Nghiên cứu, thiết kế, chế tạo một số sản phẩm cấy ghép sử dụng trong y tế bằng hợp kim titan y sinh mác Ti-6Al-7Nb; Ti-5Al2,5Fe và đánh giá độ an toàn của sản phẩm

Nhóm thứ hai là vật liệu sinh học được cấy ghép nhưng không có tác dụng thay đổi, mà chỉ có tác dụng kết hợp mô như các kim loại, các polymer không thoái biến… Đây là nhóm vật liệu bền,

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, nhiều cơ sở khoa học kể cả trong và ngoài ngành y tế đã tích cực nghiên cứu, chế tạo các thiết bị phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe nhân dân Ngoài các thiết bị khám chữa bệnh, các vật liệu cấy ghép, vật liệu hỗ trợ như carbon compozite, hydroxy apatite

đã được nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng thì gần đây Viện công nghệ Bộ công thương đã nghiên cứu chế tạo thành công một số vật liệu có nguồn gốc chủ yếu từ titan

Nhằm từng bước hoàn thiện qui trình chế tạo, đánh giá sản phẩm

để có thể thử nghiệm lâm sàng, chúng tôi tiến hành các nghiên cứu nhằm đánh giá độ an toàn sinh học của vật liệu titan Ti 5Al - 2,5 Fe và Ti 6Al- 7Nb do Viện công nghệ - Bộ công thương chế tạo.

Trong báo cáo này, chúng tôi giới thiệu kết quả nghiên cứu tính phù hợp sinh học của hai loại hợp kim chứa titan Ti-6Al-7Nb; Ti-5Al2,5Fe do Viện công nghệ Bộ công thương chế tạo Báo cáo là một phần của đề tài

“Nghiên cứu, thiết kế, chế tạo một số sản phẩm cấy ghép sửdụngtrong y tế bằng hợp kim titan y sinh mác Ti-6Al-7Nb; Ti-5Al2,5Fe và đánh giá độ an toàn của sản phẩm” với mục tiêu:

Đánh giá tính phù hợp sinh học của hai loại hợp kim chứa titan 6Al-7Nb; Ti-5Al2,5Fe do Viện công nghệ Bộ công thương chế tạo

Ti-Chương 1: TỔNG QUAN

1 Vật liệu sinh học (Biomaterials)

Trong những năm gần đây, xu hướng sử dụng vật liệu sinh học trong y tế ngày càng cao Vật liệu sinh học (Biomaterials) thường được định nghĩa là các vật liệu nhân tạo, hay tự nhiên thay thế một phần hay toàn phần chức năng thuốc (không phải thuốc) trong y học, giải phẫu, nha khoa.

Nhiều loại vật liệu khác nhau đã được sử dụng như là một vật liệu sinh học Nhóm thứ nhất gồm: mô ghép tự thân, mô ghép đồng loại, mô ghép dị loại Tính chất của nhóm này có thể thoái biến và được thay thế dần sau đó bằng mô chủ Nhóm thứ hai là vật liệu sinh học được cấy ghép nhưng không có tác dụng thay đổi, mà chỉ có tác dụng kết hợp mô như các kim loại, các polymer không thoái biến… Đây là nhóm vật liệu bền, trung tính, không gây đáp ứng miễn dịch, có thể tồn tại trong một thời gian dài hay suốt đời.

Từ những năm 1950, titan đã được đưa vào sử dụng trong ngoại khoa Hiện nay, titan là vật liệu được ứng dụng rộng rãi trong y tế để làm các bộ phận giả, dụng cụ cố định, thay thế hầu hết các bộ phận trong cơ thể người, đặc biệt là xương.

Nhu cầu sử dụng vật liệu hợp kim titan y sinh ở nước ta ngày một lớn Hàng năm, cả nước có tới hàng chục ngàn trường hợp cần nẹp xương, làm hàm, trồng răng, gắn đinh, cấy vít, làm van tim, đặt stent thông mạch máu, thay khớp, thậm chí làm vỏ não,… Tuy nhiên, hầu hết các vật liệu này đều phải nhập ngoại với giá thành rất cao Chính vì vậy, việc hạ thấp giá thành sản phẩm mà vẫn đạt được chất lượng tốt trong điều trị là một nhu cầu cấp bách, yêu cầu Nhà nước đưa vào nghiên cứu, chế tạo vật liệu titan y sinh.

Nhà nước cũng đã có các dự án mới để phát triển các vật liệu sinh học Hiện nay, nước ta đã chế tạo được một số loại vật liệu sinh học, trong đó có vật liệu titan dùng trong y tế, nhưng trước khi đưa vào sử dụng trên bệnh nhân, cần phải tiến hành nghiên cứu thực nghiệm trên động vật để đảm bảo độ an toàn của chúng và chuẩn hóa quá trình chế tạo vật liệu titan của nước ta nhằm ứng dụng ghép trên lâm sàng.

1.1 Đại cương về vật liệu sinh học

Có rất nhiều định nghĩa đã được sử dụng cho thuật ngữ “vật liệu sinh học” Theo Viện nghiên cứu sức khỏe quốc gia (National Institute of Health – NIH) (1984): “Vật liệu sinh học là bất kỳ chất hoặc hợp chất nào (không phải là thuốc) có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp, được dùng

để điều trị, tăng cường hoặc thay thế mô, cơ quan hoặc chức năng của cơ thể” [11], [12] Một định nghĩa rộng hơn về vật liệu sinh học được hầu hết các nhà khoa học chấp nhận là định nghĩa của Williams (1987): “Vật liệu sinh học là một vật liệu không sống, được sử dụng trong một thiết bị

y học, dùng để tương tác với hệ sinh học” [11]

Vật liệu sinh học chủ yếu được sử dụng trong lĩnh vực y khoa.Tuy nhiên khi các kỹ thuật vô trùng chưa phát triển thì việc sử dụng các vật liệu sinh học là không khả thi Các phẫu thuật có sử dụng vật liệu sinh học phần lớn đều thất bại do nguyên nhân nhiễm trùng Các vật liệu sinh học sớm nhất được cấy ghép thành công là ứng dụng cấy ghép vào hệ thống xương năm 1900 Sau đó đến những năm 1930, với sự ra đời của thép không gỉ và các hợp kim crom – cobalt đã tạo nên những thành công lớn trong việc cố định gãy xương và các trường hợp thay khớp đầu tiên được thực hiện [13] Cùng với sự ra đời và phát triển của nhiều loại vật liệu mới, hiện nay vật liệu sinh học được sử dụng rất rộng rãi trong y học, đem lại những phương pháp điều trị hiệu quả ở nhiều chuyên ngành

như: nha khoa, ngoại khoa, tim mạch, cơ xương khớp, phục hồi chức năng, nhãn khoa…

1.2 Các loại vật liệu sinh học

Theo nguồn gốc, vật liệu sinh học chia thành 2 nhóm lớn [11],[14]:

Nhóm vật liệu sinh học có nguồn gốc tự nhiên:

Là nhóm vật liệu có tế bào, có khả năng sống, tự sửa chữa, cấu trúc không đồng nhất.

 Vật liệu mô mềm: da, gân, màng ngoài tim, giác mạc…

 Vật liệu mô cứng: xương, răng.

Nhóm vật liệu sinh học có nguồn gốc tổng hợp:

Là nhóm vật liệu có cấu trúc đồng nhất, không có tế bào, không có khả năng sống.

 Gốm: Alumina, Zirconia, Calci Sulfate, Calci phosphate, Apatites, carbon, thủy tinh…

 Kim loại: thép không gỉ, hợp kim crom – cobalt, hợp kim titan, vàng, bạc…

 Polymer: Ultra High Molecular Weight Polyethylene (UHM WPE), Polymethylmethacacrylate (PMMA), Polyethyletherketone (PEEK), Silicone, Polyurethane (PU), Polytetrafluoroethylene (PTFE)

Zircon idSil icdB IS – GMA.

1.3 Các yêu cầu đối với vật liệu sinh học

Yêu cầu chung đối với vật liệu sinh học được phân thành 4 nhóm [11]:

 Tính phù hợp sinh học: vật liệu phải không gây ra các phản ứng có hại đối với vật chủ và có khả năng kích thích sự hòa hợp mô – vật liệu

ghép tốt

 Có thể khử trùng: vật liệu có thể trải qua quá trình khử trùng bằng nhiều phương pháp khác nhau mà không bị biến đổi các tính chất lý hóa cũng như không sinh ra các chất gây phản ứng có hại cho cơ thể

 Có tính chức năng: tính chức năng của một vật liệu sinh học phụ thuộc vào khả năng tạo được hình dáng phù hợp với chức năng mà chúng sẽ thực hiện

 Có thể chế tạo: nhiều vật liệu không thể chế tạo được thành sản phẩm để có thể cấy ghép trên người nên dù có tính tương hợp sinh học cao nhưng cũng không có tính ứng dụng.

Ngoài ra, các vật liệu sinh học còn phải có các đặc tính đặc biệt như không sinh khối u, không phân hủy, độc tính thấp… Tuy nhiên tùy thuộc vào mục đích ứng dụng, mỗi loại vật liệu lại cần đáp ứng các yêu cầu khác nhau [11].

1.4 Tính phù hợp sinh học của vật liệu sinh học (biocompatibilityof biomaterials).

1.4.1 Phản ứng của cơ thể với vật liệu ghép.

Sau khi được cấy ghép, sự tương tác giữa hệ miễn dịch của cơ thể người nhận và vật liệu sinh học sẽ xảy ra rất phức tạp và kết quả là vật liệu ghép có gây phản ứng đủ để kích thích sự hòa hợp mô – vật liệu tốt hay không [17], [18] Trong quá trình đó, sự xuất hiện phản ứng viêm là tất yếu và là một phản ứng bình thường khi một vật lạ mới được đưa vào

cơ thể.

Sau khi cấy ghép, sự tương tác giữa vật liệu và hệ thống miễn dịch của cơ thể nhận có liên quan đến đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu Đầu tiên, trên bề mặt của vật liệu sẽ hình thành các cục máu đông tạm thời, sau đó là viêm cấp tính vô khuẩn tiến triển đến viêm mạn

tính, phát triển mô hạt và cuối cùng là sự xơ hóa [17], [19] Các đặc điểm của vật liệu sinh học về kích thước, hình dạng, tính chất lý hóa…đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng đến mức độ và thời gian phản ứng của cơ thể [18], [19] Do đó mức độ, diễn biến và thời gian quá trình phản ứng của

cơ thể nhận sau khi ghép vật liệu sinh học sẽ đặc trưng cho tính phù hợp

mô của vật liệu được cấy ghép

1.4.2 Diễn biến quá trình phản ứng của cơ thể sau ghép vật liệu sinh học.

và đặc trưng là sự xâm nhập của bạch cầu đa nhân trung tính Các phản ứng viêm cấp tính đối với vật liệu sinh học thường xảy ra nhanh chóng Sau đó tiến triển thành viêm mạn tính với sự xuất hiện của các bạch cầu đơn nhân, các lympho bào tại vị trí tổn thương Phản ứng viêm mạn tính đối với vật liệu sinh học thường bị giới hạn tại vị trí cấy ghép.Phản ứng viêm sau khi thực hiện cấy ghép vật liệu bao gồm cả viêm cấp tính và viêm mạn tính thường kéo dài không quá hai tuần Nếu phản ứng kéo dài trên 3 tuần thường là dấu hiệu của sự nhiễm trùng và thải ghép [19].

 Sự phát triển của mô hạt:

Sau khi phản ứng viêm kết thúc, ở những vị trí ghép vật liệu sinh học, mô hạt được hình thành Mô hạt được xác định bởi sự xuất hiện của các đại thực bào, xâm nhập nguyên bào sợi và sự tăng sinh các mạch máu Các nguyên bào sợi hoạt động tổng hợp collagen và proteoglycan, là tiền đề cho sự xơ hóa [18],[19].

 Sự xơ hóa:

Là hiện tượng cuối cùng trong quá trình lành hóa vết thương Vị trí tổn thương do quá trình cấy ghép vật liệu sinh học sẽ được sửa chữa bằng quá trình tái tạo mô mới thay thế cho mô bị tổn thương hoặc sẽ hình thành sẹo xơ.

Theo tác giả Lê Đình Roanh (2009), diễn biến thời gian của các phản ứng hàn gắn vết thương sẽ được diễn ra như sau [21]:

- 0 giờ (Ngay khi phẫu thuật): đường rạch sẽ được lấp đầy bởi các cục máu đông.

- 3 giờ đến 24 giờ sau phẫu thuật: phản ứng viêm cấp diễn ra với sự tập trung của các bạch cầu đa nhân trung tính tại ổ viêm (vị trí tổn thương) Những tế bào này được thu hút đến ổ viêm bởi các chất hóa ứng động như histamin, leukotrien, bổ thể C5a… Vai trò của các bạch cầu đa nhân trung tính là thực bào mô bị tổn thương và các vi khuẩn có thể xâm nhập trong quá trình phẫu thuật.

- 24 giờ đến 48 giờ sau phẫu thuật: các tế bào biểu mô di chuyển từ mép vết thương tạo màng đáy và sự tăng sinh của tế bào là tối thiểu.

- Ngày thứ 3 sau phẫu thuật: bắt đầu quá trình chuyển từ phản ứng viêm cấp sang viêm mạn tính Các bạch cầu đa nhân trung tính dần được thay thế bởi các bạch cầu đơn nhân (đại thực bào, lympho bào) Các đại thực bào sẽ tiếp tục thực hiện nhiệm vụ thực bào của bạch cầu đa nhân trung tính đồng thời chúng có nhiệm vụ trình diện kháng nguyên với các tế bào miễn dịch đặc hiệu (lympho bào).Sau quá trình này, mô hạt bắt đầu xuất hiện.

- Ngày thứ 5 sau phẫu thuật: vết thương đã được lấp đầy bởi mô hạt giàu mạch máu tân tạo, quá trình tăng sinh biểu mô diễn ra mạnh mẽ

và bắt đầu xuất hiện collagen.

- Tuần thứ 2 sau phẫu thuật: quá trình viêm và phản ứng mô hạt giảm dần, thay vào đó là sự tăng sinh nguyên bào sợi và tích lũy collagen tại vị trí tổn thương.

- Tháng thứ 2 sau phẫu thuật: vết sẹo đã được hình thành bao gồm

mô liên kết không viêm được bao phủ bởi một lớp thượng bì nguyên vẹn.

1.4.3 Độc tính toàn thân của vật liệu sinh học.

Độc tính toàn thân là khả năng mà các vật liệu sinh học có thể gây

ra các phản ứng toàn thân có hại đối với các cơ quan, hệ cơ quan và toàn

cơ thể Theo tiêu chuẩn ISO 10993 các tiêu chí được sử dụng để đánh giá độc tính toàn thân của vật liệu sinh học bao gồm [22]:

- Trọng lượng cơ thể động vật thực nghiệm.

- Quan sát các dấu hiệu lâm sàng: tình trạng da, lông, trương lực

cơ, phản xạ, tình trạng tăng tiết nước bọt, các dấu hiệu hô hấp, tim mạch, các triệu chứng thần kinh, vận động

- Bệnh học lâm sàng: các chỉ số sinh hóa máu, huyết học được xem xét tại cuối giai đoạn thử nghiệm.

- Bệnh học tổng quát: Các con vật phải được giải phẫu tử thi để đánh giá tình trạng tất cả các cơ quan bộ phận và được bảo quản để kiểm tra mô bệnh học trong tương lai.

- Mô bệnh học tổng thể: kiểm tra tất cả các tổn thương tại tất cả các mô, cơ quan của động vật thực nghiệm.

Trong phạm vi đề tài này, đề đánh giá sơ bộ độc tính toàn thân của thủy tinh thể nhân tạo sản xuất tại Việt Nam chúng tôi chỉ tiến hành kiểm tra một số chỉ số sinh hóa máu, huyết học của động vật thực nghiệm

1.5 Tính phù hề tài này, đề đánh giá sơ bộ độc tính toàn thân của thủy tinh th

Hầu hết các vật liệu cấy ghép nhằm phục vụ cho con người, cải thiện chất lượng cuộc sống của con người.Việc ghép vật liệu sinh học đã đạt hiệu quả tốt.Tuy nhiên, sự tương tác giữa cơ thể với vật liệu sinh học diễn ra rất phức tạp Đó là sự tác động hai chiều của mô chủ lên vật liệu được cấy ghép và sự tác động của vật liệu cấy ghép lên mô chủ, bao gồm:

sự viêm, di chứng miễn dịch, độc tố hệ thống, tương tác máu bề mặt, nghẽn mạch

1.5.1 Sn, sự

Sự viêm có thể xem như là phản ứng của các khối mô sống, phân

bố mạch máu đến vùng tổn thương, nhằm ngăn ngừa sự lan rộng của các tác nhân gây hại đến các mô lân cận, loại bỏ các mảnh vụn tế bào và các mầm bệnh, cuối cùng là tạo cơ sở cho các quá trình phục hồi chức năng của mô [2] Các dấu hiệu chính của viêm cấp là sưng, nóng, đỏ, đau Sau khi bị tổn thương có sự thay đổi về đường kính và tính thấm của mạch máu, điều này dẫn đến hiện tượng là dịch cơ thể, protein, các tế bào máu

sẽ thoát ra từ hệ mạch đi vào vùng tổn thương.

Hình 1. 1.1: Biểu hiện tại chỗ của viêm cấp [2].

Kích thước, hình dáng và các tính chất hóa lý của vật liệu sinh học

sẽ quy định thời gian kéo dài của sự viêm hay thời gian cho quá trình lành vết thương Do đó, thời gian của phản ứng viêm, sẽ đặc trưng cho tính phù hợp mô đối với mô được cấy ghép.

Trong nghiên cứu thực nghiệm, để đánh giá tính phù hợp mô nói chung và tính phù hợp mô của các vật liệu cấy ghép nói riêng, bằng cách đánh giá các phản ứng tại chỗ sau khi ghép vật liệu vào một vị trí nào đó trên cơ thể con vật, diễn biến hàn gắn vết thương xảy ra theo từng giai đoạn Một đường rạch ngoại khoa sạch gây chết tế bào tối thiểu và gián

đoạn của màng đáy tối thiểu thì quá trình hàn gắn vết thương sinh lý được tác giả Lê Đình Roanh (2009) mô tả như sau [2]:

Ngay sau khi phẫu thuật, đường rạch sẽ được lấp đầy bởi những cặn máu đông.

3 đến 24 giờ, bạch cầu đa nhân trung tính tập trung tại chỗ vết thương, đây là tế bào dấu ấn tiêu chuẩn của phản ứng viêm cấp.Những tế bào này có bào tương có hạt với một nhân có 2 đến 4 thùy.Chúng được tàng trữ trong tủy xương, lưu thông trong máu và tụ tập nhanh chóng ở những vị trí tổn thương hay nhiễm khuẩn Trong các mô, những bạch cầu đa nhân trung tính thực bào những vi khuẩn xâm nhập và mô đã chết.

24 đến 48 giờ: những tế bào biểu mô di chuyển từ mép vết thương tạo màng đáy, tăng sinh của tế bào là tối thiểu

Ngày thứ 3: những bạch cầu đa nhân trung tính được thay thế bởi những đại thực bào Các bạch cầu đơn nhân có nguồn gốc từ tủy xương

và có thể đi ra khỏi dòng tuần hoàn để di chuyển vào mô và trở thành đại thực bào thường trực Khi phản ứng với những chất trung gian, chúng tụ tập ở những vị trí viêm cấp Các đại thực bào bắt giữ và xử lý vi khuẩn, trình diện những kháng nguyên đã gắn với phức hợp hòa hợp mô chính lớp II (MHC) với những lympho bào Chúng cũng có thể biệt hóa thành các tế bào tua là những tế bào trình diện kháng nguyên hiệu quả cao.Sau

đó, mô hạt bắt đầu xuất hiện.

Ngày thứ 5: đường rạch được lấp đầy bởi mô hạt, tạo mạch máu mới và tăng sinh tế bào biểu mô là tối đa, những collagen bắt đầu xuất hiện.

Tuần lễ thứ 2: viêm, phù, tăng sinh mạch trở nên ít đi; tăng sinh nguyên bào xơ kèm theo sự tích lũy collagen tiếp diễn Nguyên bào xơ là những tế bào có ở khắp nơi, đời sống dài, chức năng chính là sinh ra những thành phần của chất cơ bản ngoài tế bào, trên đó mô được thiết

lập lại.Chúng có nguồn gốc từ trung bì, có thể biệt hóa thành các mô liên kết khác, bao gồm tế bào sụn, những tế bào mỡ, những tế bào xương, những tế bào cơ trơn.

Tháng thứ 2: vết sẹo bao gồm mô liên kết không có viêm được bao phủ bởi một thượng bì nguyên vẹn.

Nếu phản ứng viêm kéo dài hơn sẽ diễn biến thành viêm mạn tính với sự có mặt của nhiều tương bào, lympho bào.Lympho bào là những tế bào hình cầu, nhân lớn, chiếm gần hết khối bào tương Gồm có 2 dòng là

tế bào T và B thực hiện những chức năng quan trọng của phản ứng miễn dịch thể dịch và qua trung gian tế bào.Tương bào do các lympho B biệt hóa thành Những tế bào này giàu lưới nội nguyên sinh có hạt là nguồn quan trọng của những kháng thể.

Hình 1.2 Các thành phần của viêm cấp và viêm mạn tính: tế bào viêm

và protein, tế bào nội mô, các tế bào và protein của chất nền ngoại bào [2].

Chức năng của bạch cầu trong viêm cấp [2]:

- Thực bào: Có nhiều tế bào viêm, bao gồm bạch cầu đơn nhân, đại thực bào của mô, những tế bào có tua và bạch cầu đa nhân trung tính

nhận biết, vùi vào bên trong và tiêu hóa dị vật, những vi sinh vật hoặc những mảnh vụn tế bào.

- Các enzyme của bạch cầu đa nhân trung tính cần cho sự chống lại của vi khuẩn và dọn sạch vết thương.

 Các đường trong tế bào kết hợp với hoạt hóa tế bào viêm:

Một quá trình nhờ đó những kích thích khác nhau dẫn đến những phản ứng chức năng của những tế bào viêm (ví dụ, mất hạt hoặc kết dính) được gọi là ghép cặp phản ứng kích thích [2].

Đường protein G: Các chemokine, hormone, yếu tố dẫn truyền thần kinh, cũng như các chất trung gian hóa học khác của phản ứng viêm

sử dụng những protein của nhóm gắn guanine nucleotid (những protein G) để truyền tín hiệu.

Đường TNF: là một yếu tố quan trọng trong phản ứng viêm, nó gây chết tế bào theo chương trình của tế bào u và điều hòa những chức năng miễn dịch.

Chiêu mộ bạch cầu trong viêm cấp: Một trong những đặc điểm chính của viêm là sự tụ tập bạch cầu, đặc biệt là bạch cầu đa nhân trung tính trong mô bị tổn thương Những bạch cầu dính vào nội mô của huyết quản, trở nên bị hoạt hóa.Sau đó, chúng dẹt lại và di chuyển từ trong mạch máu, qua lớp tế bào nội mô và vào trong mô xung quanh Trong

mô ngoài hạch, những bạch cầu đa nhân trung tính nuốt những vật lạ, những vi khuẩn và mô chết.

 Sự lành hoá vết thương:

Ở những vị trí ghép hình thành nên mô hạt.Mô hạt gồm những hạt mềm, màu hồng xuất hiện ở nơi bề mặt vết thương đang dần lành Chúng đặc trưng cho sự tăng sinh nguyên bào sợi, cùng với mạch máu nhỏ được

hình thành Nguyên bào sợi hoạt động tổng hợp proteoglycan và collagen trong quá trình phát triển khối mô.

 Sự xơ hoá:

Đây là hiện tượng đáp ứng cơ chế lành hóa của vết thương, các phản ứng này diễn ra vào cuối thời kỳ lành hóa Vị trí tổn thương do vật liệu cấy ghép được sửa chữa bởi quá trình tái sinh của tế bào sinh mô hay

sự tái sinh mô mới để thay thế mô bị tổn thương hay khối mô bị mất.

Tính chất lý hóa của vật liệu cần phù hợp với đặc tính chung của các tế bào tạo mô.

Khung mô sau tổn thương đóng vai trò quan trọng trong sự khôi phục lại cấu trúc mô.

Đánh giá tính phù hợp mô, ngoài việc xem xét đến phản ứng viêm, người ta còn quan tâm xem quá trình đổi mới và sửa chữa của mô xung quanh vùng cấy ghép vật liệu, đặc biệt trong đề tài này là sự đổi mới của

mô xương.

Bình thường, trên màng xương có một lớp các tiền tạo cốt bào (các

tế bào mầm của mô xương) ở trạng thái không hoạt động.Khi màng xương bị tổn thương, các tiền tạo cốt bào tích cực hoạt động để hàn gắn

mô xương bị tổn thương Đó là những tế bào có nhân hình bầu dục hoặc dài, bắt màu tím nhạt, bào tương bắt màu acid kém, đôi khi hơi ưa base, chúng thường thấy trên mặt xương, ở lớp trong màng xương, lớp mặt trong ống Havers Khi đó, các tiền tạo cốt bào tăng nhanh về số lượng bằng cách gián phân rồi biệt hóa thành những tạo cốt bào [3].

Tạo cốt bào là những tế bào đa diện, dài 20 - 30µm có nhánh nối với nhau hoặc nối với tế bào nằm trong tủy xương Tạo cốt bào thường xếp thành một hàng trên mặt các bè xương đang hình thành Nhân tạo cốt bào lớn, hình cầu hoặc hình bầu dục thường nằm lệch về phía đối diện vùng xương mới đang hình thành.Bào tương ưa màu thuốc nhuộm base Chúng tạo nên một cái nền protein và gián tiếp tham gia vào việc

lắng đọng muối khoáng vào cái nền ấy để hình thành chất căn bản xương Trong quá trình tạo xương mới, một số tạo cốt bào tự vùi trong chất căn bản xương do chúng tạo ra và trở thành tế bào xương [3].

Tế bào xương (còn gọi là cốt bào) là những tế bào có nhiều nhánh Thân của tế bào dài 20-30µm, nằm trong các ổ xương, những nhánh xương của

tế bào xương mảnh, nằm trong các tiểu quản xương [3].

Song song với quá trình tạo xương là quá trình hủy xương do hủy cốt bào đảm nhiệm Đó là những tế bào rất lớn, đường kính 20-100µm, có nhiều nhân (50-60 nhân).Hủy cốt bào thường xuất hiện ở những vùng xương đang bị phá hủy, trên mặt của các khoảng trống Howship trong

mô xương Chúng hủy muối khoáng, tiêu hủy nền protein của chất căn bản Tế bào tiền thân của hủy cốt bào có nguồn gốc tủy xương, được sinh

ra và biệt hóa theo hướng riêng, theo dòng máu đến mô xương trở thành hủy cốt bào [3].

2 Phân loại và yêu cầu đánh giá an toàn sinh học của vật liệu, thiết bị cấy

ghép trong y tế theo ISO 10993

Bảng 1.1 Các phép thử đánh giá ban đầu để xem xét khả năng tương hợp sinh học của loại thiết bị ghép, đường tiếp xúc, thời gian tiếp xúc Cách phân loại các

trang thiết bị y tế Tác động sinh học

Bản chất

tiếp xúc

Thời gian tiếp xúc

A – giới hạn(<24h)

B – kéo dài (24h đến 30 ngày)

C–vĩnh viễn

Độ

c tế bà o

Gây nhạ y cảm

Gây kích thíc h hoặ c phả n ứng da

Nhiễ m độc cấp tính

Nhiễ m độc bán cấp

Đột biế n gen

Khả năn g cấy ghé p

Phù hợp mô

Tươn g thích máu

3.1 Đ1Các đặc tính và

Titan là một nguyên tố kim loại, ký hiệu là Ti, đứng thứ tự số 22 trong bảng tuần hoàn các nguyên tố hóa học Titan là một kim loại chuyển tiếp, màu trắng bạc Nó là một kim loại nhẹ, cứng, có bề mặt sáng bóng, chống ăn mòn tốt (do có lớp oxit bảo vệ bên ngoài)

Hình 1.3 Tương hợp sinh học là được coi là một trong năm

đặc tính của titan.

Các đặc tính quý báu của titan khiến nó trở thành vật liệu sinh học được sử dụng phổ biến hiện nay.

- Đàn hồi: Hầu hết các chất rắn có thuộc tính đàn hồi nếu tải trọng không

quá lớn Với các vật liệu có các nối mạnh như kim cương thì có modul đàn hồi cao Với các vật liệu có các nối yếu như (polymer), các modul này thấp hơn.

- Độ nén: mà vật liệu phải chịu rất quan trọng trong các mô.

- Đứt gãy, giòn: Tính chất này tiêu biểu cho các vật liệu: gốm, thủy tinh,

hợp kim cứng, một số polymer.

3.2 Ứng dụng của hợp kim titan

Titan thường được sử dụng dưới dạng hợp kim, chủ yếu là hợp kim với nhôm (Al) và sắt (Fe), vonfram (V)…

Titan có thể được coi là một loại vật liệu tương đối mới Nó được phát hiện muộn hơn rất nhiều so với các kim loại thường được sử dụng khác, ứng dụng thương mại của nó bắt đầu từ cuối những năm 40, chủ yếu là vật liệu cấu trúc Titan được đưa vào sử dụng trong ngoại khoa từ những năm 1950 và được sử dụng trong nha khoa trước đó một thập kỷ.Hiện nay, titan là vật liệu được ứng dụng rộng rãi trong y tế để làm các bộ phận giả, dụng cụ cố định, thay thế các cơ quan bên trong cơ thể, đặc biệt là xương Trong cấy ghép y học, titan được sử dụng từ đầu đến chân theo đúng nghĩa đen của nó Người ta có thể tìm thấy titan trong phẫu thuật thần kinh, trợ thính dẫn xương, cấy ghép mắt giả, đốt sống, khớp háng, khớp gối, các xương, khớp khác nhỏ hơn như ngón tay, ngón chân Nó còn được dùng để chế tạo các máy móc đặt bên trong cơ thể như máy tạo nhịp tim… Lý do titan được sử dụng rộng rãi trong cơ thể

là do nó là loại vật liệu có tính tương thích sinh học cao, chỉ cần thay đổi chất phủ bề mặt.

Hình 1.4 Titan được ứng dụng để thay thế nhiều bộ phận trên cơ thể.

Titan được coi là vật liệu sinh học, vật liệu cấy ghép được ứng dụng nhiều nhất trong lĩnh vực răng hàm mặt, sọ não, chấn thương chỉnh hình.

- Trong răng hàm mặt, nhờ tính phù hợp mô mà xương có thể phát triển được quanh vật liệu, nên nó được dùng làm vật liệu chế tạo implant (trụ để cắm răng giả).

- Trong chấn thương sọ não, titan được dùng để chế tạo mảnh vá hộp sọ.

Nagawa T và cộng sự nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đánh giá khả năng phù hợp sinh học của hợp kim titan 29 niobium – 13 zirconium với tế bào dạng tạo cốt bào (osteoblast – like MG63 cells) Tế bào MG63 được nuôi cấy trong ba đĩa hợp kim chứa titan: TiNb, pTi và titanium - 6aluminiu-4vanadium (TiAl), sau 48 giờ, không có sự khác biệt

về sự phát triển của các tế bào ở ba đĩa hợp kim này [8].

Các tác giả như H.J.Rack, M Niinom và cộng sự trên các tạp chí khoa học và công nghệ vật liệu đã đề cập nhiều đến khả năng áp dụng của hợp kim titan trong lĩnh vực y sinh học [9], [10].

R.Z Valiev và cộng sự trong tạp chí chế tạo vật liệu cao cấp, trong

đó có vật liệu titan cấu trúc nano để ứng dụng trong y sinh học [11].

Y Estrin, C Kasper và cộng sự năm 2009 trên tạp chí nghiên cứu vật liệu sinh học cho thấy dụng cụ nuôi cấy phủ titan dạng hạt siêu mịn

có ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của các tiền tạo cốt bào [6].

Lopez - Heredia và cộng sự (2007) đã tiến hành cấy ghép vật liệu titan vào xương đùi của 15 con thỏ, sau 3 và 8 tuần mô xương mới đã phát triển mạnh xung quanh vật liệu titan [14].

Slaets (2008) cũng đã tiến hành cấy vật liệu Ti-6Al-4V vào xương chày của thỏ và theo dõi vào các thời điểm sau ghép 3, 7, 14, 28, 42 ngày Theo nghiên cứu này, quá trình tạo xương mới bắt đầu từ tuần thứ 2 với sự

có mặt của các tạo cốt bào trong vi trường Quá trình này đạt tối đa ở tuần thứ 4, và sau 6 tuần quá trình tạo xương giảm đi, mô xương mới thay thế

vi trường [16].

Tại Việt Nam: Nghiên cứu chế tạo các sản phẩm y tế từ hợp kim titan hầu như chưa có Đây là nghiên cứu đầu tiên do Viện công nghệ Bộ công thương tiến hành.

Chương 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPNội dung thử nghiệm này căn cứ vào ISO 10993 -10 về đặc điểm, cách tiếp xúc, thời gian tiếp xúc của thiết bị với cơ thể Các thiết bị làm

từ titan bao gồm các nẹp, vít, các trụ implant vvv… Các thiết bị này tiếp xúc trực tiếp với mô xương, mô mềm bao bọc bên ngoài, răng (tissue, bone, dentin) Thời gian tiếp xúc lâu dài Căn cứ hướng dẫn của ISO

10993 ( tiêu chuẩn quốc tế về đánh giá phù hợp sinh học của vật liệu, thiết bị y tế), cần phải thử nghiệm các nội dung sau:

- Thử nghiệm độc tính tế bào (cytotoxicity)

- Thử nghiệm độc tính gen (genotoxicity)

- Chuột cống trắng, loại dùng trong phòng thí nghiệm

- Chó ta, giống đực, cân nặng 8-12kg/con

- Thỏ ta cân nặng 2,2 -2,5kg/com

- Vật liệu ghép trên thỏ: là một khối hình tròn, đường kính

8mmx10mm,chó ta, giống đực, cân nặng 8-12kg/con

- Nguyên tắc chọn mẫu là đủ để đánh giá

Yêu cầu kích thước, hình dạng vật liệu cho nghiên cứu:

- Ghép trên thỏ: khối hình tròn đường kính 8mm x 10mm - Ghép trên chó: nẹp hình máng, dài 20mm, dầy 3mm, có 2 lỗ ở 2 đầu Đinh vít dài 10 -15mm, đường kính 2 mm

- Gây độc tính tế bào: Dạng hạt mịn, kích thước 0,5-1mm

- Gây độc tính gen: cơ vùng ghép vật liệu để đánh giá độc tính gen in vivo

2 Phương pháp nghiên cứu

2.1 Mô hình nghiên cghi

Theo tiêu chuẩn ISO 10993:

Các thiết bị y tế được làm bằng titan hầu hết tiếp xúc với mô xương, răng, mô mềm Thời gian tiếp xúc lâu dài Căn cứ vào ISO 10993, cần phải đánh giá 4 yếu tố sau:

- Đánh giá tính phù hợp mô, khả năng cấy ghép tại chỗ

- Đánh giá nhiễm độc cấp, bán cấp

- Đánh giá độc tính tế bào

- Đánh giá độc tính gen

 Đánh giá tính phù hợp mô, khả năng cấy ghép:

- 420 mẫu vật liệu (2loại: Ti-5AL-2,5Fe ký hiệu là L1; Ti-6Al-7Nb

ký hiệu là L2) ghép vào cơ mông cho 4020 thỏchuột L1:

Ti-5AL-2,5Fe: 210 thỏchuột chia 2 lô 4 tuần; 12 tuần L2: Ti-6Al-7Nb:

20 thỏ10 chia 2 lô 4 tuần; 12 tuần

- 40 máng vật liệu (mỗi loại 20) sử dụng trên chó với hai mốc thời gian 8tuần và 16 tuần

- 40 máng vật liệu (mỗi loại 20) sử dụng trên chó với hai mốc thời gian

3 và 6 tháng

 Đánh giá nhiễm độc cấp, bán cấp.

Lấy máu chuột xét nghiệm trước, sau ghép vật liệu 72 giờ đánh giá nhiễm độc cấp, lấy máu sau ghép 4 tuần đánh giá khả năng nhiễm độc bán cấp., khả năng gây độc làm đột biến gen

 Đánh giá độc tính tế bào:

- Vật liệu rời nghiền nhỏ (2loại): L1: Ti-5AL-2,5Fe; L2: Ti-6Al-7Nb nuôi cấy cùng tế bào gốc trung mô Quan sát hình thái và sự phát triển tế bào.

- Sản phẩm chứng: Thử song song

 Đánh giá độc tính gen:

- Vật liệu rời nghiền nhỏ (2 loại): L1: Ti-5AL-2,5Fe; L2: 7Nb, nuôi cấy cùng tế bào gốc trung mô Đánh giá độc tính gen gây tổn thương DNA bằng kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch.

Ti-6Al-1.42.2 Tiến hành nghiên cứu

1.42.2.1 Nghiên cứu tính phù hợp mô và khả năng cấy ghép

1.42.2.1.1 Động vật:

- Thng vật:rhng vật:g 1,8-2,0 kg, mô và khả năng cấy ghé40 con chia hai

nhóm, mả năng c20 con Nhóm 1: thhóm, mả năng cấy ghépĐánh giá độc tíửcon NhóL2:Ti-6Al-7Nb Mhóm, mả năng cấy ghépĐá4 tuần,12 tun,Al-7Nb Mhóm, mả năng cấy gên 2 loại vật liệu là 40 thỏ

- Chó ta, tr Chó ta, tNb Mhóm, mả năng cấ40 con, chia 2 nhóm: nhóm 1ghép vgên 2 loại vật liệu là 40 thỏ.tổn thương DNA bằng kỹ Theo dõi saughép8 tuần, 16 tun, Ttun, õi sau ghép nhóm 1 ghép vgên 2 loại vật liệu làChutun, ng trắng (loại sử dụng trong phòng thí nghiệm) 0.5 kg/con, mạnhkhỏe, giống đực: 20 con chia hai nhóm, mỗi nhóm 10 con Nhóm 1: thửnghiệm L1: Ti-5AL-2,5Fe, nhóm 2: thửhutun, nL2:Ti-6Al-7Nb M (loại sửdụng trong phòng thí nghiệm) 0.5 kg/con, mạnh khỏe, gi sau 12 tuần.20 thỏghép vật liệu đối chứng Tổng số chuột nghiên cứu trên 2 loại vật liệu ở lôchứng và lô thực nghiệm là 40 thỏ

- Chó ta, trọng lượng 8-10 kg, giống đực: 20 con, chia 2 nhóm: nhóm 1 ghépvật liệu L1: Ti-5AL-2,5Fe, nhóm 2 ghép L2: Ti-6Al-7Nb Theo dõi sau ghép

3 và 6 tháng Tổng số chó nghiên cứu trên 2 loại vật liệu ở lô chứng và lô thựcnghiệm là 40 chó.

1.42.2.1.2 Vật liệu:

Vật liệu phải có kích thước và khối lượng bằng nhau, phù hợp với từng loại động vật nghiên cứu, phải được hấp sấy vô trùng.

Ti-5AL-2,5Fe 7Nb

Ti-6Al-Hình 2 1 Vật liệu chế tạo dạng máng để ốp vào xương chó

Ti-5AL-2,5Fe Ti-6Al-7Nb

Hình 2 3 Vật liệu chế tạo dạng hạt để thử độc tính tế bào

Hình 2.23 V Al-7Nb ch hdh tế bàođ V Al-7Nb ch

1.42.2.1.3 Tiến hành cấy ghép

 Chuẩn bị dụng cụ

- Thuốc mê: Ketamine liều lượng 4ml/kg cân nặng.

- Thuốc sát trùng

- Săng, găng tay vô khuẩn

- Dao phẫu thuật, chỉ lin để đóng vết mổ.

- Vật liệu titan đã được hấp sấy, khử trùng

- Chỉ kim loại để buộc vật liệu

- Các dụng cụ, hóa chất cho quá trình làm tiêu bản: dung dịch cố định Bouin, dung dịch khử canxi (Acid nitric 7.7%), thuốc nhuộm H.E (Hematoxilin và Eosin).

- Kính hiển vi quang học

 Các bước tiến hành

Bước 1: Phẫu thuật đưa vật liệu vào cơ thể

- Thỏ được cạo lông vùng mông, gây tê tại chỗ, rạch da, tách cơ, đặt vật liệu vào giữa khối cơ Đóng vết mổ hai lớp.

- Chó được gây gãy xương cẳng chân thực nghiệm sau gây mê Gây mê

bằng Ketamine 4ml/kg cân nặng, bơm tĩnh mạch cẳng chân chậm, theo dõi

các dấu hiệu sinh tồn của chó (nhịp thở, mạch).Làm sạch, sát trùng vùng mặttrong đùi Rạch da, bóc tách mô cơ, mô liên kết vào mặt trong xương cẳngchân Dùng nẹp bằng vật liệu thử nghiệm cố định (nẹp chế tạo cho phù hợpvới xương chó), bắt vít Đóng vết mổ bằng chỉ line

- Chó được gây gãy xương cẳng chân thực nghiệm sau gây mê Gây mê bằngKetamine 4ml/kg cân nặng, bơm tĩnh mạch cẳng chân chậm, theo dõi các dấuhiệu sinh tồn của chó (nhịp thở, mạch) Làm sạch, sát trùng vùng mặt trongđùi Rạch da, bóc tách mô cơ, mô liên kết vào mặt trong xương cẳng chân.Dùng nẹp bằng vật liệu thử nghiệm cố định (nẹp chế tạo cho phù hợp vớixương chó), bắt vít Đóng vết mổ bằng chỉ line

Bước 2: Theo dõi sau phẫu thuật ghép vật liệu:

+ Xử trí sau ghép: Theo dõi mạch, huyết áp, truyền dịch, dùng

thuốc kháng sinh.

+ Tình trạng toàn thân: ăn uống, hoạt động.

+Tình trạng tại chỗ: vết mổ, vùng xung quanh xem có sưng tấy, chảy mủ hay dịch, đùn đẩy vật liệu ra ngoài hay không?

Bước 3: Đánh giá kết quả:

+ Đánh giá tại chỗ ghép vật liệu: viêm, đùn đấy vật liệu ra ngoài + Đánh giá trên đại thể của vùng vật liệu tiếp xúc với mô cơ, mô xương: màu sắc, sự biến đổi cấu trúc mô trên đại thể.

+ Đánh giá trên vi thể: Lấy vùng mô tiếp xúc trực tiếp với vật liệu làm tiêu bản vi thể đánh giá tính phù hợp mô với vật liệu Đánh giá tế bào và vùng mô xung quanh có thay đổi với vùng mô không ghép vật liệu

? Đối với mô xương đánh giá xem đã liền xương chưa?Có tế bào tiền tạo cốt bào, tạo cốt bào, tế bào xương, hủy cốt bào, có mô xương mới hình thành.

+ Đánh giá liền xương: chụp X-quang sau ghép 1 tháng, 4 tháng

1.42.2.1.4 Kiá liền xương: chụp X-qua

Kỹ thuật làm tiêu bản vi thể để đánh giá hình thái vi thể của mô xương sau khi cấy ghép vật liệu:

- Cố định mô cơ, xương: nhằm bất động tổ chức cũng như tế bào nhưng vẫn bảo đảm chúng trong một trạng thái gần với lúc sống nhất.

- Khử canxi (đối với mô xương): làm mềm tổ chức xương, kiểm tra bằng kim xuyên qua, đạt yêu cầu khi kim xuyên qua dễ dàng.

- Cắt, nhuộm tiêu bản: Phương pháp nhuộm màu kép H.E (Hematoxiline và Eosin).

- Cách lấy mẫu: Đối với mô cơ lấy mẫu xung quanh vùng ghép vật liệu Đối với mô xương lấy tại vị trí vùng mặt xương tiếp xúc với nẹp vít, vùng mô xương tiếp xúc với vít ( sau khi tháo nẹp vít) Mỗi mẫu lấy 10 tiêu

bản Tổng số mẫu nghiên cứu 480 (n=80).80 mẫu (40 thỏ + 40 chó), tổng số

tiêu bản 4800

1.42.2.2 Th ng số tiêu bản cứu ảnô cơ lấy mẫu xung qua

- Lấy máu 30 20 chuột trước và sau cấy ghép vật liệu 72 giờ, kể cả sản phẩm chứng,theo dõi trong 7 ngày.

- Xét nghiệm sinh hóa, huyết học đánh giá khả năng gây độc cho cơ quan tạo máu, gan, thận.

1.42.2.3 Th.ét nghiệm sinh hóa, huyết học đánh giá khả năng

- Lấy máu 3020 chuột cống trước và sau cấy ghép vật liệu 30 ngày,

kể cả vật liệu chứng theo dõi chuột trong 7 ngày.

- Xét nghiệm sinh hóa, huyết học đánh giá khả năng gây độc cho cơ quan tạo máu, gan, thận.

- Kiểm tra ngẫu nhiên giải phẫu bệnh mô gan, thận của 50 % số chuột cống ở mỗi lô Mỗi mô gan, thận lấy 5 lát mô.Tổng số tiêu bản mỗi con là 10 tiêu bản, tổng số tiêu bản nghiên cứu là 15000 tiêu bản Theo quy trình của bộ môn dược lý, trường đại học y hà nội.

1.42.2.4 Thử nghiệm đánh giá độc tính tế bào

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng tế bào gốc trung mô phân lập từ tủy xương thỏ nuôi cấy trong môi trường có Titan ở các nồng độ khác nhau, ở các thời điểm khác nhau nhằm đánh giá tác động độc tính Titan lên tế bào thử nghiệm Quá trình thử nghiệm này gồm các bước sau: chuẩn bị tế bào thử nghiệm và chuẩn bị vật liệu thử nghiệm.

 Chuẩn bị tế bào thử nghiệm:

a Hút tủy xương để phân lập tế bào

 Hút dịch tủy xương từ mào chậu, mỗi con 8-10ml.

 Dịch tủy xương được pha loãng bởi PBS với tỷ lệ 1: 4

 Đặt dịch tủy xương lên lớp ficoll, tránh làm xáo trộn bề mặt tiếp xúc

 Ly tâm với tốc độ 400g trong 20 phút

 Thu lấy lớp tế bào đơn nhân

 Rửa khối tế bào thu được trong PBS

 Ly tâm thu lấy tế bào

 Huyền phù tế bào trong môi trường nuôi

b Phân lập và nuôi cấy tế bào

Cho dung dịnh huyền phù chứa khối tế bào gốc đơn nhân vào môi trường nuôi cấy DMEM F12, 10% FBS, 1 % kháng sinh.

Phương pháp thu nhận và tăng sinh tế bào MSC dựa vào tính bám dính của chúng, vào bề mặt nhựa nuôi cấy Hầu hết những tế bào không bám dính như những tế bào tạo máu đều được loại bỏ sau khi thay môi trường.

Sau 3 ngày thay môi trường để loại bỏ môi trường cũ và tế bào nổi.Thay môi trường 3 ngày/1 lần Khoảng 10-15 ngày thu được quần thể tương đối đồng nhất khi tế bào tăng sinh khoảng 70-80% chai nuôi thì cấy chuyển nhằm cung cấp không gian và chất dinh dưỡng cho tế bào phát triển.

c Định danh tế bào thử nghiệm

- Dựa vào khả năng bám dính của MSC vào bề mặt chai nuôi cấy, sau từ 3-5 ngày lần cấy chuyển sẽ thu được quần thể tương đối thuần nhất Thông thường để khẳng định là MSC dựa vào các tiêu chí sau:

- Dựa vào hình thái tế bào : các tế bào có hình dạng giống nguyên bào sợi khi bám vào bề mặt chai nuôi cấy

- Dựa vào các marker bề mặt bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch: Nếu có, biểu hiện dương tính ≥ 95% CD105, CD90, CD73, biểu hiện âm tính: ≤ 2% CD34, CD45, CD14, CD11b, CD79α hoặc CD19, HLA-DR.

- Dựa vào khả năng biệt hóa: MSC có khả năng biệt hóa thành xương, sụn, mỡ.

- Dựa vào kỹ thuật đo dòng chảy

Hình 2 2.34 4 Sơ đồ qui trình thử nghiệm độc tính tế bào

 Chuẩn bị vật liệu thử nghiệm:

Về nguyên tắc, tế bào được thử với dịch chiết của vật liệu, tuy nhiên Titan là một hợp kim cứng, không chứa dịch chiết bởi vậy chúng tôi phải cho vật liệu tiếp xúc trực tiếp với tế bào Các sợi mảnh L1: Ti- 5AL-2,5Fe và L2: Ti-6Al-7Nb từ thiết bị được cắt, nghiền rất nhỏ theo yêu cầu, đảm bảo không đè chết tế bào Rửa sạch bằng siêu âm, ngâm trong nước cất 24 giờ Sau đó sấy khô, cân trọng lượng ở các nồng độ 0,5mg, 1mg, 5mg, 10mg, 20mg trong 1ml môi trường nuôi cấy chứa 100.000 tế bào

 Tiến hành thử nghiệm:

- Chuẩn bị số lượng tế bào gốc trung mô thỏ tương đương 100.000

tế bào cho mỗi giếng nuôi cấycó đường kính 16 mm.

- Tiến hành: Mỗi loại chất thử nghiệm được thử độc tính ở 53 nồng

độ có so sánh với chứng âm tại 3 thời điểm khác nhau là 24 giờ, 48 giờ và

96 giờ sau gieo tế bào Mỗi nồng độ được làm triple với 3 giếng khác nhau.Tại các thời điểm 24, 48, 96 giờ sau cấy tế bào, tiến hành nhuộm, chụp ảnh nhuộm, chụp ảnh, xác định số lượng và kích thước các cụm tế bào Tổng số thỏ nghiên cứu trên 2 loại vật liệu titan Ti-5AL-2,5Fe và L2: Ti-6Al-7Nb ở lô chứng, lô thực nghiệm là 40 thỏ Phân tích kết quả, đánh giá tác động độc tính của chất thử Titanium-Al trên tế bào thử nghiệm Qui trình được tiến hành như sau:

- Chất thử nghiệm được thử độc tính ở 4 3 nồng độ: 0,5mg, 1mg, 5mg, / trong 1ml chứa 100,000 tế bào

- o

- Thời gian thử nghiệm: 3 thời điểm khác nhau là 24,48 và 96 giờ.

Hình 2.52.4 5 Sơ đồ mô hình thử nghiệm độc tính tế bào

- Tại các thời điểm 24, 48,72 giờ sau cấy tế bào, tiến hành nhuộm, chụp ảnh nhuộm, chụp ảnh, xác định số lượng và kích thước các cụm tế bào.

- Phân tích kết quả, đánh giá tác động độc tính của chất thử từ titan thử nghiệm và so sánh với titan chứng trên tế bào nuôi cấy.

chứa TB và

vật liệu thử

24 giờ 48 giờ 72 giờ

Thời gian thử nghiệm

Tiến hành nuôi cấy

- Mỗi loại chất thử nghiệm được thử độc tính ở4 nồng độ có so sánh vớichứng âm tại 3 thời điểm khác nhau là 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau gieo tế bào.Mỗi nồng độ được làm triple với 3 giếng khác nhau Tổng số thỏ nghiên cứutrên 2 loại vật liệu titan -5Al, titan – 6Al ở lô chứng, lô thực nghiệm là 40mẫu

Đánh giá độc tính gene của thiết bị

- Đánh giá độc tính gene (gây tổn thương DNA): chúng tôi chọnmarker là Gamma-H2AX, một dấu chỉ cho vị trí tổn thương DNA Tại vị tríDNA bị tổn thương Histon H2AX bị phosphoryl hóa ở vị trí serin 139 trở

thành Gamma-H2AX và bao quanh tổn thương tạo thành các hạt

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18610740) Tiến hành thu hoạch tế

bào, đổ lam và nhuộm miễn dịch huỳnh quang dùng kháng thể đơn dòng cóthể phát hiện được số lượng, kích thước các hạt Gamma-H2AX

- Phân tích kết quả, đánh giá tác động độc tính trên DNA (gene) củachất thử Titanium-Al trên tế bào thử nghiệm

12.2 4 .5. 212 Thử nghiệm độc tính gene in vivo

Tiến hành

- Tiến hành cấy mảnh vật liệu vào xương đùi thỏ, sau ghép 4 tuần giết thỏ, lấy mảnh mô vùng tiếp xúc với vật liệu để đánh giá độc tính gene của vật liệu chứa Ti-5AL-2,5Fe và Ti-6Al-7Nb.

Độc tính gene với tế bào tiếp xúc gần với vật liệu

- Tiến hành lấy vùng tế bào cơ thỏ bao quanh vật liệu Cắt tiêu bản nhuộm phát hiện các hạt Gamma-H2AX trong nhân tế bào cơ quanh vị trí vật liệu (n=30)

Độc tính với tế bào khác của cơ thể thỏ

- Tiến hành lấy máu ngoại vi thỏ  tách bạch cầu bằng ficoll  đổ lam nhuộm phát hiện các hạt Gamma-H2AX trong nhân tế bào (n=30)

 Chỉ tiêu đánh giá

- So sánh số lượng hạt Gamma-H2AX trên 1 nhân tế bào giữa nhóm thiết bị chứng và thiết bị thử nghiệm.

Chương 3: KẾT QUẢ1.Kết quả thử độc tính tế bào

1.1 Đối với Ti-5AL-2,5Fe

Bảng 3.11 Tỷ lệ tế bào bao phủ trên diện tích vi trường quan sát theo

thời gian và nồng độ tiếp xúc với Ti-5AL-2,5Fe

- Thời gian càng dài, tế bào phát triển càng mạnh.

- Hình dạng tế bào không bị biến đổi.

1.2 Đối với Ti-6Al-7Nb