Kỹ thuật sinh học phân tử là việc sử dụng các kỹ thuật gen và kỹ thuật protein để xác định trình tự gen hay chuỗi acid amin của mỗi từnggen khác nhau, cũng như lập bản đồ gen của từng kh
Trang 1ĐẶT VẤN ĐỀ
Năm 1953, hai nhà bác học James D Watson và Francis H.C Crick đãphát hiện cấu trúc chuỗi xoắn kép của DNA chính thức đánh dấu sự ra đời củasinh học phân tử Kỹ thuật sinh học phân tử là việc sử dụng các kỹ thuật gen
và kỹ thuật protein để xác định trình tự gen hay chuỗi acid amin của mỗi từnggen khác nhau, cũng như lập bản đồ gen của từng khu vực nhất định trong bộgen của các loài sinh vật Hiện nay, có nhiều phương pháp sinh học phân tửứng dụng cho từng loại bệnh lý khác nhau.giúp phát hiện các bệnh lý ditruyền Trong lĩnh vực Y học và di truyền học kỹ thuật gen giúp con ngườiphát hiện được căn nguyên của một số bệnh nan y, chế tạo các loại thuốc mới
để điều trị bệnh Đặc biệt, trong những năm gần đây, liệu pháp gen đã đượcnghiên cứu và dần dần đưa vào ứng dụng để điều trị một số bệnh lý di truyền
Di truyền Y học trong các năm qua đã phát triển rất nhanh cả vềchiều rộng lẫn chiều sâu, đặc biệt là các kỹ thuật sinh học phân tử đã thâmnhập vào hầu hết các chuyên ngành của y học và phát huy hiệu quả to lớntrong chẩn đoán, điều trị và phòng bệnh
Từ những năm 1970, Shaffer và Weiss đã xác định glôcôm bẩm sinhnguyên phát là một thể bệnh glôcôm di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thểthường phổ biến ở trẻ em Các nghiên cứu đã chỉ ra protein CYP1B1 đóngvai trò quan trọng nhất trong việc hình thành cấu trúc và duy trì chức năngvùng bè, góc tiền phòng của nhãn cầu và đột biến gen này dẫn đến bệnhglôcôm bẩm sinh nguyên phát Trong 5 năm gần đây, các nghiên cứu về bệnhglôcôm bẩm sinh nguyên phát ở châu Á đã và đang tập trung đi sâu vào cơchế bệnh sinh ở mức độ phân tử, làm cơ sở cho việc triển khai chẩn đoántrước sinh cũng như liệu pháp điều trị gen, đồng thời giúp việc quản lý tốtnhững người mang gen gây bệnh, giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội
Trang 2Trong 5 năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh glôcôm bẩm sinh nguyênphát ở châu Á đã và đang tập trung đi sâu vào cơ chế bệnh sinh ở mức độphân tử, làm cơ sở cho việc triển khai chẩn đoán trước sinh cũng như liệupháp điều trị gen, đồng thời giúp việc quản lý tốt những người mang gen gâybệnh
Trong bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát, đột biến gen CYP1B1 chủyếu là đột biến điểm, xuất hiện trên toàn bộ chiều dài gen vì vậy phương phápPCR, giải trình tự gen và MLPA được sử dụng để phát hiện đột biến , , , , Cphạm vi chuyên húng tôi tiến hành chuyên đề này để trình bày xin đề cậpđến nội dung "Các kỹ thuật thông dụng để xác định đột biến gen CYP1B1
trong bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát và phát hiện người lành mang gen bệnh ".
1 GEN CYP1B1 VÀ ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH GLÔCÔM BẨM SINH NGUYÊN PHÁT
1.1 Cấu trúc và vị trí gen CYP1B1
Tên khoa học chính thức của gen CYP1B1 là "cytochrome P450,family 1, subfamily B, polypeptide 1” Ngoài ra gen CYP1B1 còn được gọivới các tên khác như: aryl hydrocarbon hydroxylase, CP1B,CP1B1_HUMAN, cytochrome P450 - subfamily I (dioxin-inducible) -polypeptide 1, flavoprotein-linked monooxygenas, microsomalmonooxygenase, xenobiotic monooxygenase
Năm 1994, Sutter và cộng sự đã xác định được gen CYP1B1 gồm 543axit amin và là một phân họ gen mới của cytochrome P450, P4501B1 Bằngcách phân tích tế bào sinh dưỡng của người và động vật gặm nhấm, tác giả đãlập bản đồ gen CYP1B1 và xác định gen nằm trên nhiễm sắc thể 2
Năm 1996, Tang và cộng sự đã phát hiện ra gen CYP1B1 nằm trênnhánh ngắn nhiễm sắc thể 2 tại vị trí 2p22.2 và bao gồm 3 exon, phần mã hóagen bắt đầu từ exon thứ 2, chiều dài gen là 1629 cặp base
Trang 3Từ việc xác định vị trí nối intron/exon của gen CYP1B1, Stoilov vàcộng sự (1997) đã chỉ ra gen CYP1B1 có 3 exon và 2 intron, dài 12 kb, mãhóa phân tử mRNA gồm 1.631 base Cụ thể hơn nữa, các gen CYP1B1 nằm
từ cặp base số 38.067.602 đến 38.076.180 Trong một loạt nghiên cứu vềnhiễm sắc thể 2, vùng chứa gen CYP1B1 đã được xác định là GLC3A
Hình 1 Vị trí của gen CYP1B1 trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 2
Năm 1998, Ivaylo Stoilov và cộng sự đã xây dựng mô hình ba chiều vềvùng C' tận (C-terminal) của protein CYP1B1 Cấu trúc này gồm bốn vùng I,
L, J và K cùng với vùng gắn heme mô tả 3 đột biến dẫn đến thiếu một sảnphẩm giữa axit amin 189 và 254 axit amin từ terminus C là Glu387, Arg390
và Cys470
Hình 2 Hình ảnh không gian 3 chiều vùng C' tận của protein CYP1B1.
Trang 41.2.2 Chức năng, cơ chế gây bệnh của gen CYP1B1
Gen CYP1B1 là một phân họ của cytochrome P450 Các cytochromecủa dòng P450 được biết đến chủ yếu với khả năng chuyển hóa các chất lạsinh học (xenobiotics) và có chức năng giống như bất kỳ phân tử men nào.Các cytochrome tham gia vào các phản ứng oxy hóa như: sinh tổng hợp, sảnxuất hormon cần thiết hoặc đóng vai trò là các hợp chất trao đổi chất trunggian trong hầu hết các sinh vật sống Đột biến ảnh hưởng đến men thường tạo
ra các đột biến lặn Đối với đột biến lặn dạng dị hợp tử, alen bình thường cókhả năng bù đắp chức năng cho alen bị đột biến Từ quan điểm này, một kiểuhình lặn như glôcôm bẩm sinh nguyên phát được gây ra bởi đột biến trongmột loại men như CYP1B1 là hợp lý
Trong quá trình hình thành và phát triển nhãn cầu, chức năng của menCYP1B1 chưa rõ ràng, nhưng nó được giả thiết rằng đóng một vai trò trongviệc hình thành các cấu trúc ở phía trước của mắt và cũng có thể tham gia vàomột quá trình điều chỉnh sự bài tiết thủy dịch
Schwartzman và cộng sự năm 1987 đã xác định có mối liên quan giữaarachidonate phụ thuộc cytochrome P450 với ức chế Na +, K +-ATPase tronggiác mạc trong việc điều chỉnh tính trong suốt của giác mạc và tiết thủy dịch.Phát hiện này phù hợp với mờ đục của giác mạc và tăng nhãn áp, 2 tiêu chuẩnchẩn đoán chính cho bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát
Stoilov I (2000) đã đưa ra giả thuyết rằng CYP1B1 chuyển hóa mộtphân tử có nguồn gốc nội sinh (như steroid, axit béo hoặc hợp chấtprostanoid) cần thiết cho phát triển bình thường và chức năng của mắt Hoạtđộng của CYP1B1 có thể dưới hai dạng: tạo ra một hợp chất hoạt động trênmột số mục tiêu hoặc ngừng tác dụng của các hợp chất sinh học khác vàchiếm vị trí của nó Tuy nhiên các phân tử này được chuyển hóa bởi quá trìnhkích hoạt có tổ chức của các men Vì vậy, CYP1B1 có thể thuộc về một con
Trang 5đường tín hiệu sinh hóa nội sinh chưa được biết rõ, liên quan đến trưởngthành cuối cùng của góc tiền phòng Đột biến gen CYP1B1 sẽ gây ra rối loạnsản xuất men , làm bất thường cấu trúc mạng lưới vùng bè, nơi có các ốngtuyến giúp lưu thoát thủy dịch khỏi mắt Sự ứ trệ thủy dịch này làm tăng nhãn
áp gây bệnh glôcôm
Hình 3 Sơ đồ minh họa cơ chế ảnh hưởng của đột biến gen CYP1B1
Có sự khác biệt về tác động của thể hoang dại và thể đột biến của phân
tử CYP1B1 Phân tử CYP1B1 thể hoang dại được neo trên màng của lưới nộinguyên sinh Chức năng bình thường của nó đòi hỏi sự tham gia của một sốđối tác oxy hóa khử P450 reductase P450 reductase có khả năng đưa mộtnguyên tử của phân tử oxy vào cơ chất của nó Khi đó có 2 khả năng xảy ra:(B) trường hợp cơ chất được hoạt hóa và tác động trên mục tiêu xuôi dòngchưa được biết Tuy nhiên, oxy phân tử có thể làm tăng khả năng ưa nước của
cơ chất và làm dễ dàng cho sự bài tiết và thanh lọc cơ chất từ trong tế bào.Bởi vậy, đột biến CYP1B1 có thể làm thay đổi 2 khả năng trên (C) sự điềuhòa không gian và thời gian của các gen kiểm soát phát triển của góc tiềnphòng sẽ bị thay đổi bởi sự vắng mặt của phân tử điều hòa (ví dụ như steroid)được sản sinh bởi CYP1B1 Bên cạnh đó, những dấu hiệu dừng phát triển của
Cơ chất
Mất chức năng
Đột biến cắt cụt
Thể hoang dại CYP1B1 Đích tác Thể đột biến CYP1B1
động
gắn heme Đột biến
vùng bản lề Đột biến vùng lõi
Hoạt hóa hay Bất hoạt
Trang 6góc tiền phòng được quan sát thấy trong góc tiền phòng của glôcôm bẩm sinhnguyên phát có thể phản ánh ảnh hưởng của một quá trình chuyển hóa có thểđược giới hạn và loại bỏ bởi phân tử CYP1B1
2 CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CYP1B1 VÀ PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH
2.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Năm 1985, kỹ thuật PCR lần đầu tiên được Kary Mullis phát minh, quátrình nhân bản DNA được thực hiện trong ống nghiệm mà không cần nhờ đếncác tế bào chủ như vi khuẩn hay nấm men, đồng thời mở ra nhiều triển vọngtrong nghiên cứu và ứng dụng
2.1.1 Nguyên tắc chung
Dựa vào hoạt tính của các DNA polymerase xúc tác tổng hợp một mạchDNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn loại nucleotid Phảnứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổsung với hai đầu của trình tự DNA khuôn
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳgồm ba bước: biến tính, bắt cặp, kéo dài chuỗi
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation) Trong một dung dịch phản ứng
bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biếntính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94oC
- 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút
- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ được hạ thấp cho phép
các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tuỳ thuộc Tmcủa các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1 phút
- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ được tăng lên
72oC để cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian phụ
Trang 7thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giâyđến nhiều phút.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi ADN mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng
để làm các DNA nền để tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo Sảnphẩm cuối của phản ứng PCR là những đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài làkhoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm đượcxác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi
Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuônDNA ban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ Sau mỗi chu kỳ sẽ làm tănggấp đôi lượng mẫu của lần trước Như vậy sau n chu kỳ, từ một DNA đích đãnhân bản được thành 2n bản sao Nhờ vậy đủ số lượng DNA để có thể tách rakhi điện di và có thể phát hiện được sau khi nhuộm và để có thể tạo dònghoặc giải trình tự Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, ở những chu kỳsau lượng khuôn tăng nhưng lượng mồi và dNTP (deoxyribonucleosidetriphosphate) tự do giảm, enzym DNA polymerase hoạt động yếu dần Do đó,cần tính toán hàm lượng mồi, dNTP và enzym để đảm bảo phản ứng PCR chokết quả tốt nhất
Trang 8Hình 4 Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR (Theo Andy Vierstraete, 1999)
2.1.2 Các thành phần tham gia phản ứng PCR
DNA khuôn
Đoạn khuôn DNA (DNA template, DNA target) tinh sạch là một yếu tốquan trọng, giúp phản ứng PCR tạo được các sản phẩm chính xác Kích thướcđoạn DNA khuôn nhỏ hơn 3kb cho kết quả nhân gen tốt nhất DNA khuônmẫu có thể được chiết tách từ bạch cầu máu ngoại vi, từ mô sinh thiết, từ tinhdịch đã lâu ngày, từ tóc và xương của người đã chết, Lượng DNA khuônthường dùng là khoảng 100-1000 ng cho phản ứng PCR 25-50 μl
Mồi
Mồi là những đoạn oligonucleotid có chiều dài khoảng 15-30 nucleotid
Để thực hiện nhân một đoạn DNA bằng phản ứng PCR, cần có một cặp mồithích hợp, bắt cặp đặc hiệu với DNA khuôn Mỗi cặp mồi gồm 1 mồi xuôi và
1 mồi ngược Mồi xuôi có trình tự acid nucleic tương đồng với trình tự củamạch đơn DNA không mang mã (mạch antisense), mồi xuôi bắt cặp ở đầu 3’của mạch antisense Mồi ngược có trình tự tương đồng với trình tự của mạch
Trang 9DNA mang mã di truyền (mạch sense) và bắt cặp với mạch sense ở đầu 3’.Nồng độ của mỗi mồi trong phản ứng là 0,1-0,5 μM
Các nucleotid tự do
Gồm 4 loại deoxynucleotid triphosphat (dNTPs): dATP, dTTP, dGTP vàdCTP, được dùng làm cơ chất để tổng hợp DNA Nồng độ dNTP mỗi loạikhoảng 50-200μM cho mỗi phản ứng PCR Khi hàm lượng dNTP tự do quá ít,tạo sản phẩm PCR ít không đủ để phát hiện Ngược lại nồng độ dNTP cao thìphản ứng PCR khó thực hiện
Enzym DNA polymerase
Là yếu tố đóng vai trò quyết định hiệu quả của phản ứng PCR Enzymthường được sử dụng hiện nay là Taq polymerase, được phân lập từ vi khuẩnThermus aquaticus sống ở nhiệt độ cao Hàm lượng enzym ảnh hưởng rất lớnđến hiệu quả PCR Khi hàm lượng enzym quá ít, không đủ tạo sản phẩm PCRcần thiết Ngược lại, quá nhiều enzym, sẽ tạo ra các sản phẩm PCR không đặchiệu Thông thường lượng enzym Taq polymerase cần cho mỗi phản ứng cóthể tích 25 μl là 0,5 U ,
Dung dịch đệm của phản ứng
Dung dịch đệm của phản ứng PCR cần đảm bảo các thành phần cầnthiết cho hoạt động của enzym DNA polymerase như MgCl2, KCl, Tris-HCl, Trong đó, Mg2+ là thành phần ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả của phản ứngPCR do ion Mg2+ ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp và gắn các mồi với mạchkhuôn Nồng độ Mg2+ thường là 1-5mM
2.1.3 Phương pháp PCR thường được sử dụng phát hiện đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát - PCR đơn mồi (monoplex PCR)
Là PCR kinh điển nhất, trong mỗi phản ứng PCR, chỉ sử dụng duy nhấtmột cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại một đoạn gen đặc hiệu từ phân tử DNAcủa tế bào
Trang 10Các tác giả đã sử dụng từng cặp mồi để khuếch đại từng exon của genCYP1B1 bằng phản ứng PCR, sau đó điện di trên gel agarose, mẫu bệnh nhânđược tiến hành song song với mẫu đối chứng Nếu mẫu đối chứng xuất hiệnvạch DNA tương ứng với kích thước của exon được khuếch đại, trong khi mẫubệnh nhân không xuất hiện vạch thì bệnh nhân bị đột biến mất đoạn exon đó
Để khuếch đại gen CYP1B1 trong bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát, các nghiên cứu trước đây đều sử dụng phương pháp PCR
Hình 5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 2, gen CYP1B1 đột biến G61E trong nghiên cứu của I Stoilov năm 1998
Hình 6 Hình ảnh PCR-RFLP của đột biến E229K
2.2 Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA sequencing)
Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắpxếp của các nuceotid trong phân tử DNA Hiện nay, người ta thường sử dụnghai phương pháp giải trình tự đó là phương pháp dideoxynucleotid và giảitrình tự bằng máy tự động
2.2.1 Giải trình tự theo phương pháp dideoxynucleotid
Phương pháp này do F Sanger, Smith và Coulson phát hiện ra năm
1977 Nguyên lý của phương pháp này như sau: dideoxynucleotid (ddNTP) làmột phân tử nhân tạo, cấu trúc của nó tương tự như phân tử deoxynucleotid
Trang 11(dNTP), tuy nhiên ở carbon số 3 của đường deoxyribose không phải là nhómhydroxyl (– OH) mà là – H (hình 7)
Hình 7 Cấu trúc phân tử dNTP và ddNTP
Trong quá trình tổng hợp mạch đơn bổ sung, một dNTP tự do gắn vàochuỗi đang tổng hợp bằng liên kết phosphodieste giữa 5’ phosphat với nhóm3’ hydroxyl của nucleotid cuối cùng của chuỗi (hình 8.A) Tuy nhiên, nếu mộtddNTP được gắn vào đầu 3’ của chuỗi đang tổng hợp thì sự tổng hợp DNA sẽdừng lại do không hình thành được liên kết phosphodieste với nucleotid tiếp theo(hình 8.B)
Trang 12Hình 8 Quá trình tổng hợp DNA bình thường (A) và tổng hợp DNA bị ức chế (B)
Quy trình giải trình tự theo phương pháp dideoxynucleotid gồm các bước:
Hình 9 Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP
(a) Đoạn DNA cần giải trình tự được đưa vào vector tách dòng (thường
là plasmid), vector mang đoạn DNA này được biến nạp vào tế bào E.coli để
Trang 13chọn lọc và nhân dòng Sau đó tiến hành tách chiết DNA plasmid.
(b) Sử dụng một đoạn mồi bổ sung với trình tự của vector và gắn vàođầu 3’ của vector gần vị trí chèn DNA
(c) Phản ứng được tiến hành trong 4 ống nghiệm, mỗi ống được cungcấp thêm DNA polymerase, 4 loại dNTP tự do ( một trong bốn loại dNTP nàyđược đánh dấu phóng xạ) và một trong bốn dideoxynucleic (ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP) Nồng độ của mỗi ddNTP được điều chỉnh thận trọng, thườngchỉ dùng một lượng nhỏ, khoảng 1%
Trong quá trình tổng hợp chuỗi, enzym DNA polymerase sẽ gắn cácdNTP vào để kéo dài chuỗi Do hàm lượng rất thấp nên thỉnh thoảng mới có 1dideoxynucleotid được gắn vào chuỗi và lúc đó phản ứng tổng hợp chuỗi bịdừng lại Như vậy trong mỗi ống phản ứng chứa các mạch đơn DNA có chiềudài khác nhau, và ở đầu 3’ của các đoạn DNA chứa một ddNTP tương ứng đãcho vào ống đó
(d) Tiến hành điện di 4 ống phản ứng trên 4 hàng của một gelpolyacrylamid để phân tách các đoạn DNA
(e) Do một trong 4 dNTP có đánh dấu phóng xạ nên khi dùng kỹ thuậtphóng xạ tự ghi, các mạch đơn trên gel điện di sẽ tạo các vạch sáng trên phim Xquang
(f) Tổng hợp kết quả ở cả 4 ống, thu được các mạch đơn có kích thướchơn kém nhau 1 nucleotid Đoạn DNA ngắn nhất sẽ di chuyển xa nhất Trên ví
dụ ở hình 10, đoạn ngắn nhất xuất hiện ở ống chứa ddATP, như vậy nucleotidđầu tiên được tổng hợp ở chuỗi bổ sung là Adenin Đoạn DNA ngắn thứ 2xuất hiện ở ống chứa ddCTP, như vậy nucleotid thứ 2 của mạch DNA bổ sung
là cytosin, Phân tích tương tự, chúng ta sẽ biết được trình tự đoạn mạch đơnmới được tổng hợp và xác định được trình tự của mạch DNA khuôn
2.2.2 Giải trình tự bằng máy tự động
Trang 14Giải trình tự gen là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của cácnucleotid trong phân tử DNA Đoạn DNA cần giải trình tự được sử dụng nhưtrình tự mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR) bắt đầu từ vị trí gắn mồi.Hỗn hợp của deoxy- và dideoxynucleotid được sử dụng trong phản ứng vớinồng độ sao cho các dideoxynucleotid sẽ gắn vào mỗi vị trí mà cácdeoxynucleotid thường gắn trên đoạn DNA đang được tổng hợp Sự gắn củacác dideoxynucleotid sẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các đoạn DNA đượctổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích thước khác nhau.Nucleotid tận cùng trên mỗi sợi DNA có thể được xác định bằng cách chạyđồng thời bốn phản ứng riêng biệt trong đó mỗi phản ứng chứa một loạidideoxynucleotid (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) hoặc bởi một phản ứnghỗn hợp nhưng từng loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng các chất pháthuỳnh quang đặc hiệu khác nhau Kết quả là hỗn hợp các sợi DNA tổng hợp
từ sợi khuôn được phân tách bằng điện di trên thạch acrylamid có độ phângiải cao, cho phép phân biệt được các sợi đơn DNA hơn kém nhau 1nucleotid Trình tự các nucleotid được xác định tương ứng với trình tự của cácvạch trên gel ứng với mỗi loại dideoxynucleotid
Máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắc
sử dụng ddNTP do F Sanger và cộng sự phát minh Máy giải trình tự gendùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, hệ thống điện
di thường là điện di mao quản Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tửddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quangtương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phân tích.Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận biết được từng loại nucleotid vàtrình tự của DNA đích
Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự gen trên GeneBank(National Center for Biotechnology Information – NCBI)
Trang 15Kỹ thuật giải trình tự của DNA đích đã được ứng dụng trong nhiều nghiêncứu để xác định các đột biến mất nucleotid, thay thế nucleotid, thêm nucleotidtrên gen
Hình 10 Hình ảnh giải trình tự gen CYP1B1 của bệnh nhân glôcôm bẩm sinh
nguyên phát (Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein)
2.2.3 Phương pháp giải trình tự gen thường được sử dụng phát hiện đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát
Nghiên cứu của Reddy A B (2004) tại Ấn Độ đã dùng phương phápDNA sequencing phát hiện 16 đột biến gen CYP1B1, trong đó có 7 đột biếnmới gồm 2 đột biến xóa đoạn là g.3905del23bp, g.7900-7901delCG và 5 độtbiến thay thế acid amin là A115P, M132R, Q144P, S239R, G466D