NGHIÊN cứu ẢNH HƯỞNG của NANO bạc lên sự NHÂN CHỒI, SINH TRƯỞNG và PHÁT TRIỂN của cây HOA HỒNG (ROSA SP ) IN VITRO

Gần đây, nano bạc được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật, nhằm tăng cường khả năng sinh trưởng, phát triển của cây trồng với ưu điểm tăng tiếp xúc, bám dính lên bề mặt tế bào, dẫn tới

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BẠC LÊN SỰ NHÂN CHỒI, SINH TRƯỞNG

VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY HOA HỒNG (ROSA SP.) IN VITRO

Dương Tấn Nhựt 1 , Nguyễn Xuân Tuấn 1 , Nguyễn Thị Thùy Anh 1 , Hồ Viết Long 1 , Hoàng Thanh Tùng 1 , Nguyễn Bá Nam 1 , Nguyễn Phúc Huy 1 , Vũ Quốc Luận 1 , Vũ Thị Hiền 1 , Lê Thị Thu Hiền 2 , Nguyễn Hoài Châu 3 , Ngô Quốc Bưu 3

1 Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2 Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3 Viện Công nghệ Môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Ngày nhận bài: 19.5.2015

Ngày nhận đăng: 30.6.2015

TÓM TẮT

Hoa hồng là một trong những loại hoa được trồng phổ biến trên thế giới, được ưa thích bởi sự đa dạng về màu sắc và chủng loại Tuy nhiên, việc vi nhân giống loài hoa này lại gặp nhiều khó khăn như vàng lá ở cụm

chồi, rụng lá và rễ hóa đen ở cây in vitro Gần đây, nano bạc được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật, nhằm

tăng cường khả năng sinh trưởng, phát triển của cây trồng với ưu điểm tăng tiếp xúc, bám dính lên bề mặt tế bào, dẫn tới hiệu quả tác động cao Trong nghiên cứu này, nồng độ nano bạc khác nhau (0; 1; 3; 5; 7; 9; 11 mg/l) được sử dụng để khảo sát hiệu quả nhân nhanh chồi, sinh trưởng và phát triển của cây hoa hồng Kết quả sau 30 ngày nuôi cấy, sự sinh trưởng và phát triển của chồi trên môi trường MS bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 2,5 mg/l BA và 7 mg/l nano bạc cho hiệu quả tốt nhất trong việc nhân nhanh chồi (tăng số chồi hình thành gấp 4,09 lần so với đối chứng không sử dụng nano bạc) Môi trường MS có bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 0,5 mg/l IBA và 9 mg/l nano bạc là tối ưu cho quá trình ra rễ, sinh trưởng và phát triển của cây hoa hồng

in vitro so với đối chứng với các chỉ tiêu chiều cao cây, số lá/cây, chiều dài lá, chiều rộng lá, khối lượng tươi,

khối lượng khô, chlorophyll a và b đều cao vượt trội (2,93 cm; 8 lá; 1,9 cm; 1,6 cm; 517, 67 mg; 52 mg; 6,80 µg/g; 3,49 µg/g; tương ứng) Đồng thời, chồi và cây đều sinh trưởng khỏe mạnh, ít hoặc không quan sát thấy hiện tượng vàng lá, rụng lá so với đối chứng trong trường hợp này Cây con có chiều cao đồng đều, bộ lá xanh,

hệ rễ dày đều và phát triển khỏe mạnh so với đối chứng

Từ khóa: Hoa hồng, nano bạc, nhân chồi, sinh trưởng và phát triển, vi nhân giống

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hoa hồng là một loài hoa được trồng phổ biến ở

nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có nước ta bởi

khả năng phân bố rộng từ miền ôn đới đến nhiệt đới,

đa dạng về chủng loại và màu sắc Sản lượng hoa

hồng hàng năm chiếm tỉ trọng cao nhất, chiếm trên

35% tổng sản lượng hoa cắt cành trên toàn thế giới

Dự kiến nhu cầu về hoa hồng cắt cành sẽ tăng mạnh

trong những năm tiếp theo (Nguyễn Xuân Linh,

2000) Với khả năng tăng trưởng nhanh về mặt

thương mại, nhu cầu về giống hoa hồng chất lượng

cao (đồng đều, sạch bệnh) với số lượng lớn ngày

càng trở nên cần thiết

Kể từ khi ra đời, kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật

đóng vai trò quan trọng trong việc nhân giống Đây

là phương pháp làm tăng nhanh số lượng cũng như

chất lượng cây trồng, cung cấp nguồn cây sạch bệnh

với số lượng cây giống lớn trong thời gian ngắn và

có thể sản xuất được quanh năm (Dhawan, Bhojwani, 1986) Kỹ thuật này đã và đang được ứng dụng cho nhiều loại cây khác như cúc, cẩm chướng,… trong đó có hoa hồng Tuy nhiên, việc vi

nhân giống in vitro cây hoa hồng thường gặp nhiều

vấn đề như vàng lá ở cụm chồi, rụng lá và rễ hóa đen

ở cây in vitro, sinh trưởng và phát triển kém; kết quả

là chất lượng cây giống và khả năng sống sót của cây con ngoài vườn ươm giảm Sự ra đời của vật liệu nano đã khắc phục được một vài bất lợi kể trên trên một số loài thực vật Vật liệu nano gồm rất nhiều loại khác nhau như: nano bạc, nano vàng, nano sắt, nano kẽm, … với kích thước hạt rất nhỏ (1-100 nm) nên các hạt nano có diện tích bề mặt lớn làm tăng khả năng tiếp xúc với không gian bên ngoài Do đó, sự bám dính lên bề mặt tế bào gia tăng dẫn đến hiệu quả tác động cao (Shah, Belozerova, 2008) Hiệu quả của dung dịch nano được báo cáo là phụ thuộc vào kết

hợp hóa học, kích cỡ, bề mặt bao phủ, tương tác hóa

học (Khodakovskaya et al., 2012), nồng độ cũng như

loài thực vật được sử dụng (Ma et al., 2010)

Hiệu quả tác động của nano bạc đã được báo cáo

trên rất nhiều đối tượng vi sinh vật và tế bào động

vật Tuy nhiên trên đối tượng thực vật in vitro còn

nhiều hạn chế (Monica, Cremonini, 2009) Nano bạc

có ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt Bacopa

monnieri, cảm ứng tổng hợp protein và carbohydrate,

giảm lượng phenol tổng và hoạt động của các

enzyme peroxidase (Krishnaraj et al., 2012) Hiệu

quả của nano bạc trong việc tăng cường khả năng

sinh trưởng, phát triển và giải quyết một số bất lợi

không mong muốn trên một số loại thực vật in vitro

cũng đã được báo cáo Nano bạc cũng làm tăng

cường các chỉ tiêu sinh trưởng và các thuộc tính hóa

học ở loài cây Brassica juncea, đậu và ngô (Sharma

et al., 2012); giúp cảm ứng sự hình thành rễ do khóa

tín hiệu ethylene ở cây Crocus sativus (Rezvani et

al., 2012)

Trong nghiên cứu này, nano bạc được sử dụng

nhằm đánh giá hiệu quả của loại nano này lên quá

trình nhân nhanh chồi, ra rễ, sinh trưởng và phát

triển cây hoa hồng in vitro

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Nguồn mẫu được sử dụng trong các thí nghiệm

là các chồi hoa hồng cam (Rosa sp.) in vitro 1 tháng

tuổi, cao khoảng 1 cm, được cấy chuyền nhiều lần

trên cùng một môi trường, hiện có sẵn tại phòng Sinh

học phân tử và Chọn tạo giống cây trồng, Viện

Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên

Môi trường thí nghiệm

Môi trường MS (Murashige, Skoog, 1962) bổ

sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar Các chất điều hòa

sinh trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường

với loại và nồng độ khác nhau tùy vào mục đích thí

nghiệm trước khi điều chỉnh pH về 5,8 Môi trường

được hấp khử trùng ở 121°C, 1 atm trong 20 phút

Dung dịch nano bạc do Viện Công nghệ

Môi trường cung cấp với các hạt nano bạc có kích

thước trung bình ≤ 20 nm được thiết lập theo tỷ

lệ: [AgNO3] = 750-1000 ppm, [β-chitozan] =

250-300 ppm, [NaBH4] = 200 ppm, tỷ lệ mol

[NaBH4]/[AgNO3] = ¼ và với tốc độ nhỏ giọt

của NaBH4 là 10-12 giọt/phút (Chau et al., 2008)

Phương pháp

Xác định hàm lượng chlorophyll

Hàm lượng chlorophyll a và b được đánh giá bằng phương pháp phân tích quang phổ hấp phụ của dịch chiết lá trong dung dịch acetone bằng máy đo quang phổ UV-2900 Hitachi, Nhật Bản) Độ hấp phụ (OD) được đo ở bước sóng 662 và 645 nm (Lichtentaler, Wellburn, 1985)

Bố trí thí nghiệm

Ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro

Các chồi hoa hồng (0,5 cm) được cấy vào các bình thủy tinh (thể tích 250 ml) có chứa 40 ml môi trường khoáng MS bổ sung 8 g/l agar, 30 g/l sucrose

và BA (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3 mg/l) nhằm tìm ra môi trường thích hợp nhất cho khả năng nhân nhanh chồi Sau 30 ngày nuôi cấy ghi nhận các chỉ tiêu: Số chồi, chiều cao chồi (cm), số đốt, khối lượng tươi (mg), khối lượng khô (mg)

Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc lên khả năng nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro

Các cụm chồi hoa hồng (0,5 x 0,5 cm) cấy vào môi trường thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh chồi ở thí nghiệm trên có bổ sung các nồng độ nano bạc khác nhau (0; 1; 3; 5; 7; 9; 11 mg/l) Sau 30 ngày nuôi cấy ghi nhận các chỉ tiêu: Số chồi, chiều cao chồi (cm), số đốt, khối lượng tươi (mg), khối

lượng khô (mg)

Ảnh hưởng của IBA lên khả năng ra rễ, sinh trưởng

và phát triển của cây hoa hồng in vitro Các chồi hoa hồng khoảng 1 cm được được cấy

vào vào môi trường MS bổ sung 8 g/l agar, 30 g sucrose và các nồng độ khác nhau của IBA (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3 mg/l) nhằm tìm ra môi trường thích hợp nhất cho quá trình ra rễ, sinh trưởng và phát

triển của chồi hoa hồng in vitro Sau 30 ngày nuôi cấy

ghi nhận các chỉ tiêu: Chiều cao cây (cm), số lá, số rễ, chiều dài rễ (cm), khối lượng tươi (mg), khối lượng khô (mg)

Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc lên khả năng sinh trưởng, phát triển cây hoa hồng in vitro

Các chồi hoa hồng khoảng 1 cm được được cấy

vào vào môi trường tốt nhất cho khả năng ra rễ, sinh

trưởng và phát triển của chồi hoa hồng in vitro ở trên

và bổ sung thêm các nồng độ khác nhau của nano bạc (0; 1; 3; 5; 7; 9; 11 mg/l) Sau 30 ngày nuôi cấy ghi nhận các chỉ tiêu: Chiều cao cây (cm), số lá, số rễ,

chiều dài rễ (cm), khối lượng tươi (mg), khối lượng

khô (mg)

Điều kiện thí nghiệm

Mẫu được nuôi cấy dưới đèn huỳnh quang với

thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ chiếu

sáng 40-45 µmol.m-2.s-1, nhiệt độ 25 ± 2°C, độ ẩm

trung bình khoảng 55-60%

Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu

Mỗi thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn

ngẫu nhiên một yếu tố Các số liệu được xử lý bằng

phần mềm SPSS 22.0 theo Ducan’s test (Duncan,

1955)

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân nhanh

chồi hoa hồng in vitro

Sau 30 ngày nuôi cấy, ở tất cả các nghiệm thức bổ

sung BA, chỉ tiêu số chồi đều cao hơn so với đối

chứng Nồng độ BA ở 3 mg/l cho hiệu quả tái sinh

nhiều chồi nhất (8,66 chồi/mẫu); tuy nhiên, trong nghiệm thức này chồi nhỏ, mảnh, thấp hơn so với các nghiệm thức còn lại, khối lượng tươi (826 mg) và khối lượng khô (83 mg) của cụm chồi cũng thấp (Bảng 1, Hình 1) Trong khi đó, ở nồng độ 2,5 mg/l BA số chồi không khác biệt có ý nghĩa so với nồng độ 3 mg/l BA

Ở nồng độ này, số chồi/mẫu (8,00 chồi) không nhiều nhất nhưng các chồi có kích thước lớn hơn các chồi ở nồng độ 3 mg/l BA (nồng độ có số chồi đạt cao nhất), cao đồng đều (1,00 cm), nhiều lá xanh (5 lá/chồi), khỏe mạnh; đặc biệt là khối lượng tươi cụm chồi (1279,33 mg), khối lượng khô cụm chồi (135,33 mg)

thu được đạt cao nhất (Bảng 1)

Trong quy trình nhân nhanh chồi ở các loài thực vật được nuôi cấy mô, BA là cytokinin được sử dụng nhiều nhất Nồng độ phù hợp cho đáp ứng nhân chồi tốt nhất được báo cáo là từ 0,1-3,0 mg/l BA (Posada

et al., 1999)

Như vậy, từ kết quả thí nghiệm này có thể kết luận rằng, nồng độ BA tối ưu cho nhân chồi hoa hồng trên môi trường MS bổ sung 8 g/l agar và 30 g/l

sucrose là 2,5 mg/l

Bảng 1 Ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro

BA

(mg/l) Số chồi Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi Khối lượng tươi (mg) Khối lượng khô (mg)

Ghi chú: * Các kí tự khác nhau (a,b,c…) trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05 theo Duncan’s

test

Hình 1 Chồi hoa hồng sau 30 ngày được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung BA (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 mg/l lần lượt từ

trái sang phải)

Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc lên khả năng

nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro

Sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường tối ưu của

thí nghiệm 1 có bổ sung nano bạc ở các nồng độ

khác nhau (0; 1; 3; 5; 7; 9; 11 mg/l), kết quả cho thấy

có sự khác nhau rõ rệt giữa các chỉ tiêu sinh trưởng

chồi ở các nghiệm thức (Bảng 2) Ở cả 6 nghiệm

thức bổ sung nano bạc đều cho số chồi tạo ra cao

hơn đối chứng Đồng thời, các chồi được tạo thành

trên môi trường này cao đồng đều nhau, lá nhiều, to,

màu xanh đậm, hiện tượng vàng lá ít xuất hiện so với

đối chứng (Hình 2)

Trong các nghiệm thức có bổ sung nồng độ

nano bạc ở 1, 3 và 5 mg/l, sự sinh trưởng của cụm

chồi hoa hồng tăng đáng kể so với đối chứng

Trong đó, số chồi (17,67; 17,33 và 18,67; tương

ứng) và gấp 2,65; 2,58; 2,80 lần so với đối chứng

Đặc biệt, ở nghiệm thức bổ sung 7 mg/l nano bạc,

số chồi (27,33 chồi), chiều cao chồi (1,87 cm/chồi),

số lá (8,33 lá/chồi), khối lượng tươi (9240 mg/cụm

chồi), khối lượng khô (907 mg/cụm chồi) cao vượt

trội so với đối chứng và các nghiệm thức bổ sung

nano bạc với nồng độ khác (Bảng 2) Tại nồng độ

này, số chồi hình thành cao gấp 4 lần so với đối

chứng Các chồi khỏe mạnh này sẽ là nguồn mẫu

chất lượng, được dùng cho các thí nghiệm tiếp theo Tuy nhiên, trên môi trường được tăng nồng độ nano bạc lên 9 và 11 mg/l thì các chỉ tiêu này đều giảm dần (Bảng 2)

Như vậy, bổ sung nano bạc vào môi trường nhân chồi hoa hồng thúc đẩy sự hình thành chồi từ cụm chồi hoa hồng so sánh với đối chứng và nồng độ tối

ưu là 7 mg/l Vượt quá nồng độ này, số lượng chồi tạo ra giảm, chồi cũng sinh trưởng kém trong điều

kiện in vitro

Nano bạc đã cho thấy tính năng kháng khuẩn

cao (Abdi et al., 2008), ảnh hưởng tới sinh sản và hô hấp của sinh vật (Lok et al., 2007), kéo dài khả năng tồn tại của lá (An et al., 2008) và tăng cường khả năng trao đổi chất ở thực vật (Giraldo et al., 2014)

Mặc dù ảnh hưởng của nano bạc đã được báo cáo trên rất nhiều đối tượng vi sinh vật và tế bào động vật; tuy nhiên, chỉ có một vài nghiên cứu hoàn thành

trên đối tượng thực vật (Krishnaraj et al., 2012;

Monica, Cremonini, 2009) Hiệu quả của nano bạc nói chung và các dung dịch nano nói riêng phụ thuộc vào kết hợp hóa học, kích cỡ, bề mặt bao phủ,

tương tác hóa học (Khodakovskaya et al., 2012), nồng độ cũng như loài thực vật được sử dụng (Ma et al., 2010)

Bảng 2 Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc lên khả năng nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro

Nano bạc

(mg/l)

Số

chồi/mẫu

Chiều cao chồi (cm)

Số lá/chồi

Khối lượng tươi (mg)

Khối lượng khô (mg)

Ghi chú : * Các kí tự khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05 theo Duncan’s

test

Hình 2 Chồi hoa hồng sau 30 ngày được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung nano bạc (0; 1 ; 3 ; 5 ; 7 ; 9 ; 11 mg/l lần

lượt từ trái sang phải)

Trong nghiên cứu của chúng tôi, nano bạc cho

hiệu quả gia tăng lượng chồi hình thành, giảm sự già

hóa lá Điều này có thể được giải thích là do ion Ag+

trong dung dịch nano ức chế sự hoạt động của

enzyme tổng hợp ethylen (Macnish et al., 2004)

Con đường diễn ra như sau Ag+ có thể thay thế các

ion Cu2+ (có vai trò quan trọng trong việc gắn

ethylen lên tế bào thực vật) hiện diện trên các thụ thể

protein, ngăn chặn sự nhận biết ethylene (Khan,

2006) Ethylen là hormone gây ra các hiện tượng già

hóa như vàng và rụng lá trên nhiều loại thực vật

(Cameron, Reid, 2001; Celikel et al., 2002) đã không

được hình thành Nồng độ nano bạc cao (9 và 11

mg/l) làm cho chồi hoa hồng giảm sinh trưởng có thể

được giải thích là do tế bào bị ngộ độc kim loại nặng

(bạc) dẫn đến hiện tượng trùng hợp phenol do hoạt động của enzyme peroxidase (Backor, 2009)

Ảnh hưởng của IBA lên khả năng ra rễ, sinh

trưởng và phát triển của cây hoa hồng in vitro

Sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường ra rễ có bổ sung IBA với các nồng độ khác nhau, kết quả cho thấy nồng độ 0,5 mg/l IBA cho khả năng ra rễ, sinh trưởng và phát triển chồi hoa hồng tốt nhất trong số các nồng độ khảo sát và so với đối chứng Chiều cao cây đạt 2,33 cm; số lá 7,17 lá/cây; lá rộng (1,07 cm)

và dài (1,53 cm); khối lượng tươi 433,67 mg; khối

lượng khô 41,33 mg; cây in vitro cũng có nhiều rễ

nhất và chiều dài rễ cao nhất, đạt 8,33 rễ và 0,87 cm; tương ứng (Bảng 3, Hình 3)

Bảng 3 Ảnh hưởng của IBA lên khả năng ra rễ, sinh trưởng và phát triển của cây hoa hồng in vitro

IBA

(mg/l)

Chiều

cao cây

(cm)

Số lá/cây Số rễ

Chiều dài

rễ

Chiều rộng lá (cm)

Chiều dài lá (cm)

Khối lượng tươi (mg)

Khối lượng khô (mg)

Ghi chú: * Các kí tự khác nhau (a, b, c…) trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05 theo Duncan’s

test Kí hiệu “-“: mẫu chết

Trên môi trường đối chứng, chỉ có trung bình 2

rễ/cây hình thành Trong khi đó, nồng độ 0,5 mg/l

IBA cho tới 8,33 rễ hình thành Các rễ này đều nhau

và cũng dài hơn so với rễ ở các nghiệm thức khác

(0,83 cm) Tuy nhiên, khi nồng độ IBA trong môi

trường nuôi cấy tăng lên, số rễ giảm dần Mức giảm

thấp đột ngột (1,33 rễ/chồi) khi chồi được nuôi cấy

trong môi trường có bổ sung 1,5 mg/l IBA và tại 2

mg/l đã không có rễ nào được quan sát (mẫu chết)

(Hình 3)

Sự hình thành rễ từ các chồi nuôi cấy là giai đoạn quan trọng trong vi nhân giống cây trồng Trong giai đoạn ra rễ, auxin như NAA, IAA, IBA là chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng nhiều nhất Auxin có tác dụng kích thích sự hình thành rễ, rút ngắn thời gian ra rễ và làm tăng số lượng cũng như

chiều dài rễ (Erwin et al., 1997) nhưng không phải

loại nào cũng có kết quả tương tự nhau Auxin chỉ có tác dụng phản biệt hóa tế bào làm xuất hiện mầm rễ trong giai đoạn đầu của sự hình thành rễ, cơ quan Ở

Hình 3 Các cây hoa hồng sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường bổ sung IBA (0; 0,5; 1; 1,5; 2 mg/l tương ứng từ trái qua phải)

giai đoạn kéo dài rễ, auxin ngăn cản sự phát triển và

ức chế sự dài rễ do đó ảnh hưởng tới sức sống và sự

sinh trưởng của chồi cấy (Davies, 1987)

Rễ hoa hồng dễ dàng cảm ứng trên môi trường

MS bổ sung auxin (IAA, IBA hoặc NAA) ở nồng độ

thấp từ 0,1-0,5 mg/l (Hasegawa, 1980) Nồng độ 0,5

mg/l IBA thu được cho kết quả ra rễ hoa hồng tốt

nhất cũng được báo cáo bởi Syamal và Singh (1996);

tuy nhiên, các tác giả này có kết hợp thêm với 0,2

mg/l NAA Kết quả của chúng tôi khác với báo cáo

của Rout và đồng tác giả (1991) cho kết quả ra rễ

hoa hồng tối ưu ở 1 mg/l IBA Điều này có thể được

giải thích là do độ tuổi mẫu và giống hoa hồng được

sử dụng trong thí nghiệm này

IBA là một loại auxin thường được dùng cho

nuôi cấy in vitro hoa hồng (Sahoo, Debata, 1997)

IBA cũng được biết đến như chất kích thích ra rễ

hiệu quả trên một số đối tượng thực vật khác như

Bixia orellana (De Paiva Neto et al., 2003) Đặc biệt,

IBA có thể có hiệu quả gấp 2 lần so với IAA trong

xử lý rễ cây Prunus (Mateja et al., 2005) và rút ngắn

thời gian ra rễ tới 4 lần so với xử lý với IAA (Van

der Krieken et al., 1993) Như vậy, nồng độ IBA tối

ưu cho sự ra rễ, sinh trưởng của hoa hồng trong nghiên cứu này là 0,5 mg/l

Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc lên khả năng

sinh trưởng, phát triển cây hoa hồng in vitro

Sau 30 ngày nuôi cấy chồi hoa hồng trên môi trường tối ưu của thí nghiệm 3 có bổ sung nano bạc với nồng độ khác nhau (0; 1; 3; 5; 7; 9; 11 mg/l), kết quả thu được cho thấy tại tất cả các nồng độ nano bạc được khảo sát đều cho các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển cao hơn so với đối chứng Nồng độ nano bạc tăng dần thì các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển cây hoa hồng cũng tăng dần (Bảng 4) Đặc biệt, nồng

độ tối ưu nhất thu được là 9 mg/l nano bạc, các cây

con in vitro đều đạt chiều cao (2,93 cm), số lá/cây (8

lá), chiều dài lá (1,9 cm), chiều rộng lá (1,6 cm), khối lượng tươi (517, 67 mg), khối lượng khô (52 mg), chlorophyll a (6,80 µg/g) và b (3,49 µg/g) cao nhất Quan sát thấy các cây con khỏe mạnh với chiều cao đồng đều, thân chắc, mập, có hệ rễ dày và bộ lá xanh, to khỏe, ít bị vàng lá, rụng lá so với đối chứng (Bảng 4, Hình 4) Trên môi trường bổ sung 11 mg/l nano bạc, các chỉ tiêu theo dõi này lại giảm, cây con thấp hơn, các chỉ tiêu theo dõi đều giảm so với nghiệm thức bổ sung 9 mg/l nano bạc

Bảng 4 Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc lên khả năng sinh trưởng, phát triển cây hoa hồng in vitro

Nano

bạc

Chiều

cao

cây

(cm)

Số lá/cây

Chiều dài lá (cm)

Chiều rộng lá (cm)

Số rễ

Chiều dài rễ (cm)

Chlorophyl

l a (µg/g)

Chlorophyl

l b (µg/g)

Khối lượng tươi (mg)

Khối lượng khô (mg)

Ghi chú: * Các kí tự khác nhau (a, b, c…) trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05 theo Duncan’s

test

Hình 4 Cây hoa hồng sau 30 ngày nuôi cấy trên môi bổ sung nano bạc với các nồng độ khác nhau (0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 mg/l)

Hiệu quả tích cực lên sự tạo rễ, sinh trưởng và

phát triển chồi trong trường hợp này có thể là do

hiệu quả cộng gộp của IBA (0,5 mg/l) kết hợp với

nano bạc

Nano bạc có vai trò quan trọng trong nuôi cấy

mô thực vật Nano bạc không chỉ có vai trò làm tăng

cường khả năng sinh trưởng, phát triển (chiều dài

chồi và rễ, diện tích lá), tăng cường các quá trình

biến dưỡng trong cây (tổng hợp chlorophyll, tăng

hàm lượng carbohydrate và protein và tổng hợp các

enzyme oxi hóa) của cải Brassica juncea, đậu và ngô

(Salama, 2012) mà còn tăng cường khả năng hình

thành rễ , ức chế hình thành ethylene ở cây Crocus

sativus (Rezvani et al., 2012)

Nồng độ nano bạc tối ưu cho quá trình sinh,

trưởng phát triển trên cây cúc (10 mg/l), đồng tiền (5

mg/l) và dâu tây (10 mg/l) cũng đã được khảo sát

(Dương Tấn Nhựt et al., 2014) Với cây hoa hồng in

vitro ở thí nghiệm của chúng tôi là 9 mg/l nano bạc

Các nồng độ tối ưu khác nhau có thể là do kiểu gene

khác nhau của mỗi loại thực vật

Quang hợp là quá trình cơ bản của thực vật trên

trái đất để chuyển hóa năng lượng ánh sáng thành

năng lượng hóa học tích lũy trong các hợp chất hữu

cơ Ngày nay, các nhà khoa học nỗ lực cải thiện tính

hiệu quả của bó mạch thực vật bởi rất nhiều kỹ thuật

và các thao tác gene Nhằm làm tăng tốc độ quang

hợp ở thực vật, Rubisco - một enzyme quan trọng

trong quá trình quang hợp khi xúc tác cho sự hợp

nhất của CO2 vào các hợp chất sinh học cũng được

nghiên cứu Theo Lei và đồng tác giả (2007), khoáng

nano thúc đẩy toàn bộ quá trình vận chuyển electron,

hoạt động quang khử của quang hệ thống II, giải

phóng oxi và hoạt động quang phophoryll hóa các

chlorophyll dưới ánh sáng khả kiến và ánh sáng cực

tím Các kim loại nano vai trò quan trọng trong hệ

thống quang hợp Chlorophyll trong trung tâm phản

ứng quang hợp gắn kết với tinh thể nano vàng hoặc

nano bạc Do đó, hình thành nên hệ thống lai mới lạ

có thể sản xuất gấp 10 lần electron vì cộng hưởng

gene nguyên sinh (plasmon resonance) và phân ly

các lỗ electron nhanh, cơ chế tăng cường có thể giúp

thiết kế hệ thống ánh sáng nhân tạo Đây có thể là lý

do vì sao trong các nghiệm thức bổ sung nano bạc,

hàm lượng chlorophyll a và b đều cao hơn so với

nghiệm thức đối chứng không bổ sung nano bạc

Trên thế giới có khá nhiều nghiên cứu về nano

nói chung và nano bạc nói riêng trong nuôi cấy mô tế

bào thực vật Nano bạc có hiệu quả lên sự kéo dài rễ,

thân và tăng khối lượng khô trên các cây Phaseolus

vulgaris L., Zea mays L (Salama, 2012); Boswellia

ovaliofoliolata (Savithramma et al., 2012) Ở Việt Nam gần đây cũng có một vài nghiên cứu in vitro về

nano bạc cũng cho thấy rằng nano bạc có hiệu quả cao trong việc thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển trên các đối tượng cúc, dâu tây, đồng tiền

(Dương Tấn Nhựt et al., 2014)

KẾT LUẬN

Hiệu quả của nano bạc trong nhân giống in vitro

hoa hồng đã được khẳng định trong nghiên cứu này

Bổ sung bạc nano kết hợp với BA hoặc IBA cho hiệu quả tốt hơn việc sử dụng BA (2 mg/l) riêng lẻ trong nhân chồi và IBA (0,5 mg/l) riêng lẻ trong tạo rễ,

sinh trưởng và phát triển cây con hoa hồng in vitro

Trong đó, nồng độ nano bạc tối ưu ảnh hưởng lên

khả năng nhân nhanh chồi in vitro và lên khả năng sinh trưởng phát triển của cây hoa hồng in vitro lần

lượt là 7 và 9 mg/l Chồi và cây con quan sát được trên môi trường trên có đặc điểm nổi bật là bộ lá xanh, khỏe, ít hoặc không bị vàng lá; chiều cao đồng đều và cao hơn so với đối chứng Bộ rễ của cây con khỏe mạnh, nhiều và đồng đều sẽ là nguồn cây con

in vitro chất lượng sau này Với các hiệu quả nhân

giống hoa hồng trong nghiên cứu này, nano bạc

chứng tỏ được sự ưu việt trong hệ thống nuôi cấy in vitro hoa hồng và sẽ được quan tâm trong tương lai

Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn

Chương trình “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nano trong nông nghiệp” (Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam) đã hỗ trợ kinh phí cho nghiên cứu này

TÀI LIỆU THAM KHẢO Abdi G, Salehi H, Khosh-khuri M (2008) Nano silver: Anovel nanomaterial for removal of bacterial

contamination in Valerian (V officinalis) tissue culture Acta Physiol Plant 30: 709-714

An J, Zhang M, Wang SH, Tang J (2008) Physical, chemical and microbiological change in stored green asparagus spears as affected by coating of silver

nanoparticle-pvp LWT - Food Sci Tech 41: 1100-1107

Backor M, Kovik J, Dzubaj A, Bakorova M (2009) Physiological comparison of copper toxicity in the lichens

Peltigera rufescens (Weis) Humb and Cladina arbuscula subsp Mitis (Sandst.) Ruoss Plant Grow Reg 58: 279-286

Cameron, AC, Reid MS (2001) 1-MCP blocks

ethylene-induced petal abscission of Pelargonium peltatum but the effect is transient Postharvest Biol Tech 22: 169-177

Celikel FG, Dodge LL, Reid MS (2002) Efficacy of

1-MCP (1-methylcyclopropene) and Promalin for extending

the post-harvest life of Oriental lilies (Lilium × ‘Mona

Lisa’ and ‘Stargazer’) Sci Hort 93: 149-155

Chau HN, Bang LA, Buu NQ, Dung TTN, Ha HT, Quang

DV (2008) Some results in manufacturing of

nanosilver and investigation of its application for

disinfection Adv Nat Sci 9: 241-248

Dhawan V, Bhojwani SS (1986) Micropropagation in crop

plants Glimpses Plant Res 7: 1-75

Davies PJ (1987) The plant hormones: their nature,

occurrence and functions In Davies PJ, ed Plant

hormones and their role in plant growth and development

Martinus Nijhoff publishers, the Netherlands: 1-12

De Paiva Neto VB, Da Mota TR, Otoni WC (2003) Direct

organogenesis from hypocotyl derived explants of annatto

(Bixa orellana) Plant Cell Tiss Org Cult 7(5): 159-167

Duncan DB (1955) Multiple range and multiple F test

Biometrics 11: 1-42

Dương Tấn Nhựt, Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Thị Thanh

Hiền, Lê Kim Cương,Vũ Quốc Luận, Nguyễn Bá Nam,

Nguyễn Phúc Huy, Vũ Thị Hiền, Trịnh Thị Hương,

Nguyễn Hồng Hoàng, Nguyễn Xuân Tuấn, Nguyễn Thanh

Sang, Nguyễn Việt Cường, Đỗ Mạnh Cường, Nguyễn

Hoài Châu, Ngô Quốc Bưu (2014) Khảo sát ảnh hưởng của

nano bạc lên sự sinh trưởng và phát triển của cây cúc, dâu

tây, đồng tiền nuôi cấy in vitro Tạp chí Công nghệ Sinh

học 12(1): 103-111

Erwin JE, Schwarze D, Donahue R (1997) Factors

affecting propagation of Clematis by stem cuttings Hort

Technol 7: 408-410

Giraldo JP, Landry MP, Faltermeier SM, McNicholas TP,

Iverson NM, Boghossian AA, Reuel NF, Hilmer AJ, Sen

F, Brew JA, Strano MS (2014) Plant nanobionics approach

to augment photosynthesis and biochemical sensing Nat

Mater 13(4): 400-408

Hasegawa PM (1980) Factors affecting shoot and root

initiation from cultured rose shoot tips J Am Soc Hortic

Sci 105(2): 216-236

Khan NA (2006) Ethylene action in plants

Springer-Verlag Berlin Heidelberg, German

Khodakovskaya MV, de Silva K, Biris AS, Dervishi E,

Villagarcia H (2012) Carbon nanotubes induce growth

enhancement of tobacco cells ACS Nano 6(3): 2128-2135

Krishnaraj C, Jagan EG, Ramachandran R, Abirami SM,

Mohan N, Kalaichelvan PT (2012) Effect of biologically

synthesized silver nanoparticles on Bacopa monnieri

(Linn.) Wettst plant growth metabolism Process Biochem

47(4): 51-658

Lei Z, Mingyu S, Chao L, Liang C, Hao H, Xiao W,

Xiaoqing L, Fan Y, Fengqing G, Fashui H (2007) Effects

of nanoanatase TiO2 on photosynthesis of spinach

chloroplasts under different light illumination Biol Trace Elem Res 119: 68-76

Lichtentaler HK, Wellburn AR (1985) Determination of total carotenoids, chlorophyll a và b of leaf in different

solvents Biolchem Soc Trans 11: 591-592

Lok CN, Ho CM, Chen R, He QY, Yu WY, Sun H, Tam PKH, Chiu JF, Che CM (2007) Silver nanoparticles:

partial oxidation and antibacterial activities Biol Inorg Chem 12: 527-534

Ma X, Geiser-Lee J, Deng Y, Kolmakov A (2010) Interactions between engineered nanoparticles (ENPs) and

plants: phytotoxicity, uptake and accumulation Sci Total Environ 408(16): 3053-3061

Macnish AJ, Irvig DE, Joyce DC, Vithanage V, Wearing

AH (2004) Anatomy of ethyelen-induced floral organ

abscission Chamelauciumuncinatum (Myrtaceae), Austr J Bot 53(2): 119-131

Mateja S, Franci S, Gregor O (2005) Influence of IAA and

IBA on root development and quality of Prunus ‘GselA5’ leafy cuttings Hortsci 40(7): 2052-2055

Monica RC, Cremonini R (2009) Nanoparticles and higher

plants Caryologia 62(2): 161-165

Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid

growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiol Plant 15(3): 473-497

Nguyễn Xuân Linh (2000) Kỹ thuật trồng hoa Nxb Nông

nghiệp Hà Nội

Posada M, Ballesteros N, Obando W, Angarita A (1999)

Micropropagation of Gerbera from floral buds Acta Hort

482: 329-332

Rezvani N, Sorooshzadeh A, Farhadi N (2012) Effect of

nano-silver on growth of saffron in flooding stress World Acad Sci Eng Technol 1: 517-522

Rout GR, Debata BK, Das P (1991) Somatic

embryogenesis in callus cultures of Rosa hybrida L cv Landora Plant Cell Tiss Org Cult 27: 65-69

Sahoo S, Debata BK (1997) A note on in vitro micropropagation and induction of flowering in the

miniature rose-dThe FairyT Orissa J Hortic 25: 87-89

Salama HMH (2012) Effects of silver nanoparticles in

some crop plants, common bean (Phaseolus vulgaris L.) and corn (Zea mays L.) Int Res J Biotech 3(10): 190-197

Savithramma N, Ankanna S, Bhumi G (2012) Effect of nanoparticles on seed germination and seedling growth of

Boswellia ovalifoliolata an endemic and endangered medicinal tree taxon Nano Vision 2: 61-68

Shah V, Belozerova I (2008) Influence of metal nanoparticles on the soil microbial community and

germination of lettuce seeds Water Air Soil Pollut 197:

143-148

Sharma P, Bhatt D, Zaidi MG, Saradhi PP, Khanna PK,

Arora S (2012) Silver nanoparticlemediated enhancement

in growth and antioxidant status of Brassica juncea Appl

Biochem Biotechnol 167: 2225-2233

Syamal MM, Singh SK (1996) In vitro propagation of

rose Hortic J 9: 57- 62

Van der Krieken WM, Breteler H, Visser MHM, Mavridou

D (1993) The role of the conversion of IBA into IAA on root regeneration in apple: introduction of a test system

Plant Cell Rep 12: 203-206

THE EFFECT OF NANO SILVER ON SHOOT MULTIPLICATION, GROWTH AND

DEVELOPMENT OF IN VITRO ROSE (ROSA SP.) PLANTLETS

Duong Tan Nhut 1,* , Nguyen Xuan Tuan 1 , Nguyen Thi Thuy Anh 1 , Ho Viet Long 1 , Hoang Thanh Tung 1 , Nguyen Ba Nam 1 , Nguyen Phuc Huy 1 , Vu Quoc Luan 1 , Vu Thi Hien 1 , Le Thi Thu Hien 2 , Nguyen Hoai Chau 3 , Ngo Quoc Buu 3

1 Tay Nguyen Institute for Scientific Research, VAST

2 Institute of Genome Research, VAST

3 Institute of Environmental Technology, VAST

SUMMARY

Rose is one of the most popular flowers which are planted all over the world, and this is due to their diversity of colors and types However, the success of micropropagation protocol is still limited due to some issues including yellow leaves, leaves senescence and brown or black roots In recent years, silver nano has

been used in in vitro plant tissue culture for enhancing growth and development owing to its high ability of cell

surface contacting In this research, different concentrations of nano silver (1, 3, 5, 7, 9 and 11 mg/l) were used

to investigate its effect on shoot multiplication, growth and development of rose plantlets After 30 days of

culture, the best shoot multiplication were on MS medium supplemented with 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 2,5

mg/l BA and 7 mg/l nano silver (the number of newly formed shoots was 4.09 times larger than control) In addition, MS medium supplemented with 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 0,5 mg/l IBA and 9 mg/l nano silver was

the optimal for rooting, growth and development of in vitro rose plantlets Compared to the control, the

plantlet’s height, number of leaves per plantlet, leaf’s length, leaf’s width, fresh and dry weights, contents of chlorophyll a and b were remarkably increased (2,93 cm; 8 leaves; 1,9 cm; 1,6 cm; 517, 67 mg; 52 mg; 6,80

µg/g and 3,49 µg/g; respectively) Simultaneously, both shoots and plantlets grew well, rarely or not observed

yellow leaves or leaf senescence Most of the plantlets were uniform in height with green leaves and thick root system

Keywords: Rose, silver nano, shoot multiplication, growth and development, micropropagation

*Author for correspondence: Tel.: +84-63-3831056; Fax: +84-63-3831028; E-mail: duongtannhut@gmail.com