KẾT QUẢ NGHIÊN cứu SÀNG lọc tác DỤNG CHỐNG UNG THƯ TRÊN INVITRO và tác DỤNG điều hòa MIỄN DỊCH CỦACÁC mẫu CAO KHÔ HH TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG bị gây SUY GIẢM MIỄN DỊCH BẰNG CYCLOPHOSPHAMID

Kết quả giải phẫu vi thể lách Tổ chức lympho ngoại biên lớn nhất của cơ thể Lô 1 3/3 mẫu bệnh phẩm có hình ảnh lách bình thường Lô 2 3/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nặng tế bào của tủy tr

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

DỊCH CỦA CÁC MẪU CAO KHÔ HH TRÊN

CHUỘT NHẮT TRẮNG BỊ GÂY SUY GIẢM MIỄN DỊCH

BẰNG CYCLOPHOSPHAMID

Nơi tiến hành nghiên cứu:

Thời gian tiến hành nghiên cứu:

Bộ môn Dược lý – Đại học Y Hà Nội 09-10/2018

Hà Nội – 2018MỤC LỤC

Trang 2

1 CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1

1.1 Thuốc nghiên cứu 1

1.2 Hóa chất và máy móc phục vụ nghiên cứu 1

1.2.1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư trên invitro 1

1.2.2 Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch trên động vật thực nghiệm 2

1.3 Đối tượng nghiên cứu 2

1.4 Phương pháp nghiên cứu 3

1.4.1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư trên invitro 3

1.4.2 Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch trên động vật thực nghiệm 4

1.5 Xử lý số liệu 5

2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 5

2.1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư trên invitro 5

2.2 Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch trên động vật thực nghiệm 7

2.2.1 Đánh giá tình trạng chung của hệ miễn dịch 7

2.3 Đánh giá đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào 17

2.4 Đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể 20

3 KẾT LUẬN 21

4 TÀI LIỆU THAM KHẢO 22

Trang 3

CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.1.Thuốc nghiên cứu

- Thuốc nghiên cứu: Các mẫu bột cao khô HH

1.2.Hóa chất và máy móc phục vụ nghiên cứu

1.2.1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư trên invitro

- Hóa chất

+ Trypsin 10x hãng Sigma

+ RPMI 1640 hãng Gibco, Invitrrogen

+ DMEM hãng Gibco, Invitrrogen

+ FBS hãng Gibco, Invitrogen

+ PBS hãng Gibco, Invitrrogen

+ Peicilin-streptomycin hãng Gibco, Invitrrogen

+ Doxorubicin của Sigma, Mỹ

- Thiết bị, dụng cụ:

+ Tủ ấm Sanyo (Nhật)

+ Tủ thao tác laminar Telstar

+ Kính hiển vi soi ngược Axiovert 25 CFL Carl-Zeiss, Đức

+ Máy li tâm Beckman Coulter

+ Bình ổn nhiệt Shellab, Mỹ

+ Nồi hấp Human, Đức, Model SS-325

Trang 4

+ Máy đo ELISA của hãng Human Đức.

+ Buồng đếm Thoma (Đức)

+ Các loại vật tư tiêu hao dùng trong nuôi cấy tế bào in vitro như chai T25,đĩa pettri các cỡ, đĩa 96 giếng, ống ly tâm falcon 50ml và 15ml, 1,5ml,pipet và đầu côn các loại

1.2.2 Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch trên động vật thực nghiệm

- Cyclophosphamid: dạng thuốc bột, biệt dược Endoxan lọ 200 mg của hãngASTA Medica, Đức

- Levamisol dạng bột trắng của hãng Sigma, Mỹ

- Nhũ dịch OA

+ Pha dung dịch Al(OH)3 0,2%: 200 mg + NaCl 0,9% = vừa đủ 100 mL

+ Pha nhũ dịch OA = lòng trắng trứng + Al(OH)3 theo tỷ lệ 1:4 tương ứng

- Máu cừu tube 10 mL do Công ty Nam Khoa (Nam Khoa Biotek) cung cấp

- Kit ELISA định lượng IL2, TNFα, IgM của hãng Cloud-Clone Corp, Mỹ

1.3 Đối tượng nghiên cứu

- Các dòng tế bào ung thư dùng trong nghiên cứu invitro

1 A549 Dòng tế bào ung thư phổi

2 Hela Dòng tế bào ung thư cổ tử cung

3 HepG2 Dòng tế bào ung thư gan

4 MCF-7 Dòng tế bào ung thư vú

5 PANC-1 Dòng tế bào ung thư tụy

6 RD Dòng tế bào ung thư cơ tim

7 NCI-N87 Dòng tế bào ung thư dạ dày

8 OVCAR-8 Dòng tế bào ung thư buồng trứng

- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, thuần chủng, cả hai giống, nặng 20  2 gam doViện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp dùng trong nghiên cứu tác dụngkích thích miễn dịch

1.4.Phương pháp nghiên cứu

1.4.1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư trên invitro

Các dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, đánh thức và duy trìtrong môi trường DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), hoặc

Trang 5

RPMI 1640 có bổ sung huyết thanh bê 10%, dung dịch kháng sinh vàkháng nấm 1% (penicillin 50,000 units/L và streptomycin 50 mg/L) Tếbào được nuôi cấy cho phát triển tới mức khoảng 70%, thay môi trườngsạch, tế bào này được dùng làm thí nghiệm.

Tế bào được cấy chuyển vào đĩa 96 với mật độ 8.000 tế bào/giếng,

để tế bào bám dính ổn định qua đêm rồi ủ với mẫu nghiên cứu, nuôi cấy ởđiều kiện 370C, 5% CO2, 95% độ ẩm trong 24 giờ

Tiếp theo, từ dung dịch gốc mẫu nghiên cứu và mẫu đối chứngdương được hòa loãng với môi trường nuôi cấy thành các dải nồng độ 200

và 100 µg/mL Mẫu thử sau đó được tra vào các giếng đã có chứa tế bào

để thăm dò độc tính của mẫu trên sự phát triển của tế bào Những mẫunào thể hiện độc tính mạnh (ở nồng độ 100 µg/ml có khả năng ức chế trên50% sự phát triển của tế bào so với giếng đối chứng) mới được tiến hànhthí nghiệm để tìm giá trị IC50

Để tìm giá trị IC50, các mẫu thử có nồng độ khác nhau tương ứng là6,25; 12,5; 25; 50; 100 µg/ml sẽ được tra vào mỗi giếng đã có chứa tếbào Ủ tế bào với mẫu nghiên cứu trong 48 giờ để mẫu thử phát huy tácdụng

Kết thúc 48 giờ ủ mẫu, bổ sung 20 µl MTT 5mg/mL vào mỗi giếng

và ủ 3 giờ trong điều kiện nuôi cấy Tại các tế bào sống 2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide có màu vàng bị biến đổithành tinh thể formazan và bị hòa tan trong dung môi DMSO tạo dungdịch màu tím Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm với bước sóng thamkhảo 630 nm Mật độ quang ở bước sóng 540 nm sẽ phản ánh số lượng tếbào sống sót ở từng giếng khi được so sánh với giếng chứng chỉ ủ vớidung môi pha mẫu

3-(4,5-Dimethyl-Tỷ lệ % tế bào sống sau khi đã xử lý thuốc so với chứng trắng (tếbào không ủ với mẫu thử, chỉ ủ với dung môi pha mẫu chứa 0,25%DMSO) được tính theo công thức như sau:

Trang 6

% tế bào sống = OD 540 của tế bào không được xử lý thuốc OD 540 của tế bào được xử lý × 100

% ức chế = 100% - % tế bào sống sótMỗi nồng độ mẫu thử được tiến hành lặp lại trên 3 giếng, thí nghiệmlặp lại 2 lần

1.4.2 Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch trên động vật thực nghiệm

Tiêm màng bụng cyclophosphamid (CY), liều duy nhất 200 mg/kgthể trọng để gây suy giảm miễn dịch

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 9 lô nghiên cứu Chuột

ở các lô được uống thuốc thử và tiêm màng bụng CY gây mô hình suygiảm miễn dịch như sau:

ST

1 Chứng sinh học Nước cất 0,2 mL/10 g Không

3 Chứng dương Levamisol 100 mg/kg/ngày Có

4 HH1 liều cao HH1 liều 2,88 g/kg/ngày Có

5 HH1 liều thấp HH1 liều 0,96 g/kg/ngày Có

Mô hình nghiên cứu được tiến hành trong 8 ngày Chuột bắt đầuđược uống nước cất và các thuốc liên tục từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 7của nghiên cứu Trong thời gian uống thuốc:

- Ngày thứ 2: chuột ở tất cả các lô được gây mẫn cảm bằng tiêm màng bụnghồng cầu cừu 5% (0,5 mL/chuột) và tiêm dưới da gáy kháng nguyên OA(Al(OH)3 + ovalbumin) (0,1 mL/chuột)

- Ngày thứ 4: tiêm màng bụng CYP liều 200 mg/kg cho các lô 2 đến 16

- Ngày thứ 7: tiêm phát hiện bằng 50 μl kháng nguyên OA vào một bên ganl kháng nguyên OA vào một bên ganbàn chân chuột, bên còn lại tiêm thể tích tương tự dung dịch NaCl 0,9%

Sau 24 giờ tiêm phát hiện vào gan bàn chân chuột, tiến hành xácđịnh các chỉ số nghiên cứu bao gồm:

Trang 7

- Cân trọng lượng

- Đo bề dày 2 bàn chân chuột bằng thước palmer → xác định % tăng bề dàychân giữa chân tiêm OA và chân tiêm NaCl 0,9%

- Lấy máu động mạch cảnh

+ Xác định số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu

+ Nồng độ IL2, TNFα, IgM trong huyết thanh

- Lấy lách, tuyến ức:

+ Cân trọng lượng

+ Quan sát hình ảnh đại thể của lách, tuyến ức ở các lô chuột

+ Giải phẫu mô bệnh học lách, tuyến ức của 30% số chuột mỗi lô

1.5 Xử lý số liệu

Các số liệu nghiên cứu được biểu diễn dưới dạng X´ ± SD hoặc X´ ±

SE, xử lý thống kê theo thuật toán thống kê T-test Student bằng phầnmềm Microsoft Excel 2010 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p <0,05

p < 0,05 p < 0,01 p < 0,001

2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

2.1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư trên invitro

Các mẫu thử được pha tan hoàn toàn trong Dimethyl Sulfoxide(DMSO) sau đó pha loãng thành các nồng độ thử trên các dòng tế bào ungthư Ban đầu mẫu thử được tiến hành sàng lọc độc tính ở 2 nồng độ là 200

và 100 µg/mL Do ở nồng độ 200 µg/ml đã xuất hiện hiện tượng mẫu caochiết tủa lại trong giếng nuôi cấy tế bào, do đó mẫu nào có khả năng ứcchế lớn hơn hoặc bằng 50% ở nồng độ 100 µg/ml mới được tiến hành tìmgiá trị IC50 Kết quả sàng lọc được trình bày ở Bảng 1

Trang 8

Bảng 1 Tỷ lệ % ức chế sự sống sót của tế bào dưới tác dụng của mẫu thử

100 µg/mL

200 µg/mL

100 µg/

mL

200 µg/mL

1,71

22,51 ± 1,04

21,23 ± 0,81

24,91 ± 1,29

23,54 ± 1,41

32,85 ± 1,72

23,94 ± 2,38

48,62 ± 1,57

25,50 ± 2,71

47,02 ± 0,99

3,20

18,79 ± 3,19

9,17 ± 4,40

13,87 ± 3,29

6,65 ± 3,78

10,29 ± 2,74

12,34 ± 3,74

32,37 ± 2,00

30,85±

3,01

51,68 ± 1,84

10,99 ± 3,79 OVCAR

8,03 ± 1,34

3,27±

1,60

10,47 ± 1,85

4,51 ± 1,41

6,58 ± 1,52

Kết quả ở bảng 1 cho thấy:

Nồng độ 200 µg/mL, ba mẫu cao chiết HH1, HH2 và HH3 chỉ thểhiện tác dụng độc tế bào trên 3 dòng tế bào: dòng tế bào ung thư vúMCF7, dòng tế bào ung thư cơ tim RD và dòng tế bào ung thư ganHepG2 Tuy nhiên mức độ gây độc cũng chưa cao, chỉ dao động từkhoảng 20% đến 50% Trong số 3 mẫu thử, mẫu HH3 có % ức chế caohơn hai mẫu còn lại ở ba dòng tế bào trên Như vậy, ba mẫu cao nghiêncứu đều không có độc tính mạnh ở nồng độ 200 µg/mL trên cả 8 dòng tếbào ung thư thực hiện trong thí nghiệm Do vậy không có mẫu cao nàođược lựa chọn để nghiên cứu tiếp tìm giá trị nồng độ tại đó ức chế 50% sựphát triển của tế bào (IC50)

Bảng 2 Giá trị IC50 của doxorubucin trên các dòng tế bào ung thư

Trang 9

2.2.Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch trên động vật thực nghiệm

2.2.1 Đánh giá tình trạng chung của hệ miễn dịch

Bảng 3 Ảnh hưởng của các mẫu cao khô HH lên

trọng lượng lách và tuyến ức tương đối

ST

T Lô nghiên cứu

Trọng lượng tương đối (‰)

- Lô mô hình: Trọng lượng lách tương đối và trọng lượng tuyến ức tương đốiđều giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với

p < 0,05

- Lô uống levamisol:

+ Trọng lượng lách tương đối có xu hướng tăng so với lô mô hình, tuy nhiên

sự khác biệt là chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)

+ Trọng lượng tuyến ức tương đối không có sự khác biệt so với lô mô hình (p

> 0,05)

- Các lô uống cao khô HH1:

Trang 10

+ Trọng lượng lách tương đối có xu hướng tăng so với lô mô hình, trong đó mứctăng ở lô uống liều cao là có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình (p < 0,05) + Trọng lượng tuyến ức tương đối ở các lô uống cao khô HH1 không có sựkhác biệt so với lô mô hình (p > 0,05).

- Các lô uống cao khô HH2 và HH3: Trọng lượng lách và tuyến ức tương đốiđều không có sự khác biệt so với lô mô hình (p > 0,05)

Bảng 4 Kết quả giải phẫu vi thể lách

(Tổ chức lympho ngoại biên lớn nhất của cơ thể)

Lô 1 3/3 mẫu bệnh phẩm có hình ảnh lách bình thường

Lô 2 3/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nặng tế bào của tủy trắng

Lô 3 3/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nhẹ tế bào của tủy trắng

Lô 4 1/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ vừa tế bào của tủy trắng

2/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nhẹ tế bào của tủy trắng

2/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nặng tế bào của tủy trắng

2/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ vừa tế bào của tủy trắng

Lô 8 1/3 mẫu bệnh phẩm có hình ảnh lách bình thường

Bảng 5 Kết quả giải phẫu vi thể tuyến ức

(Tổ chức lympho trung ương quan trọng nhất của cơ thể)

Lô 1 3/3 mẫu bệnh phẩm có hình ảnh tuyến ức bình thường

Lô 2 3/3 mẫu bệnh phẩm giảm nặng lympho bào

Lô 3

1/3 mẫu bệnh phẩm giảm vừa lympho bào

1/3 mẫu bệnh phẩm giảm nặng lympho bào

1/3 mẫu bệnh phẩm có hình ảnh tuyến ức bình thường

Trang 11

Lô Tuyến ức

Lô 4 1/3 mẫu bệnh phẩm giảm vừa lympho bào

Lô 8 2/3 mẫu bệnh phẩm giảm nhẹ lympho bào

Hình 1 Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô chứng sinh học (chuột số 3)

Trang 12

Lách giảm nặng tế bào của tủy trắng Tuyến ức giảm nặng lympho bào

Hình 2 Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô mô hình (chuột số 99)

Lách giảm nhẹ tế bào của tủy trắng Tuyến ức giảm vừa lympho bào

Hình 3 Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô uống levamisol (chuột số 15)

Lách giảm nhẹ tế bào của tủy trắng Tuyến ức giảm nặng lympho bào

Trang 13

Lách giảm nhẹ tế bào của tủy trắng Tuyến ức bình thường

Lách giảm vừa tế bào của tủy trắng Tuyến ức giảm nặng lympho bào

Hình 6 Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô HH1 liều cao (chuột số 38)

Trang 14

Hình 8 Hình ảnh vi thể lách và tuyến ức lô HH1 liều thấp (chuột số 139)

Lách giảm vừa tế bào của tủy trắng Tuyến ức giảm vừa lympho bào

Trang 15

Lách giảm nặng tế bào của tủy trắng Tuyến ức giảm nặng lympho bào

Lách giảm vừa tế bào của tủy trắng Tuyến ức giảm vừa lympho bào

Trang 16

Lách bình thường Tuyến ức giảm nhẹ lympho bào

Trang 17

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5

Lô 1 (chứng sinh học) Lô 2 (mô hình) Lô 3 (Levamisol)

Lô 4 (HH1 liều cao) Lô 5 (HH1 liều thấp) Lô 6 (HH2 liều cao)

Lô 7 (HH2 liều thấp) Lô 8 (HH3 liều cao) Lô 9 (HH3 liều thấp)

Số lượng

bạch cầu (G/l)

Biểu đồ 1 Ảnh hưởng của các mẫu cao khô HH đến

số lượng bạch cầu ở máu ngoại viKết quả ở biểu đồ 1 cho thấy:

- SLBC ở lô mô hình giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học (p < 0,001)

- Levamisol làm tăng có ý nghĩa thống kê SLBC so với lô mô hình (p < 0,001)

- Các mẫu cao khô HH đều không làm thay đổi số lượng bạch cầu so với lô môhình (p > 0,05)

Bảng 6 Ảnh hưởng của các mẫu cao khô HH đến công thức bạch cầu

ở máu ngoại vi

Lô nghiên cứu Số lượng tuyệt đối các loại bạch cầu (BC/mm3)

Chứng sinh học 3080 ± 940 1080 ± 340 420 ± 120

Trang 18

Lô nghiên cứu Số lượng tuyệt đối các loại bạch cầu (BC/mm3)

HH1 liều cao 660 ± 200++ 560 ± 180++ 220 ± 60HH1 liều thấp 740 ± 270+ 590 ± 180++ 220 ± 40

- Số lượng tuyệt đối các dòng BC ở lô mô hình đều giảm rõ rệt so với lô chứngsinh học (p < 0,001) Levamisol liều 100 mg/kg/ngày có tác dụng khôi phục

số lượng tuyệt đối của dòng BC trung tính và lympho khi so sánh với lô môhình (p < 0,05 và p < 0,01)

- Các lô uống cao khô HH1 có số lượng tuyệt đối dòng BC trung tính tăng có ýnghĩa thống kê so với lô mô hình (p < 0,05), không có tác dụng phục hồi sốlượng tuyệt đối dòng BC lympho và mono so với lô mô hình (p > 0,05)

- Các mẫu cao khô HH2 và HH3 không làm thay đổi số lượng tuyệt đối cácdòng BC so với lô mô hình (p > 0,05)

Định dạng
Số trang	24
Dung lượng	19,44 MB