NGHIÊN cứu tác DỤNG điều TRỊ TRĨ của VIÊN TRĨ THIÊN dược TRÊN mô HÌNH gây TRĨ THỰC NGHIỆM

Mã số đề tài:BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ TRĨ CỦA VIÊN TRĨ THIÊN DƯỢC TRÊN MÔ HÌNH GÂY TRĨ THỰC NGHIỆM... Đánh giá tác dụng điều trị trĩ của viên Trĩ Thiên Dược trên mô

Mã số đề tài:

BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ TRĨ CỦA VIÊN TRĨ THIÊN DƯỢC TRÊN MÔ HÌNH GÂY TRĨ THỰC NGHIỆM

Hà Nội – 2018

MỤC LỤC

I ĐẶT VẤN ĐỀ 1

II TỔNG QUAN 2

2.1 Cây rau sam 2

2.2 Cây dền gai 3

III ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 5

3.1 Đối tượng nghiên cứu 5

3.1.1 Thuốc nghiên cứu 5

3.1.2 Động vật thí nghiệm 5

3.1.3 Thuốc và hóa chất phục vụ nghiên cứu 6

3.2 Phương pháp nghiên cứu 6

3.3 Xử lý số liệu 9

3.4 Địa điểm nghiên cứu 9

IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 9

4.1 Gây mô hình trĩ thực nghiệm bằng hỗn hợp dầu croton 9

4.2 Đánh giá tác dụng điều trị trĩ của viên Trĩ Thiên Dược trên mô hình gây trĩ thực nghiệm bằng hỗn hợp dầu croton 15

V BÀN LUẬN 31

VI KẾT LUẬN 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh trĩ là tình trạng các yếu tố cơ học làm giãn, lỏng lẻo hệ thống nâng

đỡ gây sa và giãn búi mạch ống hậu môn gây chảy máu [1], [2] Trĩ là bệnhthường gặp với tần suất ngày càng gia tăng bởi lối sống hiện đại Dựa vào vịtrí giải phẫu bệnh được chia thành ba loại: Trĩ nội - khi búi trĩ nằm ở khoangdưới niêm mạc và trên đường lược; trĩ ngoại - khi búi trí nằm ở khoang cạnhhậu môn, dưới đường lược và sa ra ngoài ống hậu môn; trĩ hỗn hợp – thường

là cả trĩ nội và trĩ ngoại phân cách với nhau bởi đường lược Bệnh trĩ ảnhhưởng tới cuộc sống của bệnh nhân bởi các triệu chứng đi ngoài phân máu, sabúi trĩ, đau rát khi đi đại tiện, sưng nề vùng hậu môn Bên cạnh đó, hiện tượng

sa lồi búi trĩ là yếu tố thuận lợi gây viêm nhiễm vùng hậu môn dẫn tới sưngđau hậu môn và ngứa thường xuyên do hiện tượng viêm xuất tiết xung quanhbúi trĩ sa [1]

Bệnh trĩ là bệnh thường gặp nhất trong các bệnh hậu môn-trực tràng, do

đó, nhu cầu về thuốc điều trị trĩ là rất lớn [3] Ngày nay, một số thuốc đượclưu hành trên thị trường dược phẩm của các nước tiên tiến như Pháp, Mỹ, với giá nhập khẩu cao không phù hợp với mức sống của người lao động ViệtNam Vì vậy, việc sử dụng các thuốc y học cổ truyền đang dần trở thành xuhướng phổ biến do vừa có hiệu quả điều trị, lại ít gặp tác dụng không mongmuốn Hơn nữa, nước ta có rất nhiều cây thuốc với các nhóm chất có hoạttính sinh học điều trị bệnh trĩ cần được nghiên cứu và phát triển, trong đó có

cây rau sam (Portulaca oleracea L.) và cây dền gai (Amaranthus spinosus L.).

Hiện nay, trên thế giới có nhiều loại thuốc điều trị bệnh trĩ đa phần là cácflavonoid như Daflon, Ginkgo Fort … Vì vậy cần tìm nhóm hoạt chất có tácdụng sinh học của các phân đoạn flavonoid có tác dụng chữa trị bệnh trĩ củacây dền gai và các phân đoạn có hoạt tính sinh học của cây rau sam, sau đóphối hợp các phân đoạn với nhau để tìm ra tỷ lệ thích hợp nhất để viên thuốc

có hiệu quả điều trị bệnh Tác dụng điều trị bệnh trĩ của viên Trĩ Thiên Dược

gồm thành phần chính là cao phân đoạn flavonoid của cây dền gai và cây rausam được nghiên cứu trên các mô hình dược lý thực nghiệm.

Mục tiêu của chuyên đề: Đánh giá tác dụng điều trị trĩ của viên Trĩ Thiên Dược trên mô hình gây trĩ thực nghiệm.

II TỔNG QUAN

2.1 Cây rau sam (Portulaca oleracea L., họ Portulacaceae)

Cây rau sam có tên khoa học là (Portulaca oleracea L.) thuộc họ rau sam

Portulacaceae Theo Võ Văn Chi (1997a), cây thảo mọc bò có thân mọc màu

đỏ tím nhạt Lá dày bóng, hình bầu dục, không cuống, giống hình răng conngựa Hoa màu vàng, mọc ở đầu cành và ngọn thân Quả nang hình cầu, mở

bằng một nắp (quả hộp) chứa nhiều hạt đen bóng (Hình 2.1)

Hình 2.1 Hình ảnh cây rau sam (Portulaca oleracea L.)

Theo Võ Văn Chi (1997b), cây rau sam có một số hoạt chất sau:glycosid, saponin, chất nhầy, acid hữu cơ, các muối kali, các vitamin A, B, C,

PP Theo y học cổ truyền cây có vị chua, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt,tán huyết, sát trùng Rau sam thường được dùng trong dân gian để chữa huyếtnhiệt, đái ra máu, ho ra máu, ung nhọt, lở ngứa, đại tiện táo bón, ho gà, ngoài

ra còn dùng để trị giun kim, giun đũa Về thành phần hóa học của cây rau

sam, tùy vùng thổ nhưỡng, rau sam tích lũy nitrat, chất này có thể tiêu thụ ởmức độ vừa phải, các sắc tố ở rau sam là betacyanidin đã được acetyl hóa(Viện Dược liệu, 2004) Theo tài liệu khác, rau sam chứa 3-6,49%carbohydrat, 0,5% lipid, 1,4-1,8% protein, 85 mg % Ca, 56 mg % P, 1-5mg %

Fe, 26 mg % vitamin C, 0,32 mg % caroten, 0,03mg % vitamin B1, 0,11 mg %vitamin B2 và 0,7mg % PP Ước tính 100g rau sam có thể chứa 4900 đơn vịquốc tế vitamin A, 20 đơn vị quốc tế vitamin B và 280 đơn vị quốc tế vitamin

C Một tài liệu khác cho biết rau sam mọc ở Đài Loan chứa acid hữu cơ, kalinitrat, kali sulfat và các muối kali khác; ngoài ra, còn có 71-100

•g/gcarotenoid bao gồm lutein và β-caroten với hàm lượng 29,8 •g/g Lá rausam chứa 54-61% lutein và violaxanthin, 24-31% β-caroten, 10-14%

neoxanthin và α-ryptoxanthin Tác dụng dược lý được đề cập đến của rau sam

là tác dụng điều trị trĩ, lợi tiểu, tác dụng đối với lỵ trực khuẩn, ho lâu ngày,chữa mụn nhọt, sưng đau Cao nước rau sam làm giảm đáng kể trương lực cơ

ở một số bệnh nhân co cơ cứng, cơ gấp hoặc duỗi, đã nhận thấy giảm 50%trên cơ điện đồ Cao rau sam ức chế áp lực co giật cơ do kích thích điện giántiếp qua dây thần kinh hoành trên nửa cơ hoành (Viện Dược liệu, 2004)

Tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm đã chiết xuất được năm phân đoạn caorau sam và đưa thử tác dụng dược lý trên các mô hình (cơ trơn thành mạch,trương lực và nhu động ruột, tác dụng trên quá trình đông - cầm máu, trênhuyết áp, khả năng giảm đau, chống viêm, kháng khuẩn) Kết quả nghiên cứucho thấy trong đó có một phân đoạn đạt điểm cao nhất có tác dụng tốt nhất,phân đoạn này có thể sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị bệnh trĩ,

do đó được Bộ Y Tế đề nghị tiếp tục thực hiện nghiên cứu trong đề tài này

2.2 Cây dền gai (Amaranthus spinosus L., họ Amaranthaceae)

Cây dền gai có tên khoa học là Amaranthus spinosus L thuộc họ rau dền

nhiều, không lông Lá mọc so le, hình thuôn dài, cuống dài có cánh, ở gốc có

2 gai dài 3-15 mm, mặt trên phiến lá màu xanh Hoa mọc thành sim và sắpxếp sít nhau ở nách lá thành những bông dài, các lá bắc như gai 7-8 mm Quả

là một túi hình trứng nhọn một đầu Hạt đen óng ánh (Võ Văn Chi, 1997b)

(Hình 2.2).

Hình 2.2 Hình ảnh cây dền gai (Amaranthus spinosus L.)

Cây dền gai có thành phần hóa học chứa một tỷ lệ cao kali nitrat, nhất là

ở rễ Dền gai có vị ngọt nhạt, tính hơi lạnh, có tác dụng thanh nhiệt, lợi tiểu,trừ thấp, thu liễm ngừng tả Dền gai được sử dụng trong dân gian để điều trịphù thũng, bệnh về thận, bệnh lậu, chữa lỵ và làm thuốc điều kinh Phần câytrên mặt đất được dùng để trị bỏng, đắp tiêu viêm mụn nhọt Lá có tác dụnglong đờm, được dùng trị ho và các bệnh về đường hô hấp Hạt có thể dùngnhư hạt cây mào gà đắp để băng bó chỗ gãy Nhân dân còn dùng hạt và rễ trịbệnh đau tim Theo Viện Dược liệu, thành phần hóa học của cây dền gai gồm:

Rễ dền gai chứa spinasterol, toàn cây chứa sterol (β – sitosterol, stigmasterol,campesterol, cholesterol, n – alkan, các acid béo (acid stearic, acid oleic, acidlinoleic); phần trên mặt đất chứa rutin 1,9%; lá có rutin 1,9%, acidhydrocyanic, kali 4,5% Ngoài ra, dền gai còn có 3-methyl-1-butanol, 3-

hexen-1-ol, 3-methylbutanal, 2-heptanon Dền gai có tác dụng hoạt tính kích

thích thực bào, cao nước có tác dụng diệt nấm Cercospora cruenta.

Tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm đã chiết xuất sáu phân đoạn cao dền gai

và thử tác dụng dược lý trên cơ trơn thành mạch, trương lực và nhu động ruột,tác dụng trên quá trình đông – cầm máu, trên huyết áp, khả năng giảm đau,chống viêm, kháng khuẩn Kết quả cho thấy có hai phân đoạn đạt điểm caonhất, hai phân đoạn này có thể sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc điềutrị bệnh trĩ được tiếp tục nghiên cứu tại đề tài này

III ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

3.1.1 Thuốc nghiên cứu

- Thuốc nghiên cứu: Viên nang cứng Trĩ Thiên Dược được sản xuất bởiCông ty TNHH Thiên Dược, đạt tiêu chuẩn cơ sở

Bảng 3.1 Bảng công thức đóng viên nang Trĩ Thiên Dược

STT Thành phần Tỷ lệ % 1 viên (mg)

1 Cao khô (Hỗn hợp của các phân đoạn

rau dền gai và rau sam) 90,77% 590

3.1.3 Thuốc và hóa chất phục vụ nghiên cứu

- Daflon® có thành phần gồm phân đoạn flavonoid tinh khiết dạng vi hạtchứa diosmin 450 mg, hesperidin 50 mg, được sản xuất bởi Công ty LesLaboratoires Servier Industrie, Pháp;

- Dầu croton (lọ 10 g) được sản xuất bởi Sigma Aldrich, St Louis, USA;

- Pyridin (chai 500ml) được sản xuất bởi Kanto Chemical Co.,Inc, Nhật

- Diethyl ether (chai 500ml) sản xuất bởi Xilong Chemical Co.,Ltd,Trung Quốc;

- Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Kit for TumorNecrosis Factor Alpha (TNF-α) sản xuất bởi Cloud-Clone Corp;

- Các hóa chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học

3.2 Phương pháp nghiên cứu

Gây mô hình trĩ thực nghiệm và đánh giá tác dụng của Viên trĩ Thiên Dược trên mô hình trĩ thực nghiệm

Tiến hành theo phương pháp của Nishiki và Mohammed Azeemuddin [4], [5]:

Chia lô chuột:

- Chuột được chia thành 7 lô, mỗi lô 10 con:

+ Lô 1A (chứng sinh học): Uống nước cất

+ Lô 1B (chứng sinh học): Uống nước cất

+ Lô 2A (mô hình): Uống nước cất

+ Lô 2B (mô hình): Uống nước cất

+ Lô 3 (chứng dương): Uống daflon liều 360mg/kg/ngày (liều tươngđương trên người là 6 viên/ngày)

+ Lô 4 (lô trị 1): Uống Trĩ Thiên Dược liều 0,566g cao phân đoạn/kg/ngày (liều có tác dụng tương đương trên người, tính theo hệ số 6)

+ Lô 5 (lô trị 2): Uống Trĩ Thiên Dược liều 1,698g cao phân đoạn/kg/ngày (gấp 3 lần lô trị 1)

Gây mô hình trĩ thực nghiệm bằng hỗn hợp dầu croton:

Gây trĩ thực nghiệm cho chuột ở các lô bằng hỗn hợp dầu croton gồm: Nước/ Pyridin/Diethylether/Dung dịch dầu croton 6% trong diethylether với tỉ lệ 1:4:5:10

- Lô 1A và lô 1B: Nhúng một tăm bông sạch, đường kính 4mm vào100µl nước muối sinh lý trong 1 phút Nhét tăm bông đã được tẩm nước muốisinh lý ở trên vào trực tràng với độ sâu 2cm tính từ đầu hậu môn Giữ tămbông trong vòng 30 giây

- Từ lô 2 đến lô 5: Nhúng một tăm bông sạch, đường kính 4mm vào100µl hỗn hợp dầu croton như trên trong 1 phút Nhét tăm bông đã được tẩmhỗn hợp dầu croton ở trên vào trực tràng với độ sâu 2cm tính từ đầu hậu môn.Giữ tăm bông trong vòng 30 giây để đảm bảo hỗn hợp dầu croton tiếp xúcđều lên bề mặt niêm mạc trực tràng

- Với lô chuột 1B, 2B, sau khi gây trĩ thực nghiệm 24 giờ chuột đượcđánh giá đại thể, đánh giá mô bệnh học và tính hệ số RAC (Rectoanalcoefficient)

Đánh giá tác dụng của Trĩ Thiên Dược trên mô hình gây trĩ thực nghiệm

- Sau khi gây trĩ thực nghiệm 24 giờ, lô chuột 1A, 2A, 3, 4, 5 được uốngnước cất và thuốc thử liên tục trong vòng 7 ngày

- Quan sát hậu môn trực tràng để đánh giá tình trạng tiết dịch, tấy đỏ, phù

- Phẫu tích toàn bộ đoạn ruột dưới, mổ theo chiều dọc và đánh giá các dấuhiệu kích ứng, tổn thương biểu mô hậu môn trực tràng và tình trạng hoại tử

- So sánh tình trạng hậu môn trực tràng của chuột ở nhóm dùng thuốc thửvới nhóm chứng

Tính hệ số RAC (Rectoanal coefficient)

- Lấy đoạn trực tràng - hậu môn dài 2cm Cân đoạn trực tràng – hậu môn

- Tính hệ số RAC bằng cân nặng của đoạn trực tràng - hậu môn (mg) đoạndài 2cm/trọng lượng chuột (g)

Đánh giá mô bệnh học

- Lấy đoạn trực tràng-hậu môn dài 2cm làm giải phẫu bệnh

- Điểm đánh giá vi thể trên sẽ được tính cho từng chuột Điểm tối đa là 12

Bảng 3.2 Bảng đánh giá tính điểm mức độ tổn thương mô bệnh học

Tổn thương Điểm Biểu mô

Bình thường, nguyên vẹn

Biểu mô đang phát triển, chưa phủ toàn vẹn

Tế bào bị thoái hóa hoặc phẳng

Dị sản

Có ổ bào mòn

01234

Thâm nhiễm bạch cầu

- Sau khi gây mô hình trĩ thực nghiệm sau 24 giờ, kiểm tra cấu trúc vithể hậu môn-trực tràng của 50% số chuột lô 1B và 2B Sau 7 ngày uống nướccất/thuốc thử, 100% số chuột của các lô còn lại được mổ để đánh giá cấu trúc

vi thể hậu mô-trực tràng theo bảng đánh giá tính điểm mức độ tổn thương mô

bệnh học dựa trên các tiêu chí về mức độ thoái hóa của tế bào biểu mô niêmmạc, mật độ tế bào viêm ở lớp đệm dưới niêm mạc, mức độ sung huyết.

Mann-Sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa khi p < 0,05

3.4 Địa điểm nghiên cứu

- Nghiên cứu được tiến hành tại Bộ môn Dược lý, Bộ môn Sinh lý Miễn dịch, Bộ môn Mô – Phôi, Trường Đại học Y Hà Nội

bệnh-IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1 Gây mô hình trĩ thực nghiệm bằng hỗn hợp dầu croton

Bảng 4.3 Trọng lượng trực tràng chuột sau khi gây trĩ thực nghiệm bằng

hỗn hợp dầu croton

Lô chuột n

Trọng lượng trực tràng (mg) ( ± SD)

Hệ số RAC (Rectoanal

coefficient) ( ± SD)

Lô 1B: Chứng sinh học 10 0,18 ± 0,03 0,81 ± 0,10

Lô 2B: Mô hình 10 0,62 ± 0,09 2,87 ± 0,55

p so với lô 1 < 0,0001 < 0,0001

Nhận xét:

- Sau 24 giờ gây mô hình bằng hỗn hợp dầu croton, trọng lượng trựctràng - hậu môn và hệ số RAC của chuột ở lô mô hình tăng cao rõ rệt so với

lô chứng sinh học (p < 0,0001)

Hình ảnh đại thể hậu môn - trực tràng của các lô nghiên cứu

- Trên hình ảnh đại thể, hậu môn - trực tràng của chuột lô chứng sinh học cóhình trụ, sự co thắt trực tràng thành từng đốt, màu sáng, không có phân ứ đọng

- Sau 24 giờ gây mô hình, trên hình ảnh đại thể của tất cả các chuột gây

mô hình trĩ thực nghiệm bằng hỗn hợp dầu croton, phần hậu môn – trực tràngcủa chuột bị viêm, phù nề, sung huyết, kích thước trực tràng lớn hơn rõ rệt sovới lô chứng sinh học

Hình 4.3 Hình ảnh hậu môn -α trực tràng của chuột lô sinh học

Hình 4.4 Hình ảnh hậu môn – trực tràng của chuột lô mô hình sau 24 giờ

gây trĩ thực nghiệm bằng hỗn hợp dầu croton

Hình ảnh vi thể hậu môn - trực tràng của các lô nghiên cứu

Lô chứng sinh học

Hình 4.5 Hình ảnh vi thể hậu môn – trực tràng của chuột lô chứng sinh học (chuột số 11) (H.E x 250): Cấu trúc lớp biểu mô, tuyến lớp đệm, cơ niêm và tầng dưới niêm mạc không có hình ảnh bất thường

Hình 4.6 Hình ảnh vi thể hậu môn – trực tràng của chuột lô chứng sinh học (chuột số 12) (H.E x 250): Cấu trúc lớp biểu mô, tuyến lớp đệm, cơ niêm và tầng dưới niêm mạc không có hình ảnh bất thường

Hình 4.7 Hình ảnh vi thể hậu môn – trực tràng của chuột lô chứng sinh học (chuột số 15) (H.E x 250): Cấu trúc lớp biểu mô, tuyến lớp đệm, cơ niêm và tầng dưới niêm mạc không có hình ảnh bất thường

Lô mô hình

Hình 4.8 Hình ảnh vi thể hậu môn – trực tràng của chuột lô mô hình (chuột số 21) (H.E x 250): Biểu mô phủ và biểu mô tuyến đa số bị thoái hóa, tế bào viêm mật độ dày đặc ở lớp đệm và tầng dưới niêm mạc

Hình 4.9 Hình ảnh vi thể hậu môn – trực tràng của chuột lô mô hình (chuột số 37) (H.E x 250): Đa số tế bào biểu mô phủ và biểu mô tuyến bị thoái hóa, xen giữa có mao mạch sung huyết Lớp biểu mô mỏng Tế bào

bạch cầu, lympho thâm nhiễm nhiều

Hình 4.10 Hình ảnh vi thể hậu môn – trực tràng của chuột lô mô hình (chuột số 40) (H.E x 250): Một số tế bào biểu mô bị thoái hóa, xuất hiện tĩnh mạch sung huyết Tế bào bạch cầu lympho xuất hiện nhiều ở lớp đệm

và tầng dưới niêm mạc Bảng 4.4 Điểm đánh giá vi thể cho từng lô nghiên cứu

Lô chuột n

Tổn thương biểu mô

Thâm nhiễm bạch cầu

Sung huyết mạch

Tổng điểm

Nhận xét:

- Lô chứng sinh học:

100% vi thể hậu môn - trực tràng của chuột lô chứng sinh học có cấutrúc lớp biểu mô, tuyến lớp đệm, cơ niêm và tầng dưới niêm mạc không cóhình ảnh bất thường trên vi thể

- Lô mô hình:

Sau 24 giờ gây mô hình trĩ thực nghiệm, hình ảnh vi thể hậu môn – trựctràng cho thấy giữa lớp biểu mô là các mao mạch, tĩnh mạch sung huyết, một

số tế bào biểu mô phủ, biểu mô tuyến thoái hóa

Trong lớp đệm xuất hiện hình ảnh mao mạch, tĩnh mạch giãn rộng chứađầy máu Lớp đệm có nhiều tế bào thâm nhiễm

4.2 Đánh giá tác dụng điều trị trĩ của viên Trĩ Thiên Dược trên mô hình gây trĩ thực nghiệm bằng hỗn hợp dầu croton

Bảng 4.5 Nồng độ TNF-αα trong máu chuột gây trĩ thực nghiệm bằng hỗn

hợp dầu croton sau 7 ngày uống thuốc thử

Lô chuột n

Nồng độ TNF-α (pg/ml) ( ± SD)

p so với lô chứng

p so với

lô mô hình

Lô 1A: Chứng sinh học 10 233,98 ± 57,99

Lô 2A: Mô hình 10 888,86 ± 208,74 <0,000

1

Lô 3: Chứng dương

Daflon liều 360mg/kg/ngày 10 384,43 ± 99,17 <0,001

<0,000 1

Lô 4: Viên Trĩ Thiên Dược

liều 0,566g cao phân

đoạn/kg/ngày

10 498,38 ± 117,25 <0,001 <0,001

Lô 5: Viên Trĩ Thiên Dược

liều 1,698g cao phân

10 436,27 ± 128,06 <0,001 <0,000

1