Sàng lọc docking tìm kiếm hợp chất làm bền vững cấu trúc chuỗi xoắn tứ ADN (G4) trên tế bào ung thư ở người

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮTCytosine Cơ sở dữ liệu G-quadruplex Cấu trúc ADN bậc 2 gồm 4 guanin trên mặt phẳng Nuclear magnetic resonance – cộng hưởng từ hạt nhân Nhiễm sắc thể Guanine

Lời cảm ơn

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân

thành nhất tới người thầy của tôi – TS Phạm Thế Hải, người đã đồng hành

cùng tôi vượt qua khó khăn, ân cần quan tâm, động viên, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi từ những bước đi chập chững đầu tiên trên con đường nghiên cứu khoa học và trong suốt quãng thời gian tôi thực hiện khóa luận

Tôi cũng vô cùng biết ơn và xin được chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Hóa dược đã hết sức nhiệt tình, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận

Tôi cũng xin được cảm ơn những người bạn đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian làm khóa luận

Cuối cùng, tôi xin dành sự biết ơn sâu sắc nhất tới bố mẹ tôi và tất cả những người thân trong gia đình, những người đã luôn yêu thương, ủng hộ để tôi có được ngày hôm nay!

Hà Nội, Ngày 19 tháng 5 năm 2019 Sinh Viên

Nguyễn Quang Hƣng

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT 0

DANH MỤC CÁC BẢNG 1

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ 2

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Chuỗi xoắn tứ ADN (G4) 2

1.1.1 Khái niệm Chuỗi xoắn tứ ADN 2

1.1.2 Phân loại các Chuỗi xoắn tứ ADN 4

1.1.3 Chuỗi xoắn tứ ADN và vai trò trong ung thư 5

1.2 Kỹ thuật Protein docking 6

1.2.1 Đại cương về phương pháp Protein docking 6

1.2.2 Quy trình Docking 8

1.3 Dự đoán đặc điểm dược động học của các hợp chất tiềm năng 9

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 11

2.2 Nội dung nghiên cứu 11

2.3 Phương pháp nghiên cứu 11

2.3.1 Dock lại 11

2.3.2 Mô phỏng protein docking 36 hợp chất 13

2.3.3 Dự đoán đặc điểm dược động học 13

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 14

3.1 Dock lại BRACO-19 14

3.2 Cơ chế phân tử làm ổn định cấu trúc chuỗi xoắn tứ ADN 16

3.2.2 Cơ chế làm ổn định trên protein 143D 17

3.3 Docking 36 hợp chất với protein 18

3.3.1 Dock 36 chất với protein 1KF1 27

3.3.2 Dock 36 chất với protein 143D 28

3.4 Dự đoán đặc điểm dƣợc động học của hợp chất tiềm năng 30

3.5 Bàn luận 33

3.5.1 Về tối ưu hoá năng lượng hợp chất 33

3.5.2 Về sàng lọc ảo bằng Autodock Vina 33

3.5.3 Về ưu điểm của phương pháp 34

3.5.4 Về hạn chế của phương pháp 34

3.5.5 Về các nghiên cứu trong nước cùng hướng 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Cytosine

Cơ sở dữ liệu G-quadruplex (Cấu trúc ADN bậc 2 gồm 4 guanin trên mặt phẳng) Nuclear magnetic resonance – cộng hưởng từ hạt nhân

Nhiễm sắc thể Guanine The half maximal inhibitory concentration (Nồng độ ức chế 50%, thường dùng đối với các chất ức chế enzym, chất đối vận receptor,…)

Protein Data Bank (Ngân hàng dữ liệu Protein) Quantitative structure-activity relationships (Quan hệ định lượng giữa cấu trúc và tác dụng sinh học)

Root mean square deviation (Độ lệch căn quân phương) Thymine

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Phân loại chuỗi xoắn tứ ADN 4

Bảng 2: So sánh các tương tác giữa BRACO-19 gốc và BRACO-19 dock lại 15

Bảng 3: Kết quả docking (G và tương tác) của 36 chất với 1KF1 và 143D 19

Bảng 4: Thông số dược động học của 3 hợp chất tiềm năng: 8, 16 và 20 31

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1 1: Cấu trúc ADN 2

Hình 1 2: Telomere được sao chép bởi telomerase 3

Hình 1 3: Cấu trúc sợi G và G-tetrad 4

Hình 1 4: Các cấu dạng phổ biến của chuỗi xoắn tứ ADN 5

Hình 1 5: Vai trò telomerase trong tế bào ung thư 6

Hình 1 6: Bản chất của phương pháp protein docking 8

Hình 3 1: Cơ chế ức chế protein 3CE5 của cấu tử BRACO-19 14

Hình 3 2: Cấu dạng BRACO-19 dock lại và BRACO-19 mẫu trong protein 3CE5 15

Hình 3 3: Cấu trúc và trung tâm hoạt động của 1KF1 17

Hình 3 4: Cấu trúc protein 143D 18

Hình 3 5:Hình ảnh tổng thể cấu trúc 36 hợp chất sau khi dock protein 1KF1 27

Hình 3 6: Mô tả tương tác hợp chất 8, 16, 20 với protein 1KF1 28

Hình 3 7: Hình ảnh tổng thể cấu trúc 36 hợp chất sau khi dock protein 143D 29

Hình 3 8: Mô tả tương tác hợp chất 8, 16, 20 với protein 143D 30

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chuỗi xoắn tứ ADN (G4) là một cấu trúc ADN hoàn toàn mới, không xoắn kép

và không tuân theo nguyên tắc bổ sung A-T G-C Chuỗi xoắn tứ ADN gồm những đoạn giàu guanine và có mặt ở những vị trí quan trọng trong gen như telomere, ARN

và vùng gen khởi động Chuỗi xoắn tứ ADN (G4) thường xuất hiện trong telomere, là một cấu trúc nằm ở hai đầu của nhiễm sắc thể và có vai trò ngăn chặn sự tiêu biến của nhiễm sắc thể và làm ổn định bộ gen Những khám phá trên cùng với sự quan sát in vivo ở tế bào người đã cho thấy vai trò quan trọng của chuỗi xoắn tứ G4 ADN ở tế bào

Nhiều nghiên cứu và bằng chứng đã cho thấy những phân tử nhỏ có thể gắn với chuỗi xoắn tứ G4 ADN để ức chế quá trình sao chép và nhân lên của tế bào ung thư Cho đến nay, một số hợp chất đã được xác định và tương tác của chúng với chuỗi xoắn

tứ G4 đã được nghiên cứu rộng rãi như BRACO-19, RHPS4 và Telomestatin Tuy nhiên, sự đa hình của chuỗi xoắn tứ – G4 tồn tại rất nhiều cấu dạng không gian, phụ thuộc vào chuỗi acid nucleic và điều kiện một trường (Na+hoặc K+) là một thách thách lớn trong việc tìm kiếm hợp chất làm bền vững chuỗi xoắn tứ G4 nhằm ức chế tế bào ung thư

Trong nghiên cứu và tìm kiếm thuốc mới, docking là một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến nhất vì có khả năng dự đoán với độ chính xác khá cao sự hình thành liên kết của cấu tử với receptor trong túi liên kết Ra đời từ những năm

1980, docking phân tử đã trở thành một công cụ thiết yếu trong nghiên cứu và phát triển thuốc [18]

Vì vậy, chúng tôi tiến hành khoá luận ―Sàng lọc docking tìm kiếm hợp chất làm bền vững cấu trúc chuỗi xoắn tứ ADN (G4) trên tế bào ung thư ở người ‖ với ba mục tiêu chính như sau:

- Tìm hiểu cơ chế phân tử làm bền vững chuỗi xoắn tứ ADN (G4) trên tế bào ung thư

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Chuỗi xoắn tứ ADN (G4)

1.1.1 Khái niệm Chuỗi xoắn tứ ADN

ADN là phân tử mang thông tin di truyền, được cấu tạo từ hai mạch polyme sinh học xoắn đều quanh một trục tưởng tượng tạo thành chuỗi xoắn kép Hai mạch ADN này được gọi là các polynucleotide, bao gồm các đơn phân nucleotide Mỗi nucleotide được cấu tạo từ một trong bốn loại nucleobase chứa nitơ - cytosine (C), guanine (G), adenine (A), hay thymine (T)—liên kết với đường deoxyribose và một nhóm phosphat

Khung xương chính của mạch ADN hình thành từ các nhóm phosphat và phân

tử đường luân phiên nhau Các phân tử đường liên kết với nhau thông qua trung gian nhóm phosphat tạo thành liên kết phosphodieste giữa nguyên tử cacbon thứ 3 với nguyên tử cacbon thứ 5 trên hai mạch vòng của hai phân tử đường kế cận Các đầu không đối xứng kết thúc của chuỗi ADN là đầu 5′ (năm phẩy) và đầu 3′ (ba phẩy), với đầu 5′ kết thúc bởi nhóm phosphat và đầu 3′ kết thúc bởi nhóm hydroxyl (OH) [5]

Rãnh ADN là những khoảng trống nằm cách nhau giữa hai mạch polynucleotid Những rãnh này nằm liền kề với các cặp base và có thể hình thành túi liên kết Vì hai mạch đơn không đối xứng nhau nên dẫn đến các rãnh có kích thước không đều, trong

đó rãnh lớn rộng 22 Å và rãnh nhỏ rộng 12 Å Độ rộng của rãnh giúp cho các cạnh của base trở nên dễ tiếp cận hơn trong rãnh lớn so với rãnh nhỏ [24]

Hình 1 1: Cấu trúc ADN

(a) Chuỗi polynucleotid

(b) Rãnh ADN

Nucleoprotein telomere bao gồm những chuỗi lặp lại TTAGGG Telomere hầu hết có ở trong chuỗi xoắn kép, tuy nhiên ở đầu 3’ của nhiễm sắc thể tồn tại chuỗi đơn telomere gồm 100-200 base Sợi đơn telomere ở đầu 3’ có vai trò bảo vệ và chống lại

sự thoái hóa của nhiễm sắc thể [6]

Telomere được sao chép trong quá trình phân bào bởi enzyme phiên mã ngược telomerase Telomerase gồm cả ARN và protein Phần ARN chứa trình tự AAUCCC

và đóng vai trò làm khuôn mẫu tổng hợp telomere trong khi phần protein đảm bảo cho enzym hoạt động Enzym này kéo dài đoạn đầu mút và tạo điều kiện để ADN polymerases (enzym tác động vào quá trình kéo dài chuỗi ADN) thực hiện sao chép dọc chiều dài cho đến tận điểm cuối NST (Hình 1.2)

Hình 1 2: Telomere được sao chép bởi telomerase

Sợi G trong Telomere nhô ra ngoài đầu 3’ của telomere và gấp lại để hình thành G4-ADN (G-quadruplexes) – chuỗi axit nucleic giàu guanine Mỗi cấu trúc G4-ADN gồm nhiều G-Quartet (hoặc G-tetrad) xếp chồng lên nhau Mỗi G-quartet gồm 4 Guanine nằm trên một mặt phẳng, ở giữa là ion kim loại [28] (Hình 1.3)

Hình 1 3: Cấu trúc sợi G và G-tetrad

1.1.2 Phân loại các Chuỗi xoắn tứ ADN

Có hơn 200 loại chuỗi xoắn tứ ADN đã được tìm thấy, trong đó chúng được phân loại theo số lượng phân tử, cấu dạng không gian theo chiều của mạch và ion kim loại (Bảng 1)

Bảng 1: Phân loại chuỗi xoắn tứ ADN

Số phân tử Cấu dạng Chuỗi Ion kim loại PDB ID

Đơn phân tử

Không song song

d[AG3(T2AG3)3] Na+ 143D d(G2T2G2TGTG2T2G2) K+ 148D d[(G3T2A)3G3T] K+ 2KF7 Song song d[AG3(T2AG3)3] K+ 1KF1

d[G3T2CAG2] Na+ 1F3S d[G4T4G4] K+ 1JPQ Song song r[UAG3U2AG3U] K+ 2KBP

Chuỗi xoắn tứ ADN tồn tại dưới nhiều cấu dạng không gian khác nhau phụ thuộc vào basơ nitơ, ion làm ổn định cấu trúc và mật độ phân tử [34] Theo chiều của mạch, các chuỗi xoắn tứ ADN có 3 cấu dạng chính là song song, khôn song song và hỗn hợp (Hình 1.4)

Hình 1 4: Các cấu dạng phổ biến của chuỗi xoắn tứ ADN

Có 2 loại ion trong tế bào là Na+ và K+ Để nghiên cứu sự đa dạng về cấu trúc của chuỗi xoắn tứ ADN, chúng tôi nghiên cứu 2 PDB ( code 1KF1 và 143D) tương ứng với 2 loại ion trong mối trường là K+ và Na+ và 2 loại cấu dạng song song và không song song

1.1.3 Chuỗi xoắn tứ ADN và vai trò trong ung thư

Telomere bảo vệ các nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào, giữ cho các nhiễm sắc thể không dính vào nhau Do vậy, độ ổn định và tuổi của tế bào phụ thuộc vào độ dài của telomere Khi sao chép nhiễm sắc thể, các enzym sao chép ADN không nhân bản đến đầu cuối của nhiễm sắc thể, nên trong mỗi lần nhân bản đầu của nhiễm sắc thể được rút ngắn Các telomere trở nên ngắn hơn sau mỗi lần tái tạo ADN và cuối cùng mất khả năng bảo vệ ADN khỏi quá trình phá hủy và đột biến Sự ngắn đi của telomere có thể là một lý do cho sự lão hóa, không chỉ ở các tế bào đơn lẻ mà còn ở cả

cơ thể sinh vật

Đa số tế bào không phân chia một cách thường xuyên nên NST của chúng gặp

ít rủi ro và có vẻ ít cần đến hoạt động của telomere Ngược lại, tế bào ung thư có khả năng phân chia vô hạn và phải bảo tồn chuỗi telomere Một lý do giải thích tại sao tế bào ung thư không lão hóa và chết theo chương trình là sự hoạt động mạnh mẽ của telomerase [30]

Sự biểu hiện quá mức của telomerase làm kéo dài đuôi telomere Các nghiên cứu trước chỉ ra 80 – 85% tế bào ung thư có sự biểu hiện quá mức telomerase Có 2

cách để nhắm đích telomerase Một là ức chế trực tiếp telomerase bằng cách chặn hoạt tính xúc tác của các đơn vị nhỏ hoặc khuôn mẫu ARN, làm ngắn telomere và tế bào không còn khả năng phát triển Hai là cách không trực tiếp, làm ổn định cấu trúc G4 để chặn telomerase gắn vào telomere hoặc ức chế sự liên kết của protein liên quan đến telomerase, làm telomere mở mũ và chết theo chương trình Các nghiên cứu gần đây tập trung vào tìm hợp chất làm ổn định G4-DNA hơn là ức chế tác dụng của telomerase [19] (Hình 1.5)

Hình 1 5: Vai trò telomerase trong tế bào ung thư

1.2 Kỹ thuật Protein docking

1.2.1 Đại cương về phương pháp Protein docking

Protein docking – ra đời từ những năm 1980 – đã trở thành một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong quá trình thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc vì có khả năng dự đoán với độ chính xác khá cao sự hình thành liên kết của cấu tử với receptor trong túi liên kết Nó phản ánh sự thành công của việc ứng dụng dữ liệu

về cấu trúc của protein, được tạo bởi tinh thể học tia X và phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance – NMR) Mặc dù kỹ thuật này không thể áp dụng với mọi protein, tuy nhiên nó đã cung cấp những thông tin giá trị về kiểu liên kết

và tương tác ở nhiều protein [32]

Docking đánh giá những liên kết có ý nghĩa và độ bền cao, và thậm chí còn có thể định lượng khả năng liên kết bởi các hàm tính điểm, qua đó phân hạng khả năng liên kết mạnh yếu của các cấu tử [18] Nhờ ưu điểm thực hiện trên máy tính với tốc độ

càng ngày càng nhanh, chính xác và chi phí không quá lớn, protein docking dần được coi là bước khởi đầu cho nghiên cứu thiết kế thuốc hiện đại

Docking thực chất một bài toán tối ưu, tìm vị trí và cấu hình phù hợp và đánh giá tương tác của một cơ chất gắn kết vào túi liên kết của protein Về mặt nhiệt động lực học, mục tiêu chính của docking là tìm ra cấu hình mà năng lượng tự do của toàn

hệ là thấp nhất Để tìm cấu hình phù hợp nhất, cần liên hệ cấu hình không gian với các trị số đánh giá được khả năng gắn kết của cơ chất lên protein và sau đó áp dụng thuật toán tìm kiếm [18] (Hình 1.6)

Thuật giải di truyền (Genetic Algorithm - GA) là thuật toán tìm kiếm được ứng dụng nhiều trong các chương trình docking như Autodock, Autodock Vina, GOLD

GA áp dụng các lí thuyết liên quan đến học thuyết tiến hoá và chọn lọc tự nhiên Đầu tiên, thuật toán sẽ mã hoá tất cả các tham số của cấu trúc ban đầu trong một nhiễm sắc thế - biểu diễn bằng một vec tơ Từ nhiễm sắc thể ban đầu này, tạo ngẫu nhiên một quần thể bao phủ một miền năng lượng Quần thể này được đánh giá và từ đó các nhiễm sắc thể thích nghi nhất (tức là có giá trị năng lượng thấp nhất) được chọn làm khung để tạo ra quần thể tiếp theo Quy trình này làm giảm năng lượng trung bình của toàn bộ nhiễm sắc thể bằng cách truyền các đặc tính cấu trúc thuận lợi từ một quần thể này sang một quần thể khác Sau một số chu kỳ tìm kiếm và đánh giá, cuối cùng ta sẽ tìm được một nhiễm sắc thể (cấu dạng) phù hợp với mức năng lượng tối thiểu [23]

Chương trình docking sử dụng các hàm tính điểm (scoring function) để ước lượng các năng lượng liên kết của phức hợp cấu tử - receptor Năng lượng này được cho bởi hằng số liên kết (Kd) và năng lượng tự do Gibbs (ΔGL) Dự đoán về năng lượng liên kết được thực hiện bằng cách đánh giá những tương tác hóa lý quan trọng bao gồm: các tương tác liên phân tử, các ảnh hưởng solvat và entropy [18] Do đó, số lượng các tham số hoá lý được đánh giá càng lớn thì độ chính xác càng cao Tuy nhiên, nếu số lượng biến càng lớn thì thời gian tính toán sẽ lâu Các hàm tính điểm hiệu quả nên đưa ra sự cân bằng giữa độ chính xác và tốc độ, đây là một điểm quan trọng khi làm việc với cơ sỡ dữ liệu lớn

Hình 1 6: Bản chất của phương pháp protein docking

1.2.2 Quy trình Docking

Quá trình docking được thực hiện thông qua ba bước: chuẩn bị cấu tử, chuẩn bị protein, mô phỏng docking

Chuẩn bị cấu tử: cấu trúc các cấu tử có thể được lấy từ hệ thống dữ liệu có sẵn

như Pubchem, Zinc, Asinex database Trong trường hợp không có sẵn, chúng ta có thể

xây dựng cấu trúc cấu tử bởi các phần mềm như ChemDraw, MarvinSketch…Sau khi xây dựng được cấu trúc 3D, sử dụng các phần mềm để chuẩn bị cấu tử cho chương trình mô phỏng docking, các bước chuẩn bị thường được tiến hành gồm: gắn hydro, gắn trường lực, xây dựng file pdbqt

Chuẩn bị protein: Cấu trúc 3D của protein thường có sẵn trên ngân hàng dữ

liệu protein (protein data bank) ―https://www.rcsb.org‖ Trong trường hợp chưa có

sẵn, chúng ta có thể xây dựng cấu trúc 3D theo phương pháp mô phỏng tính tương đồng (homology modeling) Sau khi có cấu trúc 3D, sử dùng các phần mềm để chuẩn

bị protein cho chương trình mô phỏng docking Các bước chuẩn bị thường gồm: loại nước và các cấu tử (nếu có), thêm hydro, gắn trường lực và xây dựng file pdbqt

Mô phỏng docking: Trước khi phần mềm tiến hành tìm kiếm vị trí và cấu dạng

phù hợp của cấu tử, cần khoanh vùng tìm kiếm (grid box) cho thuật toán Kích thước của vùng tìm kiếm không nên quá lớn vì như thế sẽ tốn kém thời gian và độ lặp lại không cao, cũng không nên quá nhỏ vì như vậy phần mềm chỉ tìm kiếm được một vùng rất nhỏ, không có ý nghĩa Vị trí của vùng tìm kiếm thông thường sẽ được đặt ở trung tâm hoạt động của protein Sau khi xác định vị trí và kích thước của vùng tìm kiếm, phần mềm sẽ tự động tìm kiếm và đưa ra cấu dạng phù hợp với năng lượng thấp

nhất Cấu dạng này cùng với các tương tác của nó với protein sẽ được phân tích bởi các phần mềm chuyên dụng như: MOE, Pymol, Discovery studio…

1.3 Dự đoán đặc điểm dƣợc động học của các hợp chất tiềm năng

Các thông số hấp thu (Absorption), phân bố (Distribution), chuyển hóa (Metabolism), thải trừ (Excretion) có vai trò quan trọng trong việc đánh giá một chất

có phù hợp hay không để làm thuốc phù hợp với cơ thể người Việc tìm ra một thuốc mới đòi hỏi hao tổn rất nhiều chi phí cả về thời gian và tiền bạc bao gồm các bước: lựa chọn đích tác dụng, nhận dạng mục tiêu, tìm kiếm chất có tiềm năng, thử nghiệm tiền lâm sàng và thử nghiệm lâm sàng

Trước đây, chỉ có rất ít thuốc mới được phê duyệt và đưa ra thị trường trong số hàng trăm ngàn các ứng viên Hai nguyên nhân chính cho sự thất bại này là do tác dụng sinh học của các hợp chất kém và độc tính của chúng quá cao Khảo sát nhiều ứng viên tiềm năng cho thấy có tới 50% các chất có tiềm năng bị loại bỏ do bị loại khỏi thị trường hoặc thất bại trong việc thử nghiệm lâm sàng do tác dụng phụ quá nguy hiểm Ngày nay, khi việc đánh giá thông số ADME được chú ý hơn, chỉ còn gần 10% các thuốc thất bại do không đáp ứng được các thuộc tính ADME, một con số nhỏ hơn nhiều so với trước đây [9]

Việc chắt lọc và tối ưu hóa các thông số ADME trong giai đoạn đầu thử nghiệm thuốc được nghiên cứu kĩ lưỡng Tuy nhiên, với hàng triệu các hợp chất tiềm năng, việc đánh giá thuộc tính dược động học của tất cả các hợp chất tiêu tốn một số tiền khổng lồ

Do đó, kết hợp với các nghiên cứu thử nghiệm in vitro, kỹ thuật tính toán thuộc tính ADME bằng các server ảo được coi là phương pháp thay thế tối ưu

Hiện nay có rất nhiều công cụ dự đoán ADME được xây dựng bởi các tổ chức lớn trên thế giới như các web server: PreADMET ADMET Prediction, PreADMET Toxicity Prediction, SwissADME, admetSAR,… các phần mềm như chemTree, Volsurf, ADMET, MDL®Metabolite Database,…

Trong đó, SwissADME [13] là một trong những công cụ phổ biến SwissADME là một công cụ trên web cho phép người dùng truy cập miễn phí những

mô hình dự đoán nhanh và mạnh mẽ về đặc tính hóa lý, dược động học, và những đặc tính gần giống thuốc hóa dược

Bộ công cụ này được thiết kế một cách đơn giản, thân thiện và dễ sử dụng, tích hợp trên trang web online http://www.swissadme.ch/ Việc tính toán thông qua cấu dạng SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry Specification) - là dạng cấu trúc phân tử số hóa dưới dạng ký tự ASCII SMILES được sử dụng khá rộng rãi trong danh pháp hóa học và định dạng cấu trúc dữ liệu trên máy tính

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị

Nguyên liệu:

Cấu trúc của 36 hợp chất được sàng lọc bằng phương pháp định lượng quan hệ cấu trúc – tác dụng từ CSDL Asinex

Cấu trúc tinh thể tia X của chuỗi xoắn tứ ADN (1KF1, 143D và 3CE5) được tải

từ ngân hàng dữ liệu protein (protein data bank), loại nước, gắn hydro và thêm trường lực

Thiết bị: Sử dụng các phần mềm trên máy tính Acer V5-471G – Hệ điều hành

Windows 10

Phần mềm: Danh sách các phần mềm sử dụng bao gồm:

1 ChemBioOffice 2010 7 UCSF Chimera 1.10.2

2 MarvinSketch 17.15.0 8 Microsoft Word 2016

3 MGLtools 1.5.6 9 Microsoft Excell 2016

4 Autodock Vina 1.1.210 10 PyRx 0.8

5 Discovery Studio 2017 11 MOE 2009

6 PyMOL 2.3.0

2.2 Nội dung nghiên cứu

1 Tìm hiểu cơ chế phân tử làm bền vững chuỗi xoắn tứ ADN trên tế bào ung thư

ở người

2 Mô phỏng protein docking, xác định cấu dạng của các chất có khả năng làm bền

vững chuỗi xoắn tứ ADN trên tế bào ung thư ở người

3 Dự đoán đặc điểm dược động học của các hợp chất tiềm năng ức chế tế bào ung thư ở người

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Dock lại

Dock lại là phương pháp quan trọng để thẩm định quy trình dock và kiểm tra khả năng tạo ra các cấu dạng có tương tác gần giống với của cấu tử đã biết có tác dụng làm ổn định chuỗi xoắn tứ ADN Quy trình dock được đánh giá là phù hợp nếu sự sai lệch giữa cấu tử ở vị trí ban đầu trong cấu trúc tinh thể, và cấu tử sau khi dock lại là

không đáng kể Vì không có cấu tử mẫu trong 2 protein 1KF1 và 143D và để mô phỏng các điều kiện như 2 protein, protein 3CE5 với cấu trúc tinh thể phân giải 2.5 Å trong môi trường K+

và cấu tử BRACO19 đã được lựa chọn [1] Các bước dock lại BRACO19 gồm:

Chuẩn bị hợp chất: Sử dụng Chemdraw để xây dựng cấu trúc 2D của

BRACO19, sau đó xây dựng công thức 3D hợp chất này nhờ phần mềm MarvinSketch

Sau đó, sử dùng phần mềm MGLtools thêm hydrogen, gắn trường lực gasteiger và xây

dựng file pdbqt

Chuẩn bị protein: Cấu trúc tinh thể thích hợp của chuỗi xoắn tứ ADN ( PDB

ID 3CE5) [8] được lấy từ ngân hàng dữ liệu protein (Protein data bank) Sau đó, loại nước, các cấu tử (ligand) ra khỏi cấu trúc của protein và cuối cùng thêm hydro, gắn trường lực Kollman và xây dựng file pdbqt Tất cả các bước này đều được tiến hành

trên phần mềm MGLtools

Mô phỏng docking: Dữ liệu các File pdbqt đã xây dựng của hợp chất và của

protein sẽ được tiến hành docking, sử dụng phần mềm Autodock Vina [29] và PyRx [15] Trung tâm grid box được đặt ở vị trí giữa trong cấu trúc tinh thể Kích thước Grid box : 34 x 34 x 34 Å để bao trùm toàn bộ protein Số vòng lặp cho chương trình là 4 vòng, còn các tham số khác được cài đặt ở chế độ mặc định Mỗi cấu tử sẽ được dock

5 lần Phân tích các kết quả bằng phần mềm PyMOL, Discovery studio và MOE

Đánh giá kết quả: Chúng tôi đánh giá sự tương đồng của hợp chất gốc và hợp

chất dock lại theo hai chỉ tiêu: Độ lệch căn quân phương (Root mean square deviation

- RMSD), điểm đánh giá tương tác và khả năng tương tác

 RMSD: RMSD đo khoảng cách trung bình của các nguyên tử giữa 2 cấu dạng hợp chất Công thức tính RMSD cho 2 cấu dạng a, bnhư sau:

2 )

( 1 ( ) ( ) ( ) Trong đó n là tổng số nguyên tử; ix, iy, iz là toạ độ không gian của nguyên tử thứ i

RMSD càng lớn thì mức độ sai lệch của hai cấu dạng càng lớn

 Điểm đánh giá tương tác: Điểm số đánh giá theo thuyết ΔG

Phương trình là tập hợp giá trị các tham số đi kèm với hệ số theo một lý thuyết

áp đặt nhất định Mỗi loại tương tác, ví dụ như tương tác liên kết hydro, tương

tác kị nước,… đều được gán cho 1 miền giá trị Kết quả cuối phản ánh khả năng tương tác mạnh hay yếu của phối tử với receptor

 Khả năng tương tác: sử dụng phần mềm MOE để phân tích các tương tác giữa BRACO-19 dock lại với protein, các tương tác này được so sánh với các tương tác của BRACO-19 ban đầu Các phối tử chỉ có liên kết lỏng lẻo hoặc không có liên kết được

bỏ qua Mặt khác khả năng tương tác còn được đánh giá thông qua thông số năng lượng liên kết, năng lượng liên kết càng thấp, khả năng tương tác giữa cấu tử và protein càng mạnh

2.3.2 Mô phỏng protein docking 36 hợp chất

Sau khi quy trình dock được thẩm định bởi kết quả dock lại BRACO-19 vào protein 3CE5 với các điều kiện tương tự, chúng tôi sử dụng quy trình này để mô phỏng protein docking 36 hợp chất trong cơ sở dữ liệu vào 2 protein 1KF1 và 3CE5 Kết quả

mô phỏng protein docking được phân tích bởi các phần mềm MOE, PyMOL và Discovery

2.3.3 Dự đoán đặc điểm dược động học

Các thông số ADME được dự đoán trên server SwissADME [13] Dữ liệu cấu trúc được nạp vào server qua cấu dạng SMILES để tính toán các thông số hóa lý và dược động học của các phân tử

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Dock lại BRACO-19

BRACO-19 là cấu tử có nhân Acridine và 3 nhóm thế ở vị trí 3,6,9 Nó ức chế hoạt động của enzyme telomerase, làm ngắn telomere và đã được chứng minh tác dụng

ức chế hoạt động của tế bào ung thư in vitro và in vivo [7]

Cấu trúc tinh thể 3CE5 gồm BRACO-19 và 2 chuỗi xoắn tứ d(TAG3TTAG3T) (Chuỗi A và Chuỗi B) tạo thành 3 mặt phẳng G-tetrad BRACO-19 chỉ stack pi-pi trực tiếp với 2 guanine trong G-tetrad ở đầu 3’ – G11 ở chuỗi A và G17 ở chuỗi B Nhóm thế linh động ở vị trí 3 và 6 gồm cation Nitơ nằm trong rãnh ADN rộng và nông, đối diện với mặt G-tetrad và được bao bọc bởi khung phosphate mang điện âm và có liên kết hydro với đầu 3’ T24 của chuỗi B Nhóm thế anilino ở vị trí 9 nằm trong một túi hẹp kỵ nước [8] (Hình 3.1)

Hình 3 1: Cơ chế ức chế protein 3CE5 của cấu tử BRACO-19

Cấu dạng BRACO-19 sau khi dock lại được so sánh với cấu dạng ban đầu của

nó trong tinh thể 3CE5 (Hình 3.2)

Hình 3 2: Cấu dạng BRACO-19 dock lại và BRACO-19 mẫu trong protein 3CE5

(Ghi chú: Màu xanh là BRACO19 gốc, màu vàng là BRACO19 dock lại, hình ảnh được vẽ trên phân mềm PyMOL)

 RMSD  8Å do đó sự khác nhau giữa 2 cấu dạng của BRACO19 là khác biệt

 Các tương tác giữa BRACO-19 với protein sau khi dock được so sánh với các

tương tác gốc thể hiện trong bảng

Bảng 2: So sánh các tương tác giữa BRACO-19 gốc và BRACO-19 dock lại

Hình ảnh

docking

Acridine Stack pi-pi với G11 và G17 Stack pi-pi với G11 và G17