KẾT QUẢ NGHIÊN cứu độc TÍNH cấp và bán TRƯỜNG DIỄN của VIÊN NANG CỨNG KOREAN RED GINSENG (1) TRÊN THỰC NGHIỆM

Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu độc tính cấp của thuốc thử viên nang cứng Korean Red Ginseng Extract 1 theo đường uống trên chuột nhắt trắng Nghiên cứu độc tính cấp và xác định LD50 củ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

TRÊN THỰC NGHIỆM

Địa điểm nghiên cứu:

Thời gian nghiên cứu:

Bộ môn Dược lý – Đại học Y Hà Nội 10/2017 – 01/2018

Hà Nội – 2018

A ĐỘC TÍNH CẤP

1.1 Viên nang cứng Korean Red Ginseng Extract (1):

- Dạng bào chế: viên nang cứng Hàm lượng: 500 mg Thuốc thử được sản

xuất tại Công ty nghiên cứu Sâm Hàn quốc

- Liều dùng dự kiến trên người: 3 viên/lần x 2 lần/ngày, uống sau ăn 30

phút (bữa sáng, bữa tối)

- Lấy 30 viên pha trong vừa đủ 45ml dùng trong nghiên cứu xác định độc

tính cấp

1.2 Động vật thực nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng 18 –

22 g của Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương Chuột được nuôi 7 ngày trước khinghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệmnhiệt độ 22–24°C, chu kỳ sáng tối 12 giờ, với đầy đủ thức ăn và nước uống tại

Bộ môn Dược lý – Đại học Y Hà Nội

1.3 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu độc tính cấp của thuốc thử viên nang cứng Korean Red Ginseng Extract (1) theo đường uống trên chuột nhắt trắng

Nghiên cứu độc tính cấp và xác định LD50 của thuốc thửviên nang cứngKorean Red Ginseng Extract (1) trên chuột nhắt trắng theo đường uống

Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm

Chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô khác nhau, mỗi lô 10 con Chochuột uống thuốc thử viên nang cứng Korean Red Ginseng Extract (1) với liềutăng dần trong cùng một thể tích để xác định liều thấp nhất gây chết 100% chuột

và liều cao nhất không gây chết chuột (gây chết 0% chuột) Theo dõi tình trạngchung của chuột, quá trình diễn biến bắt đầu có dấu hiệu nhiễm độc (như nôn, cogiật, kích động, bài tiết…) và số lượng chuột chết trong vòng 72 giờ sau khiuống thuốc Tất cả chuột chết được mổ để đánh giá tổn thương đại thể Từ đóxây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 của thuốc thử Sau đó tiếp tục theodõi tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 7-14 sau khi uống viên nang cứngKorean Red Ginseng Extract (1)

1.4 Xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý thống kê theo thuật toán thống kê T-test Studentbằng phần mềm Microsoft Excel.

2 Kết quả nghiên cứu

Chuột nhắt trắng được uống thuốc thử viên nang cứng Korean Red GinsengExtract (1) từ liều thấp nhất đến liều cao nhất Lô chuột đã uống đến liều tối đa

75 ml/Kg, trong 24 giờ dung dịch tương đương 25g/kg, không có chuột chếttrong vòng 72 giờ Theo dõi tiếp đến hết 7 -14 ngày không có dấu hiệu bấtthường xảy ra

Bảng 1: Kết quả nghiên cứu độc tính cấp của Thuốc thử viên nang cứng

Korean Red Ginseng Extract (1)

Lô chuột n Liều (ml/

kg)

Liều (g/kg thể trọng)

Tỷ lệ chết (%)

Dấu hiệu bất thường khác

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 World Health Organization (2000) General Guidelines for Methodologies

on Research and Evaluation of Traditional Medicine WHO; Geneva,

Switzerland, 35

2 Need for revision of the guideline single dose toxicity 3BS1a,(EMEA/CHMP/SWP/302413/08)

3 Eudralex Vol3; 3BS1a Single Dose Toxicity

4 Council Directive 86/609/EEC on the protection of animals used forexperimental and other scientific purposes

5 ICH Topic M3 (R2) - Non-Clinical Safety Studies for the Conduct ofHuman Clinical Trials and Marketing Authorization for Pharmaceuticals(CPMP/ICH/286/95)

B ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN

1.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.1 Thuốc nghiên cứu:

Viên nang cứng Korean Red Ginseng Extract (1):

- Dạng bào chế: viên nang cứng, đóng gói 282 viên/lọ

- Hàm lượng: 500 mg

- Liều dùng trên người: 3 viên/lần x 2 lần/ngày, uống sau ăn 30 phút (bữa

sáng, bữa tối)

1.2 Động vật thực nghiệm

Chuột cống trắng chủngWistar, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng 180 –

200 g Chuột được nuôi 7 ngày trước khi nghiên cứu và trong suốt thời giannghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm với đầy đủ thức ăn và nước uốngtại Bộ môn Dược lý – Đại học Y Hà Nội

1.3 Hóa chất và máy móc phục vụ nghiên cứu

- Kit định lượng các enzym và chất chuyển hoá trong máu: ALT (alanin

aminotransferase), AST (aspartat aminotransferase), bilirubin toàn phần,albumin, cholesterol toàn phần, creatinin của hãng Hospitex Diagnostics (Italy)

và hãng DIALAB GmbH (Áo), định lư¬ợng trên máy xét nghiệm sinh hóa ErbaChem 5 V3 (Ấn Độ)

Dung dịch xét nghiệm máu ABX Minidil LMG của hãng ABX

-Diagnostics, định lượng trên máy Vet abcTM Animal Blood Counter

- Các hoá chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học.

1.4 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu độc tính bán trường diễn của KRG (1) được tiến hành theoHướng dẫn của WHO

Chuột cống trắng, giống đực, được chia làm 3 lô, mỗi lô 10 con, mỗi connhốt riêng một chuồng

- Lô chứng: uống dung môi pha thuốc 10 mL/kg/ngày

- Lô trị 1: uống KRG (1) liều 360 mg/kg/ngày (liều tương đương liều dự

kiến dùng trên người, tính theo hệ số 6).

- Lô trị 2: uống KRG (1) liều 1080 mg/kg/ngày (gấp 3 lần lô trị 1).

Chuột cống trắng được uống nước hoặc thuốc thử trong 12 tuần liên tục,mỗi ngày một lần vào buổi sáng

Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong quá trình nghiên cứu:

- Tình trạng chung, thể trọng của chuột cống trắng.

- Đánh giá chức phận tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, thể tích trung

bình hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, côngthức bạch cầu và số lượng tiểu cầu

- Đánh giá chức năng gan thông qua định lượng một số enzym và chất

chuyển hoá trong máu: ALT, AST, bilirubin toàn phần, và cholesterol toàn phần

- Đánh giá chức năng lọc của thận thông qua định lượng nồng độ creatinin

huyết thanh

Các thông số theo dõi được kiểm tra vào trước lúc uống thuốc thử, sau 4tuần và sau 8 tuần uống thuốc thử

- Mô bệnh học: sau 8 tuần uống thuốc thử, chuột được mổ để uan sát đại

thể toàn bộ các cơ quan.Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, thận của 30%

số chuột cống trắng ở mỗi lô.Các xét nghiệm vi thể được thực hiện tại Trungtâm nghiên cứu và phát hiện sớm ung thư – Liên hiệp các hội khoa học và kỹthuật Việt Nam (do PGS.TS Lê Đình Roanh đọc kết quả vi thể)

1.5 Xử lý số liệu

Số liệu được trình bày dưới dạng MEAN ± SD, xử lý bằng phần mềmMicrosoft Excel 2010, sử dụng t-test Student và test trước sau (Avant-après).Sựkhác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05

p < 0,05 p < 0,01 p <

0,001

2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

2.1 Tình trạng chung

Trong thời gian thí nghiệm, chuột ở cả 3 lô hoạt động bình thường, ăn uốngtốt, nhanh nhẹn, lông mượt, mắt sáng, phân khô

2.2 Sự thay đổi thể trọng của chuột

Bảng 2.1 Ảnh hưởng của KRG (1) đến thể trọng chuột

Trước uống thuốc Sau 4 tuần Sau 8 tuầnChứng sinh học 198.50 ± 29.44 209.00 ± 21.32 201.00 ± 28.07

Lô trị 1 191.50 ± 10.81 196.00 ± 11.74 196.00 ± 18.38

Lô trị 2 200.00 ± 19.86 215.00 ± 41.43 210.00 ± 28.96

Kết quả ở bảng 2.1 cho thấy: sau 8 tuần uống thuốc thử, trọng lượng chuột

ở các lô nghiên cứu đều tăng so với trước khi uống thuốc, tuy nhiên sự khác biệt

là chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Trọng lượng chuột ở các lô uống thuốcthử đều không có sự khác biệt so với lô chứng sinh học (p > 0,05)

2.3.Đánh giá chức năng tạo máu

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của KRG (1) đến số lượng hồng cầu

Thời gian Số lượng hồng cầu (10

Bảng 2.3 Ảnh hưởng của KRG (1) đến hàm lượng huyết sắc tố

Trước uống thuốc 13.37 ± 0.81 13.89 ± 0.83 13.44 ± 0.60

Thời gian Haemoglobin (g/dL)

Bảng 2.4 Ảnh hưởng của KRG (1) đến hagematocrit

Bảng 2.5 Ảnh hưởng của KRG (1) đếnthể tích trung bình hồng cầu (MCV)

Kết quả nghiên cứu ở bảng 2.5 cho thấy, sau 4 tuần và 8 tuần uống thuốcthử, thể tích trung bình hồng cầu ở lô trị 1 và lô trị 2 đều không có sự khác biệt sovới lô chứng sinh học và so với thời điểm trước khi uống thuốc thử (p > 0,05).

Bảng 2.6 Ảnh hưởng của KRG (1) đến số lượng bạch cầu

Thời gian Số lượng bạch cầu (10 9 /L)

Trước uống

thuốc 9.25 ± 1.85 10.38 ± 0.97 9.90 ± 1.93Sau 4 tuần 9.54 ± 2.62 10.13 ± 1.89 8.89 ± 1.51

Bảng 2.7 Ảnh hưởng của KRG (1) đến công thức bạch cầu

28.64 ± 8.53

71.19 ± 2.54

25.21 ± 2.01

69.14 ± 6.19

26.82 ± 5.68

5.14

30.82 ± 4.62

67.71 ± 5.56

28.33 ± 5.56

67.04 ± 5.15

27.43 ± 4.91

5.14

31.70 ± 5.44

66.46 ± 8.01

26.91 ± 8.24

67.64 ± 4.30

27.93 ± 4.61

Kết quả nghiên cứu ở bảng 2.7 cho thấy, sau 4 tuần và 8 tuần uống thuốcthử, công thức bạch cầu ở lô trị 1 và lô trị 2 đều không có sự khác biệt so với lôchứng sinh học và so với thời điểm trước khi uống thuốc thử (p > 0,05)

Bảng 2.8 Ảnh hưởng của KRG (1) đến số lượng tiểu cầu

Thời gian Số lượng tiểu cầu(10

so với lô chứng sinh học và so với thời điểm trước khi uống thuốc thử (p > 0,05)

2.4 Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan

Bảng 2.9 Ảnh hưởng của KRG (1) đến nồng độ AST và ALT huyết tương

AST

Trước uống 78.70 ± 13.33 90.20 ± 22.07 68.80 ± 21.11

2.5 Đánh giá chức năng gan

Bảng 2.10 Ảnh hưởng của KRG (1) đến nồng độ bilirubin toàn phần

Thời gian Chứng Bilirubin toàn phần(mmol/L) 360 mg/kg 1080 mg/kg

Trước uống thuốc 13.47 ± 0.47 13.44 ± 0.63 13.34 ± 0.46Sau 4 tuần 13.35 ± 0.50 13.59 ± 0.34 13.55 ± 0.32

Bảng 2.11 Ảnh hưởng của KRG (1) đến nồng độ albumin

Trước uống thuốc 2.68 ± 0.24 2.62 ± 0.24 2.63 ± 0.39Sau 4 tuần 2.99 ± 0.53 2.95 ± 0.59 2.68 ± 0.18

Bảng 2.12 Ảnh hưởng của KRG (1) đến nồng độ cholesterol toàn phần

Thời gian Cholesterol toàn phần (mmol/L)

Kết quả nghiên cứu ở bảng 2.12 cho thấy, sau 8 tuần uống thuốc thử, nồng

độ cholesterol toàn phần ở các lô chuột uống KRG (1) giảm có ý nghĩa thống kê

so với lô chứng sinh học (p < 0,01 và p < 0,001) và so với thời điểm trước khiuống thuốc thử (p < 0,05 và p < 0,001)

2.6 Đánh giá chức năng thận

Bảng 2.13 Ảnh hưởng của KRG (1) đến nồng độ creatinin huyết thanh

Kết quả nghiên cứu ở bảng 2.13 cho thấy, sau 4 tuần và 8 tuần uống KRG(1), nồng độ creatinin huyết thanhở cả hai lô trị đều không có sự khác biệt có ýnghĩa thống kê khi so sánh với lô chứng và so sánh với thời điểm trước khi uốngthuốc thử (p>0,05).

2.7 Hình ảnh đại thể và vi thể cơ quan sau 8 tuần nghiên cứu

- Hình ảnh đại thể: Trên tất cả các chuột thực nghiệm (cả lô chứng và 2 lô trị),

không quan sát thấy có thay đổi bệnh lý nào về mặt đại thể của các cơ quantim, phổi, gan, lách, tuỵ, thận và hệ thống tiêu hoá của chuột

- Hình ảnh vi thể gan:

+ Lô chứng sinh học: 3/3 mẫu bệnh phẩm có hình ảnh gan bình thường

+ Lô trị 1: 3/3 mẫu bệnh phẩm có hình ảnh gan bình thường

+ Lô trị 2: 3/3 mẫu bệnh phẩm có hình ảnh gan bình thường

Ảnh 1: Hình thái vi thể gan chuột lô chứng (chuột #404) (HE x 400)

Gan bình thường

(HE x 400: Nhuộm Hematoxylin - Eosin, độ phóng đại 400 lần)

Ảnh 2: Hình thái vi thể gan chuột lô chứng (chuột #409) (HE x 400)

Gan bình thường

Ảnh 3: Hình thái vi thể gan chuột lô trị 1 (chuột #450) (HE x 400)

Gan bình thường

Ảnh 4: Hình thái vi thể gan chuột lô trị 1 (chuột #456) (HE x 400)

Gan bình thường

Ảnh 5: Hình thái vi thể gan chuột lô trị 2 (chuột #444) (HE x 400)

+ Lô trị 2: 1/3 mẫu bệnh phẩm có hình ảnh thận thoái hóa nhẹ tế bào ống

lượn gần, 2/3 mẫu bệnh phẩm có hình ảnh thận bình thường

Ảnh 7: Hình thái vi thể thận chuột lô chứng (chuột #404)(HE x 400)

Thận bình thường

Ảnh 8: Hình thái vi thể thận chuột lô chứng (chuột #409) (HE x 400)

Thận bình thường

Ảnh 9: Hình thái vi thể thận chuột lô trị 1(chuột #450) (HE x 400)

Thận bình thường

Ảnh 10: Hình thái vi thể thận chuột lô trị 1 (chuột #456) (HE x 400)

Thận bình thường

Ảnh 11: Hình thái vi thể thận chuột lô trị 2 (chuột #444) (HE x 400)

Thận bình thường

Ảnh 12: Hình thái vi thể thận chuột lô trị 2 (chuột #446) (HE x 400)

Thận bình thường

Ảnh 13: Hình thái vi thể thận chuột lô trị 2 (chuột #441) (HE x 400)

Thận thoái hóa nhẹ tế bào ống lượn gần

3 KẾT LUẬN

Kết quả nghiên cứu độc tính bán trường diễn theo đường uống của viênnang cứng KRG (1) trong thời gian 8 tuần cho thấy:

- Các chỉ số theo dõi về tình trạng chung, cân nặng, chức năng tạo máu,

mức độ hủy hoại tế bào gan, một số chỉ số đánh giá chức năng gan (bao gồmnồng độ bilirubin toàn phần, albumin), chỉ số creatinin đánh giá chức năng thận

và mô bệnh học gan, thận đều nằm trong giới hạn bình thường, không có sựkhác biệt rõ rệt so với lô chứng

- KRG (1) liều 360 mg/kg và liều 1080 mg/kg làm giảm rõ rệt nồng độ

cholesterol toàn phần sau 8 tuần uống thuốc so với lô chứng sinh học

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 World Health Organization (2000) General Guidelines for Methodologies

on Research and Evaluation of Traditional Medicine WHO; Geneva,

Switzerland, 35

Hà Nội, ngày 14 tháng 3 năm 2018

Trưởng Bộ môn Dược lý

PGS.TS Phạm Thị Vân Anh

Trường Đại học Y Hà Nội xác nhận

Chữ ký của PGS.TS.Phạm Thị Vân Anh, Trưởng Bộ môn Dược lý là đúng

Trưởng phòng Tổ chức Cán bộ