CÁC kỹ THUẬTSÀNG lọc DI TRUYỀN ỨNG DỤNG TRONG điều TRỊ vô SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

ADO: Allele Drop-Out / Mất alenART: Assisted Reproductive Technology/ Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản a-SNP: Array Single Nucleotide Polymorphism/ Phân tích đa hình đơn dùng chíp DNA BAC: Bact

NGUYỄN THỊ BÍCH VÂN

CÁC KỸ THUẬT SÀNG LỌC DI TRUYỀN

ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ VÔ SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Duy Bắc

Cho đề tài: “Mối liên quan giữa một số yếu tố nguy cơ và tình trạng

rối loạn nhiễm sắc thể trước chuyển phôi”

ADO: Allele Drop-Out / Mất alen

ART: Assisted Reproductive Technology/ Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

a-SNP: Array Single Nucleotide Polymorphism/ Phân tích đa hình đơn dùng

chíp DNA BAC: Bacterial artificial chromosome

DNA: DeoxyriboNucleic Acid

FISH: Fluorescent In Situ Hybridization/ Lai huỳnh quang tại chỗ

ICM: Inner Cell Mass/ Nguyên bào phôi-mầm phôi

ICSI: Intra Cytoplasmic Sperm Injection/ Tiêm tinh trùng vào bào tương

của noãn IUI: Intra-Uterine Insemination/ Bơm tinh trùng vào buồng tử cung

IUI-D: Sử dụng tinh dịch hiến tặng

IUI-H: Sử dụng tinh dịch chồng

IVF: In-Vitro Fertiliztion/ Thụ tinh trong ống nghiệm

IVM: In vitro maturation of oocytes/ Kỹ thuật nuôi trứng trưởng thành trong

ống nghiệm KL-BoBs: BACs - on - Beads/ Phương pháp KaryoLite BoBs

NGS: Next Generation Sequencing/ Giải trình tự gene thế hệ mới

NST: Nhiễm sắc thể

PB: Phôi bào

PGD: Preimplantation genetic diagnosis/ Chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi PGS: Preimplantation genetic screening/ Sàng lọc di truyền trước chuyển phôi PGT: Preimplantation genetic testing/ Test di truyền trước chuyển phôi

PZD: Partial zona dissection

qPCR: Quantitative Polymerase Chain Reaction/ Phản ứng chuỗi định lượng RNA: RiboNucleic Acid

TE: Trophectoderm/ Nguyên bào lá nuôi

WGA: Whole Genome Application / Khuếch đại bộ gen

WHO: Tổ chức Y tế Thế giới

MỤC LỤC

3

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vô sinh là vấn đề được cả thế giới quan tâm do tỷ lệ vô sinh có xu hướngngày càng tăng Theo thống kê của WHO, tỷ lệ vô sinh chung trên thế giới là6÷12%, tỷ lệ này ở Việt Nam là 7,7% Nhờ sự phát triển của nền y học hiệnđại, nhiều nguyên nhân vô sinh đã được tìm ra và từ đó đưa ra những phươngpháp điều trị vô sinh phù hợp và có hiệu quả Thụ tinh trong ống nghiệm (Invitro fertilization/IVF) là phương pháp hỗ trợ sinh sản có vai trò quan trọngtrong điều trị vô sinh, và ngày càng được phát triển rộng khắp trên thế giới.Tuy nhiên, mặc dù các phôi được chuyển trong kỹ thuật IVF là các phôi đãđược chọn lựa hình thái tốt, tỷ lệ thành công của kỹ thuật này vẫn còn thấp,chỉ từ 30÷35% Nguyên nhân chính là do rối loạn nhiễm sắc thể cao ở trứnghoặc ở phôi

Đã hơn 60 năm kể từ những ca đầu tiên phát hiện rối loạn NST, các nhàkhoa học trên thế giới đã thu thập được nhiều thông tin về nguồn gốc, nguyênnhân gây ra các rối loạn này Những rối loạn này có thể xảy ra trong suốt hệthống tế bào sinh sản ( trứng và tinh trùng), vào giai đoạn phát triển ban đầu củaphôi bào, hoặc trong bất kì tế bào nào sau khi sinh Một số nghiên cứu cho rằnggần một nửa noãn người bị rối loạn NST, tỷ lệ này tăng lên đáng kể khi ngườiphụ nữ trên 35 tuổi [1] Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra phôi người ở giai đoạnsớm thường có rối loạn NST và trên 50% phôi tạo ra trong ống nghiệm có chứaphôi bào bị đột biến NST Các rối loạn về NST có thể dẫn đến kết quả như phôikhông làm tổ được, sẩy thai, thai chết lưu, hoặc sinh ra những đứa trẻ bịTrisomy Vì vậy, sàng lọc rối loạn NST cho phôi trước khi chuyển vào tử cungcủa người phụ nữ là thực sự cần thiết Gần đây, tổng hợp các kết quả nghiên cứucho thấy tỷ lệ có thai tăng lên đáng kể khi tiến hành sàng lọc di truyền trướcchuyển phôi (preimplantation genetic screening/PGS) [2]

Với sự tiến bộ của di truyền học hiện đại, nhiều kỹ thuật di truyền tế bào

và phân tử được ứng dụng thành công trong sàng lọc và chẩn đoán di truyềntrước chuyển phôi như FISH, aCGH, BoBs, NGS Mỗi kỹ thuật đều có ưu vànhược điểm khác nhau Việc nghiên cứu, tìm ra một phương pháp ưu việt đểsàng lọc, lựa chọn phôi có bộ nhiễm sắc thể bình thường là yêu cầu cấp thiết

và thực tiễn, giúp cho thụ tinh trong ống nghiệm đạt kết quả cao, đảm bảo cho

ra đời một thế hệ khoẻ mạnh về thể lực, sáng suốt về tinh thần, góp phần nângcao chất lượng dân số

Mục tiêu của chuyên đề “Các kỹ thuật sàng lọc di truyền ứng dụng trong điều trị vô sinh bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm” gồm:

1 Trình bày kỹ thuật sinh thiết phôi trong thụ tinh trong ống nghiệm

2 Các kỹ thuật di truyền trong sàng lọc di truyền trước chuyển phôi

I SỰ PHÁT TRIỂN BÌNH THƯỜNG CỦA PHÔI TRƯỚC KHI LÀM TỔ

1 Phôi ở giai đoạn tiền nhân

Noãn được thụ tinh để tạo thành hợp tử và phát triển thành phôi quanhiều giai đoạn, khởi đầu là giai đoạn tiền nhân Tiền nhân đực và tiền nhâncái thường hình thành cùng một lúc Tiền nhân đực hình thành gần vị trí tinhtrùng thâm nhập và tiền nhân cái hình thành ở cực bào tương có thoi phân bào[3] Tiền nhân có kích thước nhỏ và mờ, mỗi tiền nhân có khoảng 1 đến 9 hạtnhân, tiền nhân nhỏ có ít hạt nhân hơn [1] Có thể quan sát thấy hình ảnh tiềnnhân sau khi tiêm tinh trùng vào bào tương của noãn 4h; nhưng muộn hơn nếucấy noãn với tinh trùng, từ 5-6 giờ Khoảng 15 giờ sau khi thụ tinh, hai tiềnnhân nằm sát nhau và có hình số 8, phần tiếp xúc sát nhau tạo thành một mặtphẳng, đồng thời các hạt nhân sẽ di chuyển và xếp hàng cạnh vùng tiếp xúchai tiền nhân

2 Phôi ở giai đoạn phân chia (ngày 2-3 sau thụ tinh)

Sự phân chia của phôi bào gồm một loạt các chu kỳ phân bào của bàotương Trung thể của tinh trùng kiểm soát sự phân chia đầu tiên sau thụ tinh[4] Trong chu kỳ phân bào đầu tiên ở giai đoạn cuối, bào tương của hợp tửkéo dài ra và thắt lại dần ở giữa cho đến khi hợp tử phân chia thành hai phôibào Quá trình này tiếp tục trong những chu kỳ phân bào tiếp theo Trong 3chu kỳ phân bào đầu tiên, kích thước của phôi thường ít thay đổi, kích thướccủa phôi bào giảm khoảng 28,5% cho mỗi chu kỳ phân bào (hình 1) Phôi có

2 đến 8 phôi bào phụ thuộc chủ yếu vào sự dịch mã từ các chất liệu RNA của

mẹ để phân chia [5]

3 Phôi dâu (phôi ngày 4)

Ở người phôi dâu bắt đầu hình thành khi phôi ở giai đoạn 8 phôi bào vàbắt đầu quá trình kết đặc Phôi dâu ở người có thể xuất hiện sớm khoảng 65giờ sau thụ tinh, nhưng thường xuất hiện giữa ngày thứ 3 và thứ 4 sau thụ tinh

[6] Quá trình phôi kết đặc là một quá trình hình thành các liên kết chặt chẽgiữa các phôi bào, phần phôi bào tiếp xúc với nhau tăng lên và dàn phẳng ratạo thành một khối không nhìn rõ các ranh giới giữa các phôi bào, bề mặt củaphôi được phủ một lớp vi nhung mao Các phôi bào hoặc mảnh vụn tế bào màkhông hình thành liên kết với các phôi bào khác sẽ bị đẩy ra ngoài khối phôinhưng vẫn ở phía trong màng trong suốt cho tới khi phôi thoát màng [7] Dướikính hiển vi, hình thái của phôi dâu được thể hiện bằng sự tăng tiếp xúc giữacác phôi bào, nhưng ranh giới giữa các phôi bào còn nhìn thấy Khi quá trìnhkết đặc tăng dần, ranh giới giữa các phôi bào trở nên khó phân biệt do cácphôi bào dàn phẳng ra và kết liền với nhau Phôi dâu lúc ở giai đoạn này hoàntoàn trông như một tế bào có nhiều nhân (hình 2) Khi phôi bắt đầu kết đặclại, các phôi bào tương tác với nhau làm các phôi bào không còn đặc tính toànnăng nữa và đây là sự khởi đầu cho sự sao mã DNA của phôi

4 Phôi nang (phôi ngày 5-6)

Sau khi phôi kết đặc, phôi bắt đầu lớn dần và tạo nang dịch bên trongtạo điều kiện cho sự phát triển để phôi bào biệt hóa thành nguyên bào lá nuôi

và mầm phôi (hình 3) Phôi nang thường hình thành khoảng 100 giờ sau khithụ tinh Quá trình tạo nang bao gồm sự tích lũy dịch vận chuyển bởi cácnguyên bào lá nuôi Để hoàn thành quá trình này, nguyên bào lá nuôi đầu tiênphụ thuộc vào sự hoàn thành quá trình phân cực tế bào và hình thành mối liênkết chặt giữa các nguyên bào lá nuôi Sự liên kết và vị trí các phôi bào trongphôi kiểm soát sự phân cực tế bào

Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển phôi nang như:chất lượng tinh trùng, tuổi của mẹ, số lượng noãn thu được, số lượng trứng thụtinh, số lượng hợp tử, và số lượng phôi phát triển đến giai đoạn 8 phôi bào vàongày 3, cũng như các yếu tố khác liên quan đến sự phát triển của phôi ở giaiđoạn trước đó Sau 5-6 ngày nuôi cấy, 26-65% phôi sẽ phát triển đến giai đoạn

này Sự phát triển còn tùy thuộc vào phương pháp nuôi cấy và thành phần củamôi trường nuôi cấy

Hình 1 Sự phát triển của phôi ngày 2 và 3 (từ trái qua phải: phôi có 2 phôi

bào, 4 phôi bào, 6 phôi bào và 8 phôi bào) (Nguồn: RRFC)

Hình 2 Phôi dâu ngày 4 (từ trái qua phải: các phôi bào bắt đầu kết đặc ở vài điểm nhưng vẫn nhìn rõ ranh giới giữa các phôi bào; các phôi bào kết đặc nhưng thấy ranh giới ở góc 9-12 giờ, có nhiều nhân; kết đặc hoàn toàn không

rõ ranh giới các phôi bào) (Nguồn: RRFC)

Hình 3 Phôi giai đoạn tạo nang/ (từ trái qua phải: xuất hiện khe dịch ở góc 2 giờ; các khe dịch lớn dần, nhiều lên, khe dịch chiếm dưới 1/2 thể tích phôi)

(Nguồn: RRFC)

5 Sự biệt hóa tế bào

Ở người, phôi ở giai đoạn 8 phôi bào vẫn có đặc tính toàn năng, bằngchứng là khi tiến hành chẩn đoán trước làm tổ, nếu sinh thiết một hoặc haiphôi bào thì phôi vẫn có khả năng phát triển bình thường Tuy nhiên, nếu sinhthiết một phôi bào ở giai đoạn ≤ 4 phôi bào sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển củaphôi và giảm số lượng nguyên bào phôi (mầm phôi) [8] Trong quá trình hình

thành phôi nang, 2 loại phôi bào được hình thành là nguyên bào phôi (InnerCell Mass/ICM) và nguyên bào lá nuôi (Trophectoderm/TE) Nguyên bào lánuôi là loại phôi bào được biệt hóa đầu tiên trong quá trình hình thành thai Hailoại phôi bào này ngày càng khác nhau khi chúng di chuyển tới các vị trị mớitrong quá trình tạo nang Nguyên bào lá nuôi có hình bầu dục và phân cực,trong khi đó nguyên bào phôi có vẫn giữ hình tròn và hình thái không thay đổi.Các nguyên bào lá nuôi nối với nhau qua những phần tiếp xúc bề mặt nhỏ,trong khi đó nguyên bào phôi tiếp xúc chặt chẽ với nhau tạo thành một khối Vịtrí và sự phát triển của nguyên bào lá nuôi và nguyên bào phôi phụ thuộc vào

sự phân cực và sự hình thành trục phân bào của phôi được hình thành từ khitrứng mới bắt đầu được thụ tinh Các nguyên bào phôi di chuyển về phía mộtcực của phôi gọi là cực phôi , các phôi bào này liên kết chặt với nhau và có đặctính đa năng Các nguyên bào lá nuôi tạo thành hàng rào bên ngoài bảo vệ mầmphôi và được biệt hóa để thực hiện chức năng này [9]

6 Số lượng phôi bào của phôi nang

Để đảm bảo phôi phát triển và làm tổ, số lượng phôi bào của phôi nang

và tỷ lệ giữa số lượng nguyên bào phôi và số lượng nguyên bào lá nuôi đượcchi phối và điều hòa bởi hệ thống gen Ở người, tốc độ phân chia của nguyênbào lá nuôi nhanh hơn so với tốc độ phân chia của nguyên bào phôi Nguyênbào lá nuôi nhân đôi khi bắt đầu quá trình tạo nang vào ngày thứ 4 để tạothành phôi nang vào ngày thứ 5, trong khi đó nguyên bào phôi nhân lên vàongày thứ 5 và 6 Khi phôi nang lớn dần, tốc độ nhân lên của nguyên bào lánuôi là 1.5 chu kỳ/ 24 giờ nhanh hơn so với nguyên bào phôi [10] Thôngthường tổng số phôi bào của phôi nang là trên 60 phôi bào Ở người, phôinang ngày 5 có khoảng 60 phôi bào, tăng đến 160 vào ngày 6 và trên 200 saukhi thoát màng vào ngày 7; 40% số phôi bào tạo mầm phôi [10]

Hình 4 Các giai đoạn phát triển phôi

II QUY TRÌNH SINH THIẾT PHÔI ĐỂ SÀNG LỌC DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI

Sinh thiết phôi có thể được thực hiện ở 3 giai đoạn khác nhau: sinh thiếttrước và ngay sau khi trứng thụ tinh (sinh thiết thể cực thứ nhất và thứ hai),sinh thiết phôi ở giai đoạn phân cắt (ngày thứ 3 sau thụ tinh) hay sinh thiết ởgiai đoạn phôi nang (ngày thứ 5 sau thụ tinh) Mỗi giai đoạn sinh thiết đềumang ưu điểm, khuyết điểm cũng như chỉ định riêng

Qui trình sinh thiết chung bao gồm việc sử dụng kính hiển vi đảo ngượcđược gắn hệ thống vi thao tác để cố định mẫu vật, mở cửa sổ màng zonapellucida, dùng kim sinh thiết để lấy mẫu vật ra khỏi trứng hay phôi Sau đótrứng hay phôi sẽ tiếp tục được nuôi cấy, mẫu vật được cố định để sàng lọcphát hiện rối loạn di truyền

1 Chuẩn bị trước sinh thiết

Các tế bào ngoại lai như tinh trùng, tế bào viền cần được làm sạch trướckhi sinh thiết nhằm tránh chẩn đoán nhầm DNA của các tế bào này Do vậy,những bệnh nhân có chỉ định thực hiện chẩn đoán di truyền trước làm tổ cần được thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm bằng phương pháp bơm tinh trùng

vào bào tương trứng Danh tính của trứng, phôi và mẫu vật cũng cần được xácđịnh chính xác và kiểm tra ít nhất hai lần ở mỗi khâu trong suốt quá trình thựchiện nhằm đảm bảo kết quả sàng lọc, chẩn đoán di truyền của mẫu vật đượcliên hệ chính xác đến trứng hay phôi tương ứng Môi trường nuôi cấy và sinhthiết cũng đóng vai trò quan trọng nhằm đảm bảo sự phát triển tiếp theo củaphôi Môi trường sinh thiết giúp quá trình thao tác dễ dàng hơn Một trongnhững môi trường quan trọng đó là môi trường không có Ca2+ và Mg2+ (Ca2+

và Mg2+ free medium) Sau đó, phôi cần được nuôi cấy bằng hệ thống chuỗimôi trường tùy thuộc giai đoạn phát triển (ví dụ như hệ thống môi trường G1,G2 (Vitrolife, Sweden) và được nuôi trong tủ cấy 3 loại khí (5% O2, 6% CO2,

89 %N2) nhằm đảm bảo quá trình phát triển tối ưu của phôi

2 Mở của sổ màng Zona

2.1 Cấu tạo màng Zona

Màng zona có vai trò quan trọng trong sự phát triển của nang noãn, sựthụ tinh, chống hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng, đồng thời có vai trò như một

vỏ bảo vệ phôi khi phôi di chuyển từ vị trí thụ tinh ở tai vòi vào buồng tửcung để làm tổ Màng zona có cấu trúc là chất nền glycoprotein,carbonhydrate và protein chuyên biệt của màng zona với bề dày bình thường

là 13-15 µm Độ dày màng zona sẽ mỏng dần tương ứng với sự phát triển củaphôi, và đến ngày 5-6 sau thụ tinh, màng zona sẽ vỡ ra để phôi thoát ra ngoài.Quá trình thoát màng chịu ảnh hưởng của 3 yếu tố chính: sự tăng trưởng củakhối tế bào phôi ở giai đoạn phôi nang, sự tiết men ly giải màng zona củaphôi bào và tế bào nội mạc tử cung

2.2 Mở cửa sổ màng zona pellucida (zona pellucida opening)

Là phương pháp tạo một lỗ ở màng bao ngoài của phôi và từ vị trí ấy,kim sinh thiết được đưa vào bên trong phôi để lấy mẫu vật ra ngoài Có 3phương pháp chính được dùng để mở cửa sổ màng zona: phương pháp cơ

học, hóa học hay dùng tia laser Đã có nhiều nghiên cứu so sánh 3 phươngpháp trên về hiệu quả lâm sàng cũng như ảnh hưởng đến sự phát triển củaphôi, nhưng nhìn chung kết quả phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm, kỹ năngcũng như sự khéo léo của người thực hiện Phương pháp cơ học thường đượcdùng trong sinh thiết thể cực nhưng tương đối phức tạp Phương pháp hóa học

là sử dụng dung dịch acid Tyrode’s đơn giản hơn nhưng tỷ lệ phôi bào bị lygiải do bị tiếp xúc với dung dịch acid tương đối cao (11%; Inzunza etal.,1998) Hiện nay, dùng tia laser để mở cửa sổ màng zona được xem làphương pháp đơn giản và dễ sử dụng nhất

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thoát màng của phôi

Năm 1991, Cohen và Feldberg nghiên cứu thấy kích thước và số lượngcửa sổ được mở ở màng zona ảnh hưởng đến quá trình thoát màng của phôi.Kenichiro và cs (2008) đánh giá hiệu quả lâm sàng của kích thước cửa sổmàng zona ở phôi nang cho thấy tỷ lệ thai, tỷ lệ làm tổ và tỷ lệ trẻ sinh sống ởnhóm mở cửa sổ đường kính 40 µm là 43%, 27% và 38% và ở nhóm mở cửa

sổ có đường kính ½ chu vi màng zona là 74%, 52% và 65% so với nhóm đốichứng là 17%, 10% và 13% (p < 0.05) Nếu cửa sổ màng zona mở quá to,toàn bộ phôi sẽ có nguy cơ thoát ra ngoài khi thao tác trên phôi hay chuyểnphôi Ngược lại, nếu cửa sổ quá nhỏ, nguy cơ song thai cùng trứng sẽ tăng.Alikani và cs (2003) báo cáo tỷ lệ song thai cùng trứng ở những ca thực hiệnphương pháp hỗ trợ phôi thoát màng là 0.55% (P < 0.05) Tuy nhiên, số liệuthống kê của Cochrane 2003 từ 23 thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đốichứng cho thấy chưa có mối tương quan rõ ràng giữa song thai cùng trứng và

kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng Do vậy, nguyên nhân của sự gia tăng tỷ lệ cóthai là do bản thân quá trình thụ tinh ống nghiệm (kích thích buồng trứng, môitrường nuôi cấy phôi…) hay do tác động lên màng zona cần được xác địnhqua nhiều thực nghiệm lâm sàng hơn

2.4 Ý nghĩa của của mở cửa sổ màng

Ưu điểm của kỹ thuật là làm tăng tỷ lệ làm tổ của phôi sau mở cửa sổmàng zona khi phôi ở giai đoạn phân cắt Nguyên nhân có thể là do quá trìnhnày đã kích thích phôi bào tăng sản xuất men ly giải màng zona Tuy nhiên,

mở cửa sổ màng zona có thể dẫn đến các bất thường thoát màng như phôi bào

tự thoát qua cửa sổ, hiện tượng thoát màng sớm, thoát màng một phần hayphôi bị “mắc kẹt” ở cửa sổ khiến phôi bị chia đôi dẫn đến hiện tương songthai cùng trứng

3 Sinh thiết mẫu vật

Sau khi mở cửa sổ màng zona, kim sinh thiết được đưa qua cửa sổ đểvào khoang dưới màng zona Đường kính trong của kim sinh thiết phụ thuộcvào loại mẫu vật muốn sinh thiết Với sinh thiết phôi giai đoạn phân cắt,đường kính trong của kim sinh thiết thường từ 35-40 µm Có hai phương phápchính để lấy mẫu vật ra ngoài Thứ nhất là tạo áp lực âm trong kim sinh thiết

để hút phôi bào vào kim sinh thiết Phôi bào có thể được hút toàn bộ hay mộtphần Nếu phôi bào chỉ được hút một phần vào kim thì cần có thêm lực kéo đểnhẹ nhàng vừa hút vừa kéo phôi bào ra ngoài Cách này thường được ứngdụng nhiều nhất trên lâm sàng Phương pháp thứ hai, ít được sử dụng hơn, làtạo một áp lực dương từ kim sinh thiết (ví dụ như đẩy môi trường vào khoangdưới màng zona, vặn xoắn bên ngoài màng zona) để đẩy phôi bào ra cửa sổmàng zona Đối với sinh thiết phôi nang, khoảng 10-30 “tế bào ngoài” củaphôi (trophectoderm) được hút ra ngoài qua cửa sổ màng zona, sau đó liên kếtgiữa khối tế bào bên ngoài và bên trong sẽ được cắt bằng phương pháp cơ họchay bằng tia laser

Sau khi lấy sinh thiết, các tế bào phôi được rửa trong dung dịch đệmphosphate (PBS) vô trùng (Cell Signaling Technologies, Beverly, MA, USA),

được đặt trong các ống PCR 0,2 ml chứa 2 µl PBS và sau đó được chuyểnsang phòng thí nghiệm để sàng lọc rối loạn NST.

Phương pháp sinh thiết thể cực được xem là phương pháp ít gây tổnhại, ít ảnh hưởng đến sự sống và chất lượng của trứng và phôi nhất Tuynhiên, kết quả chẩn đoán di truyền thể cực chỉ phản ánh sự bất thường ditruyền của người mẹ mà thiếu đi thông tin di truyền của người cha và củaphôi Sinh thiết và chẩn đoán di truyền phôi ở giai đoạn phôi nang được xem

là kỹ thuật mang lại kết quả di truyền chính xác nhất hiện nay với ưu điểm lànhiều tế bào được sinh thiết để sàng lọc, chẩn đoán Đồng thời, khi áp dụng phương pháp này, do khối phôi bào vẫn được bảo tồn nên sự phát triển tiếptheo của phôi không bị ảnh hưởng

Sinh thiết thể cực Sinh thiết phôi giai

đoạn phân cắt

Sinh thiết phôi nang

Hình 5 Ba giai đoạn thực hiện sinh thiết phôi

III CÁC KỸ THUẬT SÀNG LỌC DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI

Sàng lọc di truyền trước chuyển phôi là phương pháp nhằm kiểm tranhững rối loạn NST của phôi, được chỉ định cho phôi tạo ra từ cặp vợ chồngtham gia IVF

Ở người, mỗi tế bào có 2n = 46 NST, gồm 23 cặp NST (22 cặp NST

thường và 1 cặp NST giới tính) Ở nam giới, cặp NST giới tính là XY; ở nữgiới cặp NST giới tính là XX Do vậy nữ giới có 23 loại NST, nam giới có 24

loại NST Sự tăng hoặc giảm số lượng NST trong 46 NST bình thường gọi làthể dị bội.

Sàng lọc di truyền trước chuyển phôi giúp chọn lọc được các phôi khôngmang rối loạn di truyền ở mức độ NST trước khi phôi được chuyển vào tửcung người phụ nữ Các rối loạn này này không nhận biết được bằng cáchquan sát phôi dưới kính hiển vi mà phải áp dụng các kỹ thuật di truyền hiệnđại để phân tích PGS làm tăng khả năng thành công thụ tinh ống nghiệm chophụ nữ ở mọi lứa tuổi; giảm tỷ lệ bỏ thai do những dị tật rối loạn NST; manglại hy vọng cho những gia đình có tiền sử sinh con dị tật, sẩy thai nhiều lầnhoặc thai chết lưu không rõ nguyên nhân Kỹ thuật này cũng đảm bảo cấyphôi đơn, tránh những rủi ro đa thai, đảm bảo sức khỏe sinh sản người mẹ.IVF kết hợp với xét nghiệm PGS được xem là biện pháp dự phòng các rốiloạn di truyền sớm ở mức độ NST, là biện pháp chủ động để người mẹ sinhđược con khỏe mạnh

Để làm PGS gồm nuôi cấy phôi đến ngày thứ 3 hoặc 5 rồi làm sinh thiếtphôi để xét nghiệm di truyền và phát hiện bất thường nhiễm sắc thể Như vậy

để thực hiện sàng lọc di truyền trước chuyển phôi cần phải thực hiện hai kỹthuật chính là kỹ thuật sinh thiết phôi và kỹ thuật sàng lọc di truyền của phôi