Một số nghiên cứu gần đây nhận thấy đột biến gen RHOA xuất hiện một cách đặc hiệu trong ung thư dạ dày thể lan tỏa và gợi ý rằng đây cóthể là một phân tử đích đầy tiềm năng để điều trị t
Trang 1ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư dạ dày (UTDD) là một trong các loại ung thư phổ biến nhất trênthế giới và đứng hàng đầu trong các ung thư đường tiêu hóa [1] Tổ chứcnghiên cứu ung thư quốc tế (IARC) và tổ chức y tế thế giới (WHO) ước tính
có hơn một triệu trường hợp UTDD mới mắc trong năm 2018, đứng thứ 5trong số các bệnh ung thư phổ biến nhất [2] Tỷ lệ tử vong do UTDD cũngđứng hàng thứ 3 với 782.685 ca tử vong mỗi năm [2], [3]
Việt Nam thuộc khu vực có nguy cơ mắc UTDD cao với tỷ lệ mắc mớichuẩn hóa theo tuổi ở cả 2 giới là 15.61 mỗi 100.000 dân [2] Những ghi nhận
về tình hình ung thư trên cả nước cũng cho thấy UTDD đứng thứ 3 trong 10loại ung thư thường gặp ở Việt Nam Ước tính năm 2018, nước ta có trên17.500 người mắc mới UTDD và hơn 15.000 ca tử vong [3]
UTDD được Lauren chia thành 2 thể mô bệnh học riêng biệt là thể ruột
và thể lan tỏa [4] với sự khác biệt rõ rệt về dịch tễ, bệnh nguyên và đặc biệt làtiên lượng [4], [5], [6], [7] Thể lan tỏa có xu hướng xâm lấn chuyển thành dicăn sớm và có tiên lượng xấu hơn [8] Hơn nữa, không giống như trong thểruột, nơi các khối u tăng cường biểu hiện HER2 được điều trị hiệu quả bằngTrastuzumab [9], [10], hiện nay chúng ta đang thiếu các phương pháp điều trịđích hiệu quả cho bệnh nhân thể lan tỏa [11] Sự khác biệt này đang dần đượclàm sáng tỏ khi đột biến gen CDH1-gen mã hóa E-cadherin được phát hiện ởcác bệnh nhân UTDD lan tỏa có tính chất gia đình [12], [13] và đột biến gen
RHOA- gen mã hoá RhoA GTPase nhỏ được quan sát thấy ở các bệnh nhân
UTDD thể lan tỏa [14], [15], [16]
Gen RHOA nẳm trên nhánh ngắn NST số 3, mã hóa protein RhoA
GTPase đóng vai trò quan trọng trong sự di chuyển, kết dính, sự sống sót,phân chia của tế bào và sự biểu hiện gen [17] RHOA ban đầu được mô tả như
Trang 2một gen sinh ung thư vì sự tăng cường biểu hiện nó dẫn đến chuyển dạng áctính và hình thành khối u trong in vivo [18], [19], [20] Trong thực tế, tăng
cường biểu hiện của gen RHOA được quan sát thấy ở nhiều bệnh lý ác tính và
thường liên quan đến sự tiến triển của nhiều loại ung thư như ung thư vú [21],
u Lympho [22], [23], [24], ung thư gan nguyên phát [25], ung thư đại trựctràng [26] Một số nghiên cứu gần đây nhận thấy đột biến gen RHOA xuất
hiện một cách đặc hiệu trong ung thư dạ dày thể lan tỏa và gợi ý rằng đây cóthể là một phân tử đích đầy tiềm năng để điều trị thể ung thư dạ dày có tiênlượng xấu này [14], [15], [27], [28]
Tại Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào về đột biến gen RHOA ở bệnh
nhân UTDD thể lan tỏa, vì vậy chúng tôi tiến hành để tài “ Xác định đột biến
exon 2, 3 gen RHOA trên bệnh nhân ung thư dạ dày thể lan tỏa” với 2
mục tiêu:
1 Xác định đột biến exon 2, 3 gen RHOA trên bệnh nhân ung thư dạ dày thể lan tỏa.
2 Đánh giá mối tương quan của đột biến exon 2, 3 gen RHOA với một
số yếu tố nguy cơ.
Trang 3CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ DẠ DÀY
1.1.1 Dịch tễ học ung thư dạ dày
1.1.1.1 Trên thế giới:
Ung thư dạ dày là một loại ung thư thường gặp trên thế giới và đứnghàng đầu trong các ung thư đường tiêu hóa Với hơn một triệu trường hợp mớimắc được ước tính trong năm 2018 (1.033.701 trường hợp, 5.7 % trong tổng
số ung thư mới), UTDD đã trở thành căn bệnh ác tính phổ biến thứ năm trênthế giới, sau ung thư phổi, vú, đại trực tràng và tuyến tiền liệt [3]
Tỷ lệ mới mắc UTDD thay đổi tùy theo từng vùng địa dư trên thế giới.Khoảng hơn 70% các trường hợp UTDD xảy ra ở các nước đang phát triển.Trong đó, Đông Á là khu vực có tỷ lệ mắc UTDD cao nhất, chiếm một nửa sốtrường hợp trên toàn thế giới, tiếp đến là Nhật Bản, Nam Mỹ, Đông Âu Tỷ lệmắc thấp nhất ở Bắc Mỹ, Ấn Độ, Nigieria và Úc [3] Tuy nhiên dù ở khu vựcnào thì tỷ lệ mới mắc chuẩn hóa theo tuổi ở nam giới cũng cao hơn so với nữgiới [3]
Trong năm 2018, UTDD là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ batrong số các loại ung thư ở cả hai giới trên toàn thế giới (782.685 người tửvong, chiếm 8,2% tổng số) Tỷ lệ tử vong ước tính cao nhất ở khu vực ĐôngNam Á (23,0/ 100,000 nam giới và 9,4/ 100,000 phụ nữ), thấp nhất ở Bắc Mỹ.Một số khu vực khác cũng có tỷ lệ tử vong cao như Trung Âu, Đông Âu,Trung và Nam Mỹ [2], [3]
Giống như nhiều loại ung thư có liên quan chặt chẽ đến các yếu tố môitrường, UTDD ít gặp ở người trẻ tuổi Tỷ lệ UTDD tăng dần theo tuổi và đạtcao nguyên trong khoảng 55-80 tuổi, tùy thuộc vào sự tác động của các yếu tốnguy cơ khác nhau [29]
Trang 4Hình 1.1: Tỷ lệ mắc và tử vong do UTDD chuẩn hóa theo tuổi ở cả hai giới
theo khu vực (trên 100.000 người) [ 3 ]
1.1.1.2 Tại Việt Nam
Việt Nam nằm trong khu vực có tỷ lệ mắc UTDD cao, với tỷ lệ mắcUTDD chuẩn hóa theo tuổi ở nam là 23,3/100.000 và 10,2/100.000 ở nữ Ướctính mỗi năm nước ta có khoảng 15.000 người tử vong do UTDD, chỉ đứngsau ung thư gan và ung thư phổi [3] Theo nghiên cứu của Trần Văn Huy tạiBệnh viện Trung ương Huế năm 2002, trong nhóm bệnh ung thư tiêu hóa,UTDD chiếm tỉ lệ cao nhất (52,4%) Theo tác giả Lại Phú Thưởng và cộng sựnghiên cứu về UTDD ở 5 tỉnh, thành phố: Hà Nội, Hải Phòng, Thái Nguyên,
Trang 5Huế và Cần Thơ giai đoạn 2001 – 2004 cho thấy tỷ lệ mắc UTDD ở Hà Nội làcao nhất, chiếm tỷ lệ 2309/3311 (69,3%) Các tác giả cũng cho thấy, tuổi haygặp UTDD ở nước ta là 50 – 60 tuổi, bệnh hiếm gặp ở những người Việt Namdưới 40 tuổi.
1.1.2 Phân loại ung thư dạ dày
1.1.2.1 Phân loại theo vị trí
Trên thế giới hiện nay có xu hướng chia UTDD thành 2 loại chính là ung thư tâm vị và ung thư không thuộc tâm vị vì hai loại này khác nhau rất rõ về dịch tễ, bệnh sinh, mô bệnh học, cũng như cả điều trị và tiên lượng [30], [31].Ung thư tâm vị là ung thư trong khoảng 1 cm trên đến 2 cm dưới đường nốithực quản dạ dày Ung thư không thuộc tâm vị là ung thư trong các vị trí còn lại,gồm có phình vị, thân vị, bờ cong lớn, bờ cong nhỏ, hang vị và môn vị
Trong những năm gần đây, ung thư tâm vị tăng đột biến từ 6,3% lên20,1% trong vòng 25 năm [31] Tiên lượng ung thư tâm vị thường xấu hơnUTDD không thuộc tâm vị Deans (2011) nhận thấy thời gian sống thêm trungbình của ung thư tâm vị sau phẫu thuật triệt để là 26 tháng, thấp hơn có ýnghĩa so với 69 tháng trong UTDD không thuộc tâm vị (p < 0,001) [31]
1.1.2.2 Phân loại theo mô bệnh học.
Phân loại mô bệnh học UTDD nói chung dựa trên kiểu hình mô họcchiếm ưu thế nhất (ống tuyến, nhú, nhày, biểu mô không biệt hoá) [1] Một sốphân loại mô học đã được đề xuất cho mục đích tiên lượng, trong đó, phânloại của Lauren (1965) và của WHO (2010) đang được áp dụng nhiều nhất
Phân loại mô bệnh học ung thư dạ dày của Lauren
UTDD được Lauren chia thành 2 thể mô bệnh học riêng biệt là thể ruột
và thể lan tỏa [4]:
- Thể ruột: gồm những tế bào u kết dính tạo ra cấu trúc ống tuyến tương
tự như tuyến ruột, đi kèm với thâm nhập tế bào viêm lan tỏa
Trang 6- Thể lan tỏa: gồm những mảng tế bào dạng thượng bì hoặc những tế bào
rải rác trong chất căn bản mô đệm không có bằng chứng tạo tuyến, không có tínhkết dính Ung thư thể lan tỏa có thể gồm các tế bào nhẫn, lan rộng theo lớp dướiniêm mạc, ít thâm nhập tế bào viêm, thường có mức độ biệt hóa kém
- Thể hỗn hợp: Xấp xỉ 5-10% các khối u vẫn không thể phân loại được
xếp vào thể “không xác định” hoặc có đặc điểm của cả hai thể ruột và lan tỏađược xếp vào thể “hỗn hợp” Trong đánh giá bệnh học lâm sàng, các khối uthể này thường được xem như là thể lan tỏa [6]
A Ung thư dạ dày thể ruột B Ung thư dạ dày thể lan tỏa
Hình 1.2 Phân loại ung thư biểu mô dạ dày theo Lauren [ 6 ]
Phân loại mô bệnh học theo Lauren khá đơn giản và đã được sử dụngrộng rãi trên toàn thế giới Hai thể mô học này có sự khác biệt rõ rệt về dịch
tễ, bệnh nguyên và đặc biệt là tiên lượng [4], [5], [6], [7] Khác nhau về hìnhthái được quy cho vai trò của các phân tử kết dính liên bào, chúng được bảotoàn trong thể ruột và khiếm khuyết trong thể lan tỏa [32]
Nhiều nghiên cứu cho thấy tiên lượng UTDD thể ruột thường tốt hơnUTDD thể lan tỏa Theo Lazăr và cộng sự (2009), thời gian sống thêm củacác bệnh nhân UTDD thể lan tỏa trung bình là 11,3 tháng, thấp hơn đáng kể
Trang 7so với UTDD thể ruột với thời gian sống thêm trung bình 20,4 tháng (p =0,0415) [5].
Phân loại mô bệnh học ung thư dạ dày theo tổ chức Y tế thế giới.
Bảng 1.1: Phân loại mô bệnh học ung thư biểu mô dạ dày [1], [33], [34]
Ung thư biểu mô tuyến nhú
Ung thư biểu mô tuyến ống
Ung thư biểu mô tuyến nhày
Type ruột
Ung thư biểu mô tế bào nhẫn
Các ung thư biểu mô kém kết dính khác Type lan tỏa
Ung thư biểu mô tuyến vảy
Ung thư biểu mô tế bào vảy
Ung thư biểu mô tuyến dạng tế bào gan
Ung thư biểu mô với chất nền lympho
Ung thư biểu mô nhau thai
Các ung thư biểu mô khác
1.1.3 Cơ chế bệnh sinh của ung thư dạ dày
UTDD là một quá trình diễn biến từ từ và phức tạp, hình thành bởi sựtương tác của nhiều yếu tố, bắt nguồn từ sự tích lũy dần các kiểu gen và thayđổi kiểu hình gây ra bởi viêm dạ dày kéo dài, chủ yếu là do nhiễm H pylori[1], [35], [36] Trong nhiều con đường bệnh sinh khác nhau dẫn đến UTDDđược các nhà khoa học trên thế giới hiện nay đề cập đến nhưng chủ yếu vẫntập trung vào vai trò của H pylori liên quan đến viêm dạ dày với các tổnthương tiền ung thư như viêm teo niêm mạc, dị sản ruột và loạn sản; vai tròcủa H pylori liên quan đến các type gen mắc phải có nguy cơ cao, liên quanđến gen AID, p53, liên quan đến tế bào gốc và ung thư dạ dày [37]
1.1.3.1 Các yếu tố nguy cơ của ung thư dạ dày
Nhiễm H pylori và UTDD
Trang 8Năm 1994, IARC và WHO đã công nhận và xếp nhiễm H pylori vàonhóm I các tác nhân gây ung thư dạ dày-carcinoma (nhóm nguy cơ gây ungthư cao nhất) ở người [38] Có khá nhiều bằng chứng dịch tễ về mối liên quangiữa nhiễm H pylori với UTDD, đặc biệt là UTDD không thuộc tâm vị [39],[40] Nhiễm H pylori làm tăng nguy cơ UTDD không thuộc tâm vị xấp xỉ 6lần Người ta cũng đã ước tính được rằng H pylori liên quan đến khoảng 75%các trường hợp UTDD không thuộc tâm vị, cả ở type ruột và type lan tỏa trêntoàn thế giới [39] Nhiều cơ chế đã được mô tả cho quá trình sinh UTDD liênquan với H pylori, bao gồm viêm, sự tương tác trực tiếp với các cơ quan gây
ra sự mất ổn định về di truyền trong vật chủ, và những thay đổi biểu sinh liênquan đến H pylori [41]
Chế độ ăn
- Muối và thức phẩm chứa muối
Trong số các yếu tố dinh dưỡng, lượng muối cao đã được chứng minhliên kết với một nguy cơ UTDD, chủ yếu gắn với nhiễm H pylori [42] Chế độ
ăn uống có nhiều nitrate như các loại cá, thịt chế biến sẵn, các loại thức ăn xôngkhói, ướp muối, sẽ làm tăng nguy cơ UTDD Nitrosamin có trong thức ăn hoặc
do một số loại thức ăn chứa nitrate tạo ra là một chất gây UTDD [43], [44].Các thức ăn giàu chất chống oxy hóa chẳng hạn như trái cây tươi và rauquả giảm nguy cơ ung thư dạ dày Đồng thời cũng cần nhấn mạnh rằng stressoxy hóa và viêm mãn tính có thể là một cơ chế mà H pylori gây ra UTDD [1]
Trang 9trong ly nước uống không làm thúc đẩy sự phát triển của khối u dạ dày liênquan đến N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), một tác nhân gâyung thư dạ dày [45] Thêm vào đó, khi uống rượu trắng hoặc 11% ethanol vớiMNNG ở chuột, thì rượu trắng hoặc 11% ethanol được nhận thấy có khả năng ứcthế MNNG-tác nhân gây nên ung thư dạ dày [46] Tuy nhiên, trong nhữngnghiên cứu trước đó đã chỉ ra nếu tiêm 20% ethanol với 0.9% NaCl sẽ làm tăng
số lượng MNNG-tác nhân gây ung thư tuyến dạ dày ở chuột [47] Bởi vì ethanol
và NaCl được tiêm cùng với nhau, thật khó để xác định ảnh hưởng này là củaethanol hay là NaCl làm tăng MNNG-tác nhân ung thư dạ dày ở chuột
Từ các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy mối liên quan giữa tiêu thụrượu và ung thư dạ dày vẫn đang còn là mối tranh cãi Những phân tích ở 14nghiên cứu bênh-chứng đã chỉ ra rằng tiêu thụ rượu kết hợp chặt chẽ với nguy
cơ ung thư dạ dày, mối liên quan này là 25 g/ngày alcohol tương ứng vớităng nguy cơ ung thư dạ dày lên 1.07 lần (95% CI 1.04-1.10) [48] Những dữliệu gần đây từ những nghiên cứu lớn hơn đã cung cấp nhiều giá trị đáng kể
để đánh giá mối tương quan giữa lượng rượu tiêu thụ với nguy cơ ung thư dạdày Dữ liệu từ Norwegian đã gợi ý rằng rượu kết hợp với hút thuốc lá làmtăng nguy cơ ung thư dạ dày Trong nghiên cứu ngày, hút thuốc làm tăng gấpđôi nguy cơ ung thư dạ dày, lượng rượu tiêu thụ lại không có nhiều ý nghĩa,nhưng sự kết hợp giữa tiếp xúc nhiều với thuốc lá (>20/ngày) và rượu (> 5lần/14 ngày) sẽ làm tăng nguy cơ ung thự dạ dày không tâm vị lên đến 4.9 lần(95% CI 1.90-12.62) so với người không hút thuốc và không uống rượu [49].Nhận định này cũng làm thêm phần bối rối với nhận thức giữa lượng trungbình tiêu thụ với nguy cơ ung thư dạ dày [50], [51], [52], [53]
- Hút thuốc lá
Hút thuốc lá là một yếu tố nguy cơ cho sự khởi đầu của viêm dạ dày,viêm loét dạ dày và cả UTDD vùng tâm vị cũng như không phải vùng tâm vị
Trang 10Hút thuốc lá làm tăng nguy cơ UTDD lên 1,56 lần [54] Theo Gonzalez, xấp
xỉ 18% trường hợp UTDD được quy cho hút thuốc lá Nguy cơ UTDD tăngtheo thời gian hút thuốc và giảm đi sau 10 năm cai thuốc [55]
Có một số cơ chế có thể dẫn đến mối liên quan giữa hút thuốc lá và ungthư dạ dày Các chất trong khói thuốc lá chứa một số chất gây ung thư đãđược chứng minh có liên quan đến ung thư biểu mô dạ dày ở người [56].DNA Adducts (DNA cộng sinh) liên quan đến hút thuốc có thể liên kết vớiDNA niêm mạc dạ dày đã được tìm thấy trong ung thư dạ dày của người hútthuốc [57] Hút thuốc lá làm gia tăng nguy cơ loạn sản và dị sản ruột - các tổnthương tiền thân của ung thư dạ dày [58] Các hợp chất N-nitroso có trongkhói thuốc lá và có thể có liên quan đến ung thư dạ dày [59]
Trong hầu hết các nghiên cứu thuần tập, sự liên quan của hút thuốc vớiung thư dạ dày là mạnh hơn ở nam giới so với phụ nữ [60] Trong nhữngnghiên cứu trước đây, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nam giới đượcchẩn đoán mắc ung thư dạ dày type ruột nhiều hơn, trong khi tỷ lệ phụ nữ lớnhơn được chẩn đoán UTDD type lan tỏa [61] Nếu có mối liên quan chặt chẽhơn với việc hút thuốc lá với type ruột, thì điều này có thể giải thích một sốkhác biệt giữa nam giới và phụ nữ trong mối liên hệ giữa hút thuốc với ungthư dạ dày Nghiên cứu tiến cứu của Nomura AM và cộng sự trên 215.000người cho thấy khả năng này, vì HR là 2,06 đối với ung thư type ruột và 1,18 đốivới ung thư thể lan tỏa Trong hai nghiên cứu thuần tập ở Nhật Bản ở nam giới,
có một báo cáo có nguy cơ cao hút thuốc lá cho type ruột [62] trong khi nghiêncứu khác không [63] Rõ ràng, cần nhiều nghiên cứu hơn để xác định mối liênquan giữa hút thuốc lá với các dạng mô học đặc trưng của ung thư dạ dày
Trong một phân tích tổng hợp của 42 nghiên cứu thuần tập, các nguy cơliên quan đến giới tính ở những người đang hút thuốc là 1,62 ở nam giới (95%
CI 1,50-1,75) và 1,20 ở phụ nữ (95% CI 1,01-1,43) Mặc dù phân tích tổng
Trang 11hợp này cho thấy có thể có sự khác biệt giữa nam và nữ trong mối liên quangiữa hút thuốc lá và ung thư dạ dày, nhưng IARC đã kết luận trong việc đánhgiá các nguy cơ gây ung thư cho người rằng RR là tương tự đối với nam giới
và phụ nữ trong các nghiên cứu trên một số lượng phụ nữ đủ lớn [53] Trongcùng một đánh giá, những nam giới đã từng hút thuốc có nguy cơ cao bị ungthư dạ dày (RR = 1,34, 95% CI 1,22-1,47), nhưng những phụ nữ đã từng hútthuốc lá thì không (RR = 1,16, 95% CI 0.92-1.46) Kết quả của Nomura AM
và cộng sự cũng tương tự [64] Nomura AM và cộng sự cũng quan sát thấy,như trong các nghiên cứu khác, khoảng cách ngắn hơn kể từ khi bỏ thuốc giữanhững người nam hút thuốc trước đây mang lại nguy cơ cao hơn [60] Điềunày cung cấp hỗ trợ thêm cho một mối quan hệ dương tính giữa hút thuốc lá
và ung thư dạ dày Ngoài ra, báo cáo ban đầu này về mối liên hệ thống nhấtgiữa hút thuốc lá hiện tại và ung thư dạ dày ở năm nhóm dân tộc khác nhau sẽtăng cường sự thống nhất này
Các nghiên cứu trước đây điều tra mối quan hệ phụ thuộc liều giữa hútthuốc lá và ung thư dạ dày đã cho kết quả không tương xứng Trong một phântích tổng hợp vào năm 1997, một hiệu ứng dương tính đã được báo cáo ở 6trong số 30 nghiên cứu bệnh chứng và 4 trong 10 nghiên cứu thuần tập Mộtphân tích tổng hợp mới đây cho thấy có xu hướng phụ thuộc liều, dựa trên sốlượng thuốc lá mỗi ngày [60] Ảnh hưởng của thời gian hút thuốc lá khôngđược đánh giá trong phân tích năm 2008 Trong cuộc Điều tra Châu Âu vềUng thư và Dinh dưỡng (EPIC) dựa trên 10 quốc gia châu Âu [55], tỷ lệ nguy
cơ ung thư dạ dày gia tăng với cường độ và thời gian hút thuốc lá Trong cuộcđiều tra của Nomura AM và cộng sự, những người hút thuốc lá nam và nữ đãhút hơn 20 điếu thuốc mỗi ngày có nguy cơ ung thư dạ dày cao nhất [64].Ngoài ra, có xu hướng đáng kể trong nguy cơ ung thư dạ dày với số năm hútthuốc lá tăng lên ở cả nam và nữ
Trang 12Trong nghiên cứu của Nomura AM chỉ có 104 trường hợp ung thư tâm
vị, nhưng đã tìm ra mối liên hệ dương tính giữa những người từng hút thuốc
lá Khi nam giới và phụ nữ được phân tích kết hợp, cả những người hút thuốc
lá hiện tại và trước đây đều có nguy cơ ung thư cao hơn đáng kể so với ungthư dạ dày không ở tâm vị Trong nghiên cứu EPIC, nguy cơ tương đối giữanhững người hút thuốc lá hiện nay là 4.10 (95% CI 1.76-9.57) đối với ung thưthuộc tâm vị và 1.94 (95% CI 1.05-3.60) đối với ung thư dạ dày không thuộctâm vị [55] Một số nghiên cứu bổ sung cũng cho thấy hút thuốc lá là một yếu
tố nguy cơ cao hơn đối với ung thư dạ dày tâm vị [62], [53], nhưng nhữngngười khác lại không ủng hộ quan điểm này [63], [65] Trong một phân tích tổnghợp bao gồm 9 nghiên cứu thuần tập, nguy cơ tóm tắt tương đối giữa nhữngngười hút thuốc lá hiện nay là 1.87 (95% CI 1.31-2.67) đối với ung thư tâm vị và1.60 (95% CI 1.41-1.80) đối với ung thư dạ dày không phải thuộc tâm vị [60].Một yếu tố góp phần vào sự thiếu thống nhất trong việc chỉ ra rằng hút thuốc cóthể liên quan chặt chẽ hơn với UTDD tâm vị hơn là với ung thư dạ dày khôngthuộc tâm vị là phạm vi phân loại sai đối với ung thư tâm vị [62]
Yếu tố liên quan đến vật chủ
- Yếu tố di truyền.
Nguy cơ của UTDD có liên quan với tính đa hình di truyền, chủ yếu baogồm các gen liên quan đến viêm (ví dụ, IL1B, IL1RN, IL10, và TNF) [42],[66], [67] Cả hai interleukin (IL) -1β và yếu tố hoại tử khối u (TNF) -α, làcytokine tiền viêm mạnh mẽ có tác dụng ức chế tiết acid dạ dày- tạo điều kiệncho vi khuẩn dễ dàng xâm nhập Alen IL1B-511 T được tìm thấy có mối liênquan đến nguy cơ ung thư biểu mô tuyến dạ dày [67] Trong khi đó, nhiềunghiên cứu đã chỉ ra một số kiểu hình gen IL-10 (một cytokine kháng viêm,trung hòa tác dụng của các cytokine tiền viêm) có liên quan với tác dụng bảo
Trang 13vệ chống UTDD [68], [69] Nói chung, các chủng H pylori độc tính cao vàcác đa hình gen liên quan đến phản ứng viêm tăng cường mang đến một nguy
cơ UTDD lớn hơn [1]
UTDD thường xảy ra trên người có nhóm máu A [44] Nguy cơ pháttriển bệnh UTDD cao hơn 2-10 lần ở những người có tiền sử gia đình UTDD[70] Hầu hết các trường hợp có tính chất gia đình được coi là lẻ tẻ, tuy nhiêndường như cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường, chẳng hạn nhưnhiễm H pylori, chế độ ăn uống và tình trạng kinh tế xã hội [1]
- Polyp dạ dày
Một số loại polyp dạ dày có tiềm năng ác tính [6] U tuyến (adenoma) làcác khối u xuất phát từ tổ chức tuyến của dạ dày, có nguy cơ tiến triển thànhung thư cao nhất U tuyến chiếm khoảng 10% polyp dạ dày Khoảng 2%polyp tăng sản cũng có thể phát triển thành ung thư Các polyp tuyến đáy vịthường không diễn biến thành ác tính trừ những người có hội chứng đa polyptuyến gia đình (familial adenomatous polyposis syndrome) [6]
- Loét dạ dày tá tràng:
Nguy cơ UTDD tăng 1,8 lần ở những bệnh nhân loét dạ dày lành tính vàgiảm 0,6 lần ở những bệnh nhân loét tá tràng lành tính [71] Viêm teo dạ dàyvùng thân vị và thiếu máu ác tính rõ rệt cũng làm tăng nguy cơ UTDD [72].Niêm mạc dạ dày viêm teo mạn tính có những biến đổi như dị sản, loạn sảnruột Đây được coi là trạng thái tiền ung thư, 90% UTDD có những biến đổinày trước khi xuất hiện
1.1.3.2 Cơ chế phân tử của ung thư dạ dày.
Ngày nay, các nhà khoa học đã phần nào giải thích được cơ chế phân tửcủa UTDD liên quan đến sự rối loạn điều hòa các con đường gây ung thư kinh
Trang 14điển như p53 [73], WNT / β-catenin [74], NF-κB [75] và PI3K / Akt [76].Trung tâm của các cơ chế này là những thay đổi di truyền và biểu sinh trongcác đường tín hiệu gây ung thư [1].
1.1.4 Chẩn đoán ung thư dạ dày.
Chẩn đoán ung thư dạ dày tùy thuộc vào giai đoạn tiến triển của bệnh.Chẩn đoán lâm sàng giai đoạn muộn thường không khó, chẩn đoán khó hơn làUTDD giai đoạn sớm vì triệu chứng thường không điển hình và chỉ có tínhchất gợi ý Hiện nay có khá nhiều phương tiện và các phương pháp chẩn đoáncận lâm sàng, mỗi phương pháp có một ưu nhược điểm khác nhau và nên kếtkết hợp các phương pháp trong tầm soát, chẩn đoán cũng và đánh giá bệnhnhân để lựa chọn chỉ định và phương pháp điều trị
1.1.4.2 Cận lâm sàng
- X-quang dạ dày:
Các hình ảnh hay gặp trong UTDD gồm hình khuyết, hình thấu kính vàhình đám cứng mất nhu động dạ dày tùy thuộc vào thể tổn thương Tuy nhiên,hạn chế của X-quang kể cả chụp đối quang kép là bỏ sót một số thương tổn,
Trang 15không phát hiện được chính xác các tổn thương ung thư giai đoạn sớm, cáctổn thương nông và mới khu trú ở vùng niêm mạc.
- Nội soi dạ dày-tá tràng bằng ống mềm:
Nội soi dạ dày kết hợp với sinh thiết làm giải phẫu bệnh được coi là tiêuchuẩn vàng trong chẩn đoán UTDD Nội soi có thể xác định chính xác vị trí,hình thái của khối u, độ nhạy của phương pháp là 93.8% và độ đặc hiệu là96.7% [77]
- Dấn ấn ung thư huyết thanh: Hiện nay, chưa có một dấu ấn ung thư
huyết thanh nào được xác định đủ độ nhạy và đặc hiệu để chẩn đoán xác địnhUTDD [1], [6], [43] Nồng độ huyết thanh CEA (Carcinoembryonic Antigen),
CA 19-9 (Cancer Antigen 19-9), và CA 72-4 (Cancer Antigen 72-4) có thểtăng ở một số bệnh nhân UTDD [78] Độ nhạy của CA 72-4, CEA và CA 19-9lần lượt là 33.0%, 25.5%, và 38.7% Khi kết hợp các marker này thì độ nhạytăng lên 66.0% [79] Tuy nhiên, độ nhạy của các dấu ấn này không cao nên ít
có giá trị trong chẩn đoán UTDD sớm Bên cạnh đó, độ đặc hiệu thấp khôngcho phép sử dụng các dấn ấn này để chẩn đoán xác định UTDD [80]
- Siêu âm nội soi: Là phương pháp rất có giá trị giúp đánh giá mức độ
xâm lấn của khối u ở thành dạ dày, tình trạng di căn hạch và tình trạngxâm lấn vào các hạch xung quanh Tuy nhiên việc đánh giá chính xác giaiđoạn UTDD bằn siêu âm nội soi chỉ vào khoảng 78% và tùy theo giaiđoạn TNM [81 ]
- Chụp cắt lớp vi tính (CT scanner): Giúp đánh giá sự di căn của ung thư.
Hiện nay, với phương pháp chụp xoắn ốc 3 pha có thể phát hiện các khối unhỏ để đánh giá mức độ xâm lấn trước mổ
Trang 16- Soi ổ bụng: Cho phép đánh giá những thương tổn mà chụp cắt lớp vi
tính không phát hiện được, cho biết tình trạng khối u xâm lấn vào cơ quan lâncận, di căn gan, di căn phúc mạc
- PET/CT: Có thể phát hiện và đánh giá ung thư ở giai đoạn rất sớm.
- Chẩn đoán mô bệnh học: Là phương pháp không thể thiếu và là tiêu
chuẩn vàng giúp chẩn đoán xác định UTDD
1.1.5 Điều trị ung thư dạ dày
1.1.5.1 Phẫu thuật.
Phẫu thuật là phương thức điều trị chủ yếu trong UTDD Chỉ định phẫuthuật cần dựa trên giai đoạn của UTDD, toàn trạng bệnh nhân và kinh nghiệmcủa phẫu thật viên Phẫu thuật cắt dạ dày nạo hạch D2 theo quan điểm hiệnnay trên thế giới và theo Hiệp hội Ung thư dạ dày Nhật Bản được coi phươngpháp chuẩn mực trong điều trị UTDD, được chỉ định trong trường hợp có dicăn hạch (cN+) hoặc u từ T2-T4a [82] Các khối u dạ dày sớm có thể đượcđiều trị bằng phương pháp cắt niêm mạc qua nội soi hoặc phẫu tích dưới niêmmạc qua nội soi [6], [82], [43]
1.1.5.2 Xạ trị
UTDD tương đối đề kháng đối với xạ trị Hiệu quả của xạ trị đơn thuầnhoặc phối hợp với hóa trị (hóa xạ trị liệu) chỉ giới hạn ở một số bệnh nhân,nhưng vẫn chưa thực sự rõ ràng và cần phải được nghiên cứu thêm [6], [43]
1.1.5.3 Hóa trị liệu
Hóa trị liệu giữ vai trò khá quan trọng trong điều trị UTDD nhằm giảm
tỷ lệ tái phát sau phẫu thuật và kéo dài thời gian sống thêm Chỉ định điều trị
Trang 17hóa trị hỗ trợ với bệnh nhân UTDD giai đoạn II, III theo phân loại TNM củahiệp hội chống ung thư thế giới và Hiệp hội ung thư dạ dày Nhật Bản [83],[82] Không chỉ định cho u T1 Hóa trị hỗ trợ cũng được chỉ định sau phẫuthuật cắt dạ dày nạo vét hạch D2 giúp tăng tỷ lệ sống thêm sau mổ cho ngườibệnh so với bệnh nhân chỉ điều trị ngoại khoa đơn thuần [37] Đối với bệnhnhân UTDD giai đoạn IV hoặc không thể cắt được dạ dày thì hóa trị triệuchứng được chỉ định, tuy nhiên thời gian sống thêm trung bình của các bệnhnhân này chỉ vào khoảng 3-6 tháng [37].
1.1.5.4 Điều trị đích ung thư dạ dày.
Từ năm 1997, FDA đã cấp phép cho 12 thuốc điều trị đích được sử dụngtrên lâm sàng trong đó gồm 4 loại cho điều trị UTDD và ung thư thực quản làbevacizumab, cetuximab, panitumumab và trastuzumab [84] Tuy nhiên đếnnay chỉ có trastuzumab được chứng minh là có khả năng cải thiện thời giansống của bệnh nhân UTDD có HER2(+) khi kết hợp với hóa trị liệu [10], [85].Mặc dù vậy, tỷ lệ đáp ứng thêm tuyệt đối với trastuzumab trong số các bệnhnhân UTDD tiến triển có HER2(+) ở nghiên cứu ToGA là khá nhỏ: 12.8%[10] và chỉ khoảng 3.12% bệnh nhân UTDD có thể hưởng lợi từ trastuzumabtrong khi số bệnh nhân có HER2(+) xấp xỉ 25% [85] Nhiều nghiên cứu đã tậptrung vào việc tìm hiểu cơ chế phân tử của sự đề kháng này nhằm phát triểncác thuốc mới có hiệu quả hơn với tỉ lệ đáp ứng lâm sàng cao hơn [86]
1.1.5.5 Điều trị tiệt trừ H pylori
Theo quan điểm hiện nay và dựa trên các đồng thuận ở Việt Nam cũngnhư trên thế giới, điều trị tiệt trừ H pylori được chỉ định trong các trường hợpviêm dạ dày, loét dạ dày-tá tràng và các biến chứng chứng, UTDD giai đoạnsớm sau cắt niêm mạc qua nội soi và sau phẫu thuật cắt bán phần dưới dạ dàynạo vét hạch D2 Phác đồ kinh điển 3 thuốc được chỉ định đầu tiên, hai phác
Trang 18đồ PPI-AL và phác đồ 4 thuốc PPI-BMT lần lượt là lựa chọn thứ hai và ba khiphác đồ 3 thuốc không hiệu quả Điều trị theo kết quả kháng sinh đồ khikháng cả 3 phác đồ trên.
1.1.5.6 Tiên lượng ung thư dạ dày
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tiên lượng UTDD, gồm có: tổng trạng,tuổi, giới tính, vị trí, kích thước, đặc điểm đại thể, phân loại mô bệnh học củakhối u [87] Trong đó, quan trọng nhất vẫn là phân loại giai đoạn theo TNM.Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, cùng một giai đoạn TNM nhưng diễn biếnlâm sàng cũng có sự khác nhau đáng kể [88], [89] Điều đáng tiếc hơn nữa làhầu hết các yếu tố tiên lượng kinh điển không có giá trị dự đoán đáp ứng đốivới các liệu pháp hóa trị Điều đó có nghĩa là các yếu tố này không cho phéplựa chọn liệu pháp hóa trị hoặc điều trị đích tối ưu cho mỗi bệnh nhân UTDD.Ngày nay, bên cạnh các yếu tố lâm sàng, giải phẫu bệnh, nghiên cứu nhữngthay đổi về gen là hướng đi mới giúp điều trị, tiên lượng cho bệnh nhân
1.2 GEN RHOA VÀ UNG THƯ DẠ DÀY.
1.2.1 Sơ lược về gen RHOA
1.2.1.1 Vị trí:
Gen RHOA nằm trên nhánh ngắn NST số 3, 3p21.31, gồm 5 exon, mã
hóa cho protein RhOA gồm 193 acid amin
Hình 1.3 Vị trí gen RHOA trên nhiễm sắc thể số 3
1.2.1.2 Chức năng gen RHOA
Trang 19Protein RhoA được mã hóa bởi gen RHOA là thành viên của gia đình
Rho GTPase (bao gồm 3 dưới nhóm là Rho, Rac, CDC42) thuộc về siêu họcác protein G trọng lượng phân tử nhỏ [90] Cũng giống như các protein G cócấu trúc dị lập thể, hoạt tính của RhoA phụ thuộc vào sự gắn kết với GTP.Rho có thể chuyển từ dạng bất hoạt (gắn GDP) sang dạng hoạt động (gắn vớiGTP) nhờ sự xúc tác của tác nhân trao đổi guanine nucleotide (Guaninenucleotide-exchange factors -GEFs) Quá trình ngược lại được xúc tác bởiprotein hoạt hóa GTPase (GTPase-activating protein- GAPs) nhờ sự thủyphân GTP gắn kết [91] Có trên 80 loại GEFs và 70 loại GAPs cho Rho GTPase,hoạt động của chúng được điều hòa chặt chẽ và có tính đặc trưng cao RhoA cóthể được cô lập trong tế bào chất bởi các chất ức chế phân ly guanine nuclodide(guanine nuclodide-dissociation inhibitors- GDIs) -nó gắn protein Rho-GDPđược prenyl hóa (sự gắn 1 phân tử kị nước vào protein hoặc 1 hợp chất), chophép Rho GTPases di chuyển giữa màng tế bào và bào tương [92]
RhoA được hoạt hóa bởi nhiều phân tử ngoại bào, các phân tử xuyênmàng và các phân tử tín hiệu nội bào như các thụ thể kết cặp G-protein(guanosine nucleotide-binding proteins (G proteins) coupled receptors-GPCRs), các hormon, các yếu tố phát triển và các cytokine [91], [93] Trong
số này, GPCRs, các thụ thể protein-tyrosine kinase Ephrin A (EphA), thụ thểacid Lysophosphatidic (LPA), IGF (Insulin-Like Growth Factor) và thụ thểcủa chúng hoạt hóa RhoA thông qua GEFs [94], [95], [96] trong khi proteinkinectin xuyên màng toàn bộ có thể hoạt hóa RhoA một cách trực tiếp Tiếp
đó, RhoA thông qua protein serine/threonine kinase ROCK1 và hàng loạt cácphân tử tín hiệu trong tế bào khác điều hòa các quá trình tổ chức sợi actin, quátrình nhập bào, xuất bào cũng như sự di chuyển của tế bào… (hình 1.4)
Trang 20Hình 1.4 Con đường RhoA trong tế bào
Vai trò của RhoA trong tổ chức actin.
RhoA đóng vai trò trung tâm trong duy trì hình dạng, phân cực và sự diđộng của tế bào thông qua sự polyme hóa sợi actin, co rút sợi actomyosin, kếtdính tế bào và động học của các vi ống RhoA có vai trò chính trong giai đoạncuối của quá trình di trú tế bào đến điều khiển sự gắn kết tế bào RhoA kíchthích trực tiếp sự polyme hóa sợi actin thông qua hoạt động của DRFs(diaphanous-related formins -được biết đến như là protein Dia) Kích thíchnày sẽ làm cho các monomers của actin nhanh chóng hình thành sợi actinhơn DRFs cùng với ROCKs điều hòa sự co rút của bó sợi actin cảm ứng bớiRho ROCK điều hòa sự phosphoryl hóa của LIMK và kết quả là ức chếcofilin cũng góp phần làm tăng phản ứng của sợi actin với Rho Thêm vào đó,ROCKs thúc đẩy sự co rút của actomyosin và phosphoryl hóa một vài protein
Trang 21liên quan đến điều hòa myosins và các protein gắn với actin khác Sự co rútcủa actomyosin rất quan trọng trong việc di chuyển của tế bào với việc gắn tếbào Các vi ống là thiết yếu cho việc xác định tính phân cực cũng như sự dichuyển và vận chuyển nội bào Hoạt động của ROCK và Dia là cần thiết choviệc điều hòa sự phân cực tế bào và sắp xếp các vi ống ROCK phosphorylhóa TAU và MAP2, các protein điều khiển sự ổn định của vi ống [90].
RhoA đóng vai trò then chốt trong việc duy trì tính toàn vẹn của tế chất nền ngoại bào và sự kết dính tế bào-tế bào Mất kết nối giữa tế bào-tế bào
bào-là điều kiện để gây ra sự di chuyển của tế bào biểu mô và có thể được điềuhòa thuận nghịch bởi ROCKs và DRFs
RhoA cũng có vai trò định vị cho sự phát triển các sợi trục thần kinh vàcác nón tăng trưởng Sự định vị này được điều hòa bởi nhân tố mục tiêu sợitrục (axonal targeting element) nằm ở đầu 3’UTR của RhoA [97] Trái lại, sựtăng cường biểu hiện của yếu tố ức chế sao mã GCF2 có thể làm im lặng sựbiểu hiện của RhoA, dẫn đến sự mất tổ chức của bộ khung xương actin của tếbào [98]
Vai trò của RhoA trong sự di chuyển của tế bào.
RhoA được cho rằng có vai trò ức chế hoặc làm suy giảm sự di chuyểncủa tế bào Các quan sát ban đầu chỉ ra rằng RhoA thúc đẩy sự co rút của các
bó sợi actin và sự kết dính chặt chẽ giữa các tế bào thông qua sự hình thànhcác mối nối [99] Có một mối quan hệ tương hỗ giữa RhoA và Rac1, trong đóhoạt động Rac cao dẫn đến việc giảm Rho và ngược lại Vì Rac là cần thiếtcho sự hình thành lamellae và sự nhô ra tế bào nên có vẻ như logic rằng RhoA
sẽ ức chế các quá trình này [100], [101] Cuối cùng, sự liên quan củap190RhoGAP trong lan truyền và di chuyển của tế bào, cũng như cảm ứngRhoC trong quá trình di căn đã củng cố quan niệm cho rằng RhoA có thể ngăncản sự di chuyển và xâm lấn tế bào [102]
Trang 22 Vai trò RhoA trong sự chồi ra của tế bào.
Rac1 và RhoA hoạt động đối lập bằng cách phân tách không gian và thờigian chính xác Trong RhoA đóng vai trò khởi đầu sự nhô ra, thì Rac1 vàCdc42 kích hoạt các con đường liên quan đến gia cố và ổn định các đốm chồimới được mở rộng [103]
Vai trò RhoA trong xuất bào:
RhoA liên quan đến quá trình xuất bào phụ thuộc ion Ca++ thông qua việctái tổ chức sợi actin[104] Loại xuất bào này được điều hòa bởi G12/g13thông qua con đường phụ thuộc kinase liên quan với Rho [105]
Vai trò RhoA trong nhập bào:
RhoA hỗ trợ trực tiếp quá trình nhập bào ở trong rất nhiều loại tế bàokhác nhau [106], [107] RhoA là yếu tố thiết yếu cho nhập bào không phụthuộc clathrin và caveolar Điều trị với yếu tố ức chế PIK3 (LY294002) hoặc
ức chế FAK (PF573228) ức chế quá trình nhập bào bằng cách ức chế hoạtđộng của RhoA và sau đó làm giảm hoạt động của ROCK [107]
Vai trò RhoA trong điều hòa chu kỳ tế bào:
RhoA đóng vai trò trụ cột trong chu kỳ G1 của tế bào, đầu tiên là thôngqua sự điều hòa của cả sự biểu hiên D1 và yếu tố ức chế kianse p21và p27.Nhiều con đường được xem như là kết nối của protein Rho với việc điềukhiển chu kỳ D1 Nhiều loại trong số chúng liên quan đến hoạt động củaprotein kinase, dẫn đến kết quả là hoạt hóa yếu tố sao mã RhoS ức chế nồng
độ p21 trong nhiều dòng tế bào bình thường và tế bào chuyển dạng Ảnhhưởng này sẽ xuất hiện thông qua bộ máy sao mã nhưng nó cũng độc lập vớip53, một yếu tố điều hòa sao mã chính của p21 RhoA đóng vai trò quan trọngtrong việc xác định mức p27 thông qua con đường liên quan đến vùng hiệuứng của nó, Rho-associated kinase RhoA có khả năng đi vào pha S bằng cáchgiáng hóa yếu tố ức chế CDK p27kip1
Trang 23 Vai trò RhoA trong phát triển:
Protein RhoA là cần thiết cho quá trình di chuyển của tế bào, bao gồm:
sự mọc chồi dây thần kinh lan nhanh, sự đóng ống thần kinh, hình thànhxương sống và mô cơ Làm mất chức năng của Rho thời kỳ phôi bào bằng E7gây ra phôi dị tật và tế bào không còn khả năng di trú
Vai trò RhoA trong điều khiển sao mã:
Mối quan hệ giữa các chức năng của tế bào được điều hòa bởi RhoAthông qua điều hòa quá trình sao mã đã được mô tả RhoA điều hòa hoạt độngcủa SRF, NF-kappaB, c/EBPb, Stat3, Stat5, FHL-2, PAX6, GATA-4, E2F, thụthể estrogen alpha và beta, CREB, yếu tố dịch mã phụ thuộc các con đườngJNK và p38 MAP kinase Cơ chất của các kinase này gồm c-Jun, ELK, PEA3,ATF2, MEF2A, Max và CHOP/GADD135
Vai trò RhoA trong tăng sinh tế bào:
RhoA đóng vai trò đặc biệt trong điều hòa tăng sinh tế bào RhoA đóngvai trò thiết yếu trong cả giai đoạn sớm và muộn của sự phát triển tế bàolympho B
1.2.2 Gen RHOA trong ung thư dạ dày
RHOA ban đầu được thừa nhận như một oncogene vào năm 1989 khi mà
sự khuếch đại của RHOA có khả năng gây chuyển dạng nguyên bào sợi ở
chuột [108] Mặc dù vậy, các đột biến điểm tại codon 14 và 64 lại không có
xu hướng gây ung thư trên mô hình tương tự [108] Các nghiên cứu trước đây
đều thất bại trong việc xác định đột biến RHOA trong các ung thư thường gặp
và vì lẽ đó, RHOA không được cho là bị thay đổi bởi đột biến soma trong các
ung thư ở người Phải đến những năm gần đây, khi cuộc cách mạng công nghệgiải trình tự cho phép phân tích một cách chính xác hệ gen ung thư đã tiết lộ
các đột biến thường gặp ở RHOA cũng như các phân tử liên quan trong nhiều
loại ung thư [14], [15], [24], [109] Trong số này, một vài nghiên cứu di
Trang 24truyền trên quy mô lớn đã báo cáo tần số đột biến gen RHOA là 14-25% ở
bệnh nhân ung thư dạ dày type lan tỏa nhưng lại hiếm khi quan sát thấy ở cáctype ung thư dạ dày khác [14], [15], [16]
Đột biến RHOA có liên quan đến sự kém biệt hóa cũng như giảm kết
dính của tế bào- những đặc tính của tế bào UTDD type lan tỏa [28] Điều này
cho thấy mất kiểm soát chức năng gen RHOA có thể góp phần vào các kiểu
hình bệnh lý đặc trưng của type ung thư dạ dày này Bên cạnh đó, khoảng mộtnửa đột biến là dạng mất dị hợp tử (LOH) ở các locus tương đồng khiến cácallen đột biến tồn tại ở dạng đồng hợp Điều này hoàn toàn trái ngược ở cácung thư khác khi mà các các đột biến là dị hợp tử và đã gợi ý một tác động
sinh học duy nhất của đột biến RHOA trong DGC.
Mặc dù vậy, một câu hỏi lớn được các nhà khoa học đặt ra là các đột biến
RHOA liệu rằng làm mất hay tăng cường chức năng của gen thì vẫn chưa
được làm sáng tỏ Các nghiên cứu đã tiến hành giải trình tự toàn bộ gen/ exon
đều nhận thấy rằng hầu hết các đột biến RHOA phân bố không đồng đều trong
domain đầu tận amino và chủ yếu tập trung trong hai vùng chức năng liền kề
nhau liên quan đến gắn GTP và tương tác với các chất tác động của RHOA
[27] Giống như trong u lympho, đột biến RHOA ở bệnh nhân DGC cũng xuất
hiện tại một số hotspot nổi bật, tuy nhiên khác với u lympho, trong DGC,những đột biến hay gặp là R5Q, Y42C, G17E [14], Y42C, L57V [15] vàY42C, Y42S [16] Trong số này RHOA Tyr42 tương ứng với Tyr40 trênHRAS, nơi có sự đột biến làm suy giảm một cách chọn lọc sự hoạt hóa RAFbởi HRAS nhưng không ảnh hưởng đến các chất tác động khác của RAS, cho
thấy rằng đột biến RHOA Y42 cũng có thể thay đổi hoạt động RHOA theo
cách tương tự Kakiuchi và cộng sự cho rằng các hotspot đột biến trongnghiên cứu của họ giữ tính bảo tồn cao giữa các protein của gia đình Rho và
sự hiện điện của những vùng hostspot gợi ý một đột biến làm tăng cường
Trang 25chức năng gen [14] Trong khi đó, các đột biến RHOA lại phù hợp với mô
hình gen áp chế ‘’two hit’’ cổ điển kết hợp với mất dị hợp tử xảy ra đồng thời
đã gợi ý đột biến mất/ giảm chức năng [15] Wang và cộng sự nhận thấy
RHOA đột biến (Y42C, L57V) khiến tế bào thoát khỏi quá trình anoikis (một
dạng đặc biệt của apoptosis) trên mô hình nuôi cấy mô ruột non ở chuột cóthể liên quan đến đặc trưng hình thái của type lan tỏa Kakiuchi đã chứng
minh ảnh hưởng thúc đẩy sự tăng trưởng của các đột biến RHOA (Y42C, G17E) trên dòng tế bào bị đột biến RHOA (SW948) Thực tế là các đột biến
RHOA có thể cho thấy các kiểu hình sinh ung thư với sự hiện diện của mộtalen hoang dại cho thấy một hiệu ứng tăng chức năng của đột biến RHOA.Ngoài ra, các phân tích tin sinh học dự đoán sự hoạt hóa con đường tín hiệuprotein kinase liên quan đến RhoA-Rho thông qua việc đánh giá trạng thái biểu
hiện gen trong các con đường được cho là điều hòa bởi RHOA [16] Ngược lại,
phép phân tích hóa sinh cho thấy các đột biến RHOA (Y42C, L57V) làm giảm một cách đáng kể số lượng dạng hoạt hóa gắn GTP so với RHOA hoang dại
trong các tế bào 293T/17 (một dạng của tế bào 293T được phân lập từ thận phôi
người) Việc hoạt hóa RHOA một cách khiếm khuyết cho thấy hiệu ứng mất chức năng của các đột biến RHOA [15] Những dữ liệu này đã chỉ ra rằng, các
đột biến RHOA tại các hotspot mang các đặc tính của cả “giảm chức năng hóa
sinh” và “tăng chức năng sinh học” Các đột biến này không chỉ làm mất khả
năng gắn GTP của RHOA mà còn mang đến hoạt tính sinh ung thư, có thể qua
một con đường tín hiệu nào đó chưa được xác định [27]
1.2.3 Tình hình nghiên cứu gen RHOA ở bệnh nhân ung thư dạ dày.
1.2.3.1 Trên thế giới.
Trong những năm gần đây, RHOA –một gene dẫn đường ung thư mới và
đang gây nhiều tranh cãi nổi lên nhanh chóng như một đích đột biến soma
trong ung thư dạ dày Năm 2014, các đột biến soma RHOA hay gặp ở bệnh
Trang 26nhân UTDD được xác định gần như duy nhất chỉ ở type lan tỏa trong cả 3nghiên cứu: Kakiuchi [14] và Mạng lưới nghiên cứu bản đồ hệ gen ung thư(TCGA) [16] chỉ ra các đột biến tăng cường chức năng RHOA trong khi
nghiên cứu của Wang và cộng sự [15] lại chỉ ra các đột biến làm mất chứcnăng Sự trái ngược này đang thu hút nhiều nghiên cứu, kể các các nghiên cứu
tập trung vào RHOA như một đích điều trị đầy tiềm năng.
Trên tạp chí Gastric cancer, Ushiku và cộng sự lần đầu tiên công bố cácđặc điểm bệnh học lâm sàng của các bệnh nhân UTDD type lan tỏa mang đột
biến RHOA Phân tích 87 DGC, 22 bệnh nhân đột biến RHOA và 65 RHOA hoang dã (RHOA-wt), với đặc điểm lâm sàng và mô bệnh học, đặc biệt tập
trung vào tính không đồng nhất của các đặc điểm mô học và mô hình tăng
trưởng của DGC Kết quả, bệnh nhân đột biến RHOA có biệt hóa dạng ống
trung tâm thường xuyên hơn tại lớp dưới niêm mạc (lớp Lamina Propia hay
Intrmucosal) và có xu hướng xâm lấn sâu hơn so với DGC mang RHOA-wt Các nghiên cứu khác cũng nhận thấy đột biến RHOA được xác định ở cả vùng
dưới niêm mạc và vùng xâm lấn, ở cả các thành phần ống cũng như thànhphần lan tỏa Chúng được cân nhắc có khả năng xuất hiện trong giai đoạn sớmcủa ung thư biểu mô dạ dày [28] Từ những phát hiện này, một giả thiết đưa rarằng ung thư dạ dày ở vùng dưới niêm mạc type ruột có thể phát triển thànhDGC qua các bước tiến triển giống như dạng bậc thang trong sự có mặt của
đột biến RHOA.
Trong nghiên cứu của mình Ushiku và cộng sự cũng đánh giá các tác
động lâm sàng của đột biến RHOA về thời gian sống của bệnh nhân UTDD
tuy nhiên không nhận thấy sự khác biệt có ý nghĩa Mặc dù vậy, các tác giả
vẫn nhận định đột biến RHOA có thể có tương quan một cách có ý nghĩa với
thời gian sống của bệnh nhân trong một nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn
Trang 271.2.3.2 Tại Việt Nam
Cho tới nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về đột biến gen RHOA trên
UTDD ở Việt Nam được công bố Trong khi đó, từ viễn cảnh điều trị ung thư,các vùng đột biến trọng điểm trên protein này gợi ý đây là một đích điều trịđầy tiềm năng cho những bệnh nhân UTDD Bên cạnh đó, đây cũng được coi
là một marker mới trong đánh giá cũng như tiên lượng bệnh Chính vì vậy
việc nghiên cứu sâu về gen RHOA với bước đi đầu tiên là xác định đột biến gen RHOA cũng như mối tương quan với các yếu tố nguy cơ UTDD trong
điều kiện ở Việt Nam là việc làm cần thiết
Bảng 1.2: Đột biến RHOA ở một số nghiên cứu gần đây
Tác giả Đối tượng Phương pháp Tần số đột biến Vị trí đột biến Loại đột biến
- Type lan tỏa:
25.3% (22/87).
- Type ruột: 0%
(0/51)
- Hotspot: R5W (5), G17E (3), Y42C (6).
- Khác: R5Q (1), L22R (1), V38G (1).
Tăng cường chức năng
- Type lan tỏa:
14.3% (14/98).
- Type hỗn hợp: 7.8%
(4/51)
- Type ruột: 0%
(0/134)
- Hotspot: Y42C (8), L57V (4).
- Khác: R5W (2), G17E (2), L22R (1), Y34C (1), F39V (1), E40V (1).
Mất chức năng
TCGA 295 bệnhnhân
UTDD
Giải trình
tự toàn bộ exon/ Giải trình tự toàn bộ gen
5.4 % (16/295)
- Hotspot HS1: Y42C (3), Y42S (2), Y34C (1), F39C (1), E40K (1), N41K (1)
- Khác: R5W (1), G17E (1)
Tăng cường chức năng
1.3 KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN TRÊN
GEN RHOA
1.3.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
1.3.1.1 Nguyên tắc chung
Trang 28Dựa vào hoạt tính của các DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp mộtmạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn loại nucleotid.Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự
bổ xung với hai đầu của trình tự DNA khuôn
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm
ba bước: Biến tính, bắt cặp, kéo dài chuỗi:
- Bước 1: Biến tính tách đôi sợi DNA (Denaturation)
Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảycủa phân tử (94 – 95 oC) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tửDNA mạch Các kỹ thuật PCR và ứng dụng 4 kép tách thành 2 mạch đơn.Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch
bổ sung mới
- Bước 2: Bắt cặp (Annealing)
Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm)của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn Trong thựcnghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 – 65 oC Tùy thuộc vào Tmcủa các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây
- Bước 3: Kéo dài (elongation – extension)
Nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tốtnhất Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vàoprimer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian của giai đoạn nàytùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giâyđến vài phút
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng
để làm các DNA nền để tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo Sảnphẩm cuối của phản ứng PCR là những đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài làkhoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm đượcxác định bởi đầu tận cùng 5 của hai đoạn gen mồi
Số lượng chu kỳ trong PCR thường không vượt quá 40 Sau mỗi chu kỳ,
số sợi DNA tăng gấp đôi Như vậy sau n chu kỳ số sợi DNA là - 2 (n+1)
Trang 291.4.2 Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA sequencing)
Giải trình tự gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 nucleotid A,
T, G, C trên phân tử DNA
Hiện nay phương pháp Sanger được sử dụng phổ biến trên toàn thế giới.Phương pháp này sử dụng nguyên liệu để tổng hợp sợi DNA đích gồm cảdeoxyribonucleotide (dNTP) và dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP).Cấu trúc của ddNTP tương tự như dNTP nhưng không có gốc -OH ở đầu 3’nên phản ứng tổng hợp DNA sẽ bị dừng lại ngay tại vị trí mà ddNTP đượcgắn ngẫu nhiên vào thay thế cho dNTP Do vậy sản phẩm sẽ gồm nhiều đoạngen có kích thước hơn kém nhau 1 nucleotid Điện di sản phẩm, dựa vào vị trícủa các băng sáng ta đọc được trình tự của gen
1.4.2.1 Giải trình tự bằng máy tự động
Ngày nay, việc giải trình tự được thực hiện dễ dàng nhờ có sự hỗ trợ củamáy giải trình tự tự động Máy giải trình tự hoạt động dựa theo nguyên lý củaphương pháp Sanger có cải biến Trong đó các ddNTP không được đánh dấuphóng xạ mà được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau chomỗi loại ddNTP để các vạch điện di của các mạch đơn DNA được tổng hợp raphát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser
Cấu tạo
Máy tự động giải trình tự gồm hai phần chính yếu, đó là: phần điện divới gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di Phần điện dipolyacrylamide có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel Phầnphát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser điqua trước nó
Nguyên tắc hoạt động
Trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùmtia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắtcảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ
Trang 30Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnhtương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNAVới các máy thế hệ mới sau này, người ta có thể dùng 4 màu huỳnhquang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự cóthể thực hiện được chỉ trong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện
di trên một hàng mà không cần phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây
1000 USA, đồng thời nó cũng cho phép sử dụng giải trình tự như 1 công cụlâm sàng
NGS gồm 3 bước chung:
- Chuẩn bị thư viện (Library preparation): Các thư viện được tạo ra bằng
sự phân cắt ngẫu nhiên của DNA cần giải trình tự, sau đó gắn với các adaptor
- Khuếch đại vô tính (Clonal Amplification): Thư viện được khuếch đạibằng PCR (emulsion PCR, bridge PCR)
- Giải trình tự (Sequencing): DNA được giải trình tự dựa trên các cáchtiếp cận khác nhau (Pyrosequencing, Sequencing-by-ligation, Sequencing-by-synthesis)
Giải trình tự Pyrosequencing.
Pyrosequencing được dựa trên nguyên lý giải trình tự bằng cách tổnghợp, khi một sợi bổ sung được tổng hợp với sự có mặt của enzym polymerase.Ngược lại với việc sử dụng dideoxynucleotides để chấm dứt khuếch đại chuỗi
Trang 31(như trong Sanger sequencing), pyrosequencing lợi dụng sự giải phóngpyrophosphate khi nucleotide được thêm vào chuỗi DNA.
Quá trình giải trình tự diễn ra qua 5 bước Đầu tiên, sợi khuôn, một sảnphẩm PCR sợi đơn, được lai với một primer giải trình tự và sau đó được ủ vớicác enzyme DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase và apyrase cũngnhư các cơ chất adenosine 5’ phosphosulfate (APS) và luciferin Khi dNTPđầu tiên được bắt cặp bổ sung, nó được gắn với sợi DNA khuôn nhờ DNApolymerase và kèm theo sẽ giải phóng một PPi PPi được biến đổi thành ATPnhờ enzyme ATP sulfyrelase cùng với sự tham gia của APS, sau đó một phảnứng được xúc tác bởi licuferase sẽ biến đồi luciferin thành oxyluciferin - tạo
ra ánh sánh nhìn thấy, có độ sáng tương ứng với lượng ATP tạo thành Ánhsáng này được nhận viết bởi một camera và phân tích bởi một chương trìnhphần mềm
Apyrase làm suy biến các nucleotide không bắt cặp và ATP Sau quá trìnhlàm suy biến, phản ứng bắt đầu lại với nucleotide khác được gắn vào Sau mộtquá trình liên tục, sợi DNA bổ sung được tổng hợp xong và việc giải trình tựnucleotide được xác định từ các đỉnh tín hiệu dựa trên "dấu vết của pyrogram(pyrogram trace)"
Trang 32Ưu điểm của kỹ thuật pyrosequencing gồm tính linh hoạt cao khi kết cặpprimer, phân tích được nhiều đột biến, dữ liệu và thông tin trình tự tập hợpđược đầy đủ Kỹ thuật này có tính nhạy cao hơn hẳn so với phương pháp giảitrình tự truyền thống với độ chính xác là 99,9% với các đoạn 200 base và99% với các đoạn 400 base Hệ thống giải trình tự được 400-600 triệu bptrong 10 giờ vì vậy giá thành thấp hơn khi giải trình tự lượng lớn DNA vớithời gian nhất định so với khi sử dụng phương pháp Sanger – mất nhiều ngày
để giải trình tự một lượng DNA tương đương
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu gồm 38 bệnh nhân được chẩn đoán là ung thư dạdày thể lan tỏa theo phân loại Lauren 1965 dựa trên mô bệnh học, thỏa mãncác tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ sau:
Trang 33- Tiêu chuẩn lựa chọn:
+ Tuổi 18 tuổi
+ Bệnh nhân được chẩn đoán xác định ung thư dạ dày nguyên phát với
mô bệnh học thuộc type lan tỏa theo phân loại Lauren 1965
+ Tình nguyện tham gia vào nghiên cứu
- Tiêu chuẩn loại trừ:
+ Bệnh nhân, gia đình bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.+ Không đủ hồ sơ và thông tin bệnh nhân ở thời điểm kết thúc nghiên cứu
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Thiết kế nghiên cứu
Theo phương pháp mô tả, phân tích hồi cứu
2.2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: Từ 06/2017 đến 06/2018
- Địa điểm lấy mẫu: BV K TW, BV 108 và BV Đại học Y Hà Nội
- Phân tích DNA và gen RHOA: Trung tâm Kiểm chuẩn Trường Đại học Y
Hà Nội
2.2.3 Các biến số nghiên cứu cần thu thập.
Bao gồm:
- Chỉ số nhân trắc: tuổi, giới
- Tình trạng sử dụng rượu, bia, thuốc lá trước khi được chẩn đoán bệnh
- Đặc điểm tổn thương
- Tình trạng đột biến gen RHOA
Bảng 2.1 Các biến số nghiên cứu cần thu thập ST
Phương pháp thu thập
Trang 343 Hút thuốc - Có/ Không PV
4 Uống rượu, bia
- Có (mức độ có nguy cơ)/
Không hoặc có sử dụng ởmức độ hợp lý
PV
5 Vị trí tổn thương Tâm vị/ Không phải tâm vị Hồi cứu bệnh án
6 Kích thước u (cm) <1/ 1 – 2/ 2.1 – 3/ >3 Hồi cứu bệnh án
7 Mức độ xâm lấn tạichỗ T1/ T2/ T3/ T4 Hồi cứu bệnh án
8 Đột biến gen RHOA - Có/ Không- Loại đột biến Kỹ thuật phântích
2.2.4 Phương tiện nghiên cứu
2.2.4.1 Bộ câu hỏi phỏng vấn bệnh nhân (phụ lục 1 và 2)
2.2.4.2 Dụng cụ, trang thiết bị phân tích đột biến gen.
- Máy ly tâm để bàn Eppendorf (Đức)
- Máy quang phổ kế Nano drop 2000C
- Máy ủ Thermomixer comfort
- Máy PCR Mastercycler pro S của hãng Eppendorf - Đức
- Máy điện di Consort EV243
- Máy soi gel và chụp ảnh tự động Gel Doc-It2 Imager
- Máy đọc trình tự gen ABI 3730 XL (Thermo Fisher)
- Nồi hấp ướt Hirayama
- Tủ sấy Memmert
2.2.4.3 Hóa chất dùng để tách chiết DNA
- GeneAll® Exgene™ FFPE Tissue DNA kit
Trang 352.2.5.3 Tách chiết DNA tổng số từ mô
Các mẫu mô được lựa chọn vùng tập trung tế bào ung thư (tại Khoa Giảiphẫu bệnh) bằng cách đánh dấu vùng mô ung thư để phân biệt với vùng môlành xung quanh
Sử dụng kit tách chiết ADN từ mô paraffin GeneAll® Exgene™ FFPETissue DNA kit (GeneAll, Hàn Quốc) theo quy trình của nhà sản xuất (Phụlục 3)
2.2.5.3 Kỹ thuật PCR khuếch đại exon 2, 3 gen RHOA
DNA của bệnh nhân sau khi được tách chiết được sử dụng để khuếch đạigen RHOA bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu
Phản ứng PCR với tổng thể tích 25 µl bao gồm các thành phần được trộn
theo thứ tự trong Bảng 2.2
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR cho khuếch đại gen RHOA
Trang 36Taq Master 2X 12,5 µl
Primer RhoA exon 2/ 3 xuôi 0.5 mmol/L
Primer RhoA exon 2/3 ngược 0.5 mmol/L
Mồi xuôi: 5'-GGATCGGCGTACTAGAAGTTTG- 3'
Mồi ngược: 5'-ACATGGAAAATGGCATCAGTTGTT- 3'
Chu trình nhiệt:
- Exon 3:
Mồi xuôi: 5'- ACTGTTTTAGACCGTCTGCCA - 3'
Mồi ngược: 5'- TTCAGCCACTTGATGCCCAG - 3'
- Chu trình nhiệt:
Trang 372.2.5.4 Giải trình tự gen
Sản phẩm PCR sẽ được tinh sạch và giải trình tự gen trực tiếp để xácđịnh đột biến trên gen RhoA
a Tinh sạch DNA
Sản phẩm PCR được tinh sạch phương pháp Ethanol precipitation
b Quy trình thực hiện giải trình tự gen
Thực hiện theo quy trình và sử dụng phương pháp Phương pháp Sangertrên hệ thống máy ABI 3730 XL (Thermo Fisher) chạy với hóa chấtBigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencin Kit
- Thành phần mẫu giải trình tự:
Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự
Big dye Terminator v3.1 1,0 µL
Mồi xuôi hoặc mồi ngược (10
Trang 38c Phương pháp phân tích kết quả
Kết quả được thu thập và sử lý bằng phần mềm BioEdit 7.2.6 và ApE-Aplasmid Editor 2.0.3 Trình tự được so sánh trên GeneBank để phát hiện độtbiến DNA (NG_051308.1), mRNA (NM_001313941.1)
2.2.6 Phân tích các yếu tố nguy cơ của rượu, thuốc lá.
- Sử dụng rượu ở mức độ có nguy cơ nếu tổng điểm AUDIT C:
+ Nam giới: > 4 điểm
Trang 39+ Hút thuốc: Bao gồm những bệnh nhân hút ít nhất 100 điếu thuốc trongsuốt cuộc đời, tính đến thời điểm được chẩn đoán xác định UTDD thể lan tỏa.
2.2.7 Phương pháp phân tích số liệu
- Thông tin về các đối tượng nghiên cứu ở cả 2 nhóm được thu thập theomột mẫu thống nhất
- Các số liệu được nhập và xử lý bằng phần mềm thống kê SPSS 16.0
2.2.8 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu
- Các nhóm đối tượng nghiên cứu hoàn toàn tự nguyện tham gia vàonghiên cứu
- Đối tượng hoàn toàn có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi không muốntiếp tục tham gia vào nghiên cứu
- Thông tin của các đối tượng sẽ được đảm bảo bí mật
2.2.9 Sơ đồ nghiên cứu
Bệnh nhân được chẩn đoán là ung thư dạ dày thể lan tỏa
Giải thích và phỏng vấn bệnh nhân
Thu thập mẫu mô
Phân tích mối liên quanXác định đột biến gen RHOA ở exon 2, 3
Có đột biến Không đột biến