ỨNG DỤNG kỹ THUẬT xét NGHIỆM ái lực KHÁNG NGUYÊN GIỚI hạn (LAG – AVIDITY) và hệ số PHÂN LOẠI SAI để ước TÍNH tỷ lệ mới NHIỄM HIV TRÊN một số NHÓM có NGUY cơ CAO lây NHIỄM HIV ở VIỆT NAM

- Các xét nghiệm miễn dịch chấm - thấm, miễn dịch lọc hình 1.8: là kỹ thuật dựa trên nguyên tắc miễn dịch đánh dấu trên màng lọc; màng phản ứng chứa nhữnghạt vi lượng bao phủ kháng n

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Chuyên ngành : Vi sinh vật học

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS Nguyễn Anh Tuấn

1 PGS.TS Nguyễn Quang Huy

HÀ NỘI – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Trần Hồng Trâm, nghiên cứu sinh của Trường Đại học Khoa học Tựnhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, xin cam đoan:

Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tôi với sự hướng dẫn và giúpđỡ nhiệt tình của một tập thể các chuyên gia cao cấp trong và ngoài nước Tôi đãđược Lãnh đạo Viện, chủ nhiệm đề tài và các thành viên trong nhóm nghiên cứuđồng ý cho phép sử dụng các kết quả nghiên cứu của cùng đề tài với mục đích phântích và so sánh Toàn bộ các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưađược công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Nghiên cứu sinh

Trần Hồng Trâm

Trần Hồng Trâm

15,16,22,23,25-28,36,38,40-42,56,57,59,60,73,74,77,78,81,82,84,94,103,104,108,109,112,113

1-14,17-21,24,29-35,37,39,43-55,58,61-72,75,76,79,80,83,85-93,95-102,105-107,110,111,114-LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và cảm ơn chân thành tớiPGS.TS Nguyễn Anh Tuấn và PGS.TS Nguyễn Quang Huy, những người Thày cónhiều kinh nghiệm và kiến thức đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn tôi trong suốt quátrình học tập, thực hiện đề tài cũng như hoàn thành luận án

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các anh/chị/bạn đồng nghiệp KhoaHIV/AIDS, ban Lãnh đạo Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương; các Thày, Cô Bộ môn

Vi sinh vật học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đãluôn tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án.Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Dương Thị Yến – chuyên gia cao cấp vềxét nghiệm sớm HIV của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật (CDC)Atlanta đã cung cấp tài liệu và hướng dẫn cách làm xét nghiệm và phân tích kết quảxét nghiệm; TS Neha S.Shah – chuyên gia cao cấp về dịch tễ học của CDC Atlanta

đã hỗ trợ phân tích các chỉ số liên quan đến dịch tễ học; ThS BS Patrick Nadol–Trưởng nhóm dịch tễ học CDC Việt Nam, ThS Lê Vi Linh chuyên gia cao cấp dịch

tễ học của CDC Việt Nam đã cung cấp các số liệu và kết quả xét nghiệm cuối cùng;cùng toàn thể các đồng nghiệp trong lĩnh vực HIV, HBV của CDC Atlanta và CDCViệt Nam đã hỗ trợ tôi thực hiện và hoàn thành luận án này

Luận án được thực hiện trong khuôn khổ hợp tác nghiên cứu giữa CDC ViệtNam và Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương của “Dự án nâng cao chất lượng giám sát

và xét nghiệm HIV ở Việt Nam, giai đoạn 2006- 2010, 2011 -2016” do Trung tâmkiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Hoa Kỳ tài trợ

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến bố mẹ, chồng con, các anh chị em vànhững người thân trong gia đình, bạn bè đã hết lòng ủng hộ, động viên tôi trongsuốt quá trình học tập và là động lực to lớn giúp tôi vượt qua được những khó khăn

để đạt được kết quả học tập và hoàn thành luận án

Nghiên cứu sinh

Trần Hồng Trâm

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 4

DANH MỤC CÁC HÌNH 6

DANH MỤC BẢNG 8

MỞ ĐẦU 10

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12

1.1 Tình hình nhiễm HIV trên thế giới và ở Việt Nam 12

1.2 Đặc điểm virut HIV 12

1.2.1.Cấu trúc HIV 13

1.2.2.Diễn biến quá trình nhiễm HIV 15

1.2.3.Các giai đoạn lâm sàng của các bệnh nhiễm trùng cơ hội 18

1.3 Một số thuật ngữ xét nghiệm mới nhiễm HIV 20

1.4 Các phương pháp và kỹ thuật xét nghiệm trong giám sát dịch tễ và chẩn đoán HIV ở Việt Nam 21

1.4.1.Phương pháp xét nghiệm chẩn đoán gián tiếp HIV 24

1.4.2.Phương pháp xét nghiệm chẩn đoán trực tiếp 28

1.5 Các kỹ thuật xét nghiệm xác định tỷ lệ mới nhiễm HIV 30

1.5.1 Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym kém nhạy 33

1.5.2.Các kỹ thuật xác định tỷ lệ kháng thể IgG 33

1.5.3.Các kỹ thuật ái lực 33

1.5.4.Kỹ thuật IDE-V3 34

1.5.5.Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên p24 34

1.5.6.Kỹ thuật phát hiện ARN HIV 34

1.5.7.Kỹ thuật phát hiện kháng thể IgG 3 kháng p24 35

1.5.8.Kỹ thuật miễn dịch dòng 35

1.6 Ước tính tỷ lệ mới nhiễm HIV trên thế giới 38

1.6.1.Các ứng dụng của ước tính tỷ lệ mới nhiễm HIV 39

1.6.2.Các phương pháp ước tính tỷ lệ mới nhiễm 39

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45

2.1 Xác định và so sánh tỷ lệ phân loại sai trong ước tính tỷ lệ mới nhiễm HIV của hai kỹ thuật BED –CEIA và LAg- Avidity trên những bệnh nhân bắt đầu đăng ký điều trị ARV tại các phòng khám ngoại trú của bốn tỉnh trong năm 2010 -2011 45

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 45

2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 45

2.1.3 Cỡ mẫu và cách chọn mẫu 45

2.1.4 Thiết bị và sinh phẩm, hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu 46

2.1.5 Phương pháp nghiên cứu 47

2.1.6 Quy trình thu thập mẫu tại phòng khám ngoại trú 49

2.1.7 Các yếu tố cần đánh giá trong nghiên cứu 50

2.2 Ứng dụng kỹ thuật LAg Avidity để ước tính tỷ lệ mới nhiễm HIV-1 trong một số nhóm đối tượng có nguy cơ cao lây nhiễm HIV ở Việt Nam năm 2006 và 2009 51

2.2.1 Các thông tin của nghiên cứu IBBS đã thực hiện năm 2006, 2009 51

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu tính tỷ lệ mới nhiễm HIV bằng sinh phẩm LAg-Avidity, sử dụng thông tin và mẫu IBBS 2006, 2009 53

2.3 Các kỹ thuật xét nghiệm sử dụng trong hai nghiên cứu 56

2.3.1 Xét nghiệm BED-CEIA 56

2.3.2 Quy trình kỹ thuật xét nghiệm mới LAg-Avidity EIA 59

2.3.3 Xét nghiệm Western Blot 61

2.3.4 Xét nghiệm kiểu gen HIV 62

2.3.5 Xét nghiệm đo tải lượng HIV 63

2.3.6 Xét nghiệm thành phần thuốc ARV 63

2.4 Công thức tính toán và phần mềm nhập liệu của hai nghiên cứu 63

2.4.1 Công thức tính tỷ lệ phân loại sai và tỷ lệ mới nhiễm 63

2.4.2 Phần mềm phân tích kết quả 64

2.5 Đạo đức trong nghiên cứu 65

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 66

3.1 Xác định và so sánh tỷ lệ phân loại sai trong ước tính tỷ lệ mới nhiễm HIV của hai kỹ thuật BED–CEIA và LAg-Avidity trên những bệnh nhân bắt đầu đăng ký điều trị ARV tại các phòng khám ngoại trú của bốn tỉnh trong năm 2010 -2011 66

3.1.1.Đánh giá đặc điểm chung của những người tham gia nghiên cứu 67

3.1.2.Xác định tỷ lệ phân loại sai mới nhiễm của từng sinh phẩm BED - CEIA, LAg-Avidity 71

3.2 Ứng dụng kỹ thuật LAg Avidity để ước tính tỷ lệ mới nhiễm HIV-1 trong một số nhóm đối tượng có nguy cơ cao lây nhiễm HIV ở Việt Nam năm 2006 và 2009 95

3.2.1 Đánh giá kết quả ban đầu xét nghiệm mới nhiễm bằng sinh phẩm LAg-Avidity trên ba nhóm nguy cơ cao của các điều tra IBBS 97

3.2.2 Tỷ lệ mới nhiễm hiệu chỉnh theo năm 2006, 2009 sử dụng tỷ lệ phân loại sai cho từng miền 101

3.2.3 Đánh giá kỹ thuật LAg-Avidity trên cơ sở xét nghiệm 108

3.3 Hạn chế của các nghiên cứu 113

KẾT LUẬN 114

KIẾN NGHỊ 115

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 116

TÀI LIỆU THAM KHẢO 117 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Từ gốc Tiếng Anh Nghĩa Tiếng Việt

Deoxyribonucleic Acid

ADN bổ sung

syndrome

Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải

ART Antioretroviral therapy Liệu pháp chống virut Retro

BED-CEIA Capture Enzyme ImmunoAssay

CEPHIA Consortium for the Evaluation

and Performance of HIV Incidence Assays

Nhóm ủy viên ban đánh giá và thực hiện các xét nghiệm mới nhiễm

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbert

Assay

Xét nghiệm miễn dịch hấp phụ gắnenzym

EPP Epidemic Projection Package Phần mềm dự báo dịch

FHI Family Health International Tổ chức sức khỏe gia đình Quốc tế

HIV Human immunodeficiency virus Virut gây suy giảm miễn dịch ở

người

HTLV III Human T- cell Leukaemia

Virus

Virut gây ung thư tế bào T ở người

IBBS Integrated Biological and

Behavioral Surveillance

Giám sát lồng ghép hành vi và chỉ

số sinh học

LAg Avidity Limmiting Antigen Avidity Thử nghiệm miễn dịch gắn enzym

ái lực kháng nguyên giới hạn

LAV Lymphadenopathy Associated Virus Virut gây tăng sinh bạch cầu hạt

NMR Nuclear Magnestic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

PEPFAR President's Emergency Plan for

AIDS Relief

Kế hoạch cứu trợ khẩn cấp của Tổng thống Hoa Kỳ về phòng, chống AIDS

UNGA United Nations General Assembly Đại hội đồng liên hợp quốc

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu tạo virut HIV 15

Hình 1.2 Cấu trúc gen HIV 15

Hình 1.3 Chu kỳ nhân lên của virut HIV 16

Hình 1.4 Sự biến đổi thông số sinh học trên bệnh nhân nhiễm HIV 16

Hình 1.5 Quy trình xét nghiệm trong an toàn truyền máu 22

Hình 1.6 Quy trình xét nghiệm HIV trong giám sát dịch tễ học 22

Hình 1.7 Quy trình chẩn đoán nhiễm HIV ở người lớn và trẻ em ≥ 18 tháng tuổi 23

Hình 1.8 Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch đánh dấu trên màng lọc 25

Hình 1.9 Nguyên lý kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch sắc ký 25

Hình 1.10 Nguyên lý kỹ thuật ngưng kết hạt 26

Hình 1.11 Nguyên lý kỹ thuật ELISA Sandwich 27

Hình 1.12 Hình ảnh kết quả Western blot HIV-1 28

Hình 1.13 Nguyên lý sinh phẩm BED-CEIA 36

Hình 1.14 Nguyên lý sinh phẩm LAg – Avidity 38

Hình 1.15 Sơ đồ xét nghiệm mới nhiễm HIV sử dụng một kỹ thuật 40

Hình 1.16 Sơ đồ ước tính tỷ lệ mới nhiễm sử dụng kết hợp hai hoặc nhiều kỹ thuật xét nghiệm mới nhiễm 41

Hình 1.17 Sơ đồ ước tính tỷ lệ mới nhiễm sử dụng một xét nghiệm mới nhiễm kết hợp với các xét nghiệm khác và thông tin bệnh án 42

Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ phân loại sai mới nhiễm HIV .48 Hình 2.2 Quy trình thu thập mẫu 49

Hình 2.3 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ mới nhiễm HIV bằng sinh phẩm LAg-Avidity 55

Hình 2.4 Sơ đồ xét nghiệm BED-CEIA trong nghiên cứu 56

Hình 2.5 Các bước thực hiện xét nghiệm BED-CEIA 57

Hình 2.6 Quy trình xét nghiệm LAg-Avidity 59

Hình 2.7 Các bước thực hiện xét nghiệm LAg-Avidity 60

Hình 3.1 Kết quả chạy trên thạch những mẫu nghi ngờ và mẫu mới nhiễm HIV 81

Hình 3.2 Kết quả xét nghiệm giải trình tự vùng GP41 HIV -1 trên các mẫu nghi ngờ mới nhiễm HIV 82

Hình 3.3 Kết quả xét nghiệm Western Blot trên những mẫu phân loại sai mới nhiễm 84

Hình 3.4 Kết quả xét nghiệm BED- CEIA và LAg-Avidity trên 22 mẫu Elite Controller 94

Hình 3.5 Tỷ lệ mới nhiễm HIV trên nhóm phụ nữ bán dâm 103

Hình 3.6 Tỷ lệ mới nhiễm nhóm nghiện chích ma túy 103

Hình 3.7 Tỷ lệ mới nhiễm nhóm nam quan hệ tình dục đồng giới 104

Hình 3.8 Tỷ lệ mới nhiễm nhóm nghiện chích ma túy cả nước 107

Hình 3.9 Tỷ lệ mới nhiễm nhóm phụ nữ bán dâm cả nước 107

Hình 3.10 Tỷ lệ mới nhiễm nhóm nam quan hệ tình dục đồng giới cả nước 108

Hình 3.11 Phương pháp xét nghiệm tìm tỷ lệ mới nhiễm 111

Hình 3.12 Sơ đồ chẩn đoán nhiễm HIV cho người lớn và trẻ >18 tháng tuổi 112

DANH MỤC BẢN

Bảng 1.1 Tổng hợp tám kỹ thuật phát hiện mới nhiễm HIV đang sử dụng trên

thế giới 31

Bảng 1.2 Các nghiên cứu tỷ lệ mới nhiễm HIV trên thế giới 44

Bảng 2.1 Số lượng mẫu cần cho nghiên cứu ước tính tỷ lệ mới nhiễm HIV từ mẫu lưu IBBS 53

Bảng 3.1 Số lượng mẫu chọn lọc trong nghiên cứu 66

Bảng 3.2 Đặc điểm chung của những người tham gia nghiên cứu 68

Bảng 3.3 Kết quả xét nghiệm BED-CEIA, LAg-Avidity 71

Bảng 3.4 Tổng hợp kết quả xét nghiệm mới nhiễm HIV bằng hai sinh phẩm BED-CEIA, LAg-Avidity 72

Bảng 3.5 Bảng nhập liệu kết quả sàng lọc xét nghiệm HIV-1 BED-CEIA 73

Bảng 3.6 Bảng nhập liệu kết quả khẳng định xét nghiệm HIV-1 BED-CEIA 74

Bảng 3.7 Tỷ lệ phân loại sai là mới nhiễm của sinh phẩm BED -CEIA 76

Bảng 3.8 Bảng nhập liệu kết quả sàng lọc xét nghiệm HIV-1 LAg-Avidity 77

Bảng 3.9 Bảng nhập liệu kết quả khẳng định xét nghiệm HIV-1 LAg-Avidity .78 Bảng 3.10 Tỷ lệ phân loại sai là mới nhiễm của sinh phẩm LAg-Avidity 80

Bảng 3.11 Kết quả xét nghiệm thành phần thuốc ARV 85

Bảng 3.12 Kết quả tỷ lệ phân loại sai mới nhiễm sau khi loại bỏ những trường hợp đã điều trị ARV của sinh phẩm BED –CEIA và LAg- Avidity 87

Bảng 3.13 Tỷ lệ phân loại sai phân theo từng phòng khám ngoại trú đối với hai sinh phẩm BED, LAg-Avidity 88

Bảng 3.14 So sánh kết quả tỷ lệ phân loại sai bằng sinh phẩm BED - CEIA của Việt Nam với thế giới 91

Bảng 3.16 Tổng hợp mẫu IBBS năm 2006 và 2009 95

Bảng 3.17 Cỡ mẫu cần hiệu chỉnh theo tỷ lệ mới nhiễm thực tế của nghiên cứu IBBS theo tỷ lệ phân loại sai miền Bắc 96

Bảng 3.18 Cỡ mẫu cần hiệu chỉnh theo tỷ lệ mới nhiễm thực tế của nghiên cứu

IBBS theo tỷ lệ phân loại sai miền Nam 96Bảng 3.19 Kết quả xét nghiệm mới nhiễm LAg-Avidity trên ba nhóm NCMT,

PNBD, MSM ở Miền Bắc 98Bảng 3.20 Kết quả xét nghiệm mới nhiễm LAg-Avidity trên ba nhóm NCMT,

PNBD, MSM ở Miền Nam 99Bảng 3.21 So sánh tỷ lệ mới nhiễm HIV hiệu chỉnh trên 3 nhóm nguy cơ cao ở miền

Bắc theo năm điều tra 2006 & 2009 – Tỷ lệ phân loại sai là 2,6% 101Bảng 3.22 So sánh tỷ lệ mới nhiễm HIV hiệu chỉnh trên 3 nhóm nguy cơ cao ở miền

Nam theo năm điều tra 2006 & 2009 – Tỷ lệ phân loại sai là 0,7% 102Bảng 3.23 Tổng hợp số mẫu xét nghiệm mới nhiễm HIV trên cả nước 105

Bảng 3.24 So sánh tỷ lệ mới nhiễm HIV hiệu chỉnh trên 3 nhóm nguy cơ của cả

nước năm 2006 và 2009 – Tỷ lệ phân loại sai là 1,7% 106

MỞ ĐẦU

Ngày 28 tháng 10 năm 2014 - Chính phủ Việt Nam công bố cam kết thực hiệnmục tiêu 90-90-90 phấn đấu đến năm 2020 có 90% số người biết được tình trạngnhiễm HIV của mình, 90% số người đã chẩn đoán nhiễm HIV được điều trị thuốcARV liên tục và 90% số người được điều trị ARV kiểm soát được tải lượng virut ởmức thấp và ổn định Việt Nam là quốc gia châu Á đầu tiên cam kết thực hiện mụctiêu mới này Trên thế giới và ở Việt Nam, các phương pháp xét nghiệm HIV hiện

nay chủ yếu chỉ tính được tỷ lệ hiện nhiễm là một tỷ lệ mặc dù quan trọng nhưng có

những hạn chế trong việc tìm hiểu sự lan truyền HIV mới nhất Đối với HIV việc

phát hiện ra người mới nhiễm HIV trong vòng sáu tháng đầu là rất quan trọng vì

trong thời gian này nếu người bệnh không được tư vấn, xét nghiệm và điều trị ARVkịp thời sẽ lây lan trong cộng đồng rất nhanh, khó kiểm soát để ngăn chặn dịch HIVbùng nổ [4]

Xác định được tỷ lệ mới nhiễm là rất khó mặc dù các nghiên cứu thuần tậptương lai theo dõi những người khỏe mạnh đến khi có huyết thanh chuyển đổinhiễm HIV là tiêu chuẩn vàng để ước tính tỷ lệ mới nhiễm HIV, nhưng nhữngnghiên cứu này lại rất mất thời gian, phức tạp và tốn kém tiền bạc Để khắc phụcnhững điểm này, các phòng thí nghiệm đã phát triển các loại kỹ thuật thử nghiệm để

đo lường tỷ lệ mới nhiễm dựa vào các dấu ấn miễn dịch sinh học trong nhiễm HIVdiễn ra một vài tháng sau khi nhiễm trong các quần thể nghiên cứu cắt ngang

Với tính cấp thiết, tính ứng dụng cao nên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu

“Ứng dụng kỹ thuật xét nghiệm ái lực kháng nguyên giới hạn (LAg-Avidity) và hệ

số phân loại sai để ước tính tỷ lệ mới nhiễm HIV trên một số nhóm có nguy cơ caolây nhiễm HIV ở Việt Nam” để tìm ra cách tính toán tỷ lệ mới nhiễm HIV phù hợpvới điều kiện và hoàn cảnh Việt Nam Nghiên cứu này tập trung vào các đối tượngnguy cơ cao nhiễm HIV: nghiện chích ma túy, gái mại dâm, nhóm nam quan hệ tìnhdục đồng giới ở các tỉnh trọng điểm nhiễm HIV cao ở Việt Nam

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1 Xác định và so sánh tỷ lệ phân loại sai trong ước tính tỷ lệ mới nhiễm HIV củahai kỹ thuật BED –CEIA và LAg- Avidity EIA trên những bệnh nhân bắt đầuđăng ký điều trị ARV tại các phòng khám ngoại trú của bốn tỉnh trong năm

2010 -2011

2 Ứng dụng kỹ thuật LAg Avidity EIA để ước tính tỷ lệ mới nhiễm HIV-1trong một số nhóm đối tượng có nguy cơ cao lây nhiễm HIV ở Việt Namnăm 2006 và 2009

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu định lượng và so sánh phân loại sai của sinh phẩm BED và Avidity EIA theo phương pháp nghiên cứu cắt ngang trên những người bắt đầutham gia điều trị tại các phòng khám ngoại trú

LAG Ước tính tỷ lệ mới nhiễm HIV dựa trên tỷ lệ phân loại sai đã được tính từnghiên cứu trước sử dụng nguồn mẫu lưu các đối tượng nguy cơ cao nhiễmHIV: nghiện chích ma túy, phụ nữ bán dâm, nam quan hệ tình dục đồng giớicủa điều tra “Lồng ghép hành vi và các chỉ số sinh học – IBBS” năm 2006 và

2009

ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Lần đầu tiên đã xác định được tỷ lệ phân loại sai sử dụng kỹ thuật BED-CEIA

và LAg-Avidity

- Ứng dụng được tỷ lệ phân loại sai để ước tính tỷ lệ mới nhiễm HIV trên một số

nhóm có nguy cơ cao lây nhiễm HIV ở Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nhiễm HIV trên thế giới và ở Việt Nam

Theo thống kê của UNAIDS, trên thế giới từ năm 2010 đến 2016 số người mớinhiễm HIV ở mọi độ tuổi đã giảm xuống hàng năm khoảng 16 % tương đương với1,8 triệu người (nằm trong khoảng 1,6 triệu – 1,8 triệu người) Đây là một bước tiếnđáng ghi nhận tuy nhiên con số này vẫn còn xa để đạt được mục tiêu do UNAIDSđưa ra trong năm 2016 là sẽ phải giảm xuống hàng năm chỉ còn ít hơn 500,000người mới nhiễm cho đến năm 2020 Số người mới nhiễm HIV được phân chia theocác nhóm tuổi và giới tính Đối với trẻ em (< 15 tuổi) các trường hợp mới nhiễmHIV đã giảm xuống 47% từ năm 2010 do các bà mẹ đã được điều trị dự phòngthuốc kháng vi rút ARV từ khi mang thai, con số này đã giảm từ 47 % đến 76% quatừng năm cho đến nay Tính đến 2016, UNAIDS ghi nhận số người lớn mới nhiễmHIV trên thế giới nằm chủ yếu độ tuổi lớn hơn15 [111] Tuy nhiên đến năm 2017UNAIDS ước tính số người trưởng thành mới nhiễm HIV giảm 8% so với giữa

2010 và 2015, giảm 11% so với giữa 2010 và 2016

Thống kê theo báo cáo công tác phòng, chống HIV/AIDS năm 2017 cho thấy: sốtrường hợp nhiễm HIV phát hiện mới giảm 1,1%, số bệnh nhân AIDS giảm 39% vàngười nhiễm HIV tử vong giảm 15% Kết quả giám sát trọng điểm năm 2016, tỷ lệnhiễm HIV trong nhóm NCMT là 9,53%; PNBD là 2,39% và MSM là 7,36% Tỷ lệnhiễm HIV trong nhóm MSM đã tăng từ 5,1% năm 2015 lên 7,36% năm 2016 [2] Tổng hợp của WHO/UNAIDS đến 2015 có bảy loại sinh phẩm xét nghiệmmới nhiễm đã được CEPHIA đánh giá: LAg-Avidity, BED CEIA, Ortho Clinical

Diagnostic VITROS Anti-HIV 1+2 (LS-Vitros), Ortho Clinical Diagnostics VITROS anti HIV 1+2 (BSRI – Vitros-Avidity), Biorad HIV1/2+O Avidity EIA,

sinh phẩm khẳng định Geenius HIV-1/HIV-2 được phát triển và tối ưu hóa thànhsinh phẩm xét nghiệm nhanh có nguyên lý giống Western Blot, và NMR dựa trênnguyên lý quá trình trao đổi chất thay đổi qua thời gian thông qua kiểu đo quangphổ trên mẫu huyết tương để phân biệt mới nhiễm với nhiễm lâu [116,124]

1.2 Đặc điểm virut HIV

Nhiễm virut HIV và AIDS là một quá trình bệnh lý do một loại virut thuộc họphụ Lentivirinae, họ Retroviridae gây ra Các Lentivirinae có nhiều đặc tính hìnhthái và đặc tính sinh học giống nhau Lentivirinae có thể truyền bệnh cho nhiều loài,với đặc trưng là thời gian nhiễm và ủ bệnh rất dài [72] Thời gian trung bình từ khinhiễm HIV đến khi tiến triển thành AIDS khoảng 10 năm Tuy nhiên, một số bệnhnhân có thể tiến triển nhanh đến AIDS trong vòng vài tháng Một số khác (5%) cóthể kéo dài trên 15 - 20 năm vẫn không có các triệu chứng AIDS và số lượng tế bàoCD4 không giảm [56].

Hai loại HIV đã được định rõ đặc điểm: HIV-1 và HIV-2 HIV-1 là loại virutban đầu được phát hiện và đặt tên là LAV [27] hay HTLV-III [55] HIV-1 độc hơnHIV-2 và là nguyên nhân của phần lớn các ca nhiễm HIV trên toàn cầu HIV-2 cókhả năng lây nhiễm thấp hơn HIV-1 cho nên nó chỉ hạn chế ở Tây Phi [53,57] Virut có thể sống vài ngày ở bên ngoài cơ thể trong điều kiện khô và vài tuầntrong dung dịch ở nhiệt độ phòng thí nghiệm Tuy nhiên, virut rất nhạy cảm vớinhiệt độ và các chất tẩy uế thông thường Ở nhiệt độ 560C, HIV chết sau 30 phút.Virut chết nhanh khi bị đun sôi HIV đề kháng với nhiệt độ lạnh, tia gamma, tia cựctím, sống được 3 ngày trong máu bệnh nhân nếu để ngoài trời, dễ bị tiêu diệt bởicồn 70%, nước javen [8, 10]

1.2.1 Cấu trúc HIV

HIV có dạng hình cầu, kích thước 100 - 120 nm, cấu tạo HIV gồm 3 lớp [14](hình 1.1):

- Vỏ ngoài: có cấu tạo từ lớp lipit kép với các gai glycoprotein Mỗi gai có

hai tiểu đơn vị glycoprotein có khối lượng 41kDa ký hiệu là gp41 cắm xuyên mànglipit kép và glycoprotein có khối lượng 120kDa (gp120) gắn với gp41 nhờ cầu nốidisulfua tạo thành gp160 Gp41 và gp120 là glycoprotein điển hình trên bề mặtđược xem là một trong các thành phần chính trong việc tìm ra hướng sản xuất vắc-xin HIV và các sinh phẩm [33, 38, 40, 45];

- Phía trong vỏ ngoài: có cấu trúc hình cầu được cấu tạo từ protein có khối

lượng 17kDa nằm giữa vở ngoài và lõi

- Bên trong: là vỏ capsit hình trụ cấu tạo bởi protein có khối lượng 24kDa

(p24) [3, 45] Trong cấu trúc hình trụ là hai sợi ARN (+), protein lõi (P7 và P9) vàenzym phiên mã ngược

Ngoài ra, còn có một số gen tổng hợp các protein chức năng điều hòa khác:

Vif, Vpu, Vpr, Tat, Rev, Nef [14] (hình 1.2).

 Gen Vif (virus infective factor) [5,38] – mã cho protein P23 là yếu tố gây

nhiễm, làm tang khả năng nảy chồi giúp cho virut dễ dàng xâm nhập từ tế bào nàysang tế bào khác Nếu thiếu gen vif virut sẽ mất khả năng lây nhiễm [18,75,82];

 Gen tat (transactivator of transcription): mã cho protein P16 điều hòa sự kéo

dài phiên mã Thiếu protein này sự phiên mã sẽ kết thúc sớm

 Gen rev mã cho protein rev (P19) điều hòa sự vận chuyển của các ARN từ

nhân vào tế bào chất, nhờ đó tổng hợp đầy đủ các protein cấu trúc

 Gen nef (negative expression factor) mã cho yếu tố biểu hiện âm tính, đó là protein làm giảm biểu hiện của gen Nef có thể gây điều hòa ngược CD4 [19] và

HLA lớp I [41] trên bề mặt của tế bào nhiễm HIV-1, và đây có thể là một cơ chếgiúp virut trốn tránh sự tấn công của T CD8 gây độc tế bào và tránh được sự nhậndiện của các T CD4 [56]

 Gen Vpr cần thiết cho quá trình nhân bản của virut ở các tế bào không phân chia ví dụ đại thực bào Ngoài các yếu tố kích thích khác của tế bào và virut, vpr cũng có thể kích thích HIV-LPP Gần đây, người ta thấy vpr có vai trò quan trọng

trong vận chuyển phức hợp tiền tích hợp của virut vào nhân [80] và có thể làmngừng chu kỳ tế bào ở G2

 Gen Vpu có vai trò quan trọng trong quá trình nảy chồi của virut bởi các đột biến của vpu khiến các hạt virut nằm mãi trên màng tế bào vật chủ Vpu còn liên

quan tới sự liên kết của phức hợp CD4-gp160 trong lưới nội nguyên sinh và do đócho phép gp160 được quay vòng để tạo các hạt virut mới [16,33,38]

Như vậy HIV gồm 3 nhóm gen chính [45]: Gag – mã hóa cho các protein lõi P24, P17; Pol- mã hóa cho enzym phiên mã ngược; Env – mã hóa cho các

glycoprotein vỏ gp41, gp120 có vai trò quan trọng trong việc giúp virut bám và xâm

nhập vào tế bào đích HIV-1 có nhiều kháng nguyên đặc hiệu như: gp 41, gp 120,

gp 160, P24 [47] Virut HIV có chứa mọi thành phần enzym cần thiết cho nhân bảnbao gồm: enzym phiên mã ngược (RT), integrase P32 và một protease P 11 [74]

Hình 1.1 Cấu tạo virut HIV [16]

Hình 1.2 Cấu trúc gen HIV [17]

1.2.2 Diễn biến quá trình nhiễm HIV

HIV làm suy giảm số lượng tế bào TCD4, từ đó gây ra suy giảm nghiêm trọngtình trạng miễn dịch dẫn đến bệnh nhân mắc các nhiễm trùng cơ hội và ung thư, suy

Enzym phiên mã ngược

kiệt và tử vong [82,84] Dòng di truyền của HIV là dòng di truyền ngược chiều từARN sang ADN chứ không phải thuận chiều ADN sang ARN [18]

Hình 1.3 Chu kỳ nhân lên của virut HIV [45]

Hình 1.4 Sự biến đổi thông số sinh học trên bệnh nhân nhiễm HIV [3].

Năm giai đoạn nhiễm HIV đã được xác định [17]:

Giai đoạn 1: Giai đoạn sơ nhiễm hay giai đoạn cửa sổ Sốt cấp nhất thời liên

quan đến biến đổi huyết thanh Thời kỳ ủ bệnh thường kéo dài 2 – 4 tuần Trong

máu xuất hiện virut (virema) và chưa có kháng thể Người bệnh thường bị sốt, viêmhọng, nổi hạch, nhức đầu, khó chịu, phát ban Triệu chứng này thấy ở 50 – 95%bệnh nhân nhưng không biểu hiện dấu hiệu đặc trưng, nên khi chẩn đoán dễ bịnhầm với bệnh khác Sự có mặt HIV trong máu được khẳng định thông qua xácđịnh ARN virut bằng kỹ thuật PCR, kháng thể kháng gp120 và gp41 xuất hiện sớm,kháng thể kháng P24 xuất hiện sau 6 tuần Do vậy đối với bệnh nhân âm tính cầnxác định lại kháng thể sau 3 tháng kể từ ngày có nguy cơ lây nhiễm HIV.

Giai đoạn 2: Nhiễm HIV không kèm theo triệu chứng Nhiều bệnh nhân khi

xét nghiệm huyết thanh dương tính nhưng không biểu hiện triệu chứng hoặc biểuhiện rất nhẹ như nhức đầu, nổi hạch Lượng tế bào T-CD4⁺ không giống nhau ở mỗingười, do đó cần xác định nhiều lần Hơn nữa tế bào T-CD4⁺ không hoàn toàn tỷ lệthuận với mức độ trầm trọng của bệnh Ở một số người tuy lượng tế bào T-CD4⁺thấp nhưng không biểu hiện triệu chứng, một số người khác có lượng tế bào T-CD4⁺ cao nhưng lại biểu hiện triệu chứng

- Kháng nguyên P24 tăng lên trong máu phản ánh mức độ nhân lên của virut

mà hệ thống bảo vệ của cơ thể không kiểm soát được

- Mức độ nhiễm cũng được thể hiện thông qua sự có mặt của nhiều loại phân

tử hòa tan trong huyết thanh, có khả năng hoạt hóa bạch cầu Do vậy, đối với bệnhnhân không biểu hiện triệu chứng cần phải kiểm tra lại không chỉ đối với việc giảm

số lượng tế bào T-CD4⁺ mà còn phải xem xét việc tang liên tục các phân tử hòa tanđặc trưng do sự nhiễm HIV có triệu chứng tiến triển chậm

Giai đoạn 3: Nhiễm HIV có triệu chứng giai đoạn sớm Việc chuyển giai đoạn

từ không triệu chứng sang có triệu chứng thể hiện thông qua sốt, vã mồ hôi về đêm,tiêu chảy mãn (do nhiễm virut ở màng nhày ruột), nổi hạch (chỉ thấy ở một sốngười) và đau đầu Ung thư Kaposi có thể xuất hiện sớm Bắt đầu xuất hiện cácbệnh cơ hội, đặc biệt là candidoz (do Candida albicans) nơi miệng, tăng bạch cầuniêm mạc miệng, nhiễm trùng đường hô hấp (trên và dưới) và quanh răng (nha chu)

Giai đoạn 4: Nhiễm HIV có triệu chứng giai đoạn muộn Khi số lượng tế bào

T-CD4⁺ càng giảm thì nguy cơ bệnh cơ hội càng tang Ví dụ, khi giảm xuống 200 tếbào/ml dễ bị viêm phổi và bệnh liên quan tới não do Toxoplasma Khi giảm đến còn

100 tế bào/ml dễ bị nhiễm hỗn hợp Mycobacterium avium – intracellulare hoặcCMV, phát triển Candida thực quản, viêm phổi do herpes khi cơ thể đã suy kiệt.Việc giải phóng TNF là dấu hiệu bước vào giai đoạn AIDS tiến triển và cơ thể đãkiệt sức

Giai đoạn 5: Nhiễm HIV giai đoạn tiến triển Lượng tế bào T-CD4⁺ giảm chỉ

còn 50 tế bào/ml làm mất hoàn toàn khả năng miễn dịch Ở giai đoạn này có thểxuất hiện tất cả các loại nhiễm trùng cơ hội Các biểu hiện của AIDS bao gồm:

- Nhiễm trùng cơ hội,

- Hội chứng suy kiệt tiến triển ở người lớn nhưng tốc độ suy kiệt lại diễn rachậm ở thanh thiếu niên

- Với bệnh nhân AIDS là thanh thiếu niên thì các nhiễm trùng thường xuyên khôngđược xem là nhiễm trùng cơ hội, ví dụ viêm phổi do vi khuẩn tái nhiễm hoặc lao phổi

- Một số ung thư như Kaposi, u lympho được coi là đặc trưng của AIDS

- Các bệnh tâm thần như bệnh não (giảm trí nhớ), bệnh viêm chất trắng não

- Viễm phổi kẽ mô lympho

1.2.3 Các giai đoạn lâm sàng của các bệnh nhiễm trùng cơ hội [13]

- Giai đoạn lâm sàng 1: Không triệu chứng

 Không có triệu chứng,

 Hạch to toàn thân dai dẳng

- Giai đoạn lâm sàng 2: Triệu chứng nhẹ

 Sút cân mức độ vừa không rõ nguyên nhân (< 10% trọng lượng cơ thể),

 Nhiễm trùng hô hấp tái diễn (viêm xoang, viêm amidan, viên tai giữa,viêm hầu họng),

 Zona (Herpes zoster),

 Viêm khoé miệng,

 Loét miệng tái diễn,

 Phát ban dát sẩn, ngứa,

 Viêm da bã nhờn,

 Nhiễm nấm móng

- Giai đoạn lâm sàng 3:

 Sút cân nặng không rõ nguyên nhân (> 10% trọng lượng cơ thể)

 Tiêu chảy không rõ nguyên nhân kéo dài hơn 1 tháng

 Sốt không rõ nguyên nhân từng đợt hoặc liên tục kéo dài hơn 1 tháng

 Nhiễm nấm Candida miệng tái diễn

 Bạch sản dạng lông ở miệng

 Lao phổi

 Nhiễm trùng nặng do vi khuẩn (viêm phổi, viêm mủ màng phổi, viêm đa

cơ mủ, nhiễm trùng xương khớp, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết

 Viêm loét miệng hoại tử cấp, viêm lợi hoặc viêm quanh răng

 Thiếu máu (Hb< 80g/L), giảm bạch cầu trung tính (< 0.5x109/L),và/hoặc giảm tiểu cầu mạn tính (< 50x10⁹/L) không rõ nguyên nhân

- Giai đoạn lâm sàng 4: Triệu chứng nặng

 Hội chứng suy mòn do HIV (sút cân >10% trọng lượng cơ thể, kèm theo sốtkéo dài trên 1 tháng hoặc tiêu chảy kéo dài trên 1 tháng không rõ nguyên nhân)

 Viêm phổi do Pneumocystis jiroveci (PCP)

 Nhiễm Herpes simplex mạn tính (ở môi miệng, cơ quan sinh dục, quanhhậu môn, kéo dài hơn 1 tháng, hoặc bất cứ đâu trong nội tạng)

 Nhiễm Candida thực quản (hoặc nhiễm candida ở khí quản, phế quản hoặc phổi)

 Lao ngoài phổi

 Sarcoma Kaposi

 Bệnh do Cytomegalovirus (CMV) ở võng mạc hoặc ở các cơ quan khác

 Bệnh do Toxoplasma ở hệ thần kinh trung ương

 Bệnh lý não do HIV

 Bệnh do Cryptococcus ngoài phổi bao gồm viêm màng não.

 Bệnh do Mycobacteria avium complex (MAC) lan tỏa

 Bệnh lý não chất trắng đa ổ tiến triển

(Progessive multifocal leukoencephalopathy -PML)

 Tiêu chảy mạn tính do Cryptosporidia

 Tiêu chảy mạn tính do Isospora

 Bệnh do nấm lan tỏa (bệnh nấm Penicillium, bệnh nấm Histoplasmangoài phổi)

 Nhiễm trùng huyết tái diễn (bao gồm nhiễm Sallmonella không phảithương hàn)

 U lympho ở não hoặc u lympho non-Hodgkin tế bào B

 Ung thư cổ tử cung xâm nhập (ung thư biểu mô)

 Bệnh do Leishmania lan tỏa không điển hình

 Bệnh lý thận do HIV

 Viêm có tim do HIV

1.3 Một số thuật ngữ xét nghiệm mới nhiễm HIV

Tỷ lệ mới nhiễm: là tỷ số người được phát hiện mới nhiễm HIV trên tổng số

người trong một nhóm quần thể trong khoảng thời gian được xác định, thường đượctính theo công thức: số người mới nhiễm HIV/ tổng số người/ đơn vị thời gian (VD:

số người nhiễm HIV/100.000 dân/12 tháng) [114]

Tỷ lệ hiện nhiễm: là tỷ lệ số người nhiễm HIV trên tổng số người trong một nhóm quần thể tại một thời điểm nhất định nào đó [12].

Phương pháp xét nghiệm mới nhiễm (RITA): Là xét nghiệm hoặc tổ hợp các

xét nghiệm cùng với xét nghiệm bổ sung, kết hợp với các thông tin lâm sàng đểphân loại nhiễm HIV gần đây hay đã lâu [114]

Giá trị trung bình thời gian mới nhiễm theo RITA: đây là một thông số cần

thiết đối với mới nhiễm HIV sử dụng RITA Trong khoảng lý tưởng từ 4 – 12 tháng,

giá trị trung bình thời gian có thể thay đổi theo RITA đặc hiệu được sử dụng chomỗi RITA hoặc cũng có thể thay đổi theo phân nhóm HIV Cần cân nhắc không nên

sử dụng một RITA trong ước tính tỷ lệ mới nhiễm trong một quần thể khi giá trịtrung bình thời gian chưa được xác định sẵn đối với quần thể đó và đối với các phânnhóm HIV ưu thế trong quần thể [115]

Tỷ lệ phân loại sai: là tỷ lệ phân loại sai những trường hợp nhiễm HIV lâu (>

1 năm) thành mới nhiễm Đây là một thông số cần thiết đối với mới nhiễm HIV sử

dụng RITA) [103,115].

Xét nghiệm chẩn đoán: để khẳng định một mẫu dương tính với xét nghiệm

sàng lọc có kháng thể đặc hiệu với HIV không Xét nghiệm khẳng định cần có độđặc hiệu cao [3, 6]

Chiến lược xét nghiệm: là các phương pháp xét nghiệm được ứng dụng cho

từng mục đích xét nghiệm khác nhau (chiến lược I: an toàn truyền máu, chiến lượcII: giám sát trọng điểm HIV, chiến lược III: chẩn đoán HIV) [8]

Phương pháp xét nghiệm: là cách phát hiện sự hiện diện kháng nguyên, kháng

thể hay các ADN/ARN trong máu hoặc dịch tiết của cơ thể người để xác định tìnhtrạng nhiễm HIV

1.4 Các phương pháp và kỹ thuật xét nghiệm trong giám sát dịch tễ và chẩn đoán HIV ở Việt Nam

Theo Quyết định 1098/QĐ-BYT - Hướng dẫn quốc gia về xét nghiệm Huyếtthanh học HIV, xét nghiệm HIV được tiến hành theo ba chiến lược khác nhau tùythuộc vào mục đích xét nghiệm [8]:

- Chiến lược I dùng trong an toàn truyền máu (hình 1.5)

Hình 1.5 Quy trình xét nghiệm trong an toàn truyền máu [8]

Chú thích: (1) Kết quả không được dùng cho mục đích chẩn đoán nhiễm HIV,

không thông báo kết quả cho người được xét nghiệm XN SP1: xét nghiệm sinh phẩm 1,SP1+: sinh phẩm 1 dương tính, SP2-: sinh phẩm 2 âm tính

- Chiến lược II áp dụng cho giám sát dịch tễ (hình1.6)

Hình 1.6 Quy trình xét nghiệm HIV trong giám sát dịch tễ học [8]

Chú thích: Sinh phẩm SP1, SP2 khác nhau về nguyên lý hoặc cách chuẩn bị kháng

nguyên (1) Kết quả phục vụ cho mục đích giám sát dịch tễ học HIV/AIDS khôngthông báo cho người được xét nghiệm XN SP1: xét nghiệm sinh phẩm 1, SP1+: sinh phẩm

1 dương tính, SP2-: sinh phẩm 2 âm tính, XN SP2: xét nghiệm sinh phẩm 2, SP1+SP2+:sinh phẩm 1 dương tính và sinh phẩm 2 dương tính, SP1+ SP2-: sinh phẩm 1 dương tính,sinh phẩm 2 âm tính

XN SP1

Loại bỏ đơn vị máu (1)

SP2 SP1 + hoặc không xác định

- Chiến lược III áp dụng cho xét nghiệm chẩn đoán nhiễm HIV (hình 1.7): xác

định tình trạng nhiễm HIV của người được làm xét nghiệm

Hình 1.7 Quy trình chẩn đoán nhiễm HIV ở người lớn và trẻ em

≥ 18 tháng tuổi [8]

Chú thích: Các sinh phẩm xét nghiệm SP1, SP2, SP3 khác nhau về nguyên lý hoặc cách

chuẩn bị kháng nguyên

 (1) Việc xét nghiệm lại bằng SP1, SP2 để kiểm tra loại trừ sai sót khi xét nghiệmbằng sinh phẩm SP1 hoặc SP2

 (2) Kết quả dương tính được dùng để kết luận các trường hợp nhiễm HIV với điềukiện thực hiện xét nghiệm tại phòng xét nghiệm được Bộ Y tế cho phépkhẳng định các trường hợp nhiễm HIV

 (3) Trường hợp kết quả xét nghiệm không xác định, lấy máu xét nghiệm lại lần thứ 2sau 14 ngày

SP1+SP2 SP3 SP1+SP2 -SP3 +

-KHÔNG XÁC ĐỊNH (3) DƯƠNG TÍNH (2)

SP1, SP2, SP3: sinh phẩm 1,2,3; XN SP1, XN SP2, XN SP3: xét nghiệm sinh phẩm1,2,3; SP+: sinh phẩm dương; SP-: sinh phẩm âm

1.4.1 Phương pháp xét nghiệm chẩn đoán gián tiếp HIV

Là phương pháp phát hiện sự hiện diện của kháng thể kháng HIV trong máuhoặc dịch tiết của cơ thể người

1.4.1.1 Kỹ thuật xét nghiệm nhanh (Rapid test)

Được chia thành một số loại kỹ thuật dựa trên nguyên lý sau: miễn dịch chấm

- thấm; miễn dịch lọc; miễn dịch sắc ký, là những nguyên lý kỹ thuật phổ biến trongcác sinh phẩm nhanh HIV trên thị trường Việt Nam Các loại sinh phẩm nhanhthường sử dụng là Detemine HIV-1/2, Alere Determine™ HIV-1/2 Ag/Ab ComboControls, SD Bioline HIV1/2 3.0, Vikia HIV 1/2, Double Check Gold HIV 1&2…[3]

Các xét nghiệm nhanh được thực hiện đơn giản, thuận lợi với số lượng mẫu ít;

dễ thực hiện, cho kết quả nhanh (trong vòng 30 phút), có thể đọc kết quả bằng mắtthường Xét nghiệm không đòi hỏi các trang thiết bị; dễ bảo quản sinh phẩm; vớicác sinh phẩm sử dụng được cả máu toàn phần thích hợp cho việc áp dụng chíchmáu đầu ngón tay để xét nghiệm chẩn đoán HIV ở những nơi điều kiện đi lại khókhăn [20]; có độ nhạy và độ đặc hiệu cao tương đương với kỹ thuật ELISA [16];một số sinh phẩm nhanh còn phân biệt được nhiễm HIV-1 và HIV-2 [21,29] Ngàynay một số sinh phẩm nhanh cho phép phát hiện đồng thời cả kháng nguyên P24 vàkháng thể kháng HIV trong mẫu bệnh phẩm [20] Tuy nhiên xét nghiệm này khôngthuận lợi khi số mẫu xét nghiệm nhiều; không lưu được dữ liệu kết quả; kết quả đọcphụ thuộc chủ quan vào người đọc

- Các xét nghiệm miễn dịch chấm - thấm, miễn dịch lọc (hình 1.8): là kỹ thuật

dựa trên nguyên tắc miễn dịch đánh dấu trên màng lọc; màng phản ứng chứa nhữnghạt vi lượng bao phủ kháng nguyên HIV-1 và HIV-2, đồng thời có một vùng chứng

để kiểm tra phản ứng; kháng thể kháng HIV có trong huyết thanh hoặc huyết tươngngười được làm xét nghiệm sẽ gắn với kháng nguyên trên màng lọc, phức hợpkháng nguyên - kháng thể này được phát hiện bởi cộng hợp có gắn enzym cho phảnứng hiện màu với cơ chất [21]

Hình 1.8 Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch đánh dấu trên màng lọc [3]

- Các xét nghiệm miễn dịch sắc ký (hình 1.9): mẫu xét nghiệm sẽ được nhỏ

lên vùng nhỏ mẫu thử Huyết thanh/huyết tương sẽ thấm qua vùng có chứa cộng hợp

là kháng nguyên vi rút đã gắn với một chất đánh dấu mầu và tiếp tục dịch chuyển quavùng phản ứng đã cố định kháng nguyên (xét nghiệm dương tính khi có hai vạch màu

ở vùng phản ứng và vùng kiểm chứng; xét nghiệm âm tính khi chỉ có vạch màu ở vùngkiểm chứng; xét nghiệm không có giá trị nếu không có vạch màu ở vùng chứng, khi đóphải thực hiện lại xét nghiệm mẫu đó trên thanh sinh phẩm mới) [16]

Hình 1.9 Nguyên lý kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch sắc ký [3]

1.4.1.2 Kỹ thuật xét nghiệm ngưng kết hạt vi lượng (hình 1.10)

Kỹ thuật ngưng kết hạt vi lượng được coi là đơn giản; những hạt hữu hình(gelatin, latex, hồng cầu) được gắn với các thành phần kháng nguyên của vi rút HIV-1/HIV-2 sẽ cho phản ứng ngưng kết khi có sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu với HIVnếu có trong mẫu thử (hình 1.10) [54] Các bước thực hiện tương đối đơn giản, khôngđòi hỏi nhiều trang thiết bị, thích hợp cho việc xét nghiệm sàng lọc hàng loạt mẫu máu;

kỹ thuật này không mất nhiều thời gian như ELISA và kết quả có thể đọc được bằngmắt thường sau 2 giờ; độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật này cao; tỷ lệ dương tính giả

thấp [3] Tuy nhiên các thao tác phức tạp hơn các sinh phẩm nhanh; thời gian đọc kết

quả lâu hơn sinh phẩm nhanh; đòi hỏi cán bộ có kinh nghiệm và thao tác thành thạo;hạn sử dụng một số hóa chất sau khi mở là 14 ngày [54].

Hình 1.10 Nguyên lý kỹ thuật ngưng kết hạt [3]

1.4.1.3 Các kỹ thuật miễn dịch gắn enzym ELISA (hình 1.11)

Có ba nguyên lý kỹ thuật ELISA [3]: ELISA gián tiếp, ELISA cạnh tranh vàELISA sandwich Hiện nay các sinh phẩm xét nghiệm chẩn đoán HIV trên thị trườngViệt Nam chủ yếu là nguyên lỹ kỹ thuật ELISA sandwich (hình 1.11): kháng thể khángHIV có trong mẫu thử sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên vi rút đã được cố địnhtrên phiến nhựa vi lượng Phức hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ được phát hiện bởicộng hợp là các kháng nguyên vi rút gắn enzym khi cho phản ứng hiện màu với cơ chấtthích hợp Giá trị mật độ quang (OD) của phản ứng màu tỷ lệ thuận với lượng khángthể kháng HIV hiện diện trong mẫu thử Sinh phẩm ELISA Sandwich như Murex1.2.O, Murex HIV Ag/Ab Combination, SD HIV ELISA 3.0…

Kỹ thuật này cho phép thực hiện đồng thời nhiều mẫu Có thể dùng máy tựđộng giảm bớt thao tác cho người làm xét nghiệm, tránh sai sót và lây nhiễm; đọckết quả bằng máy không phụ thuộc vào chủ quan của người làm xét nghiệm; có thểlưu các bảng kết quả và các thông số kỹ thuật thuận lợi cho việc kiểm tra đánh giáchất lượng xét nghiệm Thực hiện xét nghiệm trên số lượng mẫu > 40 mẫu/ngày [3]

Kỹ thuật xét nghiệm phát hiện đồng thời kháng nguyên và kháng thể Một số sinhphẩm dùng kỹ thuật phát hiện đồng thời kháng nguyên vi rút (P24) và kháng thểkháng HIV cho phép phát hiện sớm nhiễm HIV trong giai đoạn chuyển đổi huyếtthanh [46] Tuy nhiên kỹ thuật ELISA cần có sự đầu tư cho trang thiết bị ban đầu vàbảo dưỡng, hiệu chuẩn, hiệu chỉnh máy móc; cán bộ xét nghiệm phải được đào tạo

tốt; các sinh phẩm phải bảo quản ở nhiệt độ lạnh (4-80C); thời gian thực hiện xétnghiệm ELISA từ 2-3 giờ [101]

Hình 1.11 Nguyên lý kỹ thuật ELISA Sandwich [3]

Dựa trên cách chuẩn bị các kháng nguyên, các sinh phẩm được chia thành 4thế hệ [3]:

- Thế hệ thứ nhất sử dụng kháng nguyên là vi rút toàn phần được ly giải và

tinh chế từ các tế bào đã gây nhiễm với HIV Các sinh phẩm này có độ nhạy và độđặc hiệu hạn chế

- Thế hệ thứ hai dùng các kháng nguyên là protein tái tổ hợp Sinh phẩm có

độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn

- Thế hệ thứ ba sử dụng các kháng nguyên là các peptite tổng hợp và các

protein tái tổ hợp Độ nhạy và độ đặc hiệu được cải thiện rõ rệt

- Thế hệ thứ tư phát hiện đồng thời kháng nguyên P24 và kháng thể có trong

mẫu thử, sinh phẩm này cho phép phát hiện nhiễm HIV trong giai đoạn chuyển đổihuyết thanh và là sinh phẩm được khuyến cáo nên lựa chọn cho kiểm tra an toàntrong truyền máu

1.4.1.4 Kỹ thuật Western-blot (hình 1.12)

Kỹ thuật Western-blot là tiêu chuẩn vàng được chỉ định để xét nghiệm khẳngđịnh cuối cùng các mẫu đã có kết quả dương tính với xét nghiệm sàng lọc Kỹ thuậtnày có độ đặc hiệu rất cao (100%) và chỉ dùng để làm xét nghiệm khẳng định màkhông dùng làm xét nghiệm sàng lọc Kỹ thuật Western Blot có giá thành cao hơn tất

cả các xét nghiệm trên, người thực hiện xét nghiệm và đọc kết quả cần phải có trình

độ và kinh nghiệm nhất định nên hiện nay WHO không khuyến cáo thực hiện thường

quy ở những nước đang phát triển WHO khuyến cáo dùng phối hợp ba xét nghiệmkhác nhau về nguyên lý hoặc cách chuẩn bị kháng nguyên theo chiến lược III để chẩnđoán khẳng định trường hợp HIV dương tính Trường hợp sử dụng các sinh phẩm đểchẩn đoán nhiễm HIV theo chiến lược xét nghiệm III cho kết quả không xác địnhhoặc khó biện luận, khi đó Western-blot được cân nhắc sử dụng để xét nghiệm [28].Theo WHO xét nghiệm Western Blot HIV-1 dương tính khi xuất hiện ítnhất 02 trong 03 dải băng protein vỏ Env (gp160, gp120, gp41) có thể có hoặckhông có các dải băng Gag hoặc Pol Trường hợp âm tính khi không có bất cứdải băng nào Ngoài tiêu chuẩn dương tính và âm tính là trường hợp kết quảkhông xác định (hình 1.12) [28].

Hình 1.12 Hình ảnh kết quả Western blot HIV-1 [3]

Chú thích: 1 - chứng dương, 2 - chứng âm, 3 - kết quả mẫu dương tính

1.4.2 Phương pháp xét nghiệm chẩn đoán trực tiếp

Là phương pháp tóm bắt trực tiếp tác nhân gây bệnh (hay còn gọi là xétnghiệm vi rút học) như phát hiện kháng nguyên virut trong máu (P24), các axitnucleotit của virut: ARN hoặc ADN provirut (tế bào nhiễm) hoặc phân lập virutbằng nuôi cấy tế bào [3]

Phương pháp xét nghiệm trực tiếp được dùng để phát hiện nhiễm HIV ở trẻdưới 18 tháng tuổi [11] Đối với trẻ em sinh ra từ mẹ nhiễm HIV, kháng thể kháng

HIV của mẹ có thể tồn lưu trong máu trẻ cho đến trước 18 tháng tuổi do đó xétnghiệm phát hiện kháng thể dương tính ở trẻ chưa thể kết luận trẻ bị nhiễm HIV màcần thực hiện các xét nghiệm virut học Xét nghiệm chẩn đoán nhiễm HIV cho trẻsinh từ mẹ có huyết thanh dương tính nên được tiến hành từ 4 - 6 tuần sau khi sinhhoặc sau đó càng sớm càng tốt với các kỹ thuật phát hiện ADN/ARN provirut hoặckháng nguyên P24 của HIV [120,121] Kỹ thuật PCR phát hiện HIVADN thườngđược chỉ định do có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, có thể sử dụng lấy trên giấy thấm giọtmáu khô (DBS) dễ bảo quản và vận chuyển từ những nơi xa phòng xét nghiệm [96].Trẻ cần được khẳng định sớm tình trạng nhiễm HIV để được điều trị sớm không cầnchờ có các dấu hiệu lâm sàng hoặc suy giảm miễn dịch [13].

Các phương pháp trực tiếp phát hiện tác nhân virut còn được dùng trong cáctrường hợp chẩn đoán sớm nhiễm HIV ở người lớn trong giai đoạn cửa sổ chưa có

sự chuyển đổi huyết thanh hoặc khi xét nghiệm bằng phương pháp gián tiếp tìmkháng thể có kết quả không rõ ràng [3, 8]

1.4.2.1 Các kỹ thuật phát hiện kháng nguyên P24 (antigen P24)

Kháng nguyên P24 là protein cấu thành của lõi vi rút, bao bọc các chất liệu ditruyền và là một chỉ số phản ánh sự nhân lên của vi rút Kháng nguyên P24 tồn tạidưới dạng tự do hoặc trong phức hợp kháng nguyên-kháng thể [45, 56] Phát hiệnkháng nguyên P24 thông thường được sử dụng trong:

- Chẩn đoán nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh [11]: Đây là một kỹ thuật kém nhạy

nhưng rất đặc hiệu Hiện nay, các sinh phẩm phát hiện kháng nguyên P24 đã đượchoàn thiện để nâng cao độ nhạy

- Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV [3]: Trong giai đoạn đầu mới

nhiễm HIV, kháng nguyên P24 có thể được phát hiện trước khi có sự biến đổi huyếtthanh, ở giai đoạn cửa sổ khi chưa có kháng thể

- Theo dõi diễn tiến nhiễm HIV [14]: Kháng nguyên P24 có thể được phát

hiện rất sớm ở giai đoạn mới nhiễm Cùng với sự xuất hiện kháng thể, nồng độkháng nguyên P24 tự do trong máu giảm Ở giai đoạn cuối, cùng với sự giảm khángthể kháng P24, sự tái xuất hiện và gia tăng nồng độ P24 tự do là một tiên lượngchuyển sang AIDS

- Theo dõi đáp ứng điều trị với thuốc kháng vi rút [4,12]

- Phát hiện có sự nhân lên của vi rút trong nuôi cấy tế bào.

1.4.2.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện ARN hoặc ADN provirut HIV

- Các kỹ thuật PCR và Real Time PCR phát hiện ADN tiền vi rút trong tế bàonhiễm hoặc HIV - ARN trong huyết tương, được áp dụng trong xét nghiệm pháthiện sớm nhiễm HIV [63, 11]; đo tải lượng vi rút trong theo dõi điều trị [4, 7]

- Các nguyên tắc của các kỹ thuật sinh học phân tử HIV: Phản ứng PCR là kỹthuật cho phép khuếch đại một lượng rất nhỏ phân tử ADN đích được tách chiết từcác tế bào nhiễm hoặc được tổng hợp từ các ARN của vi rút nhờ enzym sao chépngược RT (ADNc) [96]; kỹ thuật Real time PCR - cho phép khuếch đại và xác định

số lượng các chuỗi ADN được tạo ra trong từng chu kỳ nhiệt [3]

Các sinh phẩm dùng trong xét nghiệm HIV phải có độ nhạy tối thiểu >99,5% với các sinh phẩm xét nghiệm nhanh, 100% với các kỹ thuật ELISA/hóa phátquang/điện hóa phát quang và độ đặc hiệu tối thiểu > 98% Các tiêu chuẩn này cầndựa theo các đánh giá tiêu chuẩn của WHO, CDC Hoa kỳ hoặc đánh giá của Quốcgia và các tổ chức có uy tín khác [8]

1.5 Các kỹ thuật xét nghiệm xác định tỷ lệ mới nhiễm HIV

Từ năm 2008, WHO/ UNAID đã thành lập một nhóm chuyên gia kỹ thuật đểphát triển các hướng dẫn quốc gia, đánh giá và sử dụng các xét nghiệm phát hiệnmới nhiễm HIV Đến năm 2017, tám kỹ thuật xét nghiệm mới nhiễm HIV đã được

sử dụng trên thế giới (bảng 1.1) Một vài kỹ thuật phát triển đặc biệt với mục đíchxác định tỷ lệ mới nhiễm trong quần thể, trong khi một số kỹ thuật khác đượcthương mại hóa sử dụng cho mục đích chẩn đoán [119] Với một số ít các kỹ thuậtđược chấp nhận trong xét nghiệm HIV, hầu hết các kỹ thuật được liệt kê ở bảng1.1 đều chưa được đánh giá phù hợp để đạt được các giá trị chính xác của giá trịtrung bình thời gian mới nhiễm và tỷ lệ phân loại sai trong các phân nhóm HIV-1[73,88,108]

Bảng 1.1 Tổng hợp tám kỹ thuật phát hiện mới nhiễm HIV đang sử dụng trên thế giới

Kỹ thuật xét nghiệm Loại hình xét nghiệm Hạn chế của sinh phẩm Đã được thương mại hóa (nếu có)

Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym

- Kỹ thuật yêu cầu tách riêng mẫu hiệu chuẩn

(calibrator) cho từng phân nhóm riêng biệt Điềunày đã dẫn đến việc sẽ có các thông số RITAkhác nhau cho từng phân nhóm

- PLS là mới nhiễm với: những người nhiễm

HIV lâu có miễn dịch tốt và những người đangđiều trị ARV

Aviod [68]

Kỹ thuật đo tỷ lệ, sinh phẩm gồm:

BED-CEIA

Tỷ lệ PLS là mới nhiễm với: những người nhiễm HIV

lâu có miễn dịch tốt và những người đang điềutrị ARV

- Sedia BioCences Corporration

- Caplypte Biomedical Corporration

[91]

Kỹ thuật ái lực, sinh phẩm gồm:

- Anti-HIV 1+2

- AxSYM HIV-1/2 gO,

- Avidity Index và LAg-Avidity

EIA,

- Biorad HIV1/2+O Avidity EIA

Ái lực PLS là mới nhiễm với: những người nhiễm HIV

lâu có miễn dịch tốt và những người đang điềutrị ARV

- Ortho Clinical Diagnostic [37],

- Abbott [105, 106],

- Kỹ thuật nội bộ [117],

- Kỹ thuật nội bộ [77]

Kỹ thuật xét nghiệm Loại hình xét nghiệm Hạn chế của sinh phẩm Đã được thương mại hóa (nếu có)

Kỹ thuật ưu thế miễn dịch, sinh

phẩm gồm: IDE-V3

Miễn dịch trội Kỹ thuật có độ nhạy thấp Kỹ thuật nội bộ [24]

Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên

- Yêu cầu một số lượng mẫu lớn trong quần

thể để đạt làm được các ước tính mới nhiễm

Kỹ thuật phát hiện ARN HIV Phát hiện trực tiếp

Kỹ thuật phát hiện kháng thể

kháng P24 IgG3, sinh phẩm gồm:

Anti-p24 IgG3

Phản ứng với kháng thể kháng P24

Các kết quả tìm ra chưa được đánh giá trên cácquần thể nhiễm HIV khác nhau với các phânnhóm khác nhau

1.5.1.Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym kém nhạy (Less-sensitive enzym immunoassay)

Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý miễn dịch gắn enzym (EIA) đã thayđổi một chút cho phù hợp với các xét nghiệm phát hiện sớm nhiễm HIV: xácđịnh được nồng độ kháng thể tăng dần trong một khoảng thời gian [68] Các mẫu đã được khẳng định nhiễm HIV sẽ được pha loãng 1/20 000

và giảm thời gian ủ mẫu trong quá trình xét nghiệm lại bằng kỹ thuật miễndịch gắn enzym kém nhạy Những người mới nhiễm HIV và đáp ứng miễndịch sớm sẽ có nồng độ kháng thể thấp vì vậy sẽ cho kết quả âm tính trongxét nghiệm miễn dịch gắn enzym kém nhạy này [65]

Hai kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch gắn enzym kém nhạy đã phát triểnthành sinh phẩm thương mại trên thi trường (Abbott 3A11 và Avioq HIV-1)[68] Tuy nhiên sinh phẩm Abbott 3A11 hiện nay đã ngừng sản xuất Cácsinh phẩm xét nghiệm nhanh đang được phát triển thay thế dần cho các xétnghiệm EIA [69] Hạn chế của các sinh phẩm là chỉ phù hợp với phân nhóm

B của HIV-1, mặt khác giá trị trung bình về thời gian mới nhiễm HIV chokết quả khác nhau với các phân nhóm khác nhau vì vậy không được ứngdụng rộng rãi trên thế giới [114]

1.5.2 Các kỹ thuật xác định tỷ lệ kháng thể IgG

Các kỹ thuật này được ứng dụng để xác định tỷ lệ kháng thể IgG khángHIV trên toàn bộ kháng thể IgG có trong huyết thanh/huyết tương Kháng thểIgG kháng HIV ở người mới nhiễm sẽ thấp hơn so với người đã nhiễm lâu Sinhphẩm BED-CEIA được phát triển dựa trên nguyên lý này: sử dụng một peptidephân nhánh, gồm các trình tự đặc hiệu trên gp41 của ba phân nhóm B, E và D;đoạn peptide chung cho nhiều phân nhóm này sau đó được dùng để đo tỷ lệđang tăng lên của kháng thể IgG đặc hiệu HIV so với IgG toàn phần sau giaiđoạn chuyển đổi huyết thanh Sinh phẩm BED được ứng dụng để ước tính tỷ lệmới nhiễm trong quần thể [91]

1.5.3 Các kỹ thuật ái lực

Ái lực có liên quan đến sức mạnh liên kết giữa kháng nguyên và khángthể đặc hiệu HIV Các kỹ thuật ái lực dựa trên giả thuyết rằng các kháng thể

có ái lực thấp sẽ được nhận định là mới nhiễm gần đây Theo cách đo tổng sốkháng thể kháng HIV, một tác nhân biến tính được thêm vào để tách cáckháng thể có ái lực yếu ra ngoài Chỉ số ái lực sau đó sẽ được tính [37,77,106, 117]

1.5.4 Kỹ thuật IDE-V3 (ưu thế miễn dịch)

Kỹ thuật IDE-V3 dựa trên hai trình tự miễn dịch di truyền học bảo thủtìm thấy ở phần bao ngoài (envelop) của HIV-1 Trình tự thứ nhất là vùngquyết định kháng nguyên (IDE) gp41 bao gồm 2 oligopeptide loại 30 aminoacid; còn một từ nhóm M và phân nhóm D Trình tự thứ hai là từ mạch vòngV3 của gp120 bao gồm 5 oligopeptide từ các phân nhóm A, B, C, D và E Kỹthuật này sử dụng công thức toán học để tính nồng độ kháng thể liên kết vớikháng nguyên từ mỗi vùng để phân biệt người mới nhiễm HIV [24]

1.5.5 Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên p24

Kỹ thuật này thường sử dụng để phát hiện nhiễm HIV sau vài ngày cónguy lây nhiễm trước khi xuất hiện kháng thể Mức độ kháng nguyên p24 sẽgiảm dần thì hệ thống miễn dịch của cơ thể tăng lên Phát hiện được khángnguyên p24 trong thời gian đầu khi cơ thể chưa sinh ra kháng thể cũng đượcxem như là một xét nghiệm phát hiện sớm mới nhiễm HIV Tuy nhiên p24chỉ xuất hiện nhiều trong khoảng 1-2 tuần đầu tiên sau khi lây nhiễm, sau đómất dần thay vào đó là sự tăng lên của các kháng thể IgG, chính vì vậy cácxét nghiệm khó có thể phát hiện trong thời gian này [125]

1.5.6 Kỹ thuật phát hiện ARN HIV

Kỹ thuật này thường sử dụng để phát hiện nhiễm ARN có trong huyếttương người khi chưa xuất hiện kháng thể và được sử dụng như một sinhphẩm phát hiện sớm mới nhiễm HIV ARN có thể phát hiện sớm hơn cảkháng nguyên p24, thời gian tồn tại ARN kéo dài hơn p24 nên có thể dùngtrong phát hiện sớm mới nhiễm HIV Thêm vào đó xét nghiệm có thể dùng

cách trộn các mẫu (pool) làm tăng độ chính xác trong kỹ thuật khuyếch đạiARN và giảm giá thành sản phẩm Tuy nhiên để sử dụng phát hiện mớinhiễm HIV đòi hỏi cỡ mẫu rất lớn, khó triển khai trong quần thể [125].

1.5.7 Kỹ thuật phát hiện kháng thể IgG 3 kháng p24 (IgG3 anti-p24)

Dạng IgG 3 thường xuất hiện trong thời gian đầu mới nhiễm HIV, làkháng thể kháng lại p24 Sử dụng kỹ thuật miễn dịch gắn enzym (EIA) đểphát hiện IgG 3 trong vòng 1-4 tháng đầu mới nhiễm HIV Các kết quả từnhững nghiên cứu đầu tiên chưa được sử dụng cho các quần thể khác với cácphân nhóm khác nhau [125]

1.5.8 Kỹ thuật miễn dịch dòng

Kỹ thuật miễn dịch dòng tương tự như kỹ thuật Western Blot nhưng sửdụng khoảng giới hạn oligopeptide tổng hợp và các kháng nguyên tái tổ hợpcủa cả HIV-1 và HIV-2 Thông thường kỹ thuật sẽ được sử dụng như một xétnghiệm khẳng định cuối cùng để xác định sự có mặt của kháng thể khángHIV Sinh phẩm INNO-LIA HIVI/II Score- hãng Innogenetic được sử dụng đểxét nghiệm xem một người hoặc là mới nhiễm hoặc không phải là mới nhiễmHIV [98] Kỹ thuật này có chi phí cao nên sử dụng cho mục đích khẳng địnhcuối cùng với HIV

Ở Việt Nam, các kỹ thuật phát hiện P24, ARN/ADN, Western Blot được sử

dụng là xét nghiệm thường quy trong chẩn đoán và phát hiện tỷ lệ hiện nhiễm, chưa

có một nghiên cứu nào sử dụng các sinh phẩm này để ước tính tỷ lệ mới nhiễm dogiá thành cao và cỡ mẫu cần quá lớn

Đến năm 2010, sinh phẩm BED và LAg-Avidity mới chính thức đưavào nghiên cứu ở Việt Nam với quy mô lớn [123]

- Sinh phẩm miễn dịch gắn enzym tóm bắt B,E,D (BED-CEIA)

Dùng để đo tỷ lệ của kháng thể đặc hiệu IgG với tổng số kháng thể IgG cótrong huyết thanh, huyết tương hoặc trên mẫu giọt máu khô DBS, mẫu giọthuyết tương khô DPS để xác định được tỷ lệ mới nhiễm HIV trong một quần thể

[102] Sinh phẩm này được sử dụng phục vụ chủ yếu trong các nghiên cứu giám sátdịch tễ học HIV [36, 102]

Sinh phẩm BED được thiết kế dựa vào nguyên lý miễn dịch gắnenzym để đo được các mức độ tiến triển của kháng thể kháng HIV theothời gian kể từ sau khi chuyển đổi huyết thanh (hình 1.13) Sử dụng mộtpeptide phân nhánh, gồm các trình tự đặc hiệu trên gp41 của ba phânnhóm B, E và D Đoạn peptide chung cho nhiều phân nhóm này sau đóđược dùng để đo tỷ lệ đang tăng lên của kháng thể IgG đặc hiệu HIV so vớiIgG toàn phần sau giai đoạn chuyển đổi huyết thanh [111] Ngưỡng cut-offđược ghi nhận là 1,0; độ nhạy là 89,1%; độ đặc hiệu là 89,1%; độ chínhxác để ước tính mới nhiễm là 93% [91]

Sinh phẩm BED sau khi được thẩm định ở CDC Atlanta (Mỹ) đãtiếp tục được triển khai để hoàn thiện sinh phẩm [48, 65, 89-91, 92, 94].Hạn chế của sinh phẩm BED là ước lượng cao tỉ lệ mới nhiễm HIV‐1 dophân loại sai một số các trường hợp nhiễm lâu (đã nhiễm hơn 1 năm) thànhmới nhiễm trong các nghiên cứu cắt ngang [109]

Sinh phẩm BED chỉ mới được thẩm định và tính toán tỷ lệ phân loạisai PLS với một số quần thể tại Châu Phi, Châu Âu và Mỹ, do đó vẫnchưa khẳng định có thể áp những tỷ lệ này cho các khu vực khác ở Châu

Peroxidase, pha loãng 1/1000 (90 phút/37 o C)

Streptavidin-TMB Cộng hợp (15 phút/25 o C) Goat-anti-human-IgG Capture Antibody

Hình 1.13 Nguyên lý sinh phẩm BED-CEIA

- Sinh phẩm miễn dịch gắn enzym ái lực kháng nguyên giới hạn rIDR‐M Avidity)

(LAg-Do tỷ lệ phân loại sai cao dẫn đến ước tính quá cao các trường hợp mớinhiễm HIV-1 trong một số báo cáo đã ghi nhận đối với sinh phẩm BED [26,

59, 66] nên các hiệu chỉnh đã được thực hiện để cải tiến độ chính xác củasinh phẩm trong ước tính mới nhiễm [62, 78] Một số nghiên cứu được đưa

ra để giảm tỷ lệ phân loại sai sử dụng thuật toán liên kết cả BED CEIA vàphương pháp ái lực [31, 71] Tuy nhiên một số ít các kết quả đã chỉ ra sai sốnày vẫn tương tự như những sinh phẩm kém nhạy khác Chính vì vậy CDCAtlanta (Mỹ) đã phát triển các sinh phẩm ái lực liên kết sử dụng một proteintái tổ hợp (rIDR‐M) chung cho nhiều phân nhóm gộp 3 trình tự của cáckhu vực quyết định kháng nguyên (rIDR) của gp41, đại diện cho các đadạng phân nhóm HIV‐1 từ A đến E (nhóm M) [103, 117] Trình tự thứ nhất

là trình tự chung nhất thuộc phân nhóm A, B, C, F, G, H, J, và K và các tái

tổ hợp AG, AB, AC, BF, BG [68] Trình tự thứ hai là chung cho phân nhóm

AE từ Thái Lan và trình tự thứ ba là chung cho phân nhóm D và tái tổ hợp

AD Protein tái hổ hợp này được biểu hiện trong E Coli [117]

Sinh phẩm LAg-Avidity HIV-1 là sinh phẩm thế hệ mới đo ái lựckháng thể HIV-1 và xác định tình trạng mới nhiễm hay đã nhiễm lâubằng việc tham chiếu các số trong kết quả đo được trong xét nghiệm EIAvới kết quả của mẫu chuẩn đi kèm sinh phẩm [103]

Nguyên lý của sinh phẩm này (hình 1.14) là các kháng thể được tổnghợp sớm trong quá trình nhiễm HIV sẽ gắn với kháng nguyên được chuẩnbị trong giếng không mạnh bằng những kháng thể hoàn chỉnh hơn đượctổng hợp ở giai đoạn sau Ái lực kháng thể tăng lên theo quá trình nhiễmbệnh là do đáp ứng miễn dịch đối với quá trình nhiễm bệnh hoàn thiệnhơn [103]

Kết quả nghiên cứu ở một số nước cho thấy sinh phẩm này cho