo phương pháp hạ

nhiệt độ bằng máy Nicool LM10, hơi nitơ lỏng và tủ lạnh âm sâu 39Bảng 3.12 Chất lượng tinh trùng 30 ngày sau BQL theo phương pháp hạ

nhiệt độ bằng máy Nicool LM10, hơi nitơ lỏng và tủ lạnh âm sâu 39

Biểu đồ 3.1 Phân bố mẫu nghiên cứu theo lứa tuổi 33

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc tinh trùng trưởng thành 4Hình 1.2 Cryovial 1,8M 13Hình 1.3 Máy hàn miệng cọng rạ CBS SYMS III 13Hình 1.4 Bảo quản lạnh tinh trùng đông lạnh và phôi bằng cọng rạ trong nitơ

lỏng, Phòng thí nghiệm điều trị hỗ trợ y tế Limoges 17

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vô sinh đang là vấn đề ngày càng được quan tâm nghiên cứu do tính chấtảnh hưởng sâu rộng đến chất lượng cuộc sống của nhiều cặp vợ chồng trên toànthế giới Tỷ lệ vô sinh trên thế giới dao động trong khoảng 6 - 12% các cặp vợchồng trong độ tuổi sinh đẻ Tại Việt Nam, tỷ lệ này ở mức 7,7% [1] Do đó,nhu cầu hỗ trợ sinh sản và cải tiến kỹ thuật hỗ trợ sinh sản luôn cấp thiết

Một trong các kỹ thuật thường được sử dụng trong hỗ trợ sinh sản là bảoquản lạnh tinh trùng phục vụ cho thụ tinh nhân tạo Nguyên lý của kỹ thuậtnày là làm môi trường nước ở trong và ngoài tế bào biến đổi thành thể rắn, tức

là làm ngừng chuyển động của các phân tử và các quá trình sinh học trong tếbào Mục tiêu của bảo quản lạnh là sau khi đưa về nhiệt độ 37°C, tế bào vẫn

có thể trở lại hoạt động sống bình thường, không bị ảnh hưởng về cả cấu trúc

và chức năng [2], [3]

Sau khi tan đông thì mật độ, độ di động, khả năng sống của tinh trùngđều giảm so với trước, các đứt gãy DNA cũng xuất hiện nhiều hơn, ảnh hưởngtrực tiếp đến kết quả hỗ trợ sinh [4], [5], [6], [7] Nhiều nghiên cứu đượcthực hiện để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên chất lượng của tinh trùng saubảo quản lạnh như: chất lượng tinh trùng trước bảo quản, lọc rửa tinh trùngtrước bảo quản, loại môi trường, quy trình hạ nhiệt và quy trình tan đông, bảoquản thể tích lớn tinh trùng [8], [9], [10], [11] Qua đó đưa ra được quytrình phù hợp, hiệu quả để mẫu tinh sau tan đông có khả năng thụ tinh và pháttriển thành những em bé khỏe mạnh

Tại Việt Nam, kỹ thuật bảo quản lạnh tinh trùng đã được ứng dụng ởnhiều trung tâm và được nghiên cứu sôi nổi trên nhiều khía cạnh Tuy nhiên,làm cách nào để tăng tỷ lệ tinh trùng chất lượng tốt, đơn giản giản được các

bước trong quá trình bảo quản lạnh vẫn là câu hỏi được đặt ra cho các nhànghiên cứu.

Vì lý do đó, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu "Đánh giá kết quả

bảo quản lạnh tinh trùng người bằng 3 phương pháp hạ nhiệt sử dụng máy Nicool LM10, hơi nitơ lỏng và tủ lạnh âm sâu" với 2 mục tiêu:

1 Đánh giá chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh ở những mẫu tinh dịch bình thường.

2 So sánh chất lượng tinh trùng sau bảo quả lạnh bằng phương pháp

hạ nhiệt độ sử dụng máy Nicool 10, hơi nitơ lỏng và tủ lạnh âm sâu.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tinh trùng và một số chỉ định đông lạnh tinh trùng

1.1.1 Tinh trùng

Tinh trùng là sản phẩm ngoại tiết của tinh hoàn, có cấu tạo phù hợp vớichức năng vận động và mang bộ gen đơn bội Sự sinh tinh bắt đầu từ tinhnguyên bào phân chia nhiều lần và biệt hóa thành tinh trùng trong ống sinhtinh; sau đó tinh trùng thành thục ở mào tinh hoàn rồi mới có khả năng vậnđộng và thụ tinh Hai tinh hoàn của đàn ông trẻ có khả năng sinh ra khoảng

120 triệu tinh trùng mỗi ngày, đa số chúng được dự trữ ở ống dẫn tinh, mộtphần nhỏ dự trữ ở mào tinh Quá trình từ khi tinh trùng được sinh ra từ ốngsinh tinh trong tinh hoàn cho đến khi trưởng thành hoàn toàn ở mào tinh và hệthống ống dẫn kéo dài khoảng 72 - 74 ngày Khi đạt cực khoái trong giao hợp,tinh dịch được phóng ra là một hỗn dịch bao gồm tinh trùng đã thành thục vàdịch từ ống dẫn tinh (chiếm 10%), dịch từ túi tinh (chiếm 60%), dịch tuyếntiền liệt (30%) và một lượng nhỏ dịch từ các tuyến niêm mạc Thời gian sốngcủa tinh trùng rất khác nhau, phụ thuộc vào môi trường chứa chúng Trongống sinh tinh, tinh trùng có khả năng sống đến vài tuần; trong âm đạo là 5ngày và khi để ở môi trường ngoài cơ thể thì rất nhanh chết [12], [13]

Tinh trùng người có khả năng chịu được sự thay đổi nhiệt độ (làm lạnh,làm ấm) do đó chúng ít bị tổn thương trong quá trình giữ lạnh, rã đông so vớicác loại tế bào khác Nguyên nhân có thể do lượng nước trong tinh trùng thấp,chỉ khoảng 50% Tuy nhiên, trữ đông gây tổn hại đến chức năng của tinhtrùng, đặc biệt là tỷ lệ sống và chức năng di động Việc tối ưu hóa quy trìnhtrữ lạnh có thể giúp tinh trùng kéo dài thời gian bảo quản lên đến vài chục

năm mà vẫn đảm bảo khả năng thụ tinh [14], [15] Năm 2013, Andras đã báocáo ca sinh thành công một em bé được thụ tinh bằng tinh trùng của ngườicha đã trữ lạnh trước đó 40 năm [16]

Hình 1.1 Cấu trúc tinh trùng trưởng thành

(Nguồn: Histology and Cell Biology 4th Edition, 2012)

1.1.2 Một số chỉ định đông lạnh tinh trùng

Tinh dịch của những bệnh nhân nam bị vô sinh do bất thường tinh trùngthường được lọc rửa để tuyển chọn những tinh trùng khỏe mạnh hơn sau đóđưa vào bảo quản lạnh để lưu trữ các mẫu tinh quý hiếm phục vụ cho kỹ thuật

hỗ trợ sinh sản

Tinh trùng bảo BQL còn có ý nghĩa đối với những trường bệnh nhân đặcbiệt: mắc hội chứng giảm ganadotropin vùng dưới đồi - tuyến yên, chấnthương cột sống, xuất tinh ngược dòng, gặp khó khăn trong lấy mẫu tươi Người có tinh dịch đồ bình thường nhưng mắc các bệnh mạn tính lo ngạiảnh hưởng của phác đồ điều trị lên khả năng sản cũng trữ lạnh tinh trùng để

có khả năng có những đứa con khỏe mạnh sau này

Nam giới đã thắt ống dẫn tinh hay đã phẫu thuật chuyển giới lựa chọnbảo quản tinh trùng của mình phục vụ nhu cầu có con sau này

Nam giới phải thực hiện nhiệm vụ nguy hiểm đến tính mạng như công

an, quân đội, mật vụ cũng có thể lựa chọn BQL tinh trùng để phòng rủ ro.Tinh trùng đông lạnh là cơ sở hình thành nên các ngân hàng tinh trùngtrên toàn thế giới Mẫu tinh lưu trữ ở đây thường là được hiến tặng với mụcđích phục vụ cho những phụ nữ có chồng vô sinh, không có tinh trùng haytinh tử phù hợp để làm ICSI, điều trị thất bại; phụ nữ sẩy thai tái phát; phụ nữđộc thân muốn có con

Tại Pháp, quy trình BQL tinh trùng còn được sử dụng để ngăn ngừa nhiễmtrùng khi thực hiện hỗ trợ sinh sản ở cặp vợ chồng có nam giới nhiễm HIV [17]

1.2 Những nghiên cứu về bảo quản lạnh sâu tinh trùng người

1.2.1 Lịch sử phát triển

1.2.1.1 Phương pháp bảo quản lạnh sâu tinh trùng người trên thế giới

Bảo quản lạnh sâu tinh trùng người được thực hiện lần đầu tiên bởiSpallanzani tại nhiệt độ -76°C và không sử dụng môi trường bảo quản Tácgiả Shettles (1940) lần đầu tiên công bố phương pháp làm lạnh tinh trùngngười Hoagland và Pincus (1942) sử dụng vòng làm lạnh tinh trùng người vàthỏ để làm lạnh các mẫu tinh dịch nhỏ Kết quả thu được rất khả quan: 40%tinh trùng còn sống sót sau khi đưa về nhiệt độ bình thường [18]

Năm 1954, Polge và cộng sự đã sử dụng glycerol làm môi trường bảoquản lạnh và chất lượng tinh trùng sau rã đông đã cải thiện so với cách không

dùng môi trường Nghiên cứu này được coi là dấu mốc quan trọng của bảoquản lạnh mẫu sinh vật hiện đại [19].

Ngày 9/4/1954, tờ báo Cedar Rapids Gazette đăng tin 3 đứa trẻ đầu tiên

ra đời từ tinh trùng được bảo quản lạnh do Sherman thuộc đại học Iowa bangIowa, Mỹ thực hiện Kết quả này là một bước tiến vượt bậc, mở ra một thời

kỳ phát triển của các kỹ thuật hỗ trợ thụ thai Ngay lúc này, Sherman đã nghĩđến việc tập hợp nhiều mẫu tinh dịch lưu trữ trong ngân hàng tinh trùng đểcác cặp vợ chồng hiếm muộn có cơ hội có con [20]

Phương pháp bảo quản lạnh được áp dụng rộng rãi trong những năm tiếptheo và cho đến 1963, đã có 25 đứa trẻ ra đời từ tinh trùng bảo quản lạnh [18].Tác giả Smirnop (1949) đã bảo quản thành công tinh trùng thỏ trongNitơ lỏng Năm 1962, Sherman lại ứng dụng thành công việc bảo quản tinhtrùng người bằng Nitơ lỏng ở nhiệt độ -196°C và chỉ 2 năm sau đó đã có 4đứa trẻ ra đời bằng tinh trùng bảo quản theo phương pháp này Đến năm 1968,Lizuka và cộng sự đã sử dụng môi trường có bột lòng đỏ trứng gà (egg yolk)

để bảo quản tinh trùng ở nhiệt độ -196°C và kết quả là cũng có nhiều em bé rađời [18]

Những năm gần đây, nhiều nghiên cứu về phương pháp bảo quản tinhtrùng được công bố: phương pháp đông tinh nhanh sử dụng cọng rạ tự kéo,bảo quản tinh trùng bằng phương pháp thủy tinh hóa không cần sử dụng chấtbảo quản cũng cho kết quả tốt [21], [22]

Gần đây, nhờ những tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các phương pháp hỗtrợ sinh sản ngày càng phát triển mạnh mẽ: thụ tinh nhân tạo được tiến hành

từ đơn giản như bơm tinh trùng vào buồng tử cung (intrauterine insemination)đến phức tạp như thụ tinh trong ống nghiệm và chuyển phôi (in vitrofertilization and embryo transfer: IVF-ET), tiêm tinh trùng vào bào tương củanoãn (intracytoplasmic sperm injection: ISCI) Tinh trùng có thể là của người

chồng hoặc lựa chọn mẫu hiến tặng tại ngân hàng Người chồng không có tinhtrùng trong tinh dịch có thể được phẫu thuật tìm tinh trùng trong mô tinhhoàn Thậm chí, tinh trùng còn được nuôi dưỡng tới trưởng thành từ tinh tửcho dù tỉ lệ thành công chưa cao.

1.2.1.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu tinh trùng người tại Việt Nam

Bệnh viện Từ Dũ là đơn vị đầu tiên thực hiện thành công kỹ thuật bảoquản lạnh tinh trùng người, báo cáo được đưa ra năm 1995, là tiền đề cho việcthực hiện thành công ca thụ tinh trong ống nghiệm đầu tiên năm 1997 Chođến nay, nhiều cơ sở như Bộ môn Mô Phôi thai học - trường Đại học Y HàNội, các bệnh viện sản tuyến trung ương và thành phố lớn, Học viện Quân y,ngay cả khối bệnh viện tư nhân cũng đã thực hiện được kỹ thuật và có nhiềunghiên cứu được công bố

Gần đây, kỹ thuật bảo quản tinh trùng phát triển khá nhanh cùng với sự

ra đời của các ngân hàng tinh trùng trong nước đã đáp ứng được nhu cầu điềutrị của số lượng lớn bệnh nhân Hiện tại, Việt Nam có 23 ngân hàng tinh trùngđang hoạt động với phương pháp được áp dụng chủ yếu là bảo quản tinh trùng

ở nhiệt độ lạnh sâu -196°C, trong Nitơ lỏng, quy trình hạ nhiệt độ từ từ, có sửdụng môi trường bảo quản

1.2.2 Những nghiên cứu về phương pháp bảo quản lạnh sâu tinh trùng người

Với cùng chung một mục đích nâng cao chất lượng tinh trùng sau bảoquản lạnh, các nhà khoa học khắp nơi trên thế giới đã thực hiện nhiều nghiêncứu thử nghiệm các loại môi trường khác nhau, bổ sung thêm các chất khácnhau, bằng nhiều phương thức hạ nhiệt (sử dụng máy bán tự động như máyNicool LM10; máy tự động như Minicool 40PC, Planner; sử dụng hơi ni tơlỏng trong hộp xốp hoặc trên cổ bình ), nhiều tốc độ hạ nhiệt (chậm từng

bước cho đến rất nhanh), nhiều phương pháp nâng nhiệt Tuy nhiên, kết quảđạt được vẫn còn chênh lệch ở nhiều phòng thí nghiệm Nhìn chung, quy trìnhbảo quản lạnh sâu tinh trùng gồm những bước sau:

 Chọn mẫu và xét nghiệm tinh dịch

 Cân bằng với môi trường bảo quản lạnh

Tinh dịch đồ là xét nghiệm đầu tay cung cấp những thông số về tinh dịch

và tinh trùng trong tinh dịch, giúp chẩn đoán và điều trị các bất thường về khảnăng sinh sản của nam giới Bên cạnh đó, xét nghiệm này còn giúp chẩn đoántình trạng xuất tinh máu, viêm nhiễm đường dẫn tinh, đánh giá kết quả sau phẫuthuật thắt ống dẫn tinh hay phục hồi lưu thông đường dẫn tinh tắc nghẽn

Hiện nay, 2 cách đánh giá tinh dịch thường được sử dụng là đánh giábằng phương pháp thủ công và đánh giá bằng máy:

Phương pháp đánh giá thủ công được áp dụng trên lâm sàng nhiều hơn,người thực hiện sẽ khảo sát và đánh giá chất lượng tinh trùng bằng mắtthường qua kính hiển vi Tuy nhiên, phương pháp này phụ thuộc hoàn toànvào chủ quan của người thực hiện nên họ cần được đào tạo bài bản và thựchiện đúng quy trình để có thể đưa ra đánh giá chính xác nhất về chất lượngmẫu tinh dịch

Phương pháp đánh giá bằng máy tự động có ưu điểm là không bị ảnhhưởng bởi chủ quan người làm xét nghiệm nhưng độ chính xác lại chưa cao

Nguyên nhân là do máy chưa phân biệt được tinh trùng chết với các loại tếbào khác hoặc với cặn khi chúng nằm gần nhau trong đánh giá hình dạng; khitinh trùng sống di động va vào tinh trùng chết thì máy vẫn nhận diện là cóchuyển động; máy cũng không có khả năng đánh giá hình dạng tinh trùngphức tạp như quy trình chuẩn mà WHO đưa ra

Năm 2010, WHO cho ra đời phiên bản thứ 5 của cuốn cẩm nang xétnghiệm tinh dịch người với tiêu đề tiếng Anh là "WHO laboratory manual forthe examination and processing of Human semen" để đưa ra phương pháp xétnghiệm chi tiết hơn, các mốc chỉ số mới hợp lý hơn cho các phòng xétnghiệm Hiện nay, Bộ môn Mô Phôi trường Đại học Y Hà Nội cũng đang ápdụng bộ tiêu chuẩn đánh giá tinh dịch trong cuốn cẩm nang này trong xétnghiệm tinh dịch đồ

 Chọn mẫu

Sau khi có kết quả xét nghiệm tinh dịch đồ, mẫu sẽ được chọn để bảoquản lạnh sâu tùy thuộc vào mục đích sử dụng

1.2.2.2 Môi trường bảo quản tinh trùng

Nước trong tế bào khi bị đưa xuống nhiệt độ âm sẽ hình thành nên các tinhthể băng giống như những con dao cắt đứt cấu trúc của tế bào Vì vậy, mẫu tinhdịch được thêm các chất hóa học có khả năng thẩm thấu vào tế bào và đẩy nước

ra với tốc độ đủ nhanh trước khi những tinh thể băng xuất hiện [23]

Môi trường bảo quản có thể có hoặc không được sử dụng trong quy trìnhBQL tinh trùng Nhiều loại môi trường đã được thử nghiệm ở những nồng độkhác nhau và công bố về hiệu quả của chúng cũng rất khác nhau

Năm 1937, Bernstein và Petropavlovki đã sử dụng glycerol 0,5 - 3M đểbảo quản lạnh tinh trùng của động vật ở -21°C trong đá khô [24] Các tác giảkhác cũng thu được kết quả tốt khi dùng glycerol ở nồng độ 0,5 - 2M Sau đó,

môi trường glycerol đã được cải tiến thêm bằng cách bổ sung các chất làmtăng hiệu quả bảo quản như egg yolk, acid amin, albumin, lecithin, sucrose,kẽm [18], [25], [9], [26], [27]

Tác giả Sherman (1999) khi đánh giá hiệu quả của bảo quản lạnh tinh trùng

đã đưa ra kết luận: tỷ lệ tinh trùng sống sau bảo quản không có sự khác biệt khisửa dụng môi trường bảo quản là glycerol - egg yolk hay glycerol đơn thuần [18].Ngay sau đó, tác giả Hallak (2000) đã so sánh khả năng vận động củatinh trùng người, hình thái và tính toàn vẹn màng tinh trùng bằng hai phươngtiện bảo vệ lạnh sử dụng TEST-yolk kết hợp glycerol và glycerol đơn thuần.Các thông số được đo ở 0, 60, 120 và 180 phút sau khi tan băng và loại bỏchất bảo vệ lạnh Kết quả là tỷ lệ tinh trùng di động giảm đáng kể so với giátrị trước khi BQL ở cả hai nhưng ở các mẫu được đông lạnh trong đệm TEST

- yolk, tỷ lệ này cao hơn so với đông lạnh trong glycerol sau 0 phút (P =0,004) và sau 180 phút (P = 0,013) Tỷ lệ các dạng tinh trùng bình thường caohơn đáng kể trong các mẫu vật được bảo quản lạnh trong đệm TEST-yolk (P =0,04) Tác giả kết luận tinh trùng được bảo quản trong đệm TEST-yolk có chấtlượng tốt hơn đáng kể so với tinh trùng được bảo quản trong glycerol [28].Tuy nhiên, thời gian bảo quản trong nghiên cứu này ngắn hơn rất nhiều so vớithực tế bảo quản tinh trùng nên vẫn cần những nghiên cứu trong khoảng thờigian dài hơn

Nghiên cứu của McGonagle (2002) với nhan đề "Ảnh hưởng của môitrường bảo quản và giai đoạn tan đông lên tỷ lệ tinh trùng di động và khảnăng di chuyển qua chất keo của tinh trùng người sau bảo quản lạnh" đã chỉ rarằng: môi trường egg yolk - citrate - glucose - glycerol và egg yolk - tris -glucose - glycerol tốt hơn rất nhiều so với glycerol đơn thuần (tỷ lệ tinh trùng

di động sau tan đông tương ứng là 35%, 37% và 21% với p < 0.05) Haiphương pháp tan đông là nhúng vào nước 65˚C trong 4 giây và đặt ở nhiệt độ

phòng thí nghiệm trong 10 phút cho kết quả như nhau Với test di chuyển tinhtrùng qua chất keo polyacrylamide trong 30 phút ở nhiệt độ 37°C thấy đềugiảm tương xứng với tỉ lệ tinh trùng di dộng [29] Tại thời điểm đó, các tácgiả đều khuyến cáo TEST-yolk là môi trường nên được lựa chọn đầu tiêntrong BQL tinh trùng.

Ngoài ra, một số chất khác như kẽm và albumin cũng được nghiên cứuđưa vào môi trường BQL Tác giả Kotdawala và cộng sự (2012) đã thửnghiệm trên 109 mẫu tinh trùng mẫu tinh dịch được bảo quản lạnh trongglycerol - egg yolk - citrate có hoặc không có bổ sung kẽm (100M) và đượclưu trữ trong nitơ lỏng Sau 10 ngày, mẫu tinh dịch được làm tan đông đểđánh giá tỷ lệ tinh trùng vận động, tính toàn vẹn DNA, sự toàn vẹn của màng

ty thể tinh trùng Kết quả là mẫu tinh dịch được BQL sau khi bổ sung kẽm có

tỷ lệ tinh trùng di động, sự toàn vẹn của màng ty thể tinh trùng và khả năngtham gia phản ứng acrosome cao hơn đáng kể so với mẫu tinh dịch bảo quảnlạnh mà không bổ sung kẽm (P <0,001 ở cả 3 chỉ số) [27]

Tác giả Huang (2006) chứng minh được rằng: tinh trùng BQL bằng môitrường egg yolk - glycerol - natri citrate được thêm vào albumin với nồng độ1g/L cho thấy khả năng vận động và tỷ lệ sống cao so với nhóm đối chứng vàcác nhóm thử nghiệm khác (P <0,05) [30]

Năm 2018, tác giả Dashtestani báo cáo nghiên cứu bổ sung nanoalbumin và phức hợp đồng - cysteine vào môi trường BQL Kết quả thu được

là tinh trùng đã tăng khả năng vận động, nâng cao khả năng sống sót và giảmstress oxy hóa [31]

Tại Việt Nam, nghiên cứu của Trịnh Sinh Tiên (2002) về quy trình bảoquản tinh trùng người bằng lạnh sâu trong môi trường glycerol, GEYC vàSperm freeze đã kết luận: chất lượng tinh trùng sau bảo quản ở môi trườngGEYC tương đương với môi trường Sperm freeze và cao hơn có ý nghĩathống kê so với bảo quản ở môi trường glycerol đơn thuần Chỉ số sống sót

sau BQL (CSF) 50% ở các mẫu sử dụng môi trường GEYC và Sperm freeze[32]

Tuy nhiên việc để cho tinh trùng tiếp xúc với các chất hóa học ở nhữngnồng độ khác nhau cũng có nguy cơ thay đổi áp lực thẩm thấu trong môitrường, gây độc tế bảo, làm biến đổi vật chất di truyền Hơn nữa, động tác đưavào hay tách môi trường ra khỏi huyền phù tinh dịch cũng có thể gây áp lựclàm chết tinh trùng Cho nên các nhà nghiên cứu đã đặt vấn đề thay đổiphương pháp bảo quản không phải sử dụng môi trường mà vẫn giữ được sứcsống và hoạt động chức năng của tinh trùng

1.2.2.3 Đóng gói

Sau khi được bổ sung môi trường bảo quản, mẫu được nạp vào dụng cụchuyên biệt Có 2 hình thức đóng gói hay được sử dụng là cọng rạ (straw)bằng nhựa dung tích 0,25ml hay 0,5ml hoặc tube chịu lạnh (cryotube /cryovial) dung tích 1,8ml Trên dụng cụ chứa mẫu phải nhãn dán ghi tên tuổibệnh nhân, mã số, ngày đóng gói

Những nghiên cứu về phương tiện chứa mẫu hay cách thức đóng góihiện chưa có nhiều Theo nghiên cứu của Calvacante (2006), sử dụng tubechịu lạnh mang lại kết quả tốt hơn so với cọng rạ [33] Ghaserm và cộng sựcòn đề xuất sử dụng cọng rạ tự kéo để bảo quản một lượng nhỏ tinh trùng chokết quả khả quan hơn sử dụng cọng rạ thông thường [25]

Cọng rạ sau khi nạp huyền phù tinh trùng vào sẽ được hàn kín miệngbằng máy ép nhiệt hoặc cement chuyên dụng Nếu dùng tube để chứa tinhtrùng thì chỉ cần vặn chặt nắp đạy Bước tiếp theo là đưa mẫu vào giá hoặckhung đông lạnh

các tác động của quy trình hạ nhiệt và tan đông đã phần nào bị tổn thương.Việc bổ sung và loạt bỏ chất bảo vệ lạnh ra khỏi mẫu tinh cũng gây ra tổnthương không chỉ về mặt cơ học và có thể gây độc hóa học lên bộ máy ditruyền Do đó, các nhà khoa học đã phát triển kỹ thuật thủy tinh hóa bằngcách nhúng trực tiếp huyền phù tinh trùng vào nitơ lỏng không sử dụng môitrường bảo quản Quá trình hạ nhiệt diễn ra trong một khoảng thời gian từngắn đến rất ngắn giúp ngăn chặn sự hình thành các tinh thể băng Kết quả làtránh được cả sự phá vỡ cấu trúc tế bào do tinh thể băng và các tác động gâyshock thẩm thấu của các chất bảo vệ lạnh cổ điển [37], [38].

Năm 1962, nitơ lỏng bắt đầu được sử dụng để đưa mức nhiệt xuống-196°C, kỹ thuật này nhanh chóng phát triển ở nhiều quốc gia trên thế giới vàđược áp dụng thường xuyên cho tới nay [18]

Isachenko và các cộng sự (2004) đã so sánh chất lượng tinh trùng khiđược bảo quả bằng cách sử dụng tốc độ làm lạnh rất nhanh (nhúng trực tiếphuyền phù tinh dịch vào nitơ lỏng) và tốc độ chậm hơn (đóng băng bằng hơi

ni tơ trước khi ngâm vào nitơ lỏng) Cả 2 cách thức bảo quản đều làm giảmkhoảng 40% tỉ lệ tinh trùng di động với P < 0,05 Tính toàn vẹn DNA trong cảhai nhóm tinh trùng được BQL đều không bị ảnh hưởng và xấp xỉ bằng tinhtrùng tươi với P> 0,05 Kết quả của IVF cũng chứng minh khả năng thụ tinhxấp xỉ bằng nhau của tinh trùng được thủy tinh hóa không có CPA và đônglạnh trong hơi nitơ lỏng [23]

Tác giả Rahana (2011) thuộc Đơn vị hỗ trợ sinh sản, Khoa Phụ sản,Bệnh viện Đại học Quốc gia Malaysia đã thực hiện nghiên cứu kéo dài hơn 1năm với tất cả các mẫu tinh dịch bình thường đều được đưa vào nghiên cứu

Tỷ lệ tinh trùng di động và tỷ lệ DNA nguyên vẹn của từng mẫu tinh dịchđược đánh giá vào thời điểm 7, 30 ngày sau BQL ở 2 mức nhiệt -85°C và-196°C Kết quả thu được là không có sự khác biệt thống kê về tỷ lệ tinhtrùng di động (giá trị P ngày 7 và ngày 30 lần lượt là 0,9 và 0,5) và tỷ lệ DNAnguyên vẹn (giá trị P ngày 7 và ngày 30 lần lượt là 0,1 và 0,2) [39]

Nghiên cứu trên nhận được sự đồng thuận bởi nghiên cứu do ngân hàngtinh trùng tại Chile thực hiện năm 2012 với mục đích so sánh hiệu quả củaBQL tinh trùng trong nitơ lỏng ở hai mức nhiệt -86°C và -196°C sau 60 ngàybảo quản Các thông số thu được như sau:

Như vậy, các tác giả đều đồng thuận rằng không có sự khác biệt về chấtlượng tinh trùng khi BQL ở mức nhiệt -86°C Tuy nhiên, những nghiên cứutrên mới chỉ thực hiện BQL trong khoảng thời gian ngắn nên trên lâm sàngcũng chỉ áp dụng với những trường hợp không cần bảo quản lâu và ở nơikhông có phương tiện bảo quản đến -196°C Để có thể áp dụng bảo quản tinhtrùng lâu dài ở -86°C thì vẫn cần được nghiên cứu thêm

Về tốc độ làm lạnh, nhiều tác giả ủng hộ phương pháp hạ nhiệt độ chậmvới tốc độ khoảng 1-25°C/phút [18], [41] Tác giả Isachenko (2004) lại đề cậpđến tốc độ làm lạnh nhanh hơn (khoảng 150 - 250°C/phút) [23] Khi làm lạnhbằng cách nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng, tốc độ làm lạnh có thể giảm đến10000°C/phút

Tác giả Slabbert và cộng sự (2014) đã có thử nghiệm tương tự thực hiệntrên 35 mẫu tinh dịch bình thường được thu thập từ những bệnh nhân đếnthăm khám tại bệnh viện Sản và Nội tiết Steve Biko Nghiên cứu này bảoquản lạnh theo 2 phương pháp là hạ nhiệt bằng hơi nitơ lỏng rồi lưu trữ trongbình chứa nitơ và thủy tinh hóa không sử dụng chất bảo quản Kết quả làkhông có sự khác biệt về tổng số tinh trùng di động, số di động tiến tới (P >0.05) Nhưng tỷ lệ phân mảnh DNA và tính toàn vẹn của màng ty thể trong

nhóm BQL bằng hơi nitơ thấp hơn nhóm nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng, sựkhác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) Nhận định này tương đồng với cáckết quả đã công bố trước đó [10], [23] Tác giả kết luận phương pháp BQLtrong nitơ lỏng không dùng chất bảo vệ lạnh đơn giản hơn, nhanh hơn và hiệuquả hơn so với cách thức BQL thông thường [42].

Ngân hàng tinh trùng trường Đại học Tổng hợp Nebraska sử dụng quytrình hạ nhiệt như sau: đặt mẫu ở +4°C trong 7,5 phút, sau đó hạ cách ni tơlỏng 5cm trong 5 phút rồi hạ cách nitơ lỏng 3cm trong 3 phút, cuối cùng làdìm vào nitơ lỏng [18]

Ngân hàng Gen lạnh quốc tế dùng 2 phương pháp hạ nhiệt: Bằng máy:tốc độ hạ nhiệt 1°C/phút, khi đạt -30°C thì nâng tốc độ lên 5/phút, khi đạt-80°C thì nhúng nhanh vào ni tơ lỏng; bằng hơi nitơ: đặt cách bề mặt ni tơlỏng 3,5inches trong 15 phút sau đó là 0,5inches trong 2 giờ, cuối cùng lànhúng nhanh vào ni tơ lỏng [18]

Tại Việt Nam, Bộ môn Mô Phôi - trường Đại học Y Hà Nội và ở các cơ

sở hỗ trợ sinh sản đang sử dụng máy hạ nhiệt độ Nicool LM10 hoạt động hạnhiệt theo 3 giai đoạn:

 Hạ nhiệt từ 25°C 10°C trong 6 phút, tốc độ 5,8°C /phút

 Hạ nhiệt từ -10°C -120°C trong 20 phút, tốc độ 5,5°C/phút

 Hạ nhiệt từ -120°C -196°C trong 5 phút, tốc độ 15,2°C /phút

Hình 1.4 Quá trình hạ nhiệt độ bằng máy Nicool LM10

1.2.2.5 Lưu trữ trong ni tơ lỏng

Nitơ được hoá lỏng lần đầu tiên tại Đại học Jagiellonia năm 1883 bởi 2nhà vật lý Ba Lan, Zygmunt Wroblewski và Karol Olszewski [43] Ni tơ lỏngkhông màu, bay hơi ở nhiệt độ -196˚C, được lưu trữ và vận chuyển trong bìnhchân không Năm 1962, nitơ lỏng bắt đầu được áp dụng vào BQL tinh trùng

và dần trở thành phương thức BQL được áp dụng chủ yếu Tác giả Yogev vàcộng sự (2010) đã nghiên cứu 2525 mẫu tinh dịch được BQL trong ni tơ lỏngtrong thời gian từ 6 tháng đến 15 năm Kết quả là thời gian BQL kéo dài trong

ni tơ lỏng không ảnh hưởng đáng kể lên mật độ tinh trùng di dộng tiến tới(10,8 3,3 triệu TT/ml so với 12,3 2,9 triệu TT/ml và do vậy không làm thayđổi khả năng thụ tinh của tinh trùng [44]

1.5 Bảo quản lạnh tinh trùng đông lạnh và phôi bằng cọng rạ trong nitơ

lỏng, Phòng thí nghiệm điều trị hỗ trợ y tế Limoges [45].

1.2.2.6 Tan đông

Tan đông là quá trình đưa nhiệt độ mẫu trữ lạnh về nhiệt độ cơ thể(37˚C) bằng cách để ngoài nhiệt độ phòng, trong tủ ấm hoặc trong nước ấm Tác giả Bell (1993) đã nghiên cứu "Ảnh hưởng của môi trường và quytrình bảo quản lên màng lipid và độ di động tinh trùng" Sau 2 tuần trữ lạnhtrong ni tơ lỏng, mẫu được tan đông theo 2 cách: tan đông nhanh (đặt ở 37°Ctrong 5 phút) và tan đông chậm (đặt ở nhiệt độ 4°C trong 30 phút) Theo tácgiả, mẫu tinh sau BQL ở nhóm tan đông nhanh có chất lượng tốt hơn [46].Tác giả Mcgonagle cùng cộng sự (2002) lại cho rằng 2 phương pháp tanđông là để ở nhiệt độ phòng và nhúng vào nước 65°C trong 4 giây cho kết quảnhư nhau [29]

Tác giả Vieira (2012) đã thực hiện một nghiên cứu so sánh sự phục hồicủa tinh trùng từ kỹ thuật rã đông chậm và nhanh bằng cách sử dụng 38 mẫutinh trùng bình thường trong đó có 21 người vô sinh và 17 người đã có ít nhất

1 con Sau khi đánh giá tỷ lệ tinh trùng di động, hình thái và tính toàn vẹn

chức năng của màng (hypoosmotic test), tinh trùng được chia thành hai phầnmỗi phần 0,5 ml và tiến hành đông lạnh Các mẫu được làm tan đông ở nhiệt

độ phòng (25 ± 2˚C) trong 25 phút (tan đông chậm) hoặc ngâm trong nước ở75˚C trong 20 giây sau đó ngâm nước ở 37˚C trong 3 phút (tan đông nhanh).Kết thúc quá trình tan đông, các thông số được đánh giá lại bởi một nhà điềutra mù Kết quả là:

 Trong nhóm vô sinh, không cho thấy sự khác biệt của tỷ lệ hình tháitinh trùng bình thường liên quan đến kỹ thuật làm tan chậm Tuy nhiênphương pháp tan băng nhanh lại làm giảm tỷ lệ tinh trùng hình thái bìnhthường (P = 0,0034) và tăng đáng kể các khiếm khuyết hình thái ở đầu tinhtrùng (P = 0,0362)

 Cả hai kỹ thuật tan đông nhanh và chậm đều làm giảm khả năng vận độngcủa tinh trùng (P < 0,0001) với tỷ lệ phục hồi dao động từ 46% đến 67% nhưngkết quả này lại tương đương ở cả 2 nhóm vô sinh và không vô sinh (P < 0,0001) Như vậy, phương pháp rã đông nhanh với thời gian thực hiện ngắn hơnhẳn (3 phút 20 giây so với 25 phút) mang lại chất lượng không khác gì so vớiphương pháp tan đông chậm vẫn được sử dụng Nghiên cứu này góp phần xácnhận tính an toàn của phương pháp tan đông nhanh trước khi được áp dụngthường quy trong lâm sàng [47]

Mới đây, tác giả Baum (2018) đã thực hiện một nghiên cứu hồi cứu sosánh kết quả IVF hoặc ICSI của những bệnh nhân sử dụng tinh trùng củangười hiến tặng sau khi rã đông một phần (n=99) với một nhóm đối chứngbao gồm các bệnh nhân mà tinh trùng đã tan đông hoàn toàn trước khi sửdụng (n = 99) Nghiên cứu cho thấy khả năng di chuyển giảm đáng kể trongcác mẫu tinh trùng tan một phần so với tan hoàn toàn (6,5% so với 37,1%, p

<0,001) Tuy không có sự khác biệt về tỷ lệ thụ tinh nhưng số lượng phôi chất

lượng tốt trung bình thấp hơn đáng kể ở nhóm tan một phần với nhóm làm tanhoàn toàn (1,33 ± 0,17 so với 1,87 ± 0,17, p <0,02) [48] Do vậy, để sử dụngtinh trùng tan đông lặp lại vẫn cần phải nghiên cứu thêm.

1.2.3 Kết quả hỗ trợ sinh sản khi sử dụng tinh trùng bảo quản lạnh

Tinh trùng sau BQL bị giảm tỷ lệ sống, tỷ lệ di động và có đứt gãy DNAmặc dù không có ý nghĩa thống kê nhưng sự ảnh hưởng của những thay đổi

đó lên kết quả hỗ trợ sinh sản vẫn là vấn đề được quan tâm sâu sắc

Năm 2017, tác giả Eastick đã thực hiện nghiên cứu các chu kì ICSI sửdụng tinh trùng tươi và tinh trùng đông lạnh Hình ảnh của phôi được ghi lạibởi phần mềm Time - lapse mỗi 7 phút trên 5 mặt phẳng cho đến hết ngày 5của quá trình nuôi phôi hoặc đến khi chuyển phôi hay đông lạnh phôi 486phôi thụ tinh bằng tinh trùng đông lạnh và 1441 phôi thụ tinh bằng tinh trùngtươi được đưa vào nghiên cứu Kết quả là: Số lượng tế bào trứng thu được, sốlượng trứng được tiêm tinh trùng, trưởng thành và tỷ lệ thụ tinh thành côngtương tự nhau giữa 2 nhóm phôi có nguồn gốc từ tinh trùng tươi hoặc đônglạnh Hai nhóm cũng cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khiquan sát số lượng và tỷ lệ phôi tại thời điểm 72 giờ và 120 giờ sau thụ tinh Sốlượng phôi nang và tỷ lệ phôi nang chất lượng tốt không có khác biệt đáng kểgiữa hai nhóm (23,5% và 25,9%) Cũng không có sự khác biệt có ý nghĩathống kê trong các tham số về tất cả các dấu hiệu hình thái giữa các phôi cónguồn gốc từ tinh trùng tươi hoặc đông lạnh Do đó việc sử dụng tinh trùngđông lạnh hoàn toàn có thể được áp dụng trên lâm sàng [49]

Nghiên cứu của tác giả Chen (2018) đã so sánh kết quả IUI của 2nhóm: 304 trường hợp sử dụng tinh trùng tươi của người chồng (AIH-artificial insemination by the husband) và 173 trường hợp sử dụng tinhtrùng BQL của người hiến (AID - insemination by a donor) Các kết quả

cho thấy: số trẻ sinh sống ở 2 nhóm AIH và AID lần lượt là 262 và 153.Không có sự khác biệt về tỷ lệ có thai, phá thai và GEU ở 2 nhóm Sốtrường hợp phải chấm dứt thai kỳ do biến chứng thai nghén hoặc dị tậtnặng trong nhóm AIH là 12 và nhóm AID là 4 Sự khác biệt giữa giới tính,tuổi thai lúc sinh và tỷ lệ sinh non ở 2 nhóm cũng không có ý nghĩa thống

kê Thậm chí, cân nặng lúc sinh của nhóm AID còn có phần nhỉnh hơn vớichỉ số trung bình là 3507,6 ± 459,3(g) so với 3384.3 ± 550.3(g) với P =0,020 [50] Nghiên cứu cho kết quả tương tự với các nghiên cứu đã đượccông bố trước đó của các tác giả Lansac (1997), Friedler (1998), Isachenko(2004) khi thực hiện kỹ thuật IVF bằng tinh trùng BQL [51], [52], [23].Trải qua 80 năm hình thành và phát triển, các nhà nghiên cứu trên thếgiới ngày càng hoàn thiện quy trình BQL Cho đến nay, quy trình được cáclabo và ngân hàng tinh được sử dụng nhiều nhất là :

Sử dụng môi trường TEST - Yolk, egg yolk - citrate - glucose - glycerol,egg yolk - tris - glucose - glycerol, GEYC, Sperm freeze

Bảo quản trong nitơ lỏng

Phương pháp hạ nhiệt độ từ từ, sử dụng máy tự động hoặc bán tự độnghoặc thủ công Đảm bảo tốc độ hạ nhiệt là 1°C - 25°C/phút

Tan đông từ từ, tốc độ tan 1°C - 60°C/phút

Do tính chất không thống nhất giữa các kết quả nghiên cứu hiệu quả bảo

vệ tính di dộng và vật chất di truyền cũng như kết quả hỗ trợ sinh sản trên lâmsàng, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đánh giá chất lượng tinh trùng bảo quảnbằng 3 phương pháp hạ nhiệt độ: sử dụng máy Nicool 10, sử dụng hơi nitơlỏng và sử dụng tủ lạnh âm sâu -80°C